Artykuł metodologiczny

Funkcjonalna ocena przepuszczalności jelit i migracji przeznabłonkowej neutrofili u myszy przy użyciu standaryzowanego modelu pętli jelitowej

DOI:

10.3791/62093

⸱

11 lutego 2021

 ,  , 
1Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozregulowana funkcja bariery nabłonkowej jelit i reakcje immunologiczne są cechami charakterystycznymi nieswoistego zapalenia jelit, które pozostają słabo zbadane z powodu braku modeli fizjologicznych. W tym miejscu opisujemy model pętli jelitowej myszy, który wykorzystuje dobrze unaczyniony i zewnętrzny odcinek jelita do badania przepuszczalności błony śluzowej i rekrutacji leukocytów in vivo.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Błona śluzowa jelit jest wyściełana pojedynczą warstwą komórek nabłonkowych, która tworzy dynamiczną barierę umożliwiającą parakomórkowy transport składników odżywczych i wody, jednocześnie zapobiegając przedostawaniu się bakterii luminalnych i substancji egzogennych. Naruszenie tej warstwy powoduje zwiększoną przepuszczalność dla treści świetlnej i rekrutację komórek odpornościowych, które są cechami charakterystycznymi stanów patologicznych w jelitach, w tym nieswoistego zapalenia jelit (IBD).

Mechanizmy regulujące funkcję bariery nabłonkowej i migrację przeznabłonkową (TEpM) neutrofili wielojądrzastych (PMN) są nie do końca zrozumiałe z powodu braku eksperymentalnych metod in vivo pozwalających na analizy ilościowe. Tutaj opisujemy solidny mysi model eksperymentalny, który wykorzystuje zewnętrzny segment jelita krętego lub bliższej okrężnicy. Zewnętrzna pętla jelitowa (iLoop) jest w pełni unaczyniona i oferuje fizjologiczne korzyści w porównaniu z podejściami opartymi na komorach ex vivo, powszechnie stosowanymi do badania przepuszczalności i migracji PMN przez monowarstwy komórek nabłonka.

Szczegółowo demonstrujemy dwa zastosowania tego modelu: (1) ilościowy pomiar przepuszczalności jelit poprzez wykrywanie znakowanego fluorescencyjnie dektransu w surowicy po wstrzyknięciu doświetlnym, (2) ilościowa ocena migrowanego PMN przez nabłonek jelitowy do światła jelita po doświetlnym wprowadzeniu chemoatraktantów. Wykazujemy wykonalność tego modelu i przedstawiamy wyniki z wykorzystaniem iLoop u myszy pozbawionych nabłonkowego białka JAM-A związanego ze ścisłym połączeniem w porównaniu z kontrolami. Wykazano, że JAM-A reguluje funkcję bariery nabłonkowej, a także PMN TEpM podczas reakcji zapalnych. Nasze wyniki z wykorzystaniem iLoop potwierdzają wcześniejsze badania i podkreślają znaczenie JAM-A w regulacji przepuszczalności jelit i PMN TEpM in vivo podczas homeostazy i choroby.

Model iLoop dostarcza wysoce ustandaryzowaną metodę do powtarzalnych badań in vivo homeostazy jelitowej i stanu zapalnego oraz znacznie poprawi zrozumienie funkcji bariery jelitowej i zapalenia błony śluzowej w chorobach takich jak IBD.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Błona śluzowa jelit obejmuje pojedynczą warstwę komórek nabłonka jelitowego (IEC), leżących pod nią komórek odpornościowych blaszki właściwej oraz błony śluzowej mięśni. Oprócz swojej roli we wchłanianiu składników odżywczych, nabłonek jelitowy jest fizyczną barierą, która chroni wnętrze ciała przed bakteriami komensalnymi światła, patogenami i antygenami dietetycznymi. Ponadto komórki odpornościowe IEC i blaszka właściwa koordynują odpowiedź immunologiczną, indukując tolerancję lub odpowiedź w zależności od kontekstu i bodźców. Doniesiono, że przerwanie bariery nabłonkowej może poprzedzać wystąpienie patologicznego zapalenia błony śluzowej i przyczyniać się do nieswoistego zapalenia jelit (IBD) obejmującego zarówno wrzodziejące zapalenie jelita grubego, jak i chorobę Leśniowskiego-Crohna1,2,3,4,5,6,7. Osoby z wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego wykazują nadmierną migrację przeznabłonkową (TEpM) wielojądrzastych neutrofili (PMN) tworzących ropnie krypt, co wiąże się z ciężkością choroby8,9. Chociaż upośledzona funkcja bariery nabłonkowej i nadmierna odpowiedź immunologiczna są cechami charakterystycznymi IBD, brakuje eksperymentalnych testów in vivo do przeprowadzenia ilościowych ocen przepuszczalności jelit i rekrutacji komórek odpornościowych do błony śluzowej jelit.

Najczęstsze metody używane do badania przepuszczalności nabłonka jelitowego i PMN TEpM wykorzystują metody komorowe ex vivo przy użyciu monowarstw IEC hodowanych na półprzepuszczalnych porowatych wkładkach membranowych10,11,12. Integralność bariery nabłonkowej jest monitorowana za pomocą pomiarów transnabłonkowego oporu elektrycznego (TEER) lub strumienia parakomórkowego dekstranu znakowanego izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) z przedziału wierzchołkowego do podstawnego13,14,15. Podobnie, PMN TEpM jest zwykle badany w odpowiedzi na chemoatraktant, który jest dodawany do dolnej komory16. PMN umieszcza się w górnej komorze, a po okresie inkubacji zbiera się i określa ilościowo PMN, które migrowały do komory podstawowej. Chociaż metody te są użyteczne, łatwe do wykonania i bardzo powtarzalne, są to oczywiście podejścia redukcjonistyczne i niekoniecznie stanowią dokładne odzwierciedlenie warunków in vivo.

U myszy powszechnym testem do badania przepuszczalności parakomórkowej jelit jest doustne zgłębnik FITC-dekstranu, a następnie pomiar wyglądu FITC-dekstranu w surowicy krwi13,17. Wadą tego testu jest to, że stanowi on ocenę ogólnej integralności bariery przewodu pokarmowego, a nie regionalnego wkładu jelitowego. Ponadto niebieski Evans jest powszechnie używany do oceny przecieku naczyniowego in vivo18, a także do oceny przepuszczalności błony śluzowej jelit u myszy i szczurów19,20,21. Oznaczanie ilościowe błękitu Evansa w błonie śluzowej jelit wymaga ekstrakcji z tkanki poprzez inkubację w formamidzie przez noc. Dlatego ta sama tkanka nie może być wykorzystana do badania przepuszczalności nabłonka jelitowego i nacieku neutrofili

.

Tutaj zwracamy uwagę na prosty protokół, który zmniejsza liczbę zwierząt potrzebnych do zbierania powtarzalnych danych na temat przepuszczalności błony śluzowej okrężnicy i migracji przeznabłonkowej leukocytów in vivo. W związku z tym zalecamy stosowanie FITC-dextrans, które są łatwo wykrywalne w surowicy krwi bez naruszania integralności pętli jelitowych, które można pobrać do dalszej analizy. Warto zauważyć, że podwiązane pętle jelitowe były używane u różnych gatunków (w tym myszy, szczurów, królików, cieląt) do badania infekcji bakteryjnych (takich jak Salmonella, Listeria monocytogenes i Escherichia coli)22,23,24,25 a także przepuszczalność jelit26; jednakże, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, nie ma badań oceniających mechanizmy PMN TEpM w określonych regionach jelita, takich jak jelito kręte lub okrężnica, które są powszechnie zaangażowane w IBD.

Tutaj opisujemy model pętli jelitowej myszy (iLoop), który jest solidną i niezawodną metodą mikrochirurgiczną in vivo, która wykorzystuje dobrze unaczyniony i zewnętrzny odcinek jelita krętego lub bliższej okrężnicy. Model iLoop jest fizjologicznie istotny i umożliwia ocenę integralności bariery jelitowej i PMN TEpM na żywych myszach pod narkozą. Pokazujemy dwa zastosowania: 1) kwantyfikacja poziomów 4 kDa FITC-dekstranu w surowicy po podaniu doświetlnym w iLoop 2) kwantyfikacja transmigrowanego PMN w świetle iLoop po doświetlelnym wstrzyknięciu silnego chemottraktantu Leukotriene B4 (LTB4)27. Co więcej, wykorzystanie modelu iLoop z myszami Jam-a-null lub myszami z selektywną utratą JAM-A na IEC (Villin-cre; Jam-a fl/fl) w porównaniu z myszami kontrolnymi, jesteśmy w stanie potwierdzić wcześniejsze badania, które wykazały duży wkład białka JAM-A związanego z połączeniem ścisłym do przepuszczalności jelit i transmigracji neutrofili15,28,29,30,31.

Model iLoop jest wysoce funkcjonalną i fizjologiczną metodą, która może być użyta do potwierdzenia testów in vitro. Co więcej, jest to wszechstronny model eksperymentalny, który pozwala na badanie różnych odczynników, które można wstrzyknąć do światła pętli, w tym chemokin, cytokin, patogenów bakteryjnych, toksyn, przeciwciał i środków terapeutycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i zasadami National Institutes of Health oraz zatwierdzone przez Institutional Animal Care & Use Committee na Uniwersytecie Michigan.

1. Przygotowanie przedoperacyjne

UWAGA: Ta metoda została wygenerowana przy użyciu dorosłych myszy z tła genetycznego C57BL/6, w wieku od 8 do 12 tygodni. Wszystkie myszy były trzymane w ścisłych, specyficznych warunkach wolnych od patogenów, z dostępem ad libitum do normalnej karmy i wody. Wyniki uzyskano przy użyciu C57BL/6, Jam-a - myszy zerowych (Jam-a-/-) lub myszy z selektywną utratą JAM-A na IEC (Villin-cre;Jam-afl/fl) i miot Jam-afl/fl kontroluje zgodnie z wcześniejszym opisem30.

  1. Przygotowanie terenu
    1. Wykonaj operację w czystym miejscu. Model pętli jelitowej jest jednak operacją niepozwalającą na przeżycie, która nie wymaga techniki aseptycznej/sterylnej. Przestrzegaj weterynaryjnych praktyk sanitarnych i używaj oczyszczonych narzędzi chirurgicznych (tj. wyszorowanych mydłem, spłukanych wodą, a następnie 70% etanolem).
    2. Włącz deskę chirurgiczną (lub poduszki grzewcze) o kontrolowanej temperaturze i dostosowane źródło światła, aby uchronić zwierzę przed hipotermią podczas znieczulenia i operacji.
    3. Przygotuj ligatury, wycinając 6 cm segmenty niewchłanialnych jedwabnych szwów chirurgicznych 4-0.
    4. Przygotuj bawełniane gazy (5 cm x 5 cm), które są cięte na środku zgodnie z elipsoidalnym kształtem. Zostaną one wykorzystane do pokrycia laparotomii w linii środkowej i zapobieżenia bezpośredniemu kontaktowi między zewnętrzną pętlą iLoop a futrem zwierzęcym. Namocz pokrojone gazy w ciepłym zrównoważonym roztworze soli Hanksa (HBSS) w pojemniku na szalkę Petriego.
    5. Przygotuj mokre waciki nasączone ciepłym HBSS, które będą używane do obsługi narządów i zewnętrznego iLoop.
    6. Przygotować strzykawkę o pojemności 10 ml wypełnioną ciepłym HBSS i podłączyć do żółtej rurki do karmienia. Strzykawka ta będzie używana do nawilżania odsłoniętych tkanek podczas operacji oraz do delikatnego wypłukiwania iLoop z zawartości kału.
  2. Przygotowanie zwierząt
    1. Znieczulić zwierzę zgodnie z zatwierdzonym protokołem dla zwierząt. W tym protokole mieszanina izofluranu i tlenu jest podawana przez parownik znieczulający. Zgodnie z instrukcjami producenta dostosuj natężenie przepływu tlenu na 1 l/min. Ustaw waporyzator na 5% i wstępnie naładuj komorę indukcyjną. Po 5 minutach zredukuj parownik izofluranu do 2% - 2,5%.
    2. Umieść zwierzę w komorze indukcyjnej na 3 min - 5 min, następnie przenieś zwierzę na podgrzewaną tablicę chirurgiczną i podłącz zatyczkę do znieczulenia. Unieruchomić zwierzę w pozycji leżącej na plecach za cztery kończyny za pomocą taśmy klejącej.
      UWAGA: Jako alternatywę dla znieczulenia, mieszanina ketaminy (80 mg/kg - 100 mg/kg) i ksylazyny (5 mg/kg - 10 mg/kg) rozcieńczona w roztworze soli fizjologicznej (0,9% NaCl) może być podawana we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Znieczulenie powinno być utrzymywane przez cały czas trwania zabiegu poprzez domięśniowe podawanie ketaminy/ksylazyny (w dawkach 0,1 - 0,25 razy większych niż dawki początkowe), aby zapewnić głębokość znieczulenia. Jeśli to możliwe, zdecydowanie zaleca się stosowanie parownika do znieczulenia izofluranem, aby zapewnić lepszą odtwarzalność, przeżywalność i zapobiec bólowi zwierząt.
    3. Nałóż maść okulistyczną na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
    4. Wykonaj badanie fizykalne, które obejmuje tętno (około 500 uderzeń/min) i rytm, kolor błony śluzowej (różowy), czas napełniania naczyń włosowatych (< 2 s), częstość oddechów (nie niższą niż 40 - 60 oddechów/min) i temperaturę (36,5 °C)32.
    5. Przed przejściem do kolejnych kroków oceń głębokość znieczulenia za pomocą odruchu wycofania pedału. Zastosuj bolesny bodziec (szczypanie) skóry między palcami u nóg i/lub opuszkami palców. Mysz zareaguje, kurcząc się i usuwając nogę. Ten odruch pedałowania znika, gdy zwierzę jest głęboko znieczulone.
      UWAGA: Monitorowanie parametrów życiowych i odruchu pedałowania jest zalecane przez cały czas znieczulenia co najmniej co 15 minut. Wytyczne Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) dotyczące oceny głębokości znieczulenia zalecają monitorowanie następujących elementów: (a) koloru ogona, stopy i błony śluzowej (takiej jak język). Kolor różowy jak normalny i blady lub niebieski wskazujący na zmniejszoną perfuzję krwi lub niewydolność oddechową; (b) ocena wzorca oddychania jako oddechu regularnego i nieregularnego. Sonda temperatury doodbytniczej, pulsoksymetr gryzoni i monitory pracy serca mogą być używane do oceny odpowiednio temperatury ciała, tętna i częstości oddechów.

2. Generowanie pętli jelita krętego

  1. Przygotowanie skóry: Wyszoruj sierść linii środkowej brzucha wacikami nasączonymi alkoholem lub gąbką z gazy nasączoną 70% etanolem. Nie zwilżaj dużego obszaru futra alkoholem, aby zapobiec hipotermii.
  2. Za pomocą nożyczek wykonaj laparotomię w linii środkowej. Wykonaj pionowe nacięcie na środku brzucha (około 2 cm długości) i odsłoń otrzewną. Uważaj, aby nie uszkodzić narządów wewnątrz jamy brzusznej.
  3. Umieść wstępnie przyciętą mokrą bawełnianą gazę na odsłoniętej jamie brzusznej.
  4. Użyj mokrych bawełnianych wacików, aby zmobilizować i uwidocznić kątnicę. Ostrożnie umieść kątnicę na mokrej bawełnianej gazie.
    UWAGA: Kątnica jest zlokalizowana w lewym kwadrancie ogonowym jamy brzusznej u większości myszy niezależnie od płci zwierzęcia.
  5. Użyj mokrych bawełnianych wacików, aby zmobilizować i delikatnie zewnętrzizować jelito kręte, którego końcowa część (dystalny koniec) jest przymocowana do kątnicy (Rysunek 1B).
  6. Rozłóż co najmniej 6 cm końcowego odcinka jelita krętego na mokrej gazie bawełnianej bez przerywania naczyń krezkowych i dopływu krwi. Dopływ krwi jest utrzymany, jeśli nie ma krwawienia, a tkanka zachowuje swój różowy kolor (Rysunek 1B).
    UWAGA: Unikaj wysuszania odsłoniętych tkanek, utrzymując tkanki wilgotne przez cały czas ciepłym HBSS (co 2 - 3 minuty) za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml podłączonej do żółtej rurki do karmienia (krok 1.1.6).
  7. W pobliżu kątnicy zidentyfikuj główną tętnicę zaopatrującą jelito kręte w krezce. Następnie zlokalizuj dwa miejsca podwiązania w krezce, które są wolne od krytycznych naczyń krwionośnych.
  8. Za pomocą kleszczyków tkankowych mocno chwyć końcowe jelito kręte (najbliżej kątnicy) i za pomocą kleszczyków z cienką końcówką fenestruj krezkę, unikając naczyń krwionośnych. Umieść jedwabny szew w poprzek perforacji i zawiąż węzeł chirurgiczny, aby utworzyć pierwsze podwiązanie (dystalny koniec pętli).
  9. Użyj linijki, aby zmierzyć odległość 4 cm od pierwszej ligatury i utwórz drugą ligaturę (bliższy koniec pętli), jak wspomniano w kroku 2.8 (Rysunek 1C).
  10. Cienkimi nożyczkami ostrożnie przetnij obok każdego podwiązania, aby odizolować 4-centymetrową pętlę jelita krętego, zachowując nienaruszony dopływ krwi i błonę krezkową.
    UWAGA: Odetnij oba końce zewnętrznego segmentu iLoop, a następnie delikatnie przepłucz jako niezbędny krok, który zapobiega interferencji zawartości światła (kału), ułatwiając w ten sposób równomierne rozproszenie FITC-dekstrans lub bodźców chemotaktycznych na całej długości izolowanego segmentu, a także umożliwiając dokładniejsze określenie ilościowe leukocytów za pomocą cytometrii przepływowej. Procedura ta pozwala również na równomierne rozdęcie błony śluzowej po wstrzyknięciu określonych objętości odczynnika i lepszą odtwarzalność między zwierzętami.
  11. Delikatnie przepłukać zawartość segmentu pętli jelita krętego ciepłym HBSS za pomocą elastycznej żółtej rurki do karmienia dołączonej do strzykawki o pojemności 10 ml (patrz krok 1.1.6).
  12. Podwiązać dwa odcięte końce zaczerwienionej pętli jelita krętego za pomocą jedwabnego szwu.
  13. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 30 G powoli wstrzyknąć 250 μl odczynnika, takiego jak FITC-dextrans (krok 4.2) lub chemokina (krok 5.3) do światła jelita. Pętla jelita krętego napełni się, powodując umiarkowane rozdęcie błony śluzowej (Rysunek 1D).
    UWAGA: Wstrzyknąć odczynnik do światła pętli po przeciwnej stronie tętnicy krezkowej. Należy uważać, aby nie wyciągnąć pętli jelita krętego ze zwierzęcia podczas wstrzykiwania, aby uniknąć rozerwania naczyń krwionośnych i wywołania krwawienia.
  14. Za pomocą mokrych wacików bawełnianych delikatnie odłóż pętlę jelita krętego, proksymalną część jelita krętego i kątnicę.
  15. Użyj uchwytu na igłę, anatomicznych kleszczyków i niewchłanialnych jedwabnych szwów 3,0 z igłą do odwrotnego cięcia, aby zamknąć ścianę brzucha.
  16. Umieść zwierzę w komorze anestezjologicznej o regulowanej temperaturze na okres inkubacji.

3. Generowanie pętli proksymalnego dwukropka (pcLoop)

UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat myszy, które zostały użyte do wygenerowania pcLoop, zobacz informacje podane na początku sekcji protokołu.

  1. Wykonaj kroki 2.1. - 2.4. zgodnie z powyższym opisem dla pętli jelita krętego.
  2. Za pomocą mokrych bawełnianych wacików zewnętrznij całe jelito kręte i umieść je na mokrej bawełnianej gazie. Zidentyfikuj proksymalną okrężnicę i dopływ krwi znajdujący się w mezookrężnicy. Zmobilizuj proksymalną okrężnicę i za pomocą kleszczyków z cienką końcówką utwórz pierwszą ligaturę w obszarze wolnym od naczyń w mezookrężnicy w odległości około 0,5 cm od kątnicy (Rysunek 2B).
  3. Odmierz 2 cm od pierwszej ligatury i utwórz drugą ligaturę w miejscu wolnym od dopływu krwi w mezookrężnicy (Rysunek 2C).
  4. Za pomocą cienkich nożyczek ostrożnie przytnij obok każdego podwiązania, aby wyizolować pcLoop.
    o długości 2 cm UWAGA: Jak wspomniano w notatce w kroku 2.10, ważne jest, aby odciąć oba końce, aby wyizolować pętlę pcLoop, która jest delikatnie oczyszczona z zawartości światła. Ostrożnie przeciąć tkankę okrężnicy i mezookrężnicę, aby zapobiec krwawieniu małych naczyń do światła jelita. W razie potrzeby należy zastosować kauteryzację termiczną, aby ograniczyć krwawienie w miejscu nacięcia.
  5. Delikatnie przepłucz pcLoop ciepłym HBSS, aby usunąć kał za pomocą elastycznej żółtej rurki do karmienia dołączonej do strzykawki o pojemności 10 ml (patrz krok 1.1.6).
  6. Podwiązywać dwa ścięte końce przepłukanej pętli pcLoop za pomocą jedwabnego szwu.
  7. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 30 G powoli wstrzyknąć 200 μl odczynnika, takiego jak FITC-dextrans (krok 4.2) lub chemokina (krok 5.3) do światła jelita. pcLoop napełni się, powodując umiarkowane rozdęcie błony śluzowej (Rysunek 2D).
    UWAGA: Wstrzyknąć odczynnik do światła pcLoop po przeciwnej stronie tętnicy krezkowej. Zapewnij spójność między zwierzętami i utwórz pętlę pcLoop o długości 2 cm, aby zapewnić równomierne rozdęcie błony śluzowej.
  8. Użyj mokrych bawełnianych wacików, aby delikatnie umieścić podwiązaną pętlę pcLoop, jelito kręte i kątnicę do jamy brzusznej.
  9. Użyj uchwytu na igłę, anatomicznych kleszczyków i niewchłanialnych jedwabnych szwów 3,0 z igłą do odwrotnego cięcia, aby zamknąć ścianę brzucha.
  10. Umieść zwierzę w komorze anestezjologicznej o regulowanej temperaturze na okres inkubacji.

4. Ilościowa ocena przepuszczalności jelit: test FITC-dekstran 4 kDa

  1. Wykonaj pętlę jelita krętego lub pcLoop (jak opisano powyżej).
  2. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 30 G wstrzyknąć do światła jelita 250 μl (jelito kręte - krok 2.13) lub 200 μl (okrężnica - krok 3.7) roztworu 4 kDa FITC-dekstranu (1 mg / ml w HBSS). Niewykorzystany roztwór FITC-dekstranu należy chronić przed światłem w celu przygotowania krzywej wzorcowej po pobraniu surowicy.
  3. W przypadku pętli jelita krętego wykonaj kroki od 2.14 do 2.16, a w przypadku pcLoop kroki od 3.8 do 3.10. Krótko mówiąc, umieść narządy i iLoop z powrotem na miejscu w jamie brzusznej, zamknij ścianę brzucha.
  4. Umieść zwierzę na 120 minut w podgrzewanej komorze anestezjologicznej.
  5. Po okresie inkubacji otwórz ścianę jamy brzusznej, uzyskaj dostęp do serca i wykonaj nakłucie serca za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 25G w celu pobrania krwi. Przenieś krew do probówki z aktywatorem krzepów surowicy o pojemności 1,3 ml, delikatnie wymieszaj i trzymaj na lodzie, chroniąc przed światłem. Zbierz co najmniej 500 μl krwi na mysz.
    UWAGA: Zwierzęta są poddawane eutanazji pod narkozą przy użyciu metody fizycznej, takiej jak dekapitacja lub zwichnięcie szyjki macicy, oraz zgodnie z zatwierdzonym protokołem dla zwierząt.
  6. Odwirować probówkę aktywatora skrzepów surowicy przez 5 minut przy 10 000 x g w temperaturze pokojowej zgodnie z zaleceniami producenta. Zebrać surowicę (supernatant) i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 1,7 ml. Trzymaj probówkę na lodzie i chroń przed światłem.
  7. Kwantyfikacja fluorescencji w surowicy krwi
    1. Przygotować wzorcową krzywą FITC-dekstranu 4 kDa w surowicy myszy kontrolnych (sola fizjologiczna lub HBSS jest ważną alternatywą). Utworzyć dwukrotne seryjne rozcieńczenie o stężeniu początkowym 1 mg/ml dekstranu FITC. Mierzone stężenia FITC-dekstranu 4 kDa mieszczą się w zakresie od 0,25 mg/ml do 2 μg/ml.
    2. Przenieś równą objętość próbki i wzorców na czarną 96-dołkową płytkę (płaskie dno) i zmierz FITC w czytniku płytek fluorescencyjnych (wzbudzenie 490 nm, emisja 520 nm), zgodnie z instrukcjami producenta i opublikowanymi protokołami33. Obliczyć stężenie FITC na podstawie krzywej wzorcowej lub obecnych wartości przepuszczalności jako zmiany krotności znormalizowanej dla eksperymentalnej grupy kontrolnej.

5. Ilościowa ocena migrowanego PMN do światła jelitowego po stymulacji śródświetlnej chemokinami

UWAGA: Bardzo mało PMN znajduje się w błonie śluzowej jelit na poziomie wyjściowym. Wstępne leczenie zwierząt cytokinami prozapalnymi powoduje powstanie środowiska zapalnego, które ułatwia rekrutację PMN z krwiobiegu do błony śluzowej jelit.

  1. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 30 G wykonać dootrzewnowe (i.p.) wstrzyknięcie sterylnego roztworu 100 ng czynnika martwicy nowotworu α (TNFα) i 100 ng interferonu-γ (INFγ) w 200 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  2. Po 4 - 24 godzinach wstępnego leczenia cytokinami prozapalnymi wykonaj pętlę jelita krętego lub pcLoop (jak opisano powyżej).
  3. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 30 G wstrzyknąć do światła jelita 250 μl (jelito kręte - krok 2.13) lub 200 μl (okrężnica - krok 3.7) roztworu chemoatraktantu Leukotrien B4 (LTB4) 1 nM w HBSS.
    UWAGA: Leukotrien B4 (LTB4) jest stosowany w tym protokole jako silny chemoatraktant dla PMN. Inne chemoatraktanty, takie jak N-formylometylo-leucylo-fenyloalanina (fMLF) lub ligand 1 chemokiny (motyw C-X-C) (CXCL1/KC) mogą być również stosowane do indukowania znaczącej rekrutacji PMN do okrężnicy lumen30.
  4. W przypadku pętli jelita krętego wykonaj kroki od 2.14 do 2.16. W przypadku pcLoop wykonaj kroki od 3.8 do 3.10. Krótko mówiąc, umieść narządy i iLoop z powrotem na miejscu w jamie brzusznej, zamknij ścianę brzucha.
  5. Umieść zwierzę na 60 minut w podgrzewanej komorze anestezjologicznej.
  6. Pobieranie zawartości pętli jelitowej
    1. Przygotuj roztwory i przechowuj na lodzie: Dla pętli jelita krętego i pcLoop przygotuj bufor płuczący zawierający 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 5 mM ditiotreitolu (DTT) i 2% FBS w sterylnym PBS bez wapnia i magnezu.
    2. Po okresie inkubacji i podtrzymaniu znieczulenia otwórz ścianę brzucha i wyciągnij iLoop (pętlę jelita krętego lub pcLoop). Eutanazja zwierząt pod narkozą przy użyciu metody fizycznej, takiej jak dekapitacja lub zwichnięcie szyjki macicy, oraz zgodnie z zatwierdzonym protokołem dla zwierząt.
    3. Przepłucz pętlę zimnym PBS, aby usunąć wszelkie resztki zanieczyszczenia krwi i wchłonąć nadmiar PBS za pomocą chusteczek higienicznych. Ostrożnie zebrać zawartość pętli do probówki wirówkowej o pojemności 1,7 ml (około 250 μl dla pętli jelita krętego i 200 μl dla pcLoop). Przepłukać pętlę 500 μl buforem do płukania na zimno i natychmiast po pobraniu umieścić probówkę na lodzie.
      UWAGA: DTT pomaga rozpuszczać śluz. Jeśli zawartość światła iLoop jest bardzo lepka (w zależności od tła genetycznego myszy), należy ją rozcieńczyć w stosunku 1:2 lub 1:3 buforem płuczącym zawierającym naziemną telewizję cyfrowo-teleyjną.
    4. Przepuść roztwór zawartości luminalnej przez nylonowy filtr siatkowy o grubości 35 μm za pomocą okrągłej probówki o pojemności 5 ml z nasadką sitkową. Ten krok pomaga usunąć fragmenty tkanek i agregaty komórkowe. Przepłukać sitko komórkowe 1 ml buforu do płukania.
    5. Probówkę wirówkową o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odlać supernatant, przepłukać osad 500 μl - 1 ml buforu do przemywania wodą, następnie odwirować przy 400 x g przez 5 minut, 4 °C.
    6. Zawiesić osad komórek luminalnych iLoop w 200 μl buforu cytometrii przepływowej (FCB) zawierającego 2% FBS w sterylnym PBS bez wapnia i magnezu. Komórki można przechowywać w probówce lub przenieść na 96-dołkową okrągłą płytkę denną w celu barwienia i analizy metodą cytometrii przepływowej.
  7. Barwienie i analiza cytometrii przepływowej
    1. Kontrola kompensacji: białe krwinki
      1. Przygotować strzykawkę o pojemności 1 ml z igłą 25 G, wstępnie wypełnioną sterylnym 0,5 M EDTA (pH 8,0). 10% EDTA na oczekiwaną objętość krwi (100 μL EDTA na 1 ml krwi).
      2. Zbierz krew pod narkozą przez nakłucie serca. Przenieść krew do probówki o pojemności 1,7 ml, a następnie odwirować przy 400 x g przez 10 minut, 4 °C.
        UWAGA: Gdy mysz jest pod narkozą, użyj metody fizycznej, aby potwierdzić zgon zgodnie z zatwierdzonym protokołem zwierzęcym (np. zwichnięcie szyjki macicy).
      3. Odessać supernatant. Zawiesić osad w 1 ml buforu do lizy chlorku amonu i potasu (ACK) w celu lizy czerwonych krwinek. Inkubować przez 3 minuty - 5 minut na lodzie. Wirować 400 x g przez 5 min, 4 °C. Jeśli osad jest nadal czerwony, powtórz ten krok buforowania lizy ACK, aż osad zmieni kolor na biały.
      4. Zawiesić osad w 1 ml FCB i płytce 0,5 x 106-1 x 106 komórek na studzienkę. Przygotuj pięć dołków na 96-dołkowej płytce z okrągłym dnem. Umieść talerz na lodzie.
        UWAGA: Użyj tej samej 96-dołkowej płytki, która zawiera zawartość pętli światła (patrz krok 5.6.6).
    2. Barwienie cytometrią przepływową
      1. Odwirować 96-dołkową płytkę przez 5 minut w temperaturze 400 x g, 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki z 50 μl oczyszczonego szczurzego anty-mysiego CD16/CD32 jako bloku Fc (1 μg na 100 μl FCB). Inkubować przez 5 min - 10 min na lodzie.
      2. Barwienie immunologiczne zawartości światła iLoop: Przygotować mieszaninę zawierającą wszystkie przeciwciała sprzężone z fluorochromem (rozcieńczenie 1:50 w FCB): anty-CD45-PerCP, anty-CD11b-PE i anty-Ly-6G-Alexa Fluor 647. Dodać 50 μl mieszaniny do dołka, aby uzyskać końcową objętość 100 μl.
      3. Barwienie immunologiczne białych krwinek w celu kompensacji (rozcieńczenie 1:50 w FCB): Użyj 50 μl samego FCB (niebarwiona próbka, studzienka 1), 50 μl każdego pojedynczego przeciwciała sprzężonego z fluorochromem (dołki 2 - 4), 50 μl kombinacji wszystkich przeciwciał sprzężonych z fluorochromem (studnia 5). Końcowa objętość 100 μL.
      4. Inkubować płytkę przez 30 minut na lodzie chronionym przed światłem.
      5. Odwirować płytkę przez 5 minut w temperaturze 400 x g, 4 °C. Odrzucić supernatant i przemyć 200 μl FCB. Powtórz ten krok prania dwa razy.
      6. Dodać FCB 150 μl/studzienkę do próbek krwi.
      7. Dodać 100 μl/basenik FCB do próbki zawartości luminalnej iLoop. Następnie 50 μl/studzienkę fluorescencyjnych kulek do liczenia.
    3. Analiza cytometrii przepływowej
      1. Bramka dla zdarzeń dodatnich CD45 oraz dla ekspresji Ly-6G-/Gr-1 i CD11b30.
      2. Użyć 100 μl objętości próbki jako warunek zatrzymania.
      3. Obliczyć bezwzględną liczbę PMN, która przeniosła się do strumienia świetlnego iLoop, postępując zgodnie z informacjami dostarczonymi przez producenta fluorescencyjnych kulek zliczających.
        UWAGA: Dane mogą być przedstawione jako (1) całkowita liczba PMN w lumen30,34,35, (2) liczba PMN na gram tkanki, a także (3) liczba PMN na mm3 przy użyciu wzoru na objętość cylindra: V= π(pi) r 2 h (V dla objętości, r dla promienia i h dla wysokości).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schematyczne przedstawienie modeli pętli jelita krętego i pcLoop jest przedstawione odpowiednio w Rysunek 1 i Rysunek 2. Zdjęcia anatomiczne przedstawiają krytyczne etapy zabiegu, w tym eksterioryzację odcinka jelita (Ryc. 1B i Ryc. 2B), identyfikację odpowiedniego miejsca do podwiązania, które pozwala na minimalne zakłócenie dopływu krwi (Rycina 1C i

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mechanizmy odpowiedzialne za rozregulowanie funkcji bariery jelitowej i rekrutację komórek odpornościowych w stanach patologicznych, takich jak IBD, nie są w pełni poznane. W tym miejscu szczegółowo opisujemy solidny model mysi in vivo, który wykorzystuje dobrze unaczyniony, zewnętrzny odcinek jelita krętego lub proksymalnej okrężnicy i pozwala na ocenę przepuszczalności jelit, badania migracji neutrofili, a także inne zastosowania.

iLoop to operacja niepowodująca rekonwalescencji, która jest ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują dr Svenowi Flemmingowi z Uniwersytetu w Würzburgu za jego wkład w stworzenie modelu pętli proksymalnej okrężnicy, Seanowi Watsonowi za zarządzanie koloniami myszy oraz Chithra K. Muraleedharan za pomoc w zdobyciu zdjęć modelu iLoop. Prace te były wspierane przez Niemiecką Fundację Badawczą/DFG (BO 5776/2-1) dla KB, R01DK079392, R01DK072564 i R01DK061379 dla C.A.P.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sprzęt i materiał
BD Waciki nasączone alkoholemBD326895
Igła BD PrecisionGlide, 25G x 5/8"BD305122
Igła PrecisionGlide, 30G X 1/2"BD305106
BD 1ml Strzykawka tuberkulinowa bez igłyBD309659
15ml probówka wirówkowaCorning14-959-53A
solidna płytka polistyrenowaFisherScientific07-200-592
Naczynie hodowlane Corning bez obróbki, 10 cmMilliporeSigmaCLS430588
Aplikator z bawełnianą końcówką (wacik), 6", sterylnyFisherScientific25806 2WC
Gąbki z gazy wypełnione bawełną, Niesterylny, 2" x 2"Medex3249-1
EZ-7000 waporyzator anestezjologiczny (system klasyczny, w tym jednostki grzewcze)E-Z SystemsEZ-7000
Probówka wirówkowa Falcon 50ml VWR21008-940
Kolorowa taśma do etykietowania FisherbrandFisherScientific15-901-10R
Uchwyt na igłę Halsey (uchwyt na igłę) FST12001-13
Chusteczki Kimwipe, małe (chusteczki higieniczne)FisherScientific06-666
Probówki do mikrowirówek 1,7 ml Thomas Naukowy c2170
Mikroprobówka 1,3 ml Z (tubka aktywująca skrzepy w surowicy)Sarstedt 41.1501.105
Drobne nożyczki MoriaFST14370-22
5ml Polistyrenowa tubka z okrągłym dnem z nasadką sitka komórkowego (35 µ m nylonowa siatka)Maść352235
Puraluze, sterylny lubrykant do oczuDechra12920060
Kleszcze pierścieniowe (kleszcze do tkanek)FST11103-09
Roboz Surgical 4-0 Jedwabny pleciony, 100 YDFisherScientificNC9452680
Kleszcze Semken (kleszcze anatomiczne)FST1108-13
Sofsilk Niewchłanialny powlekany szew pleciony jedwab Rozmiar 3-0, 18 ", igła 19mm długość 3/8 koła odwrotne cięcie HenryScheinSS694
Kleszcze studenckie, kątoweFST91110-10
10ml strzykawka PP/PE bez igłyMillipore Sigma 
96 dołkowa płytka do hodowli komórkowychCorning3799
Żółte rurki do karmienia gryzoni 20G x 30 mmInstechFTP-20-30
Roztwory i
Accugene 0,5 M EDTALonza51201
Bufor lizujący chlorek amonu i potasu (ACK)BioWhittaker10-548E
Zrównoważony roztwór soli HanksaCorning21-023-CV
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami bez wapnia i magnezuCorning21-040-CV
strong>Odczynniki
Alexa Fluor 647 Przeciwciało przeciw mysim Ly-6G (1A8)BioLegend127610
CD11b Przeciwciało monoklonalne, PE, eBioscience (M1/70)ThermoFisher12-0112-81
CountBright Absolutne koraliki do liczeniaInvitrogenC36950
DitiotreitolFisherScientificBP172-5
Surowica bydlęca płodu, inaktywowana termicznieR& D Systems511550
Izotiocyjanian fluoresceiny, dekstran, średnia masa cząsteczkowa 4.000Sigma60842-46-8
Halowęglowodórizofluranu12164-002-25
Leukotrien B4Millipore Sigma71160-24-2
PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11)BD Pharmingen557235
Oczyszczony szczurzy anty-mysi CD16 / CD32 (mysi blok BD FC)BD Bioscience553142
Rekombinowany mysi IFN-γPeprotech315-05
Rekombinowany mysi TNF-&alfa;Peprotech315-01A
Corning 96-dołkowa weterynaryjna Falcon Z248029<

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Olson, T. S., et al. The primary defect in experimental ileitis originates from a nonhematopoietic source. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 541-552 (2006).
  2. Jump, R. L., Levine, A. D. Mechanisms of natural tolerance in the intestine: implications for inflammatory bowel disease. Inflammatory Bowel Diseases. 10 (4), 462-478 (2004).
  3. Peeters, M., et al. Clustering of increased small intestinal permeability in families with Crohn's disease. Gastroenterology. 113 (3), 802-807 (1997).
  4. Michielan, A., D'Inca, R. Intestinal permeability in inflammatory bowel disease: Pathogenesis, clinical evaluation, and therapy of leaky gut. Mediators of Inflammation. 2015, 628157(2015).
  5. Chin, A. C., Parkos, C. A. Neutrophil transepithelial migration and epithelial barrier function in IBD: potential targets for inhibiting neutrophil trafficking. Annals of the New York Academy of Sciences. 1072, 276-287 (2006).
  6. Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn's disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
  7. Ordás, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Ulcerative colitis. Lancet. 380 (9853), 1606-1619 (2012).
  8. Muthas, D., et al. Neutrophils in ulcerative colitis: A review of selected biomarkers and their potential therapeutic implications. Scandanavian Journal of Gastroenterology. 52 (2), 125-135 (2017).
  9. Pai, R. K., et al. The emerging role of histologic disease activity assessment in ulcerative colitis. Gastrointestinal Endoscopy. 88 (6), 887-898 (2018).
  10. Parkos, C. A., Delp, C., Arnaout, M. A., Madara, J. L. Neutrophil migration across a cultured intestinal epithelium. Dependence on a CD11b/CD18-mediated event and enhanced efficiency in physiological direction. The Journal of Clinical Investigation. 88 (5), 1605-1612 (1991).
  11. Brazil, J. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil-epithelial interactions. Immunological Reviews. 273 (1), 94-111 (2016).
  12. Thomson, A., et al. The Ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease. BMC Gastroenterology. 19 (1), 98(2019).
  13. Li, B. R., et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032(2018).
  14. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  15. Fan, S., et al. Role of JAM-A tyrosine phosphorylation in epithelial barrier dysfunction during intestinal inflammation. Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 566-578 (2019).
  16. Parkos, C. A. Neutrophil-epithelial interactions: A double-edged sword. American Journal of Pathology. 186 (6), 1404-1416 (2016).
  17. Volynets, V., et al. Assessment of the intestinal barrier with five different permeability tests in healthy C57BL/6J and BALB/cJ mice. Digital Diseases and Sciences. 61 (3), 737-746 (2016).
  18. Wick, M. J., Harral, J. W., Loomis, Z. L., Dempsey, E. C. An optimized evans blue protocol to assess vascular leak in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (139), e57037(2018).
  19. Tateishi, H., Mitsuyama, K., Toyonaga, A., Tomoyose, M., Tanikawa, K. Role of cytokines in experimental colitis: relation to intestinal permeability. Digestion. 58 (3), 271-281 (1997).
  20. Mei, Q., Diao, L., Xu, J. M., Liu, X. C., Jin, J. A protective effect of melatonin on intestinal permeability is induced by diclofenac via regulation of mitochondrial function in mice. Acta Pharmacologica Sinica. 32 (4), 495-502 (2011).
  21. Vargas Robles, H., et al. Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis. Journal of Visualized Experiments. (119), e55095(2017).
  22. Arques, J. L., et al. Salmonella induces flagellin- and MyD88-dependent migration of bacteria-capturing dendritic cells into the gut lumen. Gastroenterology. 137 (2), 579-587 (2009).
  23. Coombes, B. K., et al. Analysis of the contribution of Salmonella pathogenicity islands 1 and 2 to enteric disease progression using a novel bovine ileal loop model and a murine model of infectious enterocolitis. Infection and Immunity. 73 (11), 7161-7169 (2005).
  24. Everest, P., et al. Evaluation of Salmonella typhimurium mutants in a model of experimental gastroenteritis. Infection and Immunity. 67 (6), 2815-2821 (1999).
  25. Pron, B., et al. Comprehensive study of the intestinal stage of listeriosis in a rat ligated ileal loop system. Infection and Immunity. 66 (2), 747-755 (1998).
  26. Clayburgh, D. R., et al. Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo. The Journal of Clinical Investigation. 115 (10), 2702-2715 (2005).
  27. Palmblad, J., et al. Leukotriene B4 is a potent and stereospecific stimulator of neutrophil chemotaxis and adherence. Blood. 58 (3), 658-661 (1981).
  28. Mandell, K. J., Babbin, B. A., Nusrat, A., Parkos, C. A. Junctional adhesion molecule 1 regulates epithelial cell morphology through effects on beta1 integrins and Rap1 activity. The Journal of Biological Chemistry. 280 (12), 11665-11674 (2005).
  29. Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).
  30. Flemming, S., Luissint, A. C., Nusrat, A., Parkos, C. A. Analysis of leukocyte transepithelial migration using an in vivo murine colonic loop model. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (20), (2018).
  31. Luissint, A. C., Nusrat, A., Parkos, C. A. JAM-related proteins in mucosal homeostasis and inflammation. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 211-226 (2014).
  32. Cesarovic, N., et al. Isoflurane and sevoflurane provide equally effective anaesthesia in laboratory mice. Lab Animal. 44 (4), 329-336 (2010).
  33. JoVE Science Education Database. Introduction to the Microplate Reader. Journal of Visualized Experiments. , JoVE, Cambridge, MA. e5024(2020).
  34. Kelm, M., et al. Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis. Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).
  35. Azcutia, V., et al. Neutrophil expressed CD47 regulates CD11b/CD18-dependent neutrophil transepithelial migration in the intestine in vivo. Mucosal Immunology. , (2020).
  36. Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PloS One. 11 (3), 0150606(2016).
  37. Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series). Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).
  38. Ebnet, K. Junctional Adhesion Molecules (JAMs): Cell adhesion receptors with pleiotropic functions in cell physiology and development. Physiological Reviews. 97 (4), 1529-1554 (2017).
  39. Sorribas, M., et al. FXR modulates the gut-vascular barrier by regulating the entry sites for bacterial translocation in experimental cirrhosis. Journal of Hepatology. 71 (6), 1126-1140 (2019).
  40. Mazzucco, M. R., Vartanian, T., Linden, J. R. In vivo Blood-brain Barrier Permeability Assays Using Clostridium perfringens Epsilon Toxin. Bio-Protocol. 10 (15), 3709(2020).
  41. Kelly, J. R., et al. Breaking down the barriers: the gut microbiome, intestinal permeability and stress-related psychiatric disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 392(2015).
  42. Fiorentino, M., et al. Blood-brain barrier and intestinal epithelial barrier alterations in autism spectrum disorders. Molecular Autism. 7 (1), 49(2016).
  43. Kelm, M., et al. Regulation of neutrophil function by selective targeting of glycan epitopes expressed on the integrin CD11b/CD18. FASEB Journal : An Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (2), 2326-2343 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Migracja neutrofilibariera nab onkowapo czenia cis etest z FITC dekstrannieswoiste zapalne choroby jelitcytometria przep ywowabia ko JAM A

Powiązane artykuły