Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie wiązki stereocilii z rozdzielczością w nanoskali w żywych słuchowych komórkach rzęsatych ssaków

2.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62104

⸱

21 stycznia 2021

 ,  , 
1Department of Physiology, College of Medicine, University of Kentucky, 2Universidad Nacional de Colombia

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół dla Mikroskopii Konduktancji Jonów Sondy Skaczącej (HPICM), techniki bezkontaktowej sondy skanującej, która umożliwia nanoskalowe obrazowanie wiązek stereorzęsek w żywych słuchowych komórkach rzęsatych.

Streszczenie

Komórki rzęsate ucha wewnętrznego wykrywają przemieszczenia wywołane dźwiękiem i przekształcają te bodźce w sygnały elektryczne w wiązce włosów, która składa się ze stereocilii, które są ułożone w rzędy o rosnącej wysokości. Kiedy stereorzęski są odchylone, ciągną za maleńkie (~5 nm średnicy) zewnątrzkomórkowe ogniwa końcówek łączące stereorzęski, które przenoszą siły do mechanowrażliwych kanałów transdukcji. Chociaż mechanotransdukcja jest badana w żywych komórkach rzęsatych od dziesięcioleci, funkcjonalnie ważne szczegóły ultrastrukturalne maszynerii mechanotransdukcji na końcach stereorzęsek (takie jak dynamika połączenia końcówki lub zależna od transdukcji przebudowa stereorzęsek) mogą być nadal badane tylko w martwych komórkach za pomocą mikroskopii elektronowej. Teoretycznie techniki sond skanujących, takie jak mikroskopia sił atomowych, mają wystarczającą rozdzielczość, aby uwidocznić powierzchnię stereocilii. Jednak niezależnie od trybu obrazowania, nawet najmniejszy kontakt sondy mikroskopowej sił atomowych z wiązką stereocilii zwykle uszkadza wiązkę. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół obrazowania w mikroskopii konduktancyjnej jonów z sondą skaczącą (HPICM) żywych słuchowych komórek rzęsatych gryzoni. Ta bezkontaktowa technika sondy skanującej umożliwia obrazowanie poklatkowe powierzchni żywych komórek o złożonej topografii, takich jak komórki rzęsate, z rozdzielczością pojedynczych nanometrów i bez fizycznego kontaktu z próbką. HPICM wykorzystuje prąd elektryczny przepływający przez szklaną nanopipetę do wykrywania powierzchni komórki w bliskim sąsiedztwie pipety, podczas gdy system piezoelektryczny z pozycjonowaniem 3D skanuje powierzchnię i generuje jej obraz. Dzięki HPICM byliśmy w stanie obrazować wiązki stereocilii i ogniwa łączące stereocilia w żywych słuchowych komórkach rzęsatych przez kilka godzin bez zauważalnych uszkodzeń. Przewidujemy, że zastosowanie HPICM pozwoli na bezpośrednią eksplorację zmian ultrastrukturalnych w stereorzęskach żywych komórek rzęsatych w celu lepszego zrozumienia ich funkcji.

Wprowadzenie

Pomimo faktu, że wiązki stereocilii w słuchowych komórkach rzęsatych są wystarczająco duże, aby można je było zobaczyć za pomocą mikroskopii optycznej i odchylić w żywych komórkach w eksperymencie z patch clamp, podstawowe elementy strukturalne maszynerii transdukcyjnej, takie jak połączenia końcówek, mogły być zobrazowane tylko za pomocą mikroskopii elektronowej w martwych komórkach. W słuchowych komórkach rzęsatych ssaków maszyneria transdukcji znajduje się na dolnych końcach ogniw końcówki, tj. na końcach krótszego rzędu stereocilia1 i jest regulowana lokalnie poprzez sygnalizację na końcach stereocilia2,3. Jednak bezznacznikowe obrazowanie struktur powierzchniowych w tym miejscu w żywych komórkach rzęsatych nie jest możliwe ze względu na małe rozmiary stereocilii.

Ślimak ssaków ma dwa rodzaje komórek czuciowych słuchowych: wewnętrzne i zewnętrzne komórki rzęsate. W wewnętrznych komórkach rzęskowych rzęski są dłuższe i grubsze w porównaniu do tych w zewnętrznych komórkach rzęsatych4. Pierwszy i drugi rząd stereocilii mają średnicę 300-500 nm w wewnętrznych komórkach rzęsatych myszy lub szczura. Ze względu na dyfrakcję światła, maksymalna rozdzielczość osiągalna przy użyciu mikroskopii optycznej bez znaczników wynosi około 200 nm. W związku z tym wizualizacja poszczególnych stereocilii w pierwszym i drugim rzędzie wewnętrznego pęczka komórek rzęsatych jest stosunkowo łatwa dzięki mikroskopii optycznej. W przeciwieństwie do tego, stereorzęski krótsze rzędy w wewnętrznych komórkach rzęsatych i wszystkie stereorzęski zewnętrznych komórek rzęsatych mają średnicę około 100-200 nm i nie można ich uwidocznić za pomocą mikroskopii optycznej5. Pomimo niedawnego postępu w obrazowaniu superrozdzielczym, to fundamentalne ograniczenie utrzymuje się w każdym obrazowaniu optycznym bez znaczników. Wszystkie obecnie dostępne na rynku techniki super-rozdzielczości wymagają pewnego rodzaju cząsteczek fluorescencyjnych6, co ogranicza ich zastosowania. Oprócz ograniczeń wynikających z potrzeby specyficznych cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie, wykazano, że ekspozycja na intensywne promieniowanie świetlne indukuje uszkodzenia komórek i może wpływać na procesy komórkowe, co jest wielką wadą podczas badania żywych komórek7.

Nasza obecna wiedza na temat szczegółów ultrastrukturalnych wiązek stereocilia komórek rzęsatych została uzyskana głównie za pomocą różnych technik mikroskopii elektronowej (EM), takich jak skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM), transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM), zamrażalno-łamanie EM, a ostatnio dzięki technikom 3D, takim jak seryjne cięcie z skupioną wiązką jonów lub tomografią krio-EM8,9,10, 11,12,13,14,15,16. Niestety, wszystkie te techniki EM wymagają chemicznej lub kriofiksacji próbki. W zależności od skali czasowej zjawisk, wymóg ten sprawia, że badanie procesów dynamicznych na końcach stereocilii jest albo niemożliwe, albo bardzo pracochłonne.

Podjęto ograniczone wysiłki, aby zobrazować wiązki włosów żywych komórek włosowych za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM)17,18. Ponieważ AFM działa w roztworach fizjologicznych, teoretycznie może wizualizować dynamiczne zmiany w wiązkach stereorzęsek żywych komórek rzęsatych w czasie. Problem tkwi w zasadach działania AFM o wysokiej rozdzielczości, co implikuje pewien kontakt fizyczny między sondą AFM a próbką, nawet w najmniej szkodliwym trybie "stukania"19. Kiedy sonda AFM napotyka stereocilium, zwykle rozbija się o nie, uszkadzając strukturę wiązki włosów. W rezultacie, technika ta nie nadaje się do wizualizacji żywych, a nawet stałych, wiązek komórek włosowych17,18. Problem ten można częściowo rozwiązać, stosując dużą sondę AFM w kształcie kuli, która wywiera tylko siły hydrodynamiczne na powierzchnię próbki20. Jednakże, mimo że taka sonda idealnie nadaje się do badania właściwości mechanicznych próbki21, zapewnia tylko rozdzielczość submikrometrową podczas obrazowania narządu Corti22 i nadal przykłada do próbki siłę, która może być znaczna dla bardzo czułych wiązek stereocilia.

Skaningowa mikroskopia konduktancyjna jonowa (SICM) to wersja mikroskopii z sondą skanującą, która wykorzystuje szklaną sondę pipetową wypełnioną roztworem przewodzącym23. SICM wykrywa powierzchnię, gdy pipeta zbliża się do celi, a prąd elektryczny przepływający przez pipetę zmniejsza się. Ponieważ dzieje się to na długo przed dotknięciem komórki, SICM idealnie nadaje się do bezkontaktowego obrazowania żywych komórek w roztworze fizjologicznym24. Najlepsza rozdzielczość SICM jest rzędu pojedynczych nanometrów, co pozwala na rozdzielenie pojedynczych kompleksów białkowych na błonie plazmatycznej żywej komórki25. Jednak, podobnie jak w przypadku innych technik sond skanujących, SICM jest w stanie obrazować tylko stosunkowo płaskie powierzchnie. Pokonaliśmy to ograniczenie, wynajdując mikroskop konduktancyjny jonów z sondą skaczącą (HPICM)26, w którym nanopipeta zbliża się do próbki w każdym punkcie obrazowania (Rysunek 1A). Korzystając z HPICM, byliśmy w stanie zobrazować wiązki stereocilii w żywych słuchowych komórkach rzęsatych z rozdzielczością nanoskali27.

Kolejną fundamentalną zaletą tej techniki jest to, że HPICM to nie tylko narzędzie do obrazowania. W przeciwieństwie do innych technik sond skanujących, sonda HPICM/SICM jest elektrodą szeroko stosowaną w fizjologii komórki do zapisów elektrycznych i lokalnego dostarczania różnych bodźców. Aktywność kanałów jonowych zwykle nie zakłóca obrazowania HPICM, ponieważ całkowity prąd przepływający przez sondę HPICM jest o kilka rzędów wielkości większy niż prąd zewnątrzkomórkowy generowany przez największe kanały jonowe25. Jednak HPICM umożliwia precyzyjne pozycjonowanie nanopipety nad strukturą będącą przedmiotem zainteresowania, a następnie jednokanałowy zapis patch-clamp z tej struktury28. W ten sposób uzyskaliśmy pierwsze wstępne zapisy aktywności pojedynczego kanału na końcach zewnętrznej komórki rzęsatej stereocilia29. Warto wspomnieć, że nawet duży prąd przepływający przez nanopipetę nie jest w stanie spowodować znaczących zmian potencjału w poprzek błony plazmatycznej ze względu na ogromny bocznik elektryczny ośrodka zewnątrzkomórkowego. Jednak poszczególne kanały jonowe mogą być aktywowane mechanicznie przez przepływ cieczy przez nanopipetę30 lub chemicznie przez miejscowe zastosowanie agonisty31.

W HPICM obraz jest generowany, gdy nanopipeta sekwencyjnie zbliża się do próbki w jednym punkcie, cofa się, a następnie przesuwa w kierunku bocznym, aby powtórzyć podejście (Rysunek 1A). Wzmacniacz z zaciskiem krosowym stale przykłada napięcie do przewodu AgCl w pipecie (Rysunek 1B), aby wytworzyć prąd o wartości ~1 nA w roztworze kąpieli. Wartość tego prądu, gdy pipeta znajduje się z dala od powierzchni celi, jest określana jako prąd odniesienia (I ref, Rysunek 1C). Następnie pipeta przesuwa się w osi Z, aby zbliżyć się do próbki, aż prąd zostanie zmniejszony o wartość zdefiniowaną przez użytkownika (wartość zadana), zwykle 0,2%-1% wartości I ref (Rysunek 1C, górny ślad). Następnie system zapisuje wartość Z w tym momencie jako wysokość próbki wraz ze współrzędnymi X i Y tego punktu obrazowania. Następnie pipeta jest odsuwana od powierzchni (rysunek 1C, dolna ścieżka) z prędkością określoną przez użytkownika, zwykle 700-900 nm/ms. Po wycofaniu pipeta (lub, w naszym przypadku, próbka - patrz Rysunek 1B) jest przesuwana poprzecznie do następnego punktu obrazowania, uzyskuje się nową wartość prądu referencyjnego, a pipeta ponownie zbliża się do próbki, powtarzając proces. Ruch X-Y pipety jest preferowany w ustawieniu mikroskopu pionowego, który jest zwykle używany do rejestrowania prądów mechanotransdukcji komórek rzęsatych. W tym ustawieniu sonda HPICM zbliża się do wiązek komórek rzęsatych nie od góry, ale pod kątem32. Jednak najlepszą rozdzielczość obrazowania HPICM uzyskuje się w konfiguracji mikroskopu odwróconego (Rysunek 1A,B), w której ruch próbki w kierunkach X-Y jest oddzielony od ruchu Z nanopipety, eliminując w ten sposób potencjalne artefakty mechaniczne.

Korzystając z HPICM, uzyskaliśmy obrazy topograficzne wewnętrznych i zewnętrznych wiązek stereocilii komórek rzęsastych myszy i szczura, a nawet zwizualizowaliśmy powiązania między stereociliami o średnicy około 5 nm26,27. Powodzenie obrazowania pęczka komórek rzęsatych za pomocą tej techniki zależy od kilku czynników. Po pierwsze, szum (wariancja) prądu nanopipety powinien być jak najmniejszy, aby umożliwić najniższą możliwą wartość zadaną dla obrazowania HPICM. Niska wartość zadana pozwala sondzie HPICM "wyczuć" powierzchnię stereorzęsek w większej odległości i pod dowolnym kątem do zbliżenia sondy i, co zaskakujące, poprawia rozdzielczość X-Y obrazowania HPICM (patrz Dyskusja). Po drugie, drgania i dryfty w systemie powinny zostać zmniejszone do mniej niż 10 nm, ponieważ mają one bezpośredni wpływ na artefakty obrazowania. Wreszcie, mimo że sonda HPICM i stolik na próbkę są poruszane w osiach Z i X-Y przez skalibrowane siłowniki piezoelektryczne sterowane sprzężeniem zwrotnym, które mają dokładność jednego nanometra lub lepszą, średnica końcówki nanopipety określa rozpiętość prądu (objętość wykrywania), a tym samym rozdzielczość (Rysunek 1A). Dlatego przed obrazowaniem żywych komórek rzęsatych ważne jest, aby pobrać odpowiednie pipety, osiągnąć pożądaną rozdzielczość za pomocą próbek kalibracyjnych i osiągnąć niski poziom szumów w systemie rejestracji.

Przez co najmniej kilka dekad, technika SICM nie była dostępna komercyjnie i rozwija się tylko przez kilka laboratoriów na świecie z wiodącym laboratorium prof. Korcheva w Imperial College (Wielka Brytania). Ostatnio na rynku pojawiło się kilka systemów SICM (patrz tabela materiałów), z których wszystkie są oparte na oryginalnych zasadach HPICM. Jednak obrazowanie wiązek stereocilia w komórkach rzęsatych wymaga kilku niestandardowych modyfikacji, które są technicznie trudne (lub nawet niemożliwe) w zamkniętych systemach "gotowych do użycia". W związku z tym potrzebna jest pewna integracja komponentów. Ponieważ konfiguracja HPICM reprezentuje zestaw do zacisków krosowych z bardziej rygorystycznymi wymaganiami dotyczącymi wibracji i dryfu oraz napędzany piezoruchem sondy HPICM i próbki (Rysunek 1D), ta integracja jest stosunkowo łatwa dla każdego badacza, który jest biegły w zaciskaniu łat. Jednak naukowiec bez odpowiedniego zaplecza z pewnością musiałby najpierw przeszkolić się w zakresie elektrofizjologii. Pomimo pozostałych wyzwań, takich jak zwiększenie szybkości obrazowania (patrz Dyskusja), byliśmy w stanie zobrazować wiązki stereocilii w żywych komórkach rzęsatych z rozdzielczością nanoskalową bez ich uszkadzania.

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół do przeprowadzenia udanego obrazowania HPICM żywych pakietów słuchowych komórek rzęsatych u młodych pourodzeniowych szczurów lub myszy explantat przy użyciu naszego niestandardowego systemu. Zintegrowane komponenty są wymienione w tabeli materiałów. W dokumencie opisano również typowe problemy, które można napotkać, oraz sposoby ich rozwiązywania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych National Institutes of Health. Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Kentucky (protokół 00903M2005).

1. Produkcja i testowanie nanopipet

  1. Utwórz program w ściągaczu do mikropipet, aby uzyskać pipety o rezystancji od 200 do 400 MΩ, co odpowiada wewnętrznym średnicom końcówek około 50-70 nm. Parametry będą zależeć od ściągacza do mikropipet. Aby uzyskać krótkie pipety z nieelastycznymi cienkimi końcówkami, należy zapoznać się z instrukcją obsługi ściągacza.
  2. Używaj kapilar ze szkła borokrzemianowego o średnicy zewnętrznej/wewnętrznej 1/0,58 mm i filamentu wewnętrznego, aby ułatwić napełnianie. Długość pipety ma kluczowe znaczenie, ponieważ określa częstotliwość bocznego rezonansu mechanicznego pipety. Im dłuższa jest pipeta, tym niższa jest częstotliwość rezonansowa i tym trudniej jest uniknąć tego rezonansu.
    UWAGA: Użytkownik powinien starać się wyprodukować najkrótszą pipetę, jaką może zaakceptować uchwyt. Długość nanopipet w tym eksperymencie wynosi zwykle 15-25 mm (Rysunek 2A).
  3. Napełnij nanopipetę do jej środkowego punktu (Rysunek 2A) roztworem do kąpieli, L-15 Leibovitza lub zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS) uzupełnionym 20 mM D-glukozy (w celu dostosowania osmolarności). Aby uniknąć potencjalnych artefaktów, użyj tego samego roztworu, który będzie używany w wannie do nagrań.
  4. Za pomocą mikroskopu optycznego o powiększeniu 10x sprawdź, czy na końcówce pipety nie ma pęcherzyków powietrza (Rysunek 2B). Bąbelki uniemożliwiałyby przepływ prądu. Trudniej jest usunąć pęcherzyki w pipetach, które zostały wyciągnięte na kilka godzin przed eksperymentem. Dlatego zaleca się wyciąganie nowych pipet przy każdym eksperymencie.
  5. Gdy pipeta będzie wolna od pęcherzyków powietrza, zamontuj ją w uchwycie na pipety HPICM (Rysunek 2C).
  6. Umieścić próbkę (tkankę lub wzorzec kalibracyjny) w specjalnie zbudowanej komorze i dodać 4 ml wyżej wymienionego roztworu do kąpieli.
  7. Umieść specjalnie zbudowaną komorę na stoliku HPICM i wprowadź elektrodę masową do roztworu.
  8. Upewnij się, że napięcie przyłożone do pipety przez patch clamp amplifier wynosi zero.
  9. Przesuń pipetę w położeniu Z, aż dotknie cieczy.
  10. Ustaw przesunięcie wzmacniacza na zero, a następnie dodaj +100 mV, aby sprawdzić prąd pipety.
  11. Oblicz rezystancję i średnicę pipety w oparciu o prawo Ohma:
    R = V/I
    gdzie R jest rezystancją (MOhm), V jest napięciem przyłożonym do nanopipety (mV), a I jest prądem przepływającym przez nanopipetę (nA).
    1. Oblicz średnicę wewnętrzną pipety zgodnie z opisem w innym miejscu, zgodnie z następującym wzorem12:
      Końcówka ID = 1000/ √R
      UWAGA: Idealna wartość rezystancji wynosi od 200 do 400 MΩ. Pipety o rezystancji wyższej niż 400 MΩ mogą prowadzić do niestabilnego prądu ze względu na ich mały rozmiar (< 50 nm średnicy wewnętrznej). Z kolei pipety o rezystancji mniejszej niż 200 MΩ są zbyt duże (> średnicy wewnętrznej 70 nm) i nie rozwiązują problemów związanych z małymi elementami. Zaleca się rozpoczęcie obrazowania od pipet o rezystancji 200 MΩ, ponieważ są one łatwiejsze w produkcji i zwykle zapewniają mniej szumów elektrycznych.

2. Minimalizacja dryftu próbki i wibracji

UWAGA: Aby zmniejszyć szum mechaniczny w systemie podczas obrazowania, zamontuj próbki na specjalnie zbudowanych komorach, które wykorzystują grube szkiełka podstawowe (~1,2 mm):

  1. Zdejmij szklaną część z naczynia ze szklanym dnem o średnicy 50 mm, pozostawiając nienaruszone plastikowe ścianki.
  2. Przyklej plastikową część naczynia do hodowli komórkowych na grubym szkiełku za pomocą kleju silikonowego.
  3. Zamontuj próbkę kalibracyjną na środku komory (na górze szklanego szkiełka) za pomocą kleju silikonowego lub cienkiej taśmy dwustronnej.
  4. Mocno przymocuj komorę do stolika HPICM za pomocą taśmy dwustronnej.
  5. Podczas obrazowania zamknij klatkę Faradaya i przykryj ją kocem, aby odpowiednio zminimalizować zakłócenia elektryczne i dryf termiczny.

3.Testowanie rozdzielczości za pomocą wzorców kalibracji AFM

UWAGA: Zdecydowanie zaleca się obrazowanie standardów AFM (patrz Tabela materiałów) przed obrazowaniem żywych komórek w celu rozwiązania problemów z systemem i przetestowania jego rozdzielczości w osiach X-Z-Y. Wzorce kalibracyjne mają słupki i otwory z dwutlenku krzemu o różnych kształtach, ale o stałej wysokości/głębokości (tj. 20 lub 100 nm) na chipie krzemowym o wymiarach 5 x 5 mm. Zaleca się rozpoczęcie od standardu kalibracji 100 nm, aby zagwarantować, że rozdzielczość Z jest poniżej 100 nm. Po uzyskaniu udanego obrazu w wysokiej rozdzielczości filarów lub otworów w tej próbce kalibracyjnej (Rysunek 3A), przejdź do standardu 20 nm. Jeśli obrazowanie według tego ostatniego standardu zakończy się sukcesem (Rysunek 3B), gwarantowana jest rozdzielczość w osi Z poniżej 20 nm i odpowiednia do obrazowania wiązek stereocilia komórek rzęsatych12. Poniższe kroki służą do zobrazowania obu wzorców kalibracji.

  1. Przymocuj wzorzec kalibracyjny do komory za pomocą kleju silikonowego.
  2. Dodać 4 ml HBSS do komory, aby przykryć próbkę kalibracyjną. Następnie przymocuj komorę do stopnia XY zestawu HPICM za pomocą taśmy dwustronnej.
  3. Zacisnąć uchwyt magnetyczny elektrody masowej na stoliku w pobliżu komory i zanurzyć elektrodę w roztworze kąpieli (Rysunek 1B).
  4. Zamontuj nanopipetę w uchwycie, zanurz ją w roztworze kąpieli i ustaw jej prąd na ~1 nA, postępując zgodnie z czynnościami opisanymi w rozdziale 1.
  5. Umieścić nanopipetę mniej więcej powyżej środka wzorca kalibracyjnego za pomocą manipulatora z zaciskiem krosowym. Oględziny są zwykle wystarczające do tego pozycjonowania, ponieważ obszar pokryty strukturami dwutlenku krzemu jest stosunkowo duży (1 x 1 mm). W przeciwieństwie do narządu eksplantatów Cortiego (patrz poniżej), wzorzec kalibracyjny jest nieprzezroczysty i dlatego bardziej precyzyjne pozycjonowanie oparte na obrazowaniu optycznym nie jest możliwe dla tej próbki.
  6. Zwiększ wartość zadaną, jednocześnie monitorując sygnał z czujnika siłownika piezoelektrycznego Z na oscyloskopie w czasie rzeczywistym. Po ustaleniu stabilnego, powtarzalnego cyklu podejścia Z (jak w Rysunek 1C, na dole), zmniejsz wartość zadaną do wartości, która znajduje się tuż powyżej punktu niestabilności. Procedura ta zapewniłaby optymalną wartość zadaną dla tej konkretnej nanopipety.
  7. Przesuwać pipetę w dół z prędkością ~5 μm/s za pomocą mikromanipulatora z zaciskiem krosowym, aż dotrze do próbki. W tym momencie dolny poziom sygnału pozycjonowania Z w czasie rzeczywistym (Rysunek 1C) wzrośnie, co oznacza, że nanopipeta została wycofana z powodu "wyczuwania" powierzchni próbki. Jakikolwiek dalszy ruch nanopipety będzie skutkował dalszym dodatnim przesunięciem sygnału pozycjonowania Z.
    UWAGA: Należy uważać, aby nie przekroczyć górnej granicy ruchu siłownika piezoelektrycznego Z.
  8. Rozpocznij obrazowanie w niskiej rozdzielczości (patrz Tabela 1). Ze względu na nierównomierne mocowanie standardu AFM, najwyższy punkt obszaru zainteresowania może być nieznany. Dlatego należy ustawić amplitudę wciągania pipety (amplitudę przeskoku) na co najmniej 200-500 nm.
    1. Po zidentyfikowaniu najwyższego punktu próbki w obszarze obrazowania zmniejsz amplitudę przeskoku. Mniejsza amplituda przeskoku umożliwia szybsze skanowanie, które jest preferowane w przypadku obrazowania o wysokiej rozdzielczości ze względu na zmniejszone efekty dryftów i zmniejszone wibracje.
  9. Przed przeniesieniem pipety do nowego miejsca X-Y należy ją schować na około 200 μm w osi Z, aby zapobiec niepożądanym kolizjom z próbką.
    UWAGA: W przypadku, gdy nanopipeta nie jest wyrównana ze środkiem wzorca kalibracyjnego, możliwe jest, że skanowanie rozpocznie się tuż przy obszarze elementów powierzchni.
  10. Po znalezieniu obszaru zainteresowania rozpocznij obrazowanie w wyższej rozdzielczości (patrz Tabela 1).

4. Tworzenie specjalnie zbudowanych komór do zabezpieczania eksplantatów ślimaka

UWAGA: Zamontuj eksplantaty ślimakowe w komorach za pomocą specjalnie skonstruowanych systemów zaciskowych, które wykorzystują albo elastyczne szklane pipety (krok 4.1) (Rysunek 4A) lub nić dentystyczną (krok 4.2) (Rysunek 4B). Szklana komora pipety może być sterylizowana i używana do hodowanych narządów Cortiego, podczas gdy komora nici dentystycznej zapewnia pewniejsze trzymanie próbki i kontrolę nad orientacją wiązki stereocilia podczas montażu. Te zbudowane na zamówienie komory muszą być przygotowane wcześniej, ale można je wyczyścić i ponownie wykorzystać w kilku sesjach obrazowania.

  1. Wykonaj komorę za pomocą elastycznych szklanych pipet
    1. Wyciągnij dwa cienkie i elastyczne włókna szklane ze szklanych kapilar za pomocą ściągacza do pipet. Nasze ciągnione włókna szklane zazwyczaj mierzą od 1 do 2 cm długości i są dość elastyczne.
    2. Umieść małą kroplę elastomeru silikonowego na szklanym szkiełku nakrywkowym. Używaj szkiełek nakrywkowych o średnicy 2 cm.
    3. Umieść końce dwóch włókien szklanych na kropli silikonu i ułóż włókna tak, aby miały niewielki stopień separacji między nimi (Rysunek 4A).
    4. Umieść szkiełko nakrywkowe na gorącej płycie, aby szybko utwardzić elastomer (1 do 3 minut).
    5. Przykleić szkiełko nakrywkowe do szklanego dna komory opisanej w sekcji 2, używając niewielkiej ilości (1-3 μl) elastomeru silikonowego i pozostawiając do utwardzenia przez noc.
  2. Wykonanie komory za pomocą nici dentystycznej:
    1. Usuń szklaną część naczynia ze szklanym dnem o średnicy 50 mm, pozostawiając nienaruszone plastikowe ścianki. Następnie przyklej plastikową część naczynia do hodowli komórkowej na szkiełku o grubości 1,2 mm za pomocą kleju silikonowego.
    2. Zamontuj jedno plastikowe szkiełko nakrywkowe (6,5 x 6,5 mm) za pomocą tego samego kleju na środku komory. Następnie powtórz proces z kolejnym szkiełkiem nakrywkowym na poprzednim.
    3. Zamontuj dwa małe wolframowe lub pozłacane druty (12 mm długości i ~0,5 mm średnicy) za pomocą kleju silikonowego, każdy po przeciwnych stronach prowadnic pokrywy. Przyklej je wystarczająco daleko (> 10-15 mm) od szkiełek okładkowych (Rysunek 4B).
    4. Oddziel dwa pasma nici dentystycznej i umieść je na szkiełkach pokrywy i przymocuj do drutów, tworząc węzeł. Pozostaw niewielką przerwę między oboma nitkami (Rysunek 4B, krótkie strzałki).
  3. Wyczyść komory po każdym użyciu
    1. Delikatnie wyjmij chusteczkę z komory za pomocą cienkiej pęsety i delikatnie zeskrob wszelkie pozostawione resztki tkanek.
    2. Przepłucz komorę najpierw 70% etanolem, a następnie wodą destylowaną.
    3. W razie potrzeby powtórz cykl płukania.
    4. Umieść komorę do góry nogami na bibule filtracyjnej, aby wyschła do następnego eksperymentu. Komory nie muszą być sterylizowane, chyba że po obrazowaniu planowany jest pohodowla narządu Cortiego.

5. Sekcja organu gryzonia Cortiego

  1. Wykonaj sekcję młodych eksplantatów ślimaka po urodzeniu, jak szczegółowo opisano w innym miejscu13.
  2. W przypadku obrazowania HPICM należy wyciąć narząd Cortiego od myszy między 3. a 6. dniem po urodzeniu (P3-6) oraz od szczurów między 3. a 8. dniem po urodzeniu (P3-8).
    UWAGA: Starsze komórki rzęsate są bardziej podatne na uszkodzenia podczas preparacji i dlatego nie mogą być używane do wielogodzinnego obrazowania poklatkowego HPICM.
  3. Nie zapomnij usunąć membrany tektorialnej przed obrazowaniem HPICM.
  4. Natychmiast po wypreparowaniu należy zabezpieczyć tkankę w jednej z komór opisanych w sekcji 4, umieszczając ją pod elastycznymi szklanymi pipetami lub pod dwoma pasmami nici dentystycznej (Rysunek 4). Wstępnie napełnij te komory 4 ml roztworu łaźni o temperaturze pokojowej (w celu zminimalizowania tworzenia się pęcherzyków).

6. Obrazowanie słuchowych komórek rzęsatych

  1. Zamontuj komorę ze świeżo wyizolowanym organem Cortiego na stoliku piezoelektrycznym X-Y za pomocą taśmy dwustronnej i upewnij się, że jest ona mocno zamocowana, aby zminimalizować dryf komory w osiach X i Y (Rysunek 1B).
  2. Postępuj zgodnie z instrukcjami opisanymi w sekcji 1, aby umieścić nową nanopipetę i sprawdzić, czy jej rezystancja jest prawidłowa.
  3. Za pomocą mikromanipulatora z zaciskiem krosowym umieść nanopipetę nad obszarem komórek rzęsatych, obserwując narząd eksplantatu Cortiego w odwróconym mikroskopie.
  4. Sprawdź, czy system jest stabilny z wartością zadaną 0,5% lub niższą, rejestrując prąd w czasie rzeczywistym i sygnał pozycjonowania Z na oscyloskopie (jak w Rysunek 1C). Jeśli sygnał Z nie jest stabilny, spróbuj zmniejszyć częstotliwość odcięcia filtra dolnoprzepustowego patch clamp amplifier. Nie może być jednak krótszy niż czas reakcji siłownika piezoelektrycznego Z (aby uniknąć kolizji pipety z próbką z powodu opóźnionych odczytów prądu).
    UWAGA: W praktyce ustawienie tego filtra na 5 kHz okazuje się optymalne. Lepiej jest wymienić nanopipetę, jeśli sygnał Z jest nadal niestabilny.
  5. Po uzyskaniu stabilnego zapisu należy określić optymalną wartość zadaną i zbliżyć się do próbki za pomocą pipety HPICM zgodnie z opisem w krokach 3.6-3.7 powyżej.
  6. Najpierw należy wykonać obrazowanie w niskiej rozdzielczości (patrz tabela 1), stosując amplitudę przeskoku co najmniej 6 do 8 μm. Aby zobrazować wysokie struktury, takie jak wiązki rzęsek rzęsatych, upewnij się, że amplituda przeskoku jest wystarczająca, aby uniknąć kolizji z tymi strukturami.
    UWAGA: Jeśli amplituda przeskoku jest niewystarczająca, pipeta nie będzie w stanie przeskoczyć nad stereocilium i dojdzie do nieuchronnej kolizji. Zderzenie sondy HPICM ze stereocilium może uszkodzić wiązkę włosów. Dlatego w przypadkach, gdy wysokość wiązki stereocilia jest niepewna, należy użyć większej amplitudy przeskoku.
  7. Zapoznaj się z topografią narządu Cortiego, najpierw wykonując i/lub studiując obrazy uzyskane za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (Ryc. 5).
    UWAGA: Jeśli obraz HPICM jest jednolity, a wysokość jest mniejsza niż 1 μm w każdym punkcie obrazowania, pipeta prawdopodobnie skanuje szklane dno, a nie tkankę. Alternatywnie, pipeta może "wylądować" w innym obszarze eksplantatu ślimakowego, z dala od komórek rzęsatych.
  8. Jeśli pipeta musi zostać przeniesiona w nowe miejsce X-Y, należy ją cofnąć na około 500 nm, aby uniknąć kolizji z wysokimi elementami tkanki. Powtarzaj obrazowanie HPICM o niskiej rozdzielczości, aż zostanie znaleziony obszar zainteresowania z komórkami rzęsatymi.
  9. Po znalezieniu obszaru zainteresowania rozpocznij obrazowanie w wyższej rozdzielczości (patrz Tabela 1). Staraj się poświęcić mniej niż 15 minut na obrazowanie całego pęczka włosów.
    UWAGA: Wiązki komórek rzęsatych w żywej tkance nie są nieruchome, ale mogą zmieniać swoją orientację, na przykład z powodu zmian kształtu leżących pod spodem komórek podporowych. W związku z tym obrazy mogą wykazywać artefakty ruchu, jeśli akwizycja obrazu jest zbyt wolna.
  10. Po raz kolejny określ najwyższe cechy na obrazach o niskiej rozdzielczości przed zmniejszeniem amplitudy przeskoku w przypadku obrazowania o wysokiej rozdzielczości. W przypadku obszaru zainteresowania obejmującego cały pęczek komórek rzęsatych należy zmniejszyć amplitudę chmielu do 4-5 μm, natomiast w przypadku stosunkowo małego i "płaskiego" obszaru w obrębie pęczka (np. 2 x 2 μm) należy jeszcze bardziej zmniejszyć amplitudę przeskoku, do mniej niż 1 μm, zwiększając w ten sposób szybkość i rozdzielczość obrazowania.

7. Przetwarzanie obrazu

UWAGA: Artefakty obrazowania są powszechne w obrazowaniu HPICM. Niektóre z nich można skorygować za pomocą parametrów akwizycji obrazu, podczas gdy inne wymagają obróbki końcowej za pomocą specjalistycznej przeglądarki SICM lub bardziej ogólnych programów do przetwarzania danych, takich jak ImageJ lub MatLab. Tutaj opisujemy najczęstsze artefakty i sposób ich naprawiania za pomocą przeglądarki SICM.

  1. Wykonaj korekcję nachylenia
    UWAGA: Nie jest to oczywiste dla początkującego, ale ludzkie oko nie jest w stanie rozpoznać cech o rozmiarach submikrometrowych na powierzchni komórki, jeśli obszar obrazowania ma ogólne nachylenie równego lub większego rozmiaru (Rysunek 3A, B, po lewej). W związku z tym konieczne jest wyznaczenie średniego nachylenia obrazowanego obszaru (poprzez dopasowanie danych obrazu HPICM 3D do pojedynczej płaszczyzny) i odjęcie go od obrazu HPICM (Rysunek 3A,B, środek).
    1. Kliknij przycisk Otwórz, aby otworzyć obraz w przeglądarce SICM.
    2. Wybierz kartę Image Correction (Korekcja obrazu).
    3. Wybierz zakładkę Prawidłowe nachylenie.
    4. Naciśnij przycisk Popraw nachylenie, aby uzyskać automatyczną korektę nachylenia.
  2. Wykonaj wyrównanie linii
    UWAGA: Jak wspomniano wcześniej, dryfy mechaniczne i/lub termiczne, a także artefakty ruchu komórek stanowią poważny problem w obrazowaniu HPICM. Niewielki dryft z prędkością mniejszą niż mikrometr na minutę zwykle nie jest zauważalny w zwykłej konfiguracji zacisku krosowego. Mimo to w obrazowaniu HPICM można uzyskać artefakty o wielkości kilkudziesięciu nanometrów, które są znacznie większe niż rozdzielczość HPICM. Dlatego nierzadko zdarza się, że podczas obrazowania występują nagłe skoki w osi Z między dwiema sąsiednimi liniami skanowania HPICM. Można to skorygować, analizując różnice między początkowymi (i/lub końcowymi) wartościami Z w tych sąsiednich liniach skanowania.
    1. Kliknij przycisk Otwórz, aby otworzyć obraz w przeglądarce SICM.
    2. Wybierz kartę Image Correction (Korekcja obrazu).
    3. Wybierz zakładkę Prawidłowe nachylenie.
    4. Wybierz szerokość linii, które mają zostać wyrównane. Naciśnij przycisk ButtonDestripeLineFit, aby automatycznie skorygować wyrównanie linii.
  3. Wykonaj redukcję szumów
    UWAGA: Podczas uzyskiwania obrazów za pomocą HPICM niewielkie wahania prądu nanopipety mogą prowadzić do zatrzymania nanopipety daleko od powierzchni próbki, zwłaszcza przy niskich wartościach zadanych. Powoduje to pojawienie się małych białych kropek na obrazie. Aby skorygować ten artefakt obrazowania, konieczne jest zidentyfikowanie punktów obrazowania o wartości Z znacznie większej niż wartość sąsiadów i zastąpienie tej wartości średnią sąsiadów. Odbywa się to za pomocą regulowanego filtra mediany.
    1. Kliknij przycisk Otwórz, aby otworzyć obraz w przeglądarce SICM.
    2. Wybierz kartę Image Processing (Przetwarzanie obrazu).
    3. Wybierz kartę Redukcja szumów.
    4. Ustaw filtr Próg (μm) dla pikseli, które mają zostać usunięte.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Protokół przedstawiony w niniejszej pracy może być wykorzystany do wizualizacji dowolnych żywych komórek o złożonej topografii. Postępując zgodnie z tymi krokami, rutynowo uzyskujemy obrazy żywych wiązek komórek rzęsatych ucha szczura (Rysunek 6B,D). Pomimo niższej rozdzielczości w płaszczyźnie X-Y w porównaniu z obrazami SEM, nasze obrazy HPICM pozwalają pomyślnie rozdzielić poszczególne rzędy stereocilii, kształt ich wierzchołków, a nawet niewielkie połączenia (o średnicy ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Aby uzyskać udane obrazy HPICM, użytkownicy muszą stworzyć system o niskim poziomie hałasu i wibracji oraz wyprodukować odpowiednie pipety. Zdecydowanie zalecamy stosowanie wzorców kalibracyjnych AFM w celu przetestowania stabilności systemu przed próbą wykonania obrazowania żywych komórek. Po przetestowaniu rozdzielczości systemu użytkownicy mogą rozważyć obrazowanie nieruchomego narządu próbek Cortiego, aby zapoznać się z ustawieniami obrazowania przed przystąpieniem do obrazowania żywych komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Prof. Yuri Korchev (Imperial College, Wielka Brytania) za długoterminowe wsparcie i porady na wszystkich etapach projektu. Dziękujemy również dr. Pavlowi Novakowi i dr. Andrew Shevchukowi (Imperial College, Wielka Brytania) oraz Olegowi Belovowi (Narodowe Centrum Badań Audiologicznych, Rosja) za pomoc w tworzeniu oprogramowania. Badanie było wspierane przez NIDCD/NIH (R01 DC008861 i R01 DC014658 do G.I.F.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Oscyloskop analogowyB& K Precision2160COscyloskop analogowy do monitorowania w czasie rzeczywistym prądu nanopipet i podejścia do osi Z,
wzorce kalibracji AFMTED PELLA IncHS-100MG; HS-20MGTe wzorce kalibracyjne 100 i 20 nm są używane do testowania działania systemu HPICM
Laboratoryjny izolator drgańAMETEK/TMCEverstill K-400Aktywna izolacja
drgań Kapilary ze szkła borokrzemianowegoWorld Precision Instruments (WPI)1B100F-4Kapilary ze szkła borokrzemianowego do nanopipet
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270Do dodania do roztworu do kąpieli w celu regulacji osmolarności
DigitizerNational Instruments CorporationPCI-6221Wielokanałowy digitizer wejść/wyjść
Szybki analogowy regulator proporcjonalno-całkująco-pochodną (PID) dla ruchu ZStandford Research SystemsSIM900, SIM960, SIM980Moduły oprzyrządowania zintegrowane z zewnętrznym regulatorem PID dla ruchu Z. Wymaga szybkiej reakcji, która zwykle nie jest zaimplementowana w komercyjnych wzmacniaczach piezoelektrycznych.
Klatka FaradayaAMETEK/TMCTyp IIWymagany do ekranowania zakłóceń elektromagnetycznych
Szklana podstawkaprecyzyjne World Precision Instruments (WPI)FD5040-100Używany jako naczynie do komory na tkankę
Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS)Gibco, Thermo Fisher Scientific14025092Roztwór zewnątrzkomórkowy (do kąpieli)
Wzmacniacz oprzyrządowaniaBrownlee WzmacniaczModel 440zapewnia wymagane przesunięcia, filtrowanie i wtórne powiększenie lub tłumienie
Laserowy ściągacz do mikropipetSutter InstrumentP-2000/Gdo wytwarzania nanopipet. Laser jest potrzebny do ostrych pipet kwarcowych.
Lebovitz's L-15, bez czerwieni fenolowejGibco, Thermo Fisher Scientific21083027Roztwór zewnątrzkomórkowy (kąpielowy)
MikromanipulatorScientificaPatchStarSłuży do "kursowego" pozycjonowania siłownika piezoelektrycznego
Z MikroskopNikonEclipse TS100Odwrócony mikroskop optyczny
Wzmacniacz krosowyUrządzenia molekularneAxopatch 200BWzmacniacz patch clamp mierzy prąd przez nanopipetę
Wzmacniacz piezoelektryczny (osie XY)Physik Instrumente (PI)E-500.00, E-505.00, E-509. C2AWzmocnienie i regulacja PID dla stopnia translacji piezoelektrycznej XY
Wzmacniacz piezoelektryczny (oś Z)Piezosystem jenaENT 400 & 800Niestandardowy wzmacniacz składający się z zasilacza ENT 400 i dwóch wzmacniaczy ENT 800 równolegle w celu uzyskania maksymalnego prądu 1,6 nA
Szkiełka nakrywkowe z tworzywa sztucznegoTED PELLA Inc26028Używane do produkcji komór na tkanki 
Kontroler i oprogramowanie SICM*Ionscope, Wielka Brytania (ionscope.com)NiedotyczyNiestandardowy kontroler oparty na płytce SBC6711 cyfrowego przetwarzania sygnału firmy Innovative Integration Ltd
Elastomer silikonowy (Sylgard)World Precision Instruments (WPI)SYLG184Służy do mocowania elastycznych włókien szklanych do komory na tkankę
Klej silikonowyThe Dow Chemical Company734Służy do klejenia różnych części komory na tkankę
Pręt wolframowyA-M Systems717500Służy do przytrzymywania pasm nici dentystycznej w komorze na tkankę
Nanopozycjoner piezoelektryczny XYPhysik Instrumente (PI)P-733.2DDStolik translacyjny XY z czujnikami pojemnościowymi
Z nanopozycjoner piezoelektrycznyPiezosystem jenaRA 12/24 SGPierścieniowy siłownik piezoelektryczny z czujnikiem tensometrycznym
*Ionscope nie sprzedaje już oddzielnych kontrolerów SICM. Istnieje kilka innych komercyjnych systemów:  NX12-Bio oraz NX10 SICM, 
Park Systems, Korea i moduły SICM firmy ICAPPIC Limited, Wielka Brytania (icappic.com). Wszystkie te systemy bazują na oryginale 
Zasady HPICM. Jednak obrazowanie wiązek stereocilia w komórkach rzęsatych wymaga kilku niestandardowych modyfikacji, które są technicznie 
trudne (lub wręcz niemożliwe) w zamkniętym " Gotowy do pracy" systemy takie jak Ionscope lub NX12-Bio/NX10. Obecnie jest tylko jeden 
system modułowy (ICAPPIC), który jest elastyczny i pasuje do każdego eksperymentu SICM/HPICM, ale wymaga pewnej integracji komponentów.
, , Instrumenty oprzyrządowania Precision Ściągacz do mikropipet

Bibliografia

  1. Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging. Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).
  2. Effertz, T., Becker, L., Peng, A. W., Ricci, A. J. Phosphoinositol-4,5-bisphosphate regulates auditory hair-cell mechanotransduction-channel pore properties and fast adaptation. The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (48), 11632-11646 (2017).
  3. Peng, A. W., Gnanasambandam, R., Sachs, F., Ricci, A. J. Adaptation independent modulation of auditory hair cell mechanotransduction channel open probability implicates a role for the lipid bilayer. The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (10), 2945-2956 (2016).
  4. Engström, H., Engström, B. Structure of the hairs on cochlear sensory cells. Hearing research. 1 (1), 49-66 (1978).
  5. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nature Methods. 2 (12), 920-931 (2005).
  6. Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361 (6405), 880-887 (2018).
  7. Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348(2015).
  8. Pickles, J. O., Comis, S. D., Osborne, M. P. Cross-links between stereocilia in the guinea pig organ of Corti, and their possible relation to sensory transduction. Hearing Research. 15 (2), 103-112 (1984).
  9. Furness, D. N., Hackney, C. M. Cross-links between stereocilia in the guinea pig cochlea. Hearing Research. 18 (2), 177-188 (1985).
  10. Jacobs, R. A., Hudspeth, A. J. Ultrastructural correlates of mechanoelectrical transduction in hair cells of the bullfrog’s internal ear. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 55, 547-561 (1990).
  11. Goodyear, R. J., Marcotti, W., Kros, C. J., Richardson, G. P. Development and properties of stereociliary link types in hair cells of the mouse cochlea. The Journal of Comparative Neurology. 485 (1), 75-85 (2005).
  12. Kachar, B., Parakkal, M., Kurc, M., Zhao, Y., Gillespie, P. G. High-resolution structure of hair-cell tip links. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 13336-13341 (2000).
  13. Vélez-Ortega, A. C., Freeman, M. J., Indzhykulian, A. A., Grossheim, J. M., Frolenkov, G. I. Mechanotransduction current is essential for stability of the transducing stereocilia in mammalian auditory hair cells. eLife. 6, 1-22 (2017).
  14. Ivanchenko, M. V., et al. Serial scanning electron microscopy of anti-PKHD1L1 immuno-gold labeled mouse hair cell stereocilia bundles. Scientific Data. 7 (1), 182(2020).
  15. Hadi, S., Alexander, A. J., Vélez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. Myosin-XVa controls both staircase architecture and diameter gradation of stereocilia rows in the auditory hair cell bundles. Journal of the Association for Research in Otolaryngology JARO. 21 (2), 121-135 (2020).
  16. Metlagel, Z., et al. Electron cryo-tomography of vestibular hair-cell stereocilia. Journal of Structural Biology. 206 (2), 149-155 (2019).
  17. Langer, M. G., et al. Mechanical stimulation of individual stereocilia of living cochlear hair cells by atomic force microscopy. Ultramicroscopy. 82 (1-4), 269-278 (2000).
  18. Dufrêne, Y. F. Towards nanomicrobiology using atomic force microscopy. Nature Reviews Microbiology. 6 (9), 674-680 (2008).
  19. Putman, C. A., van der Werf, K. O., de Grooth, B. G., van Hulst, N. F., Greve, J. Viscoelasticity of living cells allows high resolution imaging by tapping mode atomic force microscopy. Biophysical journal. 67 (4), 1749-1753 (1994).
  20. Gavara, N., Chadwick, R. S. Noncontact microrheology at acoustic frequencies using frequency-modulated atomic force microscopy. Nature Methods. 7 (8), 650-654 (2010).
  21. Cartagena-Rivera, A. X., Van Itallie, C. M., Anderson, J. M., Chadwick, R. S. Apical surface supracellular mechanical properties in polarized epithelium using noninvasive acoustic force spectroscopy. Nature Communications. 8 (1), 1030(2017).
  22. Katsuno, T., et al. TRIOBP-5 sculpts stereocilia rootlets and stiffens supporting cells enabling hearing. JCI Insight. 4 (12), (2019).
  23. Hansma, P. K., Drake, B., Marti, O., Gould, S. A., Prater, C. B. The scanning ion-conductance microscope. Science. 243 (4891), 641-643 (1989).
  24. Korchev, Y. E., et al. Specialized scanning ion-conductance microscope for imaging of living cells. Journal of Microscopy. 188 (Pt 1), 17-23 (1997).
  25. Shevchuk, A. I., et al. Imaging proteins in membranes of living cells by high-resolution scanning ion conductance microscopy. Angewandte Chemie (International ed in English. 45 (14), 2212-2216 (2006).
  26. Novak, P., et al. Nanoscale live-cell imaging using hopping probe ion conductance microscopy. Nature Methods. 6 (4), 279-281 (2009).
  27. Vélez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. Visualization of live cochlear stereocilia at a nanoscale resolution using hopping probe ion conductance microscopy. Methods in Molecular Biology. 1427, 203-221 (2016).
  28. Gu, Y., et al. High-resolution scanning patch-clamp: new insights into cell function. FASEB Journal Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 16 (7), 748-750 (2002).
  29. Frolenkov, G. I., et al. Single-channel recordings from the apical surface of outer hair cells with a scanning ion conductance probe. Association for Research in Otolaryngology. Abs. 444, (2004).
  30. Sánchez, D., et al. Noncontact measurement of the local mechanical properties of living cells using pressure applied via a pipette. Biophysical Journal. 95 (6), 3017-3027 (2008).
  31. Korchev, Y. E., Negulyaev, Y. A., Edwards, C. R., Vodyanoy, I., Lab, M. J. Functional localization of single active ion channels on the surface of a living cell. Nature Cell Biology. 2 (9), 616-619 (2000).
  32. Shevchuk, A., et al. Angular approach scanning ion conductance microscopy. Biophysical Journal. 110 (10), 2252-2265 (2016).
  33. Furness, D. N., Katori, Y., Nirmal Kumar, B., Hackney, C. M. The dimensions and structural attachments of tip links in mammalian cochlear hair cells and the effects of exposure to different levels of extracellular calcium. Neuroscience. 154 (1), 10-21 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Pomiar przewodnictwa jonowego metod przeskakuj cej sondyobrazowanie HPICMobrazowanie ywych kom rekmechanizm mechanotransdukcjidynamika po cze wierzcho kowychpatch clamplimak organ Cortiego
Obrazowanie wiązki stereocilii z rozdzielczością w nanoskali w żywych słuchowych komórkach rzęsatych ssaków
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.