Mikrodysekcja laserowa na tkankach chirurgicznych w celu identyfikacji nieprawidłowej ekspresji genów w upośledzonym gojeniu się ran w cukrzycy typu 2

Podsumowanie

Ta technika dostarcza przewodnika do zadawania ran ex vivo, przeprowadzania mikrodysekcji laserowej i ilościowego określania zmian w ekspresji genów związanych ze słabymi procesami gojenia się ran w cukrzycy przy użyciu klinicznie istotnych tkanek ludzkich.

Streszczenie

Globalne rozpowszechnienie cukrzycy typu 2 (T2DM) nasila się w szybkim tempie. Pacjenci z cukrzycą typu 2 cierpią z powodu wielu powikłań, a jednym z nich jest upośledzenie gojenia się ran. Może to prowadzić do rozwoju niegojących się owrzodzeń lub owrzodzeń stóp, a ostatecznie do amputacji. U zdrowych osób gojenie się ran następuje po kontrolowanej i nakładającej się na siebie sekwencji zdarzeń obejmujących stan zapalny, proliferację i przebudowę. W cukrzycy typu 2 co najmniej jeden z tych etapów staje się dysfunkcyjny. Obecne modele do badania upośledzonego gojenia się ran w cukrzycy typu 2 obejmują testy ran in vitro, odpowiedniki skórne lub modele zwierzęce w celu zbadania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw gojenia się ran i/lub potencjalnych opcji terapeutycznych. Nie oddają one jednak w pełni złożonego procesu gojenia się ran u pacjentów z cukrzycą typu 2, a testy skórne ex vivo na ludziach są problematyczne ze względu na etykę pobierania biopsji dziurkowej od pacjentów, o których wiadomo, że będą się słabo goić. W tym miejscu opisano technikę, za pomocą której profile ekspresji określonych komórek zaangażowanych w (dys)funkcjonalną odpowiedź na gojenie się ran u pacjentów z cukrzycą typu 2 można badać przy użyciu nadmiaru tkanki odrzuconej po amputacji lub planowej operacji plastycznej. W tym protokole próbki skóry od dawcy są pobierane, ranione, hodowane ex vivo w granicy faz cieczy, utrwalane w różnych punktach czasowych i dzielone na sekcje. Określone typy komórek biorących udział w gojeniu się ran (np. keratynocyty naskórka, fibroblasty skóry (brodawkowate i siateczkowate), naczynia krwionośne) izoluje się za pomocą mikrodysekcji laserowej, a różnice w ekspresji genów analizuje się za pomocą sekwencjonowania lub mikromacierzy, a interesujące geny są dalej walidowane za pomocą qPCR. Protokół ten może być wykorzystany do identyfikacji nieodłącznych różnic w ekspresji genów zarówno między słabo gojącą się, jak i nienaruszoną skórą, u pacjentów z cukrzycą lub bez cukrzycy, przy użyciu tkanek zwykle odrzucanych po operacji. Pozwoli to lepiej zrozumieć mechanizmy molekularne przyczyniające się do przewlekłych ran spowodowanych cukrzycą typu 2 i utraty kończyn dolnych.

Wprowadzenie

Częstość występowania cukrzycy typu 2 rośnie na całym świecie, napędzana przez epidemię otyłości i brak aktywności fizycznej. Słabe gojenie się ran jest powszechne u tych pacjentów i do 25% pacjentów rozwija przewlekłą, niegojącą się ranę¹. Mechanizmy leżące u podstaw tego zjawiska są złożone i nie do końca poznane, co ogranicza tempo odkrywania nowych środków terapeutycznych. Jednym z czynników przyczyniających się do tego jest brak odpowiedniego modelu do badania gojenia się ran u pacjentów z cukrzycą typu 2. W związku z tym celem tej metody jest dostarczenie fizjologicznie istotnego modelu ex vivo do badania gojenia się ran u osób zagrożonych ranami przewlekłymi, co pozwoli na analizę transkryptomiczną w celu postępu w identyfikacji nowych celów terapeutycznych.

Obecnie dostępnych jest wiele modeli do badania gojenia się ran, a każdy z nich ma swoje mocne i słabe strony. Modele zwierzęce in vivo, takie jak db/db mouse² lub szczury z cukrzycą indukowaną streptozotocyną³ są szeroko stosowane; Jednak rany w modelach gryzoni goją się poprzez skurcz, który bardzo różni się od mechanizmu zastosowanego w ludzkim ciele i mają ograniczony sukces w translacji do badań klinicznych^4,5. Korzyści płynące z używania tkanek ludzkich są dobrze znane⁴, ale są skomplikowane ze względu na etykę zadawania eksperymentalnych ran osobom, o których już wiadomo, że mają upośledzoną reakcję na gojenie się ran. W związku z tym badania na ludziach z cukrzycą są częściej ukierunkowane na odpowiedź zapalną niż eksperymentowanie na wyciętej tkance⁶. Dostępne są również Organ-on-a-chip⁷ oraz modele sztucznej skóry⁸. Mają one tę zaletę, że są w stanie analizować wkład komórek ludzkich, ale dają niewiele wskazówek na temat zmienności między pacjentami. W związku z tym klinicznie istotne modele do badania postępów w gojeniu się ran w wrażliwych populacjach pacjentów mogą przyspieszyć zrozumienie mechanizmów i odkrywanie leków w tej dziedzinie.

Opisany poniżej protokół leczenia ran ex vivo jest zaadaptowany z Stojadinovic i Tomic-Canic, 2013⁹. Nadaje się do badania danych transkrypcyjnych z kontrolowanych zranień próbek tkanek ludzkich ex vivo i może być stosowany do próbek klinicznych od pacjentów ze słabym gojeniem się ran (np. cukrzyca typu 2, osoby starsze), w celu pogłębienia wiedzy na temat wpływu gojenia się ran w tych stanach i potencjalnie, jak można je przywrócić.

Protokół

Ten protokół opiera się na dostarczaniu ludzkiej tkanki chirurgicznej. Aprobata etyczna i świadoma zgoda pacjenta zostały uzyskane przed eksperymentem, a badanie było zgodne z zasadami określonymi w Deklaracji Helsińskiej.

1. Pobieranie tkanek i ranienie ex vivo

1. Zbierz tkankę chirurgiczną po amputacji/operacji kończyny do sterylnego pojemnika zawierającego Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) z 5% penicyliny-streptomycyny-fungizone, 2 mM L-glutaminy i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS; kompletna pożywka wzrostowa).
   UWAGA: Tkanka pobrana w ten sposób może być przechowywana w temperaturze 4 °C do 24 godzin przed eksperymentem. Aby zapewnić żywotność tkanki do eksperymentów ex vivo, zaleca się jak najszybsze przetworzenie tkanki lub utrzymanie stałego odstępu czasu między pobraniem a zranieniem w celu standaryzacji doświadczeń w wielu dawstwach tkanek. Jeśli tkanka ma być przechowywana przez dowolny okres czasu, do próbki należy dodać roztwór stabilizujący RNA, aby zachować integralność RNA.
2. Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś tkankę na szalkę Petriego o średnicy 60 mm wypełnioną sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) uzupełnionym 5% penicyliną-streptomycyną-fungizonem. Odetnij tłuszcz ze skóry właściwej za pomocą sterylnego skalpela i/lub nożyczek chirurgicznych i wyrzuć. Przenieś tkankę na świeżą szalkę Petriego wypełnioną sterylnym PBS.
3. Połącz ze sobą dwa sterylne ostrza tak, aby między nimi była szczelina 1 mm. Zaznacz dwie równoległe linie liniowe, oddalone od siebie o ~1 mm, na całej długości naskórka i górnej części brodawkowatej skóry właściwej^10,11.
4. Usuń naskórek między liniami nacięć za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek chirurgicznych, aby utworzyć liniową ranę.
5. Za pomocą skalpela pociąć tkankę na małe prostokąty (maksymalny rozmiar 1^cm2) obejmujące ranę z nienaruszonym naskórkiem po obu stronach.
   UWAGA: Aby zachować integralność tkanki i późniejszej integralności RNA, kroki 1.2-1.5 należy przeprowadzić tak szybko, jak to możliwe.
6. Wykonaj zdjęcie zranionej tkanki za pomocą mikroskopu mikrodystrekcyjnego przy 4-krotnym powiększeniu, upewniając się, że pole widzenia obejmuje całą ranę i otaczającą ją nienaruszoną tkankę naskórka.
7. Za pomocą sterylnych kleszczy umieść prostokąty tkanek na wkładce do hodowli tkankowej na 6-dołkowej płytce i delikatnie odpipetuj 2 ml kompletnej pożywki wzrostowej do dołka. Zapewni to, że próbka zostanie wyhodowana na granicy faz ciecz-powietrze.
8. Inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ w powietrzu do 120 h.
   UWAGA: Tkankę należy zobrazować pod mikroskopem mikrodyparacyjnym w takim samym powiększeniu, jak w kroku 1.6 pod koniec inkubacji. W razie potrzeby zdjęcia mogą być również wykonywane co 24 godziny.

2. Utrwalanie tkanek i kriosekcja

1. Snap zamrozić tkankę w ciekłym azocie. Umieść niewielką ilość środka tnącego kompatybilnego z kriostatem na uchwycie kriostatycznym i zanurz w nim tkankę. Ustaw tkankę prostopadle do uchwytu tak, aby powierzchnia tnąca przecięła wszystkie warstwy skóry, w tym zraniony obszar. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
   UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
2. Wyczyść kriostat w temperaturze pokojowej za pomocą 70% etanolu i sprayu do odkażania RNazy. Ustawić temperaturę kriostatu na -28 °C.
3. Sprawdź, czy orientacja uchwytu i ostrza kriostatu może wytworzyć sekcje obejmujące całą grubość tkanki, w tym zranioną tkankę i leżącą pod nią skórę właściwą.
4. Za pomocą kriostatu wytnij do dziesięciu odcinków o wielkości 7 μm z każdej rany i umieść je na szkiełkach mikrodysekcyjnych bez RNA.
5. Przechowuj szkiełka w oryginalnym pudełku, w którym dostarczono szkiełka do mikrodysekcji, w temperaturze -80 °C, aby zapewnić środowisko wolne od RNaz.
   UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać, ale należy pamiętać, że degradacja RNA będzie się nasilać, im dłuższy jest czas przechowywania.

3. Mikrodysekcja przechwytywania laserowego

1. Umieść szkiełka do mikrodysekcji z sekcją tkankową w suchym lodzie i przejdź do pomieszczenia mikroskopu mikrodystrekcyjnego z wychwytem laserowym.
2. Wysuszyć na powietrzu 1. szkiełko i szybko przystąpić do barwienia skrawków hematoksyliną za pomocą zestawu do barwienia hematoksyliny i eozyny bez RNaz bezpośrednio przed wykonaniem mikrodysekcji laserowej.
3. Wizualizuj zranioną tkankę za pomocą mikroskopu mikrodystrekcyjnego przechwytywania laserowego przy 10-krotnym powiększeniu i zrób zdjęcie obszaru zainteresowania, który zostanie uchwycony laserowo.
4. Obrysuj wokół tego obszaru (na przykład język nabłonkowy, tkanka ziarninowa, mikronaczynia) i zbierz do mikrodyfuzora 0,5 ml nasadki izolacyjne, korzystając z instrukcji oprogramowania dla konkretnego używanego mikroskopu.
5. Ponownie wizualizuj i zobrazuj obszar zainteresowania przechwycony laserowo za pomocą mikroskopu mikrodystrekcyjnego z wychwytem laserowym przy 10-krotnym powiększeniu, aby zademonstrować lokalizację i całkowite wycięcie wypreparowanej tkanki.
   UWAGA: Wykonaj przechwytywanie laserowe dla każdej próbki (do 10 sekcji) przez maksymalny czas 1 godziny, aby zminimalizować degradację RNA.
6. Dodaj bufor do przechowywania RNA do probówki zawierającej mikrowypreparowaną tkankę zgodnie z instrukcjami producenta i przechowuj w suchym lodzie, aż będzie można go przenieść do zamrażarki o temperaturze -80^°C.
   UWAGA: W tym miejscu protokół może zostać tymczasowo wstrzymany.

4. Kwantyfikacja różnicowej ekspresji genów

1. Odwirować probówki z próbkami z pełną prędkością przez 1 minutę.
2. Wyizoluj RNA z mikrowypreparowanej tkanki zgodnie z instrukcjami producenta.
3. Eluować RNA w końcowej objętości 12 μl wody wolnej od RNaz i amplifikować RNA za pomocą zestawu do amplifikacji RNA i termocyklera, zgodnie z instrukcjami producenta. Zalecane są dwie rundy amplifikacji, aby zapewnić wystarczającą ilość RNA do dalszej analizy. Należy użyć warunków amplifikacji podanych w tabeli 1.

.

Pierwsza runda amplifikacji			Druga runda poprawek
Synteza pierwszej nici			Synteza pierwszej nici
krok	temperatura	Godzina	krok	temperatura	Godzina
1	65 °C	Czas trwania: 5 min	1	65 °C	Czas trwania: 5 min
cyfra arabska	4 °C	trzymać	cyfra arabska	4 °C	trzymać
3	42 °C	Czas trwania: 45 min	3	25 °C	Czas trwania: 10 min
4	4 °C	trzymać	4	37 °C	Czas trwania: 45 min
5	37 °C	Czas trwania: 20 min	5	4 °C	trzymać
6	95 °C	Czas trwania: 5 min
7	4 °C	trzymać	Synteza drugiej nici
			krok	temperatura	Godzina
Synteza drugiej nici			1	95 °C	Czas trwania: 2 min
krok	temperatura	Godzina	cyfra arabska	4 °C	trzymać
1	95 °C	Czas trwania: 2 min	3	37 °C	15
cyfra arabska	4 °C	trzymać	4	70 °C	Czas trwania: 5 min
3	25 °C	Czas trwania: 5 min	5	4 °C	trzymać
4	37 °C	Czas trwania: 10 min
5	70 °C	Czas trwania: 5 min	Transkrypcja in vitro
6	4 °C	trzymać	krok	temperatura	Godzina
			1	42 °C	6 godzin
Transkrypcja in vitro			cyfra arabska	4 °C	trzymać
krok	temperatura	Godzina	3	37 °C	Czas trwania: 15 min
1	42 °C	3 godz	4	4 °C	trzymać
cyfra arabska	4 °C	trzymać
3	37 °C	Czas trwania: 15 min
4	4 °C	trzymać

Tabela 1: Warunki wzmocnienia.

4. Określ ilościowo stężenie i czystość amplifikowanego RNA. Współczynniki absorbancji A260/230 (czystość) i A260/280 (zanieczyszczenia) > 1,8 są odpowiednie do dalszej analizy.
   UWAGA: Oczyszczone amplifikowane RNA może być używane do ukierunkowanych badań ekspresji genów (kroki 4.5-4.6) lub może być wysłane do analizy mikromacierzy.
5. Zsyntetyzuj cDNA za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności zgodnie z instrukcjami producenta. Reprezentatywne warunki są następujące:
   • 25 °C przez 10 min
   • 37 °C przez 2 h
   • 85 °C przez 5 min
   • Zatrzymanie w 4 °C
6. Wykonaj ilościową reakcję PCR przy użyciu 0,5 μl cDNA i 1 μM starterów (interesującego genu) zgodnie z instrukcjami producenta. Reprezentatywne warunki i sekwencje starterów są następujące.
   1. Dla ilościowych warunków PCR należy stosować następujące warunki: 95 °C przez 10 minut; 40 cykli w temperaturze 95°C przez 15 s i 62°C przez 1 minutę; 95 °C przez 5 minut i utrzymywać w 4°C.
   2. Użyj następujących sekwencji starterów:
      GAPDH
      Naprzód 5'-TATAAATTGAGCCCGCAGCC-3'
      Rewers 5'-CGACCAAATCCGTTGACTCC-3'
      
      KRT17
      Naprzód 5'-AGGGAGAGGATGCCCACCTG-3'
      Odwrócony 5'-GCGGGAGGAGATGACCTTGC-3'

5. Interpretacja danych

1. Oblicz szybkość gojenia się ran, korzystając z obrazów tkanki ex vivo wygenerowanych w krokach 1.6-1.8 przy użyciu ImageJ. Istnieje wiele ostatnich publikacji przedstawiających różne warianty automatycznej analizy obszarów ran w ImageJ^12,13,14.
2. Określić ilościowo ekspresję genów za pomocą metody ΔC_T, porównując cykle progowe dla genu będącego przedmiotem zainteresowania w porównaniu z cyklem gospodyni domowej (np. 3-fosforan aldehydu glicerynowego; GAPDH). Aby to zrobić, zwróć uwagę na wartość C_T dla gospodyni domowej i dla interesującego nas genu.
   1. Oblicz różnicę między dwiema wartościami_CT, aby znormalizować ilość obecnego mRNA i kontrolować różnice w stężeniach ekstrakcji RNA między różnymi izolacjami:
      ΔC_T = C_T (gen zainteresowania) - C_T (gospodyni)
   2. Obliczyć wielkość różnicy między wartościami C_T, aby uzyskać względną kwantyfikację interesującego genu, wyrażoną jako procent gospodyni:
      Kwantyfikacja względna = (^2-ΔCT) x 100
   3. Zbadaj różnice między różnymi dawcami pacjentów/stanami chorobowymi, porównując względne kwantyfikacje genów będących przedmiotem zainteresowania dla każdej próbki.
      UWAGA: Schemat całej techniki można znaleźć w Rysunek 1.

Wyniki

Zgodnie z protokołem, wybrano 48-godzinny punkt czasowy do wygenerowania reprezentatywnych wyników. Powstanie początkowej rany w nadmiarze tkanki z planowej chirurgii plastycznej można zobaczyć na Rysunek 2A, gdzie wycięta rana jest wyraźnie widoczna. Barwienie hematoksyliną i eozyną potwierdza, że wytworzyło to ranę o pełnej grubości (Ryc. 2B). Po 48 godzinach częściowe zamknięcie rany jest widoczne pod mikroskopem świetlnym (Rysunek 2C). Barwienie histologiczn...

Dyskusja

Wraz ze wzrostem częstości występowania chorób przewlekłych, takich jak cukrzyca typu 2 na całym świecie, coraz pilniejsze staje się zapotrzebowanie na techniki, które mogą ułatwić badania o znaczeniu patofizjologicznym. Opisany powyżej protokół zapewnia ustandaryzowaną metodę badania danych transkryptomicznych z gojących się ran ex vivo z wykorzystaniem tkanki ludzkiej.

Protokół ten jest uzależniony od dostarczenia nadwyżki tkanki klinicznej, na którą odpowiednie władze udzieliły zgo...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw Arcturus RiboAmp PLUS	Zestaw do amplifikacji RNA	ThermoFisher Scientific	KIT0521
Nasadki dyfuzora 0,5 ml	MMI	K10028161	Nasadki do mikrodysekcji wychwytywane laserowo; 50 sztuk
Dulbecco' s Zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM)	Sigma-Aldrich	D6046	Z 1000 mg / L glukozy, L-glutaminą i wodorowęglanem sodu, płynne, sterylnie filtrowane, odpowiednie do hodowli komórkowych
Surowica bydlęca płodu	Thermo Fisher Scientific	10270106	Suplement do hodowli komórkowych
H& E Staining Kit Plus	MMI	K10028305	Zestaw do barwienia hematyoksyliny i eozyny bez rnazy Zestaw do odwrotnej transkrypcji
cDNA o dużej pojemności	Applied Biosystems	4368814	Zestaw do odwrotnej transkrypcji
L-glutamina	Thermo Fisher Scientific	25030149	Suplement do hodowli komórkowych
MembraneSlides	MMI	K10028153	Laer do mikrodysekcji wychwytywania; 5 w pudełku
Netwell Mesh Insert	Corning	3479	Wkład do hodowli komórkowych
Penicylina-Streptomycyna-Fungizone	Thermo Fisher Scientific	15070-063	Suplement do hodowli komórkowych
15290-026
OCT	Tissue-Tek Sakura	4583	Środek tnący kompatybilny z kriostatem
PBS	Thermo Fisher Scientific	10209252	Pięć tabletek na 100 ml sterylnej wody, a następnie autoklawowane do hodowli komórkowej
Użyj RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	Zestaw do ekstrakcji
RNA RNase Away	Sigma-Aldrich	83931	RNaza
w sprayu Sterylne ostrza	Naukowe materiały laboratoryjne	INS4974	Narzędzia do preparowania tkanek
Suwak podporowy	MMI	K10028159	Mikrodysekcja przechwytywania laserowego Prowadnica podporowa, bez RNaz
Nożyczki chirurgiczne	Materiały do laboratoriów naukowych	INS4860	Narzędzia do preparowania tkanek
Kleszcze chirurgiczne	Materiały do laboratoriów naukowych	INS2026	Narzędzia do preparacji tkanek
SYBR Green Supermix	Biosystemy stosowane	4344463	Ilościowy mastermix PCR