Artykuł metodologiczny

Analiza R-Loop za pomocą Dot-Blot

11.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62069

⸱

22 stycznia 2021

 ,  ,  , 
1Life Sciences Institute, University of Michigan, Ann Arbor, 2Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health, 3Department of Pediatrics, University of Michigan, Ann Arbor, 4Howard Hughes Medical Institute, 5Neurogenetics Branch, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje prostą metodę, która określa ilościowo R-loop, trójniciową strukturę kwasu nukleinowego, która składa się z hybrydy RNA-DNA i przemieszczonej nici DNA.

Streszczenie

Trójniciowa struktura kwasu nukleinowego, R-loop, jest coraz bardziej rozpoznawalna ze względu na swoją rolę w regulacji genów. Początkowo uważano, że pętle R są produktami ubocznymi transkrypcji; ale ostatnie odkrycia dotyczące mniejszej liczby pętli R w chorych komórkach jasno pokazały, że pętle R odgrywają funkcjonalne role w różnych komórkach ludzkich. Następnie ważne jest, aby zrozumieć rolę pętli R i sposób, w jaki komórki równoważą swoją liczebność. Wyzwaniem w tej dziedzinie jest kwantyfikacja pętli R, ponieważ większość prac opiera się na przeciwciałie monoklonalnym S9.6, którego swoistość dla hybryd RNA-DNA została zakwestionowana. Tutaj używamy dot-blot z przeciwciałem S9.6 do ilościowego określenia pętli R i pokazania czułości i swoistości tego testu z RNazą H, RNazą T1 i RNazą III, które rozszczepiają odpowiednio hybrydy RNA-DNA, jednoniciowe RNA i dwuniciowe RNA. Ta metoda jest wysoce powtarzalna, wykorzystuje ogólny sprzęt laboratoryjny i odczynniki, a wyniki dostarczają w ciągu dwóch dni. Test ten może być stosowany w warunkach badawczych i klinicznych do ilościowego określania pętli R i oceny wpływu mutacji w genach, takich jak senataksyna, na obfitość pętli R.

Wprowadzenie

Ten protokół dostarcza przewodnik krok po kroku do testu dot-blot, który pozwala na szybką ocenę porównawczą obfitości R-loop, trójniciowej struktury kwasu nukleinowego. Pętla R powstaje, gdy RNA atakuje dwuniciowy DNA, aby wygenerować hybrydę RNA-DNA i wypiera drugą nić DNA. Pętle R znajdują się na różnych etapach cyklu życia RNA. W kompleksie transkrypcyjnym powstający RNA jest syntetyzowany komplementarnie do matrycowego DNA, a nić niematrycowa jest przemieszczana. Krótka hybryda RNA-DNA (<10 pz) jest rozdzielona w celu uwolnienia powstającego RNA, aby mógł opuścić kompleks polimerazy RNA przez kanał wyjściowy1,2. Poza kompleksem transkrypcyjnym, powstające RNA jest blisko swojej matrycy DNA, która jest jeszcze nieznacznie rozwinięta po skopiowaniu, dzięki czemu RNA może rehybrydyzować ze swoim matrycowym DNA, tworząc R-loops3. Dodatkowo, pętle R mogą powstawać, gdy kompleksy replikacji i transkrypcji zderzają się4, oraz w transkrypcji antysensownej5. Biorąc pod uwagę wiele możliwości ich powstawania, pętle R nie są rzadkie i można je znaleźć w 3-5% ludzkiego genomu6, w zależności od statusu transkrypcji komórki. Pętle R znajdują się w promotorach genów7 i termination5 miejsc w mRNA oraz wzdłuż rybosomalnego RNA8, a także transferu RNA9. Pętle R znajdują się również w telomerowych regionach chromosomów.

R-loops odgrywają rolę regulacyjną. Regulują ekspresję genów, wpływając na transkrypcję w promotorach10,11, pośrednicząc w rekombinacji class-switch12 i ułatwiając edycję genomu w oparciu o CRISPR13,14,15. Podobnie jak w przypadku wielu zdarzeń komórkowych, obfitość pętli R jest ściśle miareczkowana; zbyt wiele lub zbyt mało pętli R wpływa na normalne funkcjonowanie komórki16,17. Pętle R są regulowane przez różne białka, w tym RNazę H, senataksynę i inne helikazy, które rozwijają hybrydy RNA-DNA18,19,20,21,22.

Aby monitorować obfitość pętli R, metody obejmujące cały genom najpierw wzbogacają dla pętli R przeciwciałem S9.68,23,24 lub z innymi nukleazami25 w tym RNase H10,26,27, a następnie ocenić liczbę wzbogaconych pętli R przez sekwencjonowanie. Wczesne wersje tych metod opartych na sekwencjonowaniu nie osiągnęły odpowiedniego pokrycia sekwencji, aby umożliwić precyzyjną ocenę ilościową, ale szybkie ulepszenie technologii sekwencjonowania umożliwia teraz analizę pętli R locus-by-locus. Techniki immunofluorescencji zostały również wykorzystane do ilościowego określenia i lokalizacji pętli R10,17. Metody te są kompleksowe, ale nie są praktyczne w wielu warunkach klinicznych lub jako wstępne oceny, ponieważ wymagają drogiego sprzętu i specjalistycznej analizy.

Potrzebna jest procedura, która może być wykonywana jednolicie we wszystkich laboratoriach w warunkach klinicznych. Dot-bloty zapewniają taką opcję, ponieważ można je przeprowadzić bez specjalnego sprzętu lub analizy obliczeniowej. Jako etap wstępny lub w warunkach klinicznych w celu oceny wpływu mutacji na pętle R, te kropki muszą dostarczyć czułych i specyficznych wyników. Tutaj opisujemy nasz test, który konkretnie identyfikuje pętle R; wyklucza sygnały z dwuniciowego (ds) DNA, dwuniciowego RNA i jednoniciowego RNA. Nasz protokół wykorzystuje przeciwciało S9.6 27 do identyfikacji hybryd RNA-DNA w pętlach R i zawiera RNazę H, endorybonukleazę, która rozszczepia się, a tym samym prowadzi do degradacji RNA w hybrydzie RNA-DNA20,28, aby zapewnić, że wykryte sygnały należą do hybryd. Dodaliśmy również RNazę T1, która rozszczepia jednoniciowy RNA na guaninie29,30, oraz RNazę III, która rozszczepia dwuniciowe RNA, w tym pętle macierzyste31,32, aby sprawdzić, czy nie ma niespecyficznych sygnałów. Przeciwciało S9.6 rozpoznaje hybrydy RNA-DNA o różnej długości, nawet te, które mają tylko 8 nukleotydów długości33.

Tutaj prezentujemy protokół, który zaczyna się od izolacji kwasu nukleinowego, następnie przygotowania dot-blot i wykrywania pętli R za pomocą przeciwciała S9.6. Nasz protokół zawiera kroki mające na celu zapewnienie, że załadowane są równe ilości próbek, a sygnały są specyficzne. Dostarcza oligonukleotydy, które służą jako kontrole pozytywne i negatywne. Jest to szybka, łatwa i przyjazna dla użytkownika metoda oceny obfitości pętli R.

Protokół

1. Liza komórek do frakcjonowania jądrowego

  1. Umyj komórki 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) dwukrotnie. Usuń komórki z naczyń do hodowli tkankowych przy użyciu standardowych technik dysocjacji komórek, takich jak trypsyna. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
    UWAGA: Kroki opisane poniżej zostały wykorzystane do analizy pierwotnych fibroblastów ludzkiej skóry, chociaż można oznaczyć szereg typów komórek. Fibroblasty hodowano w pożywkach podstawowych zawierających 10% płodowej surowicy bydlęcej. Alternatywnie, bufor do lizy komórek (Tabela 1) może być dodany bezpośrednio do kultury komórkowej po umyciu.
  2. Przenieś zawiesinę komórek do probówki o pojemności 1,5 ml w celu osadzenia komórek.
  3. Odwirować próbkę o masie 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zassać pożywkę.
  4. Umyj dwukrotnie lodowatym 1x PBS, używając ustawień wirowania w kroku 1.3.
  5. Dodać bufor do lizy zimnych komórek (Tabela 1) do osadu komórkowego (300 μL na 2 x 106 komórek). Pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić osad.
  6. Inkubować na lodzie przez 10 minut.
  7. Wirować w 500 x g przez 5 minut, aby otoczkować jądra.
  8. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad jądrowy w 400 μl zimnego buforu do lizy jądrowej (tabela 1).
  9. Inkubować na lodzie przez 10 min.
    UWAGA: Frakcjonowanie przedziałów jądrowych i cytoplazmatycznych komórek zapewnia specyficzność sygnału. Jakość separacji jądrowej i cytoplazmatycznej można ocenić przed kontynuowaniem (Tabela 2).
  10. Dodać 3 μl 20 mg/ml proteinazy K i inkubować przez 3-5 godzin w temperaturze 55 °C.
    UWAGA: Wskazane woluminy są przeznaczone dla komórek 2 x 106, w razie potrzeby skaluj w górę lub w dół.

2. Oczyszczanie genomowego DNA (w tym hybryd RNA-DNA)

  1. Jeśli DNA jest lepkie, należy przeprowadzić sonikację w celu zmniejszenia lepkości (np. sonikacja przy wysokiej mocy wyjściowej, 30 s ON / 30 s OFF, przez 2 minuty w łaźni wodnej o temperaturze 4 °C).
  2. Dodać 400 μl buforu elucyjnego (tabela 1) i 400 μl fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego (25:24:1 pH 8,0).
  3. Wir przez 10 s.
  4. Wirować z prędkością 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Przenieść fazę wodną (około 350 μl) do nowej probówki.
  6. Pobrać jednorazową ekstrakcję za pomocą 1 objętości chloroformu, wirować przez 10 s, a następnie wirować w temperaturze 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść fazę wodną do nowej probówki (około 300 μl).
  7. Dodać 35 μl 3 M octanu sodu (pH 5,2), 1 μl glikogenu i 700 μl lodowatego 100% etanolu.
  8. Wirować przez 10 s i wirować w dół przy 12 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  9. Umyj granulat 1 ml 70% etanolu.
  10. Wirować przez 10 s i wirować w dół przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  11. Odrzucić supernatant i pozostawić granulki do wyschnięcia.
  12. Dodać 12 μl buforu elucyjnego i wirować przez 10 sekund w celu ponownego zawieszenia. Inkubować próbkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C z mieszaniem lub w temperaturze 4 °C przez noc w celu ponownego zawieszenia osadu.
  13. Zmierzyć stężenie DNA za pomocą standardowej spektrofotometrii.
    UWAGA: Wskazane woluminy są przeznaczone dla komórek 2 x 106, w razie potrzeby skaluj w górę lub w dół. W razie potrzeby DNA (z hybrydami RNA-DNA) może być przechowywane w temperaturze -20 °C.

3. Plamienie próbek DNA (w tym hybryd RNA-DNA) na nylonowych membranach

  1. Przygotować rozcieńczenia kwasów nukleinowych do pożądanych stężeń w buforze elucyjnym (tj. 50 ng/μL, 25 ng/μL lub 12,5 ng/μL). Te próbki o różnych stężeniach (200, 100, 50, 25, 12,5 ng) zapewniają, że sygnały będą występować w zakresie liniowym.
    UWAGA: Upewnij się, że przygotowałeś wystarczającą ilość próbki do kontrprób technicznych i biologicznych, a w przypadku różnych zabiegów RNazy, patrz Krok 5.
  2. Przygotować dodatnio naładowaną membranę nylonową tak, aby na każdą próbkę o objętości 2 μl było miejsce na 0,5 cm2 powierzchni.
  3. Umieść 2 μl każdej próbki na 2 błonach: jednej dla przeciwciała S9.6, a drugiej dla przeciwciała dsDNA. Alternatywnie można zastosować aparat dot-blot lub slot-blot, który umożliwia ładowanie próbek o większych objętościach.
  4. Pozwolić, aby próbki nasyciły się w membranie. Odczekaj co najmniej 2 minuty przed sieciowaniem membrany światłem UV.
  5. Umieść membranę w środku urządzenia UV i usieciuj membranę za pomocą środka sieciującego UV, korzystając z ustawienia "Auto Crosslink" (1,200 μJ x 100).

4. Hybrydowe wykrywanie RNA-DNA z przeciwciałem S9.6

  1. Inkubować błonę w roztworze blokującym (5% mleka w soli fizjologicznej buforowanej Tris z 0,05% Tween-20 (TBST) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.
    UWAGA: Roztwór blokujący powinien być wystarczający do pokrycia membrany.
  2. Inkubować błony przez noc w przeciwciałie pierwszorzędowym (w 5% mleku w TBST) w temperaturze 4 °C z wytrząsaniem. Dodać przeciwciało anty-dsDNA (rozcieńczenie 1:10 000) do jednej błony. Dodać 1 μg/ml przeciwciała S9.6 do drugiej błony (rozcieńczenie 1:1 000).
    UWAGA: Przeciwciało S9.6 jest dostępne w handlu lub w Dr. S. Leppla, NIAID, National Institutes of Health.
  3. Usuń przeciwciało pierwotne i przemyj 3x TBST. Wykonuj każde pranie przez 5-10 minut z potrząsaniem w temperaturze pokojowej.
  4. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP) (przeciwciało przeciw myszy, rozcieńczenie 1:5 000) w 5% mleku w TBST z wytrząsaniem w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Zarówno anty-dsDNA, jak i hybryda anty-RNA-DNA są przeciwciałami myszymi.
  5. Usuń przeciwciało wtórne i przemyj 3x TBST przez 5-10 minut z wytrząsaniem w temperaturze pokojowej.
  6. Wywoływanie za pomocą odczynników o wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) w celu uzyskania sygnałów do obrazowania.
  7. Ilościowe określanie intensywności sygnału za pomocą standardowych narzędzi do przetwarzania obrazu, takich jak ImageJ.
    UWAGA: Rozwiązywanie problemów jest szczegółowo opisane w Tabeli 2.

5. Leczenie rybonukleazą w celu oceny specyficzności sygnału

UWAGA: Leczenie RNazą powinno być przeprowadzone na próbkach kwasów nukleinowych, aby wykazać specyficzność wiązania S9.6. Leczenie RNazą H, ale nie RNazą T1 lub RNazą III, powinno skutkować zmniejszeniem barwienia immunologicznego S9.6.

  1. Próbki zawierające hybrydy RNA-DNA należy przetrawić, przygotowując je w czterech oddzielnych probówkach. Potraktuj każdą z 4 próbek za pomocą 5 U RNazy H, 1000 U RNazy T1, 0,5 U RNazy III lub próby. Próbki inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut w objętości 20 μl.
  2. Umieścić 2 μl każdej próbki na membranie, jak opisano w sekcji 3.

6. Przygotowanie kontroli oligonukleotydów do oceny specyficzności sygnału

UWAGA: Kontrole oligonukleotydowe mogą być użyte do zademonstrowania specyficzności wiązania S9.6. S9.6 rozpoznaje hybrydy RNA-DNA, ale nie dsDNA lub kontrole dsRNA, jak wcześniej informowano34.

  1. Rozpuścić oligonukleotydy (Tabela 3) w buforze do wyżarzania (10 mM Tris, pH 8,0; 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) do 100 μM.
  2. Przygotuj 4 probówki reakcyjne do
    1. Hybryda RNA-DNA #1: Wymieszaj 10 μl górnej nici ssRNA z 10 μl dolnej nici ssDNA i 80 μl buforu do wyżarzania.
    2. Hybryda RNA-DNA #2: Wymieszaj 10 μl górnej nici ssDNA z 10 μl dolnej nici ssRNA i 80 μl buforu do wyżarzania.
    3. dsRNA: Wymieszać 10 μl górnej nici ssRNA z 10 μl dolnej nici ssRNA i 80 μl buforu do wyżarzania.
    4. dsDNA: Wymieszaj 10 μl górnej nici ssDNA z 10 μl dolnej nici ssDNA i 80 μl buforu do wyżarzania.
  3. Podgrzewać 4 mieszaniny z kroku 6.2 w temperaturze 95 °C przez 10 minut.
  4. Pozwól rurkom powoli ostygnąć do temperatury pokojowej, aby umożliwić ponowne wyżarzanie pasm. Wyżarzone wzorce można przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania.
    UWAGA: Wydajność wyżarzania należy sprawdzić za pomocą elektroforezy żelowej bez denaturacji. Dupleksy migrują wolniej niż niewyżarzone oligonukleotydy (tabela 2).
  5. Załadować 2 μl każdej próbki na dwie błony, jedną dla przeciwciała S9.6 i jedną dla przeciwciała dsDNA, jak opisano w sekcji 3.
  6. Wykonaj czynności opisane w punkcie 4.

7. Kwantyfikacja i normalizacja intensywności sygnału pętli R S9.6 za pomocą ImageJ.

  1. Zapisuj obrazy barwienia S9.6, dsDNA w formacie TIFF i analizuj je za pomocą oprogramowania ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).
  2. Wybierz opcję odwrócenia obrazu (punkt menu Edycja | Odwrócić). Po odwróceniu każda kropka będzie widoczna jako biała na ciemnym tle.
  3. Użyj narzędzia do zaznaczania owalnego obrazu, aby wybrać owal, który jest wystarczająco duży, aby otoczyć największą kropkę na obrazie.
  4. Użyj menedżera ROI, aby dodać wybrany obszar do kwantyfikacji. Upewnij się, że opcje "Pokaż wszystko" i "Etykiety" są wybrane, aby można było wizualizować obszary zainteresowania.
  5. Użyj tego samego owalnego obszaru zaznaczenia, który został użyty w kroku 7.3, aby dodać dodatkowe obszary zainteresowania wokół każdej kropki, która ma zostać określona ilościowo. Użyj skrótu Command + Shift + E, aby skopiować zaznaczony obszar z kroku 7.3 do każdej z kolejnych kropek.
  6. Zmierz zintegrowane zagęszczenie każdego z obszarów zainteresowania.
  7. Podziel intensywność sygnału S9.6 dla każdej próbki przez pomiar dsDNA, aby uzyskać stosunek sygnału S9.6 / dsDNA. Zweryfikuj wyniki, powtarzając eksperymenty (co najmniej trzykrotnie dla akwizycji sygnału S9.6 i dsDNA). Błąd standardowy średniej można obliczyć na podstawie stosunków sygnału S9.6/dsDNA.

Wyniki

Obróbka enzymatyczna w celu oceny swoistości przeciwciała S9.6 (RNA-DNA).
Hodowano pierwotne ludzkie fibroblasty skóry17. Wyizolowano i oznaczono ilość DNA zawierającego hybrydy RNA-DNA. Próbki o masie 2 µg trawiono RNazą T1, RNazą H lub RNazą III przez 15 min w temperaturze 37 °C. W celu porównania z próbkami traktowanymi RNazą przeanalizowano również próbkę kontrolną (mock). Próbki (200, 100, 50, 25, 12,5 lub 6,25 ng) przeniesiono na dwie różne membrany zgodnie z opisem w sekcji 3. Membrany poddano sieciowaniu i blokowaniu, a następnie jedną z nich inkubowano z przeciwciałem S9.6 (Rycina 1A).

Wyniki wykazały, że sygnał S9.6 koreluje z ilością naniesionej próbki. Traktowanie RNazą H, ale nie RNazą T1 ani RNazą III, prowadzi do zmniejszenia intensywności barwienia S9.6.

Drugą membranę poddano analizie z użyciem przeciwciała przeciwko dsDNA (Rysunek 1B) w celu normalizacji. Do analizy intensywności sygnałów wykorzystano program Image J. Do kwantyfikacji wybrano próbki zawierające 50 ng, ponieważ intensywności sygnałów z przeciwciał S9.6 i dsDNA mieściły się w zakresie dynamicznym. Intensywności sygnałów znormalizowano względem próbek kontrolnych (mock). Dane przedstawiono na Rysunku 2.

S9.6 dot-blot przeciwciał z wykorzystaniem syntetycznych kontroli nukleotydowych.
Aby ocenić swoistość przeciwciała S9.6, zastosowano oligonukleotydy odpowiadające dsRNA, dsDNA oraz hybrydom RNA-DNA, zgodnie z opisem w sekcji 6. Przygotowano serie rozcieńczeń nukleotydów RNA-DNA, dsRNA i dsDNA, a następnie przeniesiono je na membranę nylonową, jak opisano w sekcji 3. Membranę inkubowano z przeciwciałem S9.6 (Rycina 3). Wyniki wykazały, że przeciwciało S9.6 wiąże się swoiście z hybrydami RNA-DNA w sposób zależny od dawki i wykazuje minimalną reaktywność krzyżową z dsRNA i dsDNA.

Analiza dot blot hybryd RNA-DNA i dsDNA po traktowaniu RNazami; schemat wyników eksperymentalnych.
Rysunek 1: Specyficzność S9.6 wykazana w analizie dot-blot z nałożonymi kwasami nukleinowymi z ludzkich fibroblastów. Próbki kwasów nukleinowych z ludzkich fibroblastów poddano pozorowanemu traktowaniu (mock) lub traktowaniu RNazą T1, RNazą H lub RNazą III, a następnie nałożono na membrany nylonowe w serii rozcieńczeń 200, 100, 50, 25, 12,5 i 6,25 ng na kropkę o objętości 2 µL. Następnie membrany inkubowano z przeciwciałem S9.6 (A) lub przeciwciałem przeciwko dsDNA (B). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Wykres słupkowy przedstawiający wpływ RNazy na sygnał S9.6/dsDNA; analiza danych w porównaniu wpływu enzymu.
Rysunek 2: Ilościowe oznaczenie barwienia pętli R przeciwciałem S9.6. Próbki 50 ng z Rysunku 1 wybrano do analizy ilościowej z użyciem programu ImageJ. Sygnał S9.6 podzielono przez intensywność sygnału dsDNA, a następnie znormalizowano względem próbki kontrolnej (mock) zgodnie z krokami opisanymi w sekcji 7. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki elektroforezy; analiza stężenia dsRNA, dsDNA i hybrydy RNA/DNA; metoda dot blot.
Rycina 3: Dot-blot S9.6 z użyciem kontroli oligonukleotydowych. Dot-blot z użyciem przeciwciała S9.6 przeciwko serii rozcieńczeń syntetycznych oligonukleotydów jako dsRNA, dsDNA lub hybrydy RNA-DNA. S9.6 wiąże się specyficznie z hybrydami RNA-DNA w sposób zależny od dawki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Bufor do lizy komórekDla 10mLDla 200mLStężenie końcowe
Woda wolna od nukleaz9mL180mL-
10% NP-400.5mL10mL0.5%
2M KCl0.4mL8mL80mM
0.5M PIPES (pH 8.0)100uL2mL5mM
Bufor do lizy jąderDla 10mLDla 200mLStężenie końcowe
Woda wolna od nukleaz8.65mL173mL-
10% SDS1mL20mL1%
1M Tris-HCl (pH 8.0)0.25mL5mL25 mM
0.5M EDTA100uL2mL5 mM
Bufor do elucjiDla 10mLDla 200mLStężenie końcowe
1M Tris-Cl, pH 8.50.1 mL2 mL10 mM
Woda wolna od nukleaz9.9 mL198 mL-

Tabela 1. Przygotowanie buforów

KrokProblemMożliwa przyczynaRoztwór
1.9Nie dotyczyWeryfikacja frakcjonowania komórekJakość separacji frakcji jądrowej i cytoplazmatycznej można ocenić poprzez dodanie standardowych koktajli inhibitorów proteaz do buforów lizujących komórki i jądra (tabela 1). Frakcje cytoplazmatyczna i jądrowa mogą zostać poddane analizie metodą western blotting w celu potwierdzenia odpowiedniego ograniczenia sygnału markerów cytoplazmatycznych (np. GAPDH lub HSP90) do frakcji cytoplazmatycznej oraz markerów jądrowych (np. HDAC1 lub histony H3) do frakcji jądrowej. Stopień zanieczyszczenia frakcji jądrowej mitochondriami można ocenić za pomocą analizy qPCR z zastosowaniem sond specyficznych dla mtDNA. 
2.1Próbka jest zbyt lepkaLiczba komórek jest zbyt wysoka.Zmniejszyć ilość DNA o połowę i kontynuować etap sonikacji 2.1 
2.12Brak widocznego osaduNiewystarczająca ilość materiału wyjściowego lub straty podczas ekstrakcji.Zacznij od początku, używając większej liczby komórek. 
2.13Niskie stężenie DNA
3.1Niewystarczająca ilość DNA do rozcieńczeń
3.4Próbka nie nasyca membranyNamoczyć membranę w 1x TBST. Pozostawić do wyschnięcia nadmiaru buforu i przejść do kroku 3.4.
4.6Wykryto wzór plamisty lub nakrapianyDo próbki należy dodać 0,1% dodecylosiarczanu sodu (SDS), a następnie przejść do kroku 3.1.
4.6Kropki mają wygląd „pierścienia kawowego”Dodać 0,01% sarkozylu do próbki i kontynuować od kroku 3.1
5.2Kontrola RNaseH nie wykazuje spadku sygnałuTrawienie rybonukleazą jest niepełne.Wydłużyć czas inkubacji lub zwiększyć stężenie enzymu.
6.5Brak sygnału dla kontroli oligosowegoDupleks nie uległ sformowaniu. Oligonukleotydy nie zostały prawidłowo zdenaturowane.Zweryfikuj proporcje oligonukleotydów i buforu do wyżarzania.
6.5Sygnał S9.6 nie jest swoisty dla hybrydPartia przeciwciał S9.6 wykazuje nieswoiste wiązanieNależy zweryfikować czułość i swoistość nowych partii przeciwciał S9.6, wykorzystując do tego celu albo traktowanie enzymem RNazą, albo analizę syntetycznych oligonukleotydów.

Tabela 2: Rozwiązywanie problemów

ssRNA, nić górna5’-UGGGGGCUCGUCCGGGAUAUGGGAACCACUGAUCCC-3’
ssDNA, nić górna5’-TGGGGGCTCGTCCGGGATATGGGAACCACTGATCCC-3’
ssRNA, nić dolna5’-GGGAUCAGUGGUUCCCAUAUCCCGGACGAGCCCCCA-3’
ssDNA, nić dolna5’-GGGATCAGTGGTTCCCATATCCCGGACGAGCCCCCA-3’

Tabela 3. Sekwencje oligonukleotydów kontrolnych

Dyskusja

3-niciowe kwasy nukleinowe, pętle R, tworzą się na różnych etapach podczas cyklu życia RNA i coraz częściej regulują procesy komórkowe. Aby w pełni zrozumieć pętle R, niezbędne są niezawodne techniki wykrywania pętli R. W tym miejscu opisujemy podejście do badania obfitości pętli R przy użyciu przeciwciała S9.6 8,23,24. Metoda ta pozwala na szybką ocenę liczebności pętli R w próbkach komórek i kultur tkankowych. Nie wymaga specjalnego sprzętu, ani dużej ilości materiału wyjściowego. Zapewnia konkretne i powtarzalne wyniki przy użyciu kombinacji zabiegów RNazą.

Niektórzy zgłaszali obawy dotyczące swoistości przeciwciała S9.6. Podobnie jak w przypadku każdego odczynnika, może wystąpić zmienność między partiami z przeciwciałem S9.6. Nasz protokół obejmuje RNazę H, RNazę T1 i RNazę III w celu sprawdzenia specyficzności sygnału. Ponadto stosujemy syntetyczne oligonukleotydy, aby zapewnić swoistość każdej partii przeciwciała S9.6.

Biologia pętli R to rozwijająca się dziedzina; Opracowanie wiarygodnych metod wykrywania i kwantyfikacji, takich jak ta przedstawiona tutaj, ułatwi badania mechanistyczne w celu wyjaśnienia, kiedy tworzą się pętle R, jak są regulowane i co regulują. Przy odpowiednich kontrolach ten test punktowy jest prostą metodą badania przesiewowego pod kątem obfitości pętli R w warunkach klinicznych i badawczych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Instytut Medyczny Howarda Hughesa oraz Badania Wewnątrzuczelniane w Narodowym Instytucie Zaburzeń Neurologicznych i Udaru Mózgu.

Dziękujemy dr Stephenowi Leppla za dostarczenie partii przeciwciał S9.6 do analizy. Dziękujemy również dr Dongjun Li za pomoc w leczeniu rybonukleazą.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało anty-dsDNAAbcamab27156
Hybrydowe przeciwciało anty-RNA-DNA (S9.6)KerafastENH001
Sonikator BiorupterDiagenodeUCD-200
EB BuforQiagen19086
EDTA (0,5M)InvitrogenAM9261
Nylonowa membrana Hybond N+GE healthcare Life NaukiRPN203B
KCl (2M)InvitrogenAM9640G
NP-40 (Igepal CA-630)SigmaI8896
PBSInvitrogen10010-023
Fenol:chloroform:alkohol izoamylowyInvitrogen15593031
PIPES (0,5M, pH 8,0)VWRAAJ61406-AE
Proteinaza KQiagen19131
RNaza IIIInvitrogenAM2290
RNaza HNew England BiolabsM0297
RNaza T1ThermoFisher Sci.EN0541
SDS (10%)Invitrogen15553027
octan sodu (3M, pH 5,2)InvitrogenAM9740
sól fizjologiczna buforowana trisem (10X)Corning46-012-CM
Tris-HCl (1M, pH 8,0)KD MedicalRGF-3360
TrypLEInvitrogen12605010
Tween-20SigmaP9416
UV Stratalinker 2400Stratagene Stratalinker 2400
Długopis znakujący WhatmanSigmaWHA10499001

Bibliografia

  1. Daube, S. S., von Hippel, P. H. RNA displacement pathways during transcription from synthetic RNA-DNA bubble duplexes. Biochemistry. 33 (1), 340-347 (1994).
  2. Westover, K. D., Buschnell, D. A., Kornberg, R. D. Structural basis of transcription: separation of RNA from DNA by RNA polymerase II. Science. 303 (5660), 1014-1016 (2004).
  3. Itoh, T., Tomizawa, J. Formation of an RNA primer for initiation of replication of ColE1 DNA by ribonuclease H. Proceedings of the National Academy of Science USA. 77 (5), 2450-2454 (1980).
  4. Hamperl, S., Bocek, M. J., Saldivar, J. C., Swigut, T., Cimprich, K. A. Transcription-replication conflict orientation modulates R-loop levels and activates distinct DNA damage responses. Cell. 170 (4), 774-786 (2017).
  5. Skourti-Stathaki, K., Kamieniarz-Gdula, K., Proudfoot, N. J. R-loops induce repressive chromatin marks over mammalian gene terminators. Nature. 516 (7531), 436-439 (2014).
  6. Sanz, L. A., et al. conserved R-loop structures associate with specific epigenomic signatures in mammals. Molecular Cell. 63 (1), 167-178 (2016).
  7. Chen, L., et al. R-ChIP using inactive RNase H reveals dynamic coupling of R-loops with transcriptional pausing at gene promoters. Molecular Cell. 68 (4), 745-757 (2017).
  8. El Hage, A., French, S. L., Beyer, A. L., Tollervey, D. Loss of topoisomerase I leads to R-loop mediated transcriptional blocks during ribosomal RNA synthesis. Genes and Development. 24 (14), 1546-1558 (2010).
  9. Tran, P., et al. PIF1 family DNA helicases suppress R-loop mediated genome instability at tRNA genes. Nature Communication. 8, 15025(2017).
  10. Ginno, P. A., Lott, P. L., Christensen, H. C., Korf, I., Chedin, F. R-loop formation is a distinctive characteristic of unmethylated human CpG island promoters. Molecular Cell. 45 (6), 814-825 (2012).
  11. Colak, D., et al. Promoter-bound trinucleotide repeat mRNA drives epigenetic silencing in fragile X syndrome. Science. 343 (6174), 1002-1005 (2014).
  12. Yu, K., Chedin, F., Hsieh, C., Wilson, T. E., Lieber, M. R. R-loops at immunoglobulin class switch regions in the chromosomes of stimulated B cells. Nature Immunology. 4 (5), 442-451 (2003).
  13. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleotide complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Science USA. 109 (39), 2579-2586 (2012).
  14. Westra, E. R., et al. CRISPR immunity relies on the consecutive binding and degradation of negatively supercoiled invader DNA by Cascade and Cas3. Molecular Cell. 46 (5), 595-605 (2012).
  15. Jiang, F., et al. Structures of a CRISPR-Cas9 R-loop complex primed for DNA cleavage. Science. 351 (6275), 867-871 (2016).
  16. Huertas, P., Aguilera, A. Cotranscriptionally formed DNA:RNA hybrids mediate transcription elongation impairment and transcription-associated recombination. Molecular Cell. 12 (3), 711-721 (2003).
  17. Grunseich, C., et al. Senataxin mutation reveals how R-loops promote transcription by blocking DNA methylation at gene promoters. Molecular Cell. 69 (3), 426-437 (2018).
  18. Kim, H. D., Choe, J., Seo, Y. S. The sen1(+) gene of Schizosaccharomyces pombe, a homologue of budding yeast SEN1, encodes an RNA and DNA helicase. Biochemistry. 38 (44), 14697-14710 (1999).
  19. Stein, H., Hausen, P. Enzyme from calf thymus degrading the RNA moiety of DNA-RNA hybrids: effect on DNA-dependent RNA polymerase. Science. 166 (3903), 393-395 (1969).
  20. Cerritelli, S. M., Crouch, R. J. Ribonuclease H: the enzymes in eukaryotes. FEBS Journal. 276 (6), 1494-1505 (2009).
  21. Hyjek, M., Figiel, M., Nowotny, M. RNases H: Structure and mechanism. DNA Repair. 84, 102672(2019).
  22. Pohl, T. J., Zakian, V. A. Pif1 family DNA helicases: A helpmate to RNase H. DNA Repair. 84, 102633(2019).
  23. Pohjoismaki, J. L., et al. Mammalian mitochondrial DNA replication intermediates are essentially duplex but contain extensive tracts of RNA/DNA hybrid. Journal of Molecular Biology. 397 (5), 1144-1155 (2010).
  24. Sanz, L. A., Chedin, F. High-resolution, strand-specific R-loop mapping via S9.6-based DNA-RNA immunoprecipitation and high-throughput sequencing. Nature Protocols. 14 (6), 1734-1755 (2019).
  25. Wahba, L., Costantino, L., Tan, F. J., Zimmer, A., Koshland, D. S1-DRIP-seq identifies high expression and polyA tracts as major contributors to R-loop formation. Genes and Development. 30 (11), 1327-1338 (2016).
  26. Yan, Q., Shields, E. J., Bonasio, R., Sarma, K. Mapping native r-loops genome-wide using a targeted nuclease approach. Cell Reports. 29 (5), 1369-1380 (2019).
  27. Hu, Z., Zhang, A., Storz, G., Gottesman, S., Leppla, S. H. An antibody-based microarray assay for small RNA detection. Nucleic Acids Research. 34 (7), 52(2006).
  28. Nowotny, M., Gaidamakov, S. A., Crouch, R. J., Yang, W. Crystal structures of RNase H bound to an RNA/DNA hybrid: substrate specificity and metal-dependent catalysis. Cell. 121 (7), 1005-1016 (2005).
  29. Sato, K., Egami, F. Studies on ribonucleases in takadiastase. Journal of Biochemistry. 44 (11), Tokyo. 753-767 (1957).
  30. Takahashi, K., Moore, S. Ribonuclease T1. Enzymes. 15, 435-468 (1982).
  31. Dunn, J. J. RNase III cleavage of single-stranded RNA: Effect of ionic strength in the fidelity of cleavage. Journal of Biological Chemistry. 251 (12), 3807-3814 (1976).
  32. Pertzev, A., Nicholson, A. W. Characterization of RNA sequence determinants and antideterminants of processing reactivity for a minimal substrate of Escherichia coli ribonuclease III. Nucleic Acids Research. 34 (13), 3708-3721 (2006).
  33. Phillips, D. D., et al. The sub-nanomolar binding of DNA-RNA hybrids by the single chain Fv fragment of antibody S9.6. Journal of Molecular Recognition. 26 (8), 376-381 (2013).
  34. Haruki, M., Noguchi, E., Kanaya, S., Crouch, R. J. Kinetic and stoichiometric analysis for the binding of Escherichia coli ribonuclease H1 to RNA-DNA hybrids using surface plasmon resonance. Journal of Biological Chemistry. 272 (35), 22015-22022 (1997).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza typu dot blothybrydy RNA DNAprzeciwcia o S9 6kwantyfikacja p tli RRNaza HRNaza T1RNaza IIIregulacja gen wmutacja senataksyny
Film wkrótce dostępny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.