Mysi model przewlekłego zapalenia trzustki poprzez infuzję TNBS z dróg żółciowych

Podsumowanie

Przewlekłe zapalenie trzustki (CP) to choroba charakteryzująca się stanem zapalnym i zwłóknieniem trzustki, często związana z nieuleczalnym bólem brzucha. Ten artykuł koncentruje się na udoskonaleniu techniki generowania mysiego modelu CP poprzez infuzję dróg żółciowych z kwasem 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowym (TNBS).

Streszczenie

Przewlekłe zapalenie trzustki (CP) to złożona choroba obejmująca zapalenie i zwłóknienie trzustki, zanik gruczołów, bóle brzucha i inne objawy. Opracowano kilka modeli gryzoni do badania CP, z których model infuzji kwasu 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowego (TNBS) w drogach żółciowych odtwarza cechy bólu neuropatycznego obserwowanego w CP. Jednak wlew leku z dróg żółciowych u myszy jest technicznie trudny. Protokół ten demonstruje procedurę infuzji TNBS do dróg żółciowych w celu wytworzenia mysiego modelu CP. TNBS podawano do trzustki przez bańkę Vatera w dwunastnicy. Protokół ten zoptymalizował objętość leku, techniki chirurgiczne i postępowanie z lekiem podczas zabiegu. Myszy leczone TNBS wykazywały cechy CP odzwierciedlone w zmniejszeniu masy ciała i masy trzustki, zmianach w zachowaniach związanych z bólem i nieprawidłowej morfologii trzustki. Dzięki tej poprawie śmiertelność związana z wstrzyknięciem TNBS była minimalna. Procedura ta ma kluczowe znaczenie nie tylko w generowaniu modeli chorób trzustki, ale jest również przydatna w miejscowym dostarczaniu leków trzustkowych.

Wprowadzenie

Przewlekłe zapalenie trzustki (CP) jest przewlekłą chorobą zapalną charakteryzującą się zanikiem trzustki, zwłóknieniem, bólem brzucha i ostateczną utratą zarówno funkcji zewnątrzwydzielniczych, jak i hormonalnych¹. Obecne leczenie medyczne i chirurgiczne nie jest lecznicze, ale jest podejmowane w celu złagodzenia objawów, które są konsekwencją choroby: opornego na leczenie bólu brzucha, dysfunkcji endokrynologicznej i zewnątrzwydzielniczej. Dlatego pilnie potrzebne są skuteczniejsze metody leczenia². Modele zwierzęce stanowią niezbędne narzędzie do lepszego zrozumienia choroby i zbadania potencjalnych metod terapeutycznych³. Opracowano wiele mysich modeli CP, z których powszechnie stosuje się modele ceruleiny i/lub alkoholu. Wykazano, że ceruleina, oligopeptyd stymulujący wydzielanie trzustki, w sposób powtarzalny indukuje model CP obejmujący między innymi zanik trzustki, zwłóknienie⁴. Inny popularny model wykorzystuje seryjne wstrzyknięcia L-argininy, która powoduje niewydolność zewnątrzwydzielniczą podobną do obserwowanej u ludzi⁵. CP może być również wywołany przez całkowite lub częściowe podwiązanie przewodu trzustkowego, a także nadciśnienie w przewodzie trzustkowym^6,7. Pomimo różnorodności modeli zwierzęcych dostępnych dla MPD, żaden z tych modeli nie odtwarza skutecznie bólu brzucha doświadczanego przez pacjentów z MPD⁸.

Poprzednie badania wykazały, że miejscowe wstrzyknięcie kwasu 2,4,6 -trinitrobenzenosulfonowego (TNBS) do trzustki odwzorowuje uporczywy ból odczuwany przez pacjentów z CP^9,10,11. Myszy leczone TNBS wykazywały nadwrażliwość brzucha i zwiększone zachowania związane z bólem, a także "uogólnioną nadwrażliwość" na bolesne bodźce, zjawisko, które zaobserwowano u pacjentów z CP¹⁰. Oprócz dokładnego naśladowania bólu CP, model TNBS replikuje również inne patologiczne cechy ludzkiego stanu, takie jak zwłóknienie, naciekanie komórek jednojądrzastych i zastępowanie komórek groniastych tkanką tłuszczową^10,12. Jednak infuzja TNBS przez drogi żółciowe jest technicznie trudną procedurą u myszy, która może spowodować śmierć. O ile nam wiadomo, nie ma protokołu wizualnego, który pokazywałby, w jaki sposób przeprowadza się wlew do dróg żółciowych. W tym artykule demonstrujemy procedurę infuzji dróg żółciowych TNBS w celu wygenerowania mysiego modelu CP. Ta procedura pomoże wygenerować wartościowe modele zwierzęce do badania CP i innych chorób trzustki i może być wykorzystana do wprowadzania innych materiałów (np. wirusa, komórek) do trzustki¹³.

Protokół

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone za zgodą Instytucjonalnych Komitetów ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Medycznym Południowej Karoliny oraz Centrum Medycznego Ralpha H. Johnsona. W tym badaniu wykorzystano samce myszy C57BL/6J w wieku 8-10 tygodni. Myszy trzymano w standardowym cyklu 12 jasnych / 12 ciemnych z dostępem ad libitum do pożywienia i wody.

1. Przygotowanie roztworu TNBS do wstrzykiwań

1. Przygotuj 10% etanol w 0,9% soli fizjologicznej. Rozpuścić podstawowy TNBS (patrz tabela materiałów) w 10% etanolu do końcowego stężenia 7,5 mM, dodając 7,5 μl TNBS do 1 ml 10% etanolu.
   UWAGA: TNBS stanowi zagrożenie chemiczne. Przygotuj roztwór pod wyciągiem i używaj środków ochrony osobistej, takich jak rękawice, okulary i fartuch laboratoryjny, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu z TNBS.
2. Załaduj 50 μl 0,75% roztworu TNBS do strzykawki insulinowej z igłą o rozmiarze 31. Załadować 50 μl 10% etanolu w soli fizjologicznej do strzykawki o tym samym rozmiarze, co układ sterowania pojazdu. Umieścić strzykawki na lodzie i chronić je przed światłem do czasu, gdy będą potrzebne.

2. Przygotowanie i operacja myszy

1. Ogolić włosy z obszaru chirurgicznego jamy brzusznej.
2. Należy wstrzyknąć jedną dawkę zapobiegawczą leku przeciwbólowego (np. buprenorfiny 0,1 mg/kg i.p.) przed zabiegiem chirurgicznym.
3. Indukuj i utrzymuj mysz w znieczuleniu ogólnym za pomocą 1,5-2% izofluranu i 1 l/min tlenu. Potwierdź znieczulenie, szczypiąc palce u nóg i obserwując zwierzę pod kątem braku odruchu.
4. Umieść mysz na podgrzewanej podkładce chirurgicznej podczas operacji. Nałóż maść weterynaryjną na każde oko, gdy mysz jest pod narkozą.
5. Zdezynfekuj pole operowane, przecierając pole operacyjne 3x 2% jodem, a następnie 70% alkoholem (tabela materiałów).
6. Wykonaj laparotomię mikronożyczkami, aby wygenerować nacięcie o długości 0,5-1 cm.
7. Delikatnie odsłoń dwunastnicę i zlokalizuj wspólny przewód żółciowy za pomocą bawełnianych wacików (tabela materiałów).
8. Umieść prosty mikroklips hemo (tabela materiałów) na bliższym wspólnym przewodzie, aby zapobiec przepływowi TNBS lub roztworów nośnika do wątroby i pęcherzyka żółciowego (Rysunek 1A, B).
9. Delikatnie odsłonić dwunastnicę i wprowadzić igłę do przewodu trzustkowego przez brodawkę Vatera.
10. Gdy igła znajdzie się w kanaliku, umieść zakrzywiony mikroklips do hemo (Tabela materiałów) nad dwunastnicą otaczającą igłę (Rysunek 1A), aby zabezpieczyć igłę na miejscu i zapobiec przedostawaniu się wstrzykniętego roztworu do dwunastnicy.
11. Stopniowo wstrzykiwać roztwór (TNBS lub nośnik) do przewodu trzustkowego w ciągu jednej minuty.
    UWAGA: TNBS należy podawać powoli przez jedną minutę i łatwo jest kontrolować prędkość infuzji, gdy trzustka jest perfundowana za pomocą strzykawki insulinowej z igłą 5/16 cala i igłą 31G. Trzymaj rękę tak stabilnie, jak to możliwe, aby uniknąć nakłucia przewodu żółciowego. Jeśli TNBS zostanie pomyślnie wstrzyknięty, wewnątrz trzustki może być widoczny żółty kolor.
12. Po infuzji ostrożnie zdejmij mikrozacisk w pobliżu wątroby, a następnie usuń mikrozacisk przytrzymujący igłę i dwunastnicę.
13. Ostrożnie przywróć dwunastnicę do pierwotnej pozycji.
14. Pozostaw 0,5 ml ciepłej sterylnej soli fizjologicznej (36-37 °C) w jamie brzusznej przed zamknięciem, aby pomóc dwunastnicy powrócić do pierwotnej pozycji i pomóc w odzyskaniu perystaltyki.
15. Zamknij nacięcie w warstwie mięśniowej za pomocą ciągłego szwu 5-0. Zamknij skórę za pomocą przerywanego szwu ze szwem 4-0.
16. Umieść klatkę zawierającą myszy na poduszce grzewczej, aby umożliwić powrót do zdrowia po znieczuleniu.
17. Upewnij się, że myszy są ciepłe i zdolne do spontanicznych ruchów przed powrotem do pomieszczenia trzymania.
18. Kontynuuj podawanie leku przeciwbólowego (np. buprenorfiny 0,1 mg/kg domięśniowo) co 12 godzin i dodatkowego ogrzewania przez 48 godzin po zabiegu.

3. Monitorowanie zachowania myszy

1. Usuń szwy w 7 dniu po operacji.
2. Monitoruj zdrowie i zachowanie myszy codziennie w pierwszym tygodniu po operacji. Zwracaj uwagę na oznaki niepokoju, takie jak wokalizowanie, zgarbiona postawa pleców lub zmniejszona lokomocja. Mierz masę ciała co drugi dzień.
3. Użyj monofili von Freya (VFFs) do pomiaru nadwrażliwości mechanicznej brzucha przed i 2, 3 tygodnie po operacji zgodnie z opisem^9,14.
   1. Zastosuj VFF o różnych przyłożonych siłach w kolejności rosnącej do górnej części brzucha 10 razy co 1-2 s. Rozważ podnoszenie, cofanie lub lizanie brzucha (reakcja wycofania) jako pozytywną reakcję.
   2. Zastosuj silniejszy bodziec, jeśli nie zaobserwuje się pozytywnej odpowiedzi, i słabszy bodziec, jeśli zaobserwuje się pozytywną reakcję. Próg wycofania to siła, przy której mysz reaguje w 50% przypadków.

4. Pobieranie i analiza histologiczna tkanki trzustki

1. Poświęć myszy pod narkozą przez zwichnięcie szyjki macicy i ostrożnie wypreparuj trzustkę z jelita i innych narządów.
2. Utrwal trzustkę w 10% paraformaldehydzie na 24 godziny, zanurz w parafinie, wytnij skrawki tkanki o grubości 5 μm i umieść je na szkiełkach w celu barwienia.
3. Wykonaj barwienie hematoksyliny-eozyny i trichromu Massona przy użyciu standardowych metod, jak wcześniej podano⁴.

Wyniki

Procedury wlewu do przewodu żółciowego zostały zoptymalizowane w celu zmniejszenia śmiertelności myszy związanej z tym zabiegiem¹⁰. TNBS podawano początkowo w całkowitej objętości 35 μL lub 50 μL. Wstrzyknięcie TNBS w objętości 50 μL pozwalało objąć całą trzustkę i indukowało bardziej jednorodny fenotyp choroby (Rycina 1B). Ponadto zastosowanie strzykawki insulinowej z igłą 31G pozwalało na lepszą kontrolę szybkości wlewu w porównaniu ze standardowymi strzykawkami i r...

Dyskusja

Wlew TNBS do przewodu żółciowego w celu wywołania przewlekłego zapalenia trzustki jest technicznie trudny u myszy, ponieważ do 22,5% myszy może umrzeć w ciągu 3-4 dni od infuzji leku¹⁰. W tym przypadku raport ten udoskonalił procedurę w oparciu o wcześniejsze badania i zmniejszył wczesną śmiertelność myszy do <10%. Na przykład zwiększona objętość leku (z 35 μl do 50 μl) może zapewnić, że leki dotrą do całej trzustki. Używanie strzykawki insulinowej i igły o mniejszym rozmiarze (31G) zmniejsza pote...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10% neutralna buforowana formalina v/v	Fisher Scientific	23426796
Wkładki nasączone alkoholem, sterylne	Fisher Scientific	22-363-750
System znieczulenia zwierząt	VetEquip, Inc.
Chlorowodorek buprenorfiny, do wstrzykiwań	Par Sterile Products, LLC	NDC 42023-179-05
Probówki wirówkowe, 15 ml	Fisher Scientific	0553859A
Etanol, absolutny (200 proof), klasa biologii molekularnej	Fisher Scientific	BP2818500
Bardzo drobne nożyczki do mikro preparacji 4" proste, ostre	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5882
Kleszcze Graefe 4-calowa bardzo delikatna końcówka	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5136
Podgrzewana podkładka	Amazon	B07HMKMBKM
Uchwyt igły Hegar-Baumgartner 5,25 "	Narzędzie chirurgiczne Roboz Co.	RS-7850
Strzykawka insulinowa z igłą o rozmiarze 31 BD		324909
Podkładki do przygotowania jodu	Fisher Scientific	19-027048
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
Mikroklips do nakładania kleszczy 5,5 "	Narzędzie chirurgiczne Roboz Co.	RS-5410
Mikro klips, prosty, mocny, zakrzywiony 1x6mm	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5433
Mikroklips, prosty, szerokość klipsa 0,75 mm	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5420
Roztwór kwasu pikrylosulfonowego, TNBS, 1M w H2O	Millipore Sigma	92822-1ML
Szew polipropylenowy 4-0	Med-Vet International	MV-8683
Szew polipropylenowy 5-0	Med-Vet International	MV-8661
Chlorek sodu, 0,9% roztwór dożylny	VWR	2B1322Q
Obłożnik chirurgiczny, sterylny	Med-Vet International	DR1826
Kaseta na tkanki	Fisher Scientific	22-272416
Włókna Von Frey	Bioseb	EB2-VFF

901806