Analiza R-Loop za pomocą Dot-Blot

Summary

Ten protokół opisuje prostą metodę, która określa ilościowo R-loop, trójniciową strukturę kwasu nukleinowego, która składa się z hybrydy RNA-DNA i przemieszczonej nici DNA.

Abstract

Trójniciowa struktura kwasu nukleinowego, R-loop, jest coraz bardziej rozpoznawalna ze względu na swoją rolę w regulacji genów. Początkowo uważano, że pętle R są produktami ubocznymi transkrypcji; ale ostatnie odkrycia dotyczące mniejszej liczby pętli R w chorych komórkach jasno pokazały, że pętle R odgrywają funkcjonalne role w różnych komórkach ludzkich. Następnie ważne jest, aby zrozumieć rolę pętli R i sposób, w jaki komórki równoważą swoją liczebność. Wyzwaniem w tej dziedzinie jest kwantyfikacja pętli R, ponieważ większość prac opiera się na przeciwciałie monoklonalnym S9.6, którego swoistość dla hybryd RNA-DNA została zakwestionowana. Tutaj używamy dot-blot z przeciwciałem S9.6 do ilościowego określenia pętli R i pokazania czułości i swoistości tego testu z RNazą H, RNazą T1 i RNazą III, które rozszczepiają odpowiednio hybrydy RNA-DNA, jednoniciowe RNA i dwuniciowe RNA. Ta metoda jest wysoce powtarzalna, wykorzystuje ogólny sprzęt laboratoryjny i odczynniki, a wyniki dostarczają w ciągu dwóch dni. Test ten może być stosowany w warunkach badawczych i klinicznych do ilościowego określania pętli R i oceny wpływu mutacji w genach, takich jak senataksyna, na obfitość pętli R.

Introduction

Ten protokół dostarcza przewodnik krok po kroku do testu dot-blot, który pozwala na szybką ocenę porównawczą obfitości R-loop, trójniciowej struktury kwasu nukleinowego. Pętla R powstaje, gdy RNA atakuje dwuniciowy DNA, aby wygenerować hybrydę RNA-DNA i wypiera drugą nić DNA. Pętle R znajdują się na różnych etapach cyklu życia RNA. W kompleksie transkrypcyjnym powstający RNA jest syntetyzowany komplementarnie do matrycowego DNA, a nić niematrycowa jest przemieszczana. Krótka hybryda RNA-DNA (<10 pz) jest rozdzielona w celu uwolnienia powstającego RNA, aby mógł opuścić kompleks polimerazy RNA przez kanał wyjściowy^1,2. Poza kompleksem transkrypcyjnym, powstające RNA jest blisko swojej matrycy DNA, która jest jeszcze nieznacznie rozwinięta po skopiowaniu, dzięki czemu RNA może rehybrydyzować ze swoim matrycowym DNA, tworząc R-loops³. Dodatkowo, pętle R mogą powstawać, gdy kompleksy replikacji i transkrypcji zderzają się⁴, oraz w transkrypcji antysensownej⁵. Biorąc pod uwagę wiele możliwości ich powstawania, pętle R nie są rzadkie i można je znaleźć w 3-5% ludzkiego genomu⁶, w zależności od statusu transkrypcji komórki. Pętle R znajdują się w promotorach genów⁷ i termination⁵ miejsc w mRNA oraz wzdłuż rybosomalnego RNA⁸, a także transferu RNA⁹. Pętle R znajdują się również w telomerowych regionach chromosomów.

R-loops odgrywają rolę regulacyjną. Regulują ekspresję genów, wpływając na transkrypcję w promotorach^10,11, pośrednicząc w rekombinacji class-switch^{12 i ułatwiając edycję} genomu w oparciu o CRISPR^13,14,15. Podobnie jak w przypadku wielu zdarzeń komórkowych, obfitość pętli R jest ściśle miareczkowana; zbyt wiele lub zbyt mało pętli R wpływa na normalne funkcjonowanie komórki^16,17. Pętle R są regulowane przez różne białka, w tym RNazę H, senataksynę i inne helikazy, które rozwijają hybrydy RNA-DNA^{18,19,20,21,22}.

Aby monitorować obfitość pętli R, metody obejmujące cały genom najpierw wzbogacają dla pętli R przeciwciałem S9.6^8,23,24 lub z innymi nukleazami²⁵ w tym RNase H^10,26,27, a następnie ocenić liczbę wzbogaconych pętli R przez sekwencjonowanie. Wczesne wersje tych metod opartych na sekwencjonowaniu nie osiągnęły odpowiedniego pokrycia sekwencji, aby umożliwić precyzyjną ocenę ilościową, ale szybkie ulepszenie technologii sekwencjonowania umożliwia teraz analizę pętli R locus-by-locus. Techniki immunofluorescencji zostały również wykorzystane do ilościowego określenia i lokalizacji pętli R^10,17. Metody te są kompleksowe, ale nie są praktyczne w wielu warunkach klinicznych lub jako wstępne oceny, ponieważ wymagają drogiego sprzętu i specjalistycznej analizy.

Potrzebna jest procedura, która może być wykonywana jednolicie we wszystkich laboratoriach w warunkach klinicznych. Dot-bloty zapewniają taką opcję, ponieważ można je przeprowadzić bez specjalnego sprzętu lub analizy obliczeniowej. Jako etap wstępny lub w warunkach klinicznych w celu oceny wpływu mutacji na pętle R, te kropki muszą dostarczyć czułych i specyficznych wyników. Tutaj opisujemy nasz test, który konkretnie identyfikuje pętle R; wyklucza sygnały z dwuniciowego (ds) DNA, dwuniciowego RNA i jednoniciowego RNA. Nasz protokół wykorzystuje przeciwciało S9.6 ²⁷ do identyfikacji hybryd RNA-DNA w pętlach R i zawiera RNazę H, endorybonukleazę, która rozszczepia się, a tym samym prowadzi do degradacji RNA w hybrydzie RNA-DNA^20,28, aby zapewnić, że wykryte sygnały należą do hybryd. Dodaliśmy również RNazę T1, która rozszczepia jednoniciowy RNA na guaninie^29,30, oraz RNazę III, która rozszczepia dwuniciowe RNA, w tym pętle macierzyste^31,32, aby sprawdzić, czy nie ma niespecyficznych sygnałów. Przeciwciało S9.6 rozpoznaje hybrydy RNA-DNA o różnej długości, nawet te, które mają tylko 8 nukleotydów długości³³.

Tutaj prezentujemy protokół, który zaczyna się od izolacji kwasu nukleinowego, następnie przygotowania dot-blot i wykrywania pętli R za pomocą przeciwciała S9.6. Nasz protokół zawiera kroki mające na celu zapewnienie, że załadowane są równe ilości próbek, a sygnały są specyficzne. Dostarcza oligonukleotydy, które służą jako kontrole pozytywne i negatywne. Jest to szybka, łatwa i przyjazna dla użytkownika metoda oceny obfitości pętli R.

Protocol

1. Liza komórek do frakcjonowania jądrowego

1. Umyj komórki 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) dwukrotnie. Usuń komórki z naczyń do hodowli tkankowych przy użyciu standardowych technik dysocjacji komórek, takich jak trypsyna. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
   UWAGA: Kroki opisane poniżej zostały wykorzystane do analizy pierwotnych fibroblastów ludzkiej skóry, chociaż można oznaczyć szereg typów komórek. Fibroblasty hodowano w pożywkach podstawowych zawierających 10% płodowej surowicy bydlęcej. Alternatywnie, bufor do lizy komórek (Tabela 1) może być dodany bezpośrednio do kultury komórkowej po umyciu.
2. Przenieś zawiesinę komórek do probówki o pojemności 1,5 ml w celu osadzenia komórek.
3. Odwirować próbkę o masie 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zassać pożywkę.
4. Umyj dwukrotnie lodowatym 1x PBS, używając ustawień wirowania w kroku 1.3.
5. Dodać bufor do lizy zimnych komórek (Tabela 1) do osadu komórkowego (300 μL na 2 x 10⁶ komórek). Pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić osad.
6. Inkubować na lodzie przez 10 minut.
7. Wirować w 500 x g przez 5 minut, aby otoczkować jądra.
8. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad jądrowy w 400 μl zimnego buforu do lizy jądrowej (tabela 1).
9. Inkubować na lodzie przez 10 min.
   UWAGA: Frakcjonowanie przedziałów jądrowych i cytoplazmatycznych komórek zapewnia specyficzność sygnału. Jakość separacji jądrowej i cytoplazmatycznej można ocenić przed kontynuowaniem (Tabela 2).
10. Dodać 3 μl 20 mg/ml proteinazy K i inkubować przez 3-5 godzin w temperaturze 55 °C.
    UWAGA: Wskazane woluminy są przeznaczone dla komórek 2 x 10⁶, w razie potrzeby skaluj w górę lub w dół.

2. Oczyszczanie genomowego DNA (w tym hybryd RNA-DNA)

1. Jeśli DNA jest lepkie, należy przeprowadzić sonikację w celu zmniejszenia lepkości (np. sonikacja przy wysokiej mocy wyjściowej, 30 s ON / 30 s OFF, przez 2 minuty w łaźni wodnej o temperaturze 4 °C).
2. Dodać 400 μl buforu elucyjnego (tabela 1) i 400 μl fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego (25:24:1 pH 8,0).
3. Wir przez 10 s.
4. Wirować z prędkością 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
5. Przenieść fazę wodną (około 350 μl) do nowej probówki.
6. Pobrać jednorazową ekstrakcję za pomocą 1 objętości chloroformu, wirować przez 10 s, a następnie wirować w temperaturze 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść fazę wodną do nowej probówki (około 300 μl).
7. Dodać 35 μl 3 M octanu sodu (pH 5,2), 1 μl glikogenu i 700 μl lodowatego 100% etanolu.
8. Wirować przez 10 s i wirować w dół przy 12 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
9. Umyj granulat 1 ml 70% etanolu.
10. Wirować przez 10 s i wirować w dół przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
11. Odrzucić supernatant i pozostawić granulki do wyschnięcia.
12. Dodać 12 μl buforu elucyjnego i wirować przez 10 sekund w celu ponownego zawieszenia. Inkubować próbkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C z mieszaniem lub w temperaturze 4 °C przez noc w celu ponownego zawieszenia osadu.
13. Zmierzyć stężenie DNA za pomocą standardowej spektrofotometrii.
    UWAGA: Wskazane woluminy są przeznaczone dla komórek 2 x 10⁶, w razie potrzeby skaluj w górę lub w dół. W razie potrzeby DNA (z hybrydami RNA-DNA) może być przechowywane w temperaturze -20 °C.

3. Plamienie próbek DNA (w tym hybryd RNA-DNA) na nylonowych membranach

1. Przygotować rozcieńczenia kwasów nukleinowych do pożądanych stężeń w buforze elucyjnym (tj. 50 ng/μL, 25 ng/μL lub 12,5 ng/μL). Te próbki o różnych stężeniach (200, 100, 50, 25, 12,5 ng) zapewniają, że sygnały będą występować w zakresie liniowym.
   UWAGA: Upewnij się, że przygotowałeś wystarczającą ilość próbki do kontrprób technicznych i biologicznych, a w przypadku różnych zabiegów RNazy, patrz Krok 5.
2. Przygotować dodatnio naładowaną membranę nylonową tak, aby na każdą próbkę o objętości 2 μl było miejsce na 0,5 cm2 powierzchni.
3. Umieść 2 μl każdej próbki na 2 błonach: jednej dla przeciwciała S9.6, a drugiej dla przeciwciała dsDNA. Alternatywnie można zastosować aparat dot-blot lub slot-blot, który umożliwia ładowanie próbek o większych objętościach.
4. Pozwolić, aby próbki nasyciły się w membranie. Odczekaj co najmniej 2 minuty przed sieciowaniem membrany światłem UV.
5. Umieść membranę w środku urządzenia UV i usieciuj membranę za pomocą środka sieciującego UV, korzystając z ustawienia "Auto Crosslink" (1,200 μJ x 100).

4. Hybrydowe wykrywanie RNA-DNA z przeciwciałem S9.6

1. Inkubować błonę w roztworze blokującym (5% mleka w soli fizjologicznej buforowanej Tris z 0,05% Tween-20 (TBST) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.
   UWAGA: Roztwór blokujący powinien być wystarczający do pokrycia membrany.
2. Inkubować błony przez noc w przeciwciałie pierwszorzędowym (w 5% mleku w TBST) w temperaturze 4 °C z wytrząsaniem. Dodać przeciwciało anty-dsDNA (rozcieńczenie 1:10 000) do jednej błony. Dodać 1 μg/ml przeciwciała S9.6 do drugiej błony (rozcieńczenie 1:1 000).
   UWAGA: Przeciwciało S9.6 jest dostępne w handlu lub w Dr. S. Leppla, NIAID, National Institutes of Health.
3. Usuń przeciwciało pierwotne i przemyj 3x TBST. Wykonuj każde pranie przez 5-10 minut z potrząsaniem w temperaturze pokojowej.
4. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP) (przeciwciało przeciw myszy, rozcieńczenie 1:5 000) w 5% mleku w TBST z wytrząsaniem w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Zarówno anty-dsDNA, jak i hybryda anty-RNA-DNA są przeciwciałami myszymi.
5. Usuń przeciwciało wtórne i przemyj 3x TBST przez 5-10 minut z wytrząsaniem w temperaturze pokojowej.
6. Wywoływanie za pomocą odczynników o wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) w celu uzyskania sygnałów do obrazowania.
7. Ilościowe określanie intensywności sygnału za pomocą standardowych narzędzi do przetwarzania obrazu, takich jak ImageJ.
   UWAGA: Rozwiązywanie problemów jest szczegółowo opisane w Tabeli 2.

5. Leczenie rybonukleazą w celu oceny specyficzności sygnału

UWAGA: Leczenie RNazą powinno być przeprowadzone na próbkach kwasów nukleinowych, aby wykazać specyficzność wiązania S9.6. Leczenie RNazą H, ale nie RNazą T1 lub RNazą III, powinno skutkować zmniejszeniem barwienia immunologicznego S9.6.

1. Próbki zawierające hybrydy RNA-DNA należy przetrawić, przygotowując je w czterech oddzielnych probówkach. Potraktuj każdą z 4 próbek za pomocą 5 U RNazy H, 1000 U RNazy T1, 0,5 U RNazy III lub próby. Próbki inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut w objętości 20 μl.
2. Umieścić 2 μl każdej próbki na membranie, jak opisano w sekcji 3.

6. Przygotowanie kontroli oligonukleotydów do oceny specyficzności sygnału

UWAGA: Kontrole oligonukleotydowe mogą być użyte do zademonstrowania specyficzności wiązania S9.6. S9.6 rozpoznaje hybrydy RNA-DNA, ale nie dsDNA lub kontrole dsRNA, jak wcześniej informowano³⁴.

1. Rozpuścić oligonukleotydy (Tabela 3) w buforze do wyżarzania (10 mM Tris, pH 8,0; 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) do 100 μM.
2. Przygotuj 4 probówki reakcyjne do
   1. Hybryda RNA-DNA #1: Wymieszaj 10 μl górnej nici ssRNA z 10 μl dolnej nici ssDNA i 80 μl buforu do wyżarzania.
   2. Hybryda RNA-DNA #2: Wymieszaj 10 μl górnej nici ssDNA z 10 μl dolnej nici ssRNA i 80 μl buforu do wyżarzania.
   3. dsRNA: Wymieszać 10 μl górnej nici ssRNA z 10 μl dolnej nici ssRNA i 80 μl buforu do wyżarzania.
   4. dsDNA: Wymieszaj 10 μl górnej nici ssDNA z 10 μl dolnej nici ssDNA i 80 μl buforu do wyżarzania.
3. Podgrzewać 4 mieszaniny z kroku 6.2 w temperaturze 95 °C przez 10 minut.
4. Pozwól rurkom powoli ostygnąć do temperatury pokojowej, aby umożliwić ponowne wyżarzanie pasm. Wyżarzone wzorce można przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania.
   UWAGA: Wydajność wyżarzania należy sprawdzić za pomocą elektroforezy żelowej bez denaturacji. Dupleksy migrują wolniej niż niewyżarzone oligonukleotydy (tabela 2).
5. Załadować 2 μl każdej próbki na dwie błony, jedną dla przeciwciała S9.6 i jedną dla przeciwciała dsDNA, jak opisano w sekcji 3.
6. Wykonaj czynności opisane w punkcie 4.

7. Kwantyfikacja i normalizacja intensywności sygnału pętli R S9.6 za pomocą ImageJ.

1. Zapisuj obrazy barwienia S9.6, dsDNA w formacie TIFF i analizuj je za pomocą oprogramowania ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).
2. Wybierz opcję odwrócenia obrazu (punkt menu Edycja | Odwrócić). Po odwróceniu każda kropka będzie widoczna jako biała na ciemnym tle.
3. Użyj narzędzia do zaznaczania owalnego obrazu, aby wybrać owal, który jest wystarczająco duży, aby otoczyć największą kropkę na obrazie.
4. Użyj menedżera ROI, aby dodać wybrany obszar do kwantyfikacji. Upewnij się, że opcje "Pokaż wszystko" i "Etykiety" są wybrane, aby można było wizualizować obszary zainteresowania.
5. Użyj tego samego owalnego obszaru zaznaczenia, który został użyty w kroku 7.3, aby dodać dodatkowe obszary zainteresowania wokół każdej kropki, która ma zostać określona ilościowo. Użyj skrótu Command + Shift + E, aby skopiować zaznaczony obszar z kroku 7.3 do każdej z kolejnych kropek.
6. Zmierz zintegrowane zagęszczenie każdego z obszarów zainteresowania.
7. Podziel intensywność sygnału S9.6 dla każdej próbki przez pomiar dsDNA, aby uzyskać stosunek sygnału S9.6 / dsDNA. Zweryfikuj wyniki, powtarzając eksperymenty (co najmniej trzykrotnie dla akwizycji sygnału S9.6 i dsDNA). Błąd standardowy średniej można obliczyć na podstawie stosunków sygnału S9.6/dsDNA.

Results

Leczenie enzymatyczne w celu oceny swoistości przeciwciała S9.6 (RNA-DNA).
Pierwotne fibroblasty ludzkiej skóry były uprawiane¹⁷. DNA z hybrydami RNA-DNA wyizolowano i określono ilościowo. Dwa μg próbek trawiono RNazą T1, RNazą H lub RNazą III przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Próbkę próbną przeanalizowano również w celu porównania z próbkami traktowanymi RNazą. Próbki (200, 100, 50, 25, 12,5 lub 6,25 ng) osuszono na dwóch różnych błonach, jak opisano w sekcji 3. Błony zostały usieciowane, zablokowane, a jedna z nich została zbadana przeciwciałem S9.6 (Figura 1A).

Wyniki pokazały, że sygnał S9.6 koreluje z obfitością załadowanej próbki. Leczenie RNazą H, ale nie RNazą T1 lub RNazą III, powoduje zmniejszenie barwienia S9.6.

Druga błona została zbadana za pomocą przeciwciała dsDNA (Rysunek 1B) w celu normalizacji. Obraz J został wykorzystany do analizy natężenia sygnału. Próbki o masie 50 ng wybrano do oceny ilościowej, ponieważ intensywność sygnału z przeciwciał S9.6 i dsDNA mieściła się w zakresie dynamicznym. Natężenia sygnału zostały znormalizowane do tych w próbkach próbnych. Dane są pokazane w Rysunek 2.

S9.6 dot-blot przeciwciała przy użyciu syntetycznych kontroli nukleotydów.
Aby ocenić swoistość przeciwciała S9.6, użyliśmy oligonukleotydów odpowiadających dsRNA, dsDNA i RNA-DNA, jak opisano w sekcji 6. Serię rozcieńczeń nukleotydów RNA-DNA, dsRNA i dsDNA przygotowano i osuszono na nylonowej membranie, jak opisano w sekcji 3. Błonę badano przeciwciałem S9.6 (Ryc. 3). Wyniki wykazały, że przeciwciało S9.6 wiąże się specyficznie z hybrydami RNA-DNA w sposób zależny od dawki i wykazywało minimalną reaktywność krzyżową z dsRNA i dsDNA.

Rysunek 1: Specyficzność S9.6 pokazana przez dot-blot załadowany kwasami nukleinowymi z ludzkich fibroblastów. Próbki kwasów nukleinowych z ludzkich fibroblastów poddano próbie lub potraktowano RNazą T1, RNazą H lub RNazą III, a następnie załadowano na membrany nylonowe w serii rozcieńczeń 200, 100, 50, 25, 12,5 i 6,25 ng na 2 μl kropki. Błony były następnie badane za pomocą przeciwciała S9.6 (A) lub przeciwciała dsDNA (B). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Kwantyfikacja barwienia S9.6 R-loop. 50 ng próbek z Rysunek 1 został wybrany do kwantyfikacji za pomocą ImageJ. Sygnał S9.6 podzielono przez intensywność sygnału dsDNA, a następnie znormalizowano do próbki próbnej zgodnie z krokami opisanymi w sekcji 7. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: S9.6 dot-blot przy użyciu kontroli oligonukleotydów. Przeciwciało S9.6 dot-blot przeciwko serii rozcieńczeń syntetycznych oligonukleotydów jako dsRNA, dsDNA lub hybryda RNA-DNA. S9.6 wiąże się specyficznie z hybrydami RNA-DNA w sposób zależny od dawki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

.

Bufor do lizy komórek	Na 10 ml	Na 200 ml	Końcowa konc.
Woda wolna od nukleaz	9 ml	180 ml	-
10% NP-40	0,5 ml	10 ml	0,5 %
2 mln KCl	0,4 ml	8 ml	80 mln
RURY 0,5 M (pH 8,0)	100uL	2 ml	5 mln
Bufor do lizy jądrowej	Na 10 ml	Na 200 ml	Końcowa konc.
Woda wolna od nukleaz	8,65 ml	173 ml	-
10% SDS	1 ml	20 ml	1 proc
1M Tris-HCl (pH 8,0)	0,25 ml	5 ml	25 mM
0,5 mln EDTA	100uL	2 ml	5 mM
Bufor elucyjny	Na 10 ml	Na 200 ml	Końcowa konc.
1M Tris-Cl, pH 8,5	0,1 ml	2 ml	10 mM
Woda wolna od nukleaz	9,9 ml	198 ml	-

Tabela 1. Przygotowanie

krok	problem	Możliwa przyczyna	rozwiązanie
Pytanie 1.9	N/a	Sprawdź frakcjonowanie komórek	Jakość separacji jądrowej i cytoplazmatycznej można ocenić, dodając standardowe koktajle inhibitorów proteazy do komórki i lizy jądrowej (Tabela 1). Frakcje cytoplazmatyczne i jądrowe można ocenić za pomocą analizy western blot w celu potwierdzenia odpowiedniego ograniczenia znakowania markerami cytoplazmatycznymi (na przykład GAPDH lub HSP90) we frakcjach cytoplazmatycznych i znakowania markerami jądrowymi (na przykład, HDAC1 lub histon H3) we frakcjach jądrowych. Udział zanieczyszczenia mitochondriów we frakcji jądrowej można ocenić za pomocą analizy qPCR z sondami specyficznymi dla mitochondrialnego DNA.
2.1	Próbka jest zbyt lepka	Numer komórki jest zbyt wysoki.	Zmniejsz DNA o połowę i kontynuuj krok sonikacji 2.1
2.12	Brak widocznego granulatu	Niewystarczająca ilość materiału wyjściowego lub strata podczas wydobycia.	Zacznij od początku, używając więcej komórek.
Pytanie 2.13	Niskie stężenie DNA
3.1	Za mało DNA do rozcieńczeń
3.4	Próbka nie zostanie nasycona przez membranę		Namocz membranę w 1x TBST. Poczekaj, aż nadmiar bufora wyschnie i zacznij od kroku 3.4
Rozdział 4.6	Wykryto niejednolity lub nakrapiany wzór		Dodać 0,1% dodecylosiarczanu sodu (SDS) do próbki i kontynuować w kroku 3.1
Rozdział 4.6	Kropki mają wygląd "pierścienia kawy"		Dodać 0,01% Sarkozylu do próbki i kontynuować od kroku 3.1
5.2	Kontrolka RNaseH nie wykazuje spadku sygnału	Trawienie rybonukleazą jest niepełne.	Zwiększ inkubację lub zwiększ stężenie enzymów.
6,5	Brak sygnału dla elementów sterujących oligo	Duplex nie został utworzony. Oligonukleotydy nie zostały prawidłowo wyżarzane.	Sprawdź proporcje oligonukleotydów i buforu do wyżarzania.
6,5	Sygnał S9.6 nie jest specyficzny dla hybryd	Partia przeciwciał S9.6 ma niespecyficzne wiązanie	Walidacja czułości i swoistości nowych partii przeciwciała S9.6 przy użyciu leczenia enzymami RNazy lub analizy syntetycznych oligonukleotydów.

Tabela 2: Rozwiązywanie problemów

ssRNA, górna nić	5'-UGGGCUCGUCCGGGAUAUGGGAACCACUGAUCCC-3'
ssDNA, górna nić	5'-TGGGGGCTCGTCCGGGATATGGGAACCACTGATCCC-3'
ssRNA, dolna nić	5'-GGGAUCAGUGGUUCCCAUAUCCCGGACGAGCCCCCA-3'
ssDNA, dolna nić	5'-GGGATCAGTGGTTCCCATATCCCGGACGAGCCCCCA-3'

Tabela 3. Kontroluj sekwencje oligonukleotydowe

Discussion

3-niciowe kwasy nukleinowe, pętle R, tworzą się na różnych etapach podczas cyklu życia RNA i coraz częściej regulują procesy komórkowe. Aby w pełni zrozumieć pętle R, niezbędne są niezawodne techniki wykrywania pętli R. W tym miejscu opisujemy podejście do badania obfitości pętli R przy użyciu przeciwciała S9.6 ^8,23,24. Metoda ta pozwala na szybką ocenę liczebności pętli R w próbkach komórek i kultur tkankowych. Nie wymaga specjalnego sprzętu, ani dużej ilości materiału wyjściowego. Zapewnia konkretne i powtarzalne wyniki przy użyciu kombinacji zabiegów RNazą.

Niektórzy zgłaszali obawy dotyczące swoistości przeciwciała S9.6. Podobnie jak w przypadku każdego odczynnika, może wystąpić zmienność między partiami z przeciwciałem S9.6. Nasz protokół obejmuje RNazę H, RNazę T1 i RNazę III w celu sprawdzenia specyficzności sygnału. Ponadto stosujemy syntetyczne oligonukleotydy, aby zapewnić swoistość każdej partii przeciwciała S9.6.

Biologia pętli R to rozwijająca się dziedzina; Opracowanie wiarygodnych metod wykrywania i kwantyfikacji, takich jak ta przedstawiona tutaj, ułatwi badania mechanistyczne w celu wyjaśnienia, kiedy tworzą się pętle R, jak są regulowane i co regulują. Przy odpowiednich kontrolach ten test punktowy jest prostą metodą badania przesiewowego pod kątem obfitości pętli R w warunkach klinicznych i badawczych.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Przeciwciało anty-dsDNA	Abcam	ab27156
Hybrydowe przeciwciało anty-RNA-DNA (S9.6)	Kerafast	ENH001
Sonikator Biorupter	Diagenode	UCD-200
EB Bufor	Qiagen	19086
EDTA (0,5M)	Invitrogen	AM9261
Nylonowa membrana Hybond N+	GE healthcare Life Nauki	RPN203B
KCl (2M)	Invitrogen	AM9640G
NP-40 (Igepal CA-630)	Sigma	I8896
PBS	Invitrogen	10010-023
Fenol:chloroform:alkohol izoamylowy	Invitrogen	15593031
PIPES (0,5M, pH 8,0)	VWR	AAJ61406-AE
Proteinaza K	Qiagen	19131
RNaza III	Invitrogen	AM2290
RNaza H	New England Biolabs	M0297
RNaza T1	ThermoFisher Sci.	EN0541
SDS (10%)	Invitrogen	15553027
octan sodu (3M, pH 5,2)	Invitrogen	AM9740
sól fizjologiczna buforowana trisem (10X)	Corning	46-012-CM
Tris-HCl (1M, pH 8,0)	KD Medical	RGF-3360
TrypLE	Invitrogen	12605010
Tween-20	Sigma	P9416
UV Stratalinker 2400		Stratagene Stratalinker 2400
Długopis znakujący Whatman	Sigma	WHA10499001