Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Niezawodna inżynieria i kontrola stabilnych optogenetycznych obwodów genowych w komórkach ssaków

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62109

⸱

6 lipca 2021

 ,  ,  , 
1Biomedical Engineering Department, Stony Brook University, 2Laufer Center for Physical and Quantitative Biology, Stony Brook University, 3Stony Brook Medical Scientist Training Program

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Niezawodna kontrola komórek ssaków reagujących na światło wymaga standaryzacji metod optogenetycznych. Aby osiągnąć ten cel, badanie to nakreśla linię budowy obwodów genowych, inżynierii komórkowej, obsługi sprzętu optogenetycznego i testów weryfikacyjnych w celu standaryzacji badania ekspresji genów indukowanej światłem przy użyciu optogenetycznego obwodu genowego o ujemnym sprzężeniu zwrotnym jako studium przypadku.

Streszczenie

Niezawodna kontrola ekspresji genów w komórkach ssaków wymaga narzędzi o dużej zmianie fałdowania, niskim poziomie szumu i określonych funkcjach transferu między wejściami a wyjściami, niezależnie od użytej metody. W tym celu w ciągu ostatniej dekady wiele uwagi poświęcono optogenetycznym systemom ekspresji genów w celu czasoprzestrzennej kontroli poziomów białek w komórkach ssaków. Jednak większość istniejących obwodów kontrolujących ekspresję genów indukowaną światłem różni się architekturą, jest wyrażana przez plazmidy i wykorzystuje zmienny sprzęt optogenetyczny, co stwarza potrzebę zbadania charakterystyki i standaryzacji składników optogenetycznych w stabilnych liniach komórkowych. W tym przypadku badanie dostarcza eksperymentalnego toku niezawodnej konstrukcji, integracji i charakterystyki obwodów genowych w celu kontrolowania indukowanej światłem ekspresji genów w komórkach ssaków, wykorzystując jako przykład obwodu optogenetycznego z ujemnym sprzężeniem zwrotnym. Protokoły ilustrują również, w jaki sposób standaryzacja sprzętu optogenetycznego i reżimów świetlnych może niezawodnie ujawnić cechy obwodu genowego, takie jak szum ekspresji genów i wielkość ekspresji białek. Wreszcie, artykuł ten może być przydatny dla laboratoriów niezaznajomionych z optogenetyką, które chcą zastosować taką technologię. Opisany tutaj rurociąg powinien mieć zastosowanie do innych obwodów optogenetycznych w komórkach ssaków, co pozwoli na bardziej wiarygodną, szczegółową charakterystykę i kontrolę ekspresji genów na poziomie transkrypcyjnym, proteomicznym i ostatecznie fenotypowym w komórkach ssaków.

Wprowadzenie

Podobnie jak inne dyscypliny inżynierskie, biologia syntetyczna ma na celu standaryzację protokołów, umożliwiając wykorzystanie narzędzi o wysoce powtarzalnych funkcjach do badania zagadnień związanych z systemami biologicznymi1,2. Jedną z dziedzin biologii syntetycznej, w której zbudowano wiele systemów kontroli, jest obszar regulacji ekspresji genów3,4. Kontrola ekspresji genów może być ukierunkowana zarówno na poziomy białek, jak i zmienność (szum lub współczynnik zmienności, CV = σ/μ, mierzony jako odchylenie standardowe od średniej), które są kluczowymi cechami komórkowymi ze względu na ich rolę w fizjologicznych i patologicznych stanach komórkowych5,6,7,8. Wiele syntetycznych systemów, które mogą kontrolować poziom białka i szum4,9,10,11,12 zostało zaprojektowanych, tworząc możliwości standaryzacji protokołów w różnych narzędziach.

Jednym z nowatorskich narzędzi do kontrolowania sieci genów, który pojawił się niedawno, jest optogenetyka, umożliwiająca wykorzystanie światła do kontrolowania ekspresji genów13,14,15,16,17. Podobnie jak ich chemiczni poprzednicy, optogenetyczne obwody genowe mogą być wprowadzane do dowolnego typu komórek, od bakterii po ssaki, umożliwiając ekspresję dowolnego genu będącego przedmiotem zainteresowania18,19. Jednak ze względu na szybkie generowanie nowych narzędzi optogenetycznych, pojawiło się wiele systemów, które różnią się architekturą obwodów genetycznych, mechanizmem ekspresji (np. integracja oparta na plazmidzie vs. integracja wirusowa) oraz sprzętem kontrolującym dostarczającym światło11,16,20,21,22,23,24,25. W związku z tym pozostawia to miejsce na standaryzację cech optogenetycznych, takich jak budowa i optymalizacja obwodów genowych, metoda wykorzystania systemu (np. integracja vs. ekspresja przejściowa), narzędzia eksperymentalne wykorzystywane do indukcji i analiza wyników.

Aby poczynić postępy w standaryzacji protokołów optogenetycznych w komórkach ssaków, ten protokół opisuje eksperymentalny proces inżynierii systemów optogenetycznych w komórkach ssaków przy użyciu obwodu genu ujemnego sprzężenia zwrotnego (NF) zintegrowanego z komórkami HEK293 (ludzka embrionalna linia komórkowa nerki) jako przykład. NF jest idealnym systemem do demonstracji standaryzacji, ponieważ występuje w dużej obfitości26,27,28 w przyrodzie, co pozwala na dostrojenie poziomów białka i zminimalizowanie szumów. Krótko mówiąc, NF pozwala na precyzyjną kontrolę ekspresji genów przez represor, który wystarczająco szybko redukuje własną ekspresję, ograniczając w ten sposób wszelkie zmiany od stanu ustalonego. Stan ustalony może być zmieniony przez induktor, który dezaktywuje lub eliminuje represor, aby umożliwić większą produkcję białka, aż do osiągnięcia nowego stanu ustalonego dla każdego stężenia induktora. Niedawno stworzono zmodyfikowany system optogenetyczny NF, który może wytwarzać szeroką dynamiczną odpowiedź ekspresji genów, utrzymywać niski poziom szumów i reagować na bodźce świetlne, co pozwala na przestrzenną kontrolę ekspresji genów11. Narzędzia te, znane jako tunery indukowane światłem (LITers), zostały zainspirowane wcześniejszymi systemami, które umożliwiały kontrolę ekspresji genów w żywych komórkach4,10,29,30 i były stabilnie zintegrowane z ludzkimi liniami komórkowymi, aby zapewnić długoterminową kontrolę ekspresji genów.

Tutaj, na przykładzie LITera, przedstawiono protokół tworzenia obwodów genowych reagujących na światło, indukowania ekspresji genów za pomocą Aparatu Płytki Świetlnej (LPA, sprzętu do indukcji optogenetycznej)31, oraz analizy odpowiedzi zmodyfikowanych, optogenetycznie kontrolowanych linii komórkowych na niestandardowe bodźce świetlne. Protokół ten pozwala użytkownikom na wykorzystanie narzędzi LITer dla dowolnego funkcjonalnego genu, który chcą zbadać. Można go również dostosować do innych systemów optogenetycznych o różnych architekturach obwodów (np. dodatnie sprzężenie zwrotne, negatywna regulacja itp.) poprzez integrację metod i sprzętu optogenetycznego opisanych poniżej. Podobnie jak w przypadku innych protokołów biologii syntetycznej, przedstawione tutaj nagrania wideo i protokoły optogenetyczne mogą być stosowane w badaniach pojedynczych komórek w różnych obszarach, w tym między innymi w biologii raka, rozwoju embrionalnym i różnicowaniu tkanek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Projekt obwodu genu

  1. Wybierz komponenty genetyczne do połączenia w pojedynczy obwód genu/plazmid (np. motywy sekwencji integracji DNA ssaków32, elementy reagujące na światło33 lub funkcjonalne geny34).
  2. Korzystając z dowolnego oprogramowania do inżynierii genetycznej i/lub klonowania molekularnego, przechowuj sekwencje DNA do późniejszego wykorzystania i odniesienia, opisz każdą sekwencję i zbadaj wszystkie niezbędne cechy (np. kodony START, sekwencje regulacyjne lub translowane)35.
  3. Opracuj lub zaadoptuj części zgodnie z ogólnym projektem obwodu genetycznego36. Na przykład, dla represorów optogenetycznych, takich jak w LITers11, połącz sekwencję genu kodującą domenę zdolną do degradacji indukowanej światłem37,38 lub inaktywacja zdolności wiązania DNA represora 39, w sąsiedztwie i w ramce genu represorowego (np. TetR)4.
    1. W przypadku aktywatorów optogenetycznych należy upewnić się, że występuje domena aktywatora40, która promuje ekspresję genów po wiązaniu DNA pod wpływem światła41. W przypadku autoregulacji ujemnej lub dodatniej należy upewnić się, że w promotorze genu regulatorowego lub przed nim znajduje się miejsce wiązania regulatorowego (np. miejsca tetO w promotorze wykazującym ekspresję TetR lub przed nim)42.
  4. Zaprojektuj startery do amplifikacji sekwencji DNA lub sekwencjonowania plazmidu za pomocą oprogramowania do klonowania molekularnego dla każdego obwodu genu.
  5. Walidacja obliczeniowa starterów pod kątem budowy plazmidu za pomocą wbudowanych funkcji oprogramowania do klonowania molekularnego (np. Wyrównanie sekwencji).
  6. Zamów startery oligonukleotydowe u producenta. Plazmidy skonstruowane i użyte w tej pracy można znaleźć w oryginalnym materiale pomocniczym11 wraz z zaprojektowanymi i użytymi starterami.
  7. Rozcieńczyć startery do stężenia 100 mM w wodzie podwójnie destylowanej (ddH2O).
  8. Rozcieńczyć zapas starterów o wielkości 100 mM do stężenia 10 mM do PCR.
  9. Przygotować mieszaninę PCR z 1 μl startera do przodu, 1 μl startera odwrotnego, 1 μl matrycy DNA o łącznej masie 0,5-500 ng dla DNA genomowego lub 0,5 pg-5 ng dla DNA plazmidowego lub wirusowego, 12,5 μl polimerazy DNA 2x mieszanina główna (lub objętość, która spełnia współczynnik rozcieńczenia określony przez producenta), i 9,5 μlddH2O, dla całkowitej objętości reakcji wynoszącej 25 μL.
  10. Inkubować mieszaninę PCR w termocyklerze przy odpowiednich ustawieniach w zależności od wybranego enzymu43. Sugerowane cykle reakcji obejmują:
    Etap 1: Jeden cykl 30-sekundowego etapu początkowej denaturacji w temperaturze 95 °C.
    Etap 2: 40 cykli po 5 s etapu denaturacji w temperaturze 98 °C.
    Etap 3: Jeden cykl trwający 30 s etapu wyżarzania w temperaturze 65 °C (określony na podstawie wcześniej zaprojektowanych starterów).
    Krok 4: Jeden cykl trwający 1 minutę rozciągania w temperaturze 72 °C (~1 kilobase (kb) długość fragmentu szablonu).
    Krok 5: Jeden cykl przedłużenia o 2 minuty w temperaturze 72 °C.
    Utrzymać reakcję w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie można ją przetestować za pomocą elektroforezy żelowej. Protokół ten będzie się różnić w zależności od użytych odczynników (np. polimerazy i).
  11. Powtórzyć krok 1.9 w celu amplifikacji wszystkich fragmentów, które mają być użyte w reakcji składania DNA wymaganej do połączenia liniowych produktów PCR w pojedynczy kolisty wektor DNA.
  12. Uruchom produkty PCR na 1% żelu agarozowym, a następnie oczyść pasma o pożądanej długości.
  13. Przygotować mieszaninę wzorcową do reakcji składania DNA (Tabela 1).
    UWAGA: W tym przykładzie wektor macierzysty jest dzielony na dwa fragmenty, aby zwiększyć wydajność etapów PCR bez powodowania znaczących zmian w ogólnym wyniku montażu.
  14. Inkubować główną mieszaninę reakcji składania DNA w termocyklerze w temperaturze 50 °C przez 1 godzinę (o ile nie określono inaczej w protokole odczynnika do składania DNA) i przechowywać reakcję w temperaturze 4 °C, aby wykorzystać produkt reakcji do transformacji bakteryjnej.
  15. Ustaw transformację bakteryjną (chemiczną lub elektroporację) przy użyciu kompetentnych komórek E. coli (Escherichia coli) i odpowiedniego protokołu transformacji bakteryjnej. Po przemianie należy użyć bakteryjnych płytek agarowych Luria-Bertani (LB) zawierających wybrany marker selekcji bakteryjnej (np. Ampicylinę) do płytki mieszaniny transformacyjnej. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc44.
  16. Sprawdź tabliczki następnego dnia. Aby zaszczepić kolonie, należy wybrać pojedyncze kolonie z płytek i ponownie zawiesić je w płynnym bulionie LB z odpowiednim markerem selekcji bakteryjnej w probówkach hodowlanych. Inkubować w inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 37 °C, 300 obr./min przez noc.
  17. Wykonaj protokół przygotowania plazmidu, aby wyekstrahować DNA plazmidu z kultury bakteryjnej.
  18. Sprawdź poprawność obwodu w dwóch krokach. Najpierw wykonaj próbne trawienie przy użyciu enzymów restrykcyjnych jako surowej weryfikacji, aby sprawdzić, czy uzyskano przybliżony produkt plazmidowy. Po drugie, jeśli trawienie testowe zakończy się pomyślnie/potwierdzeniem, prześlij plazmid do zakładu sekwencjonowania Sanger (lub procesu przy użyciu dostępnego sprzętu), aby uzyskać dokładną sekwencję DNA i porównać ją później z oczekiwaną sekwencją w oprogramowaniu do projektowania.
    1. Aby przeprowadzić trawienie testowe, wybierz co najmniej dwa enzymy restrykcyjne, które wytwarzają co najmniej dwa fragmenty, w oparciu o użyte oprogramowanie do klonowania molekularnego. Po wybraniu enzymów należy przygotować próbki do badań, dodając 1 μl każdego enzymu, 5 μl wygenerowanego DNA i 13 μl wody z odpowiednimi solami i w zależności od użytych enzymów. Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę lub zgodnie z sugestią producenta enzymu. Przeprowadź test produktów trawiennych na 1% żelu agarozowym i określ, czy prążki są prawidłowe.
      UWAGA: Jeśli pasma są prawidłowe, przejdź do sekwencjonowania.
    2. Aby przeprowadzić sekwencjonowanie, wygeneruj startery na podstawie DNA przechowywanego w oprogramowaniu tak, aby obszary wyżarzania starterów były oddalone od siebie o około 500 pz (par zasad) i pokrywały interesujący fragment (składnik obwodu genu) lub pełny plazmid. Rozcieńczyć startery czystą wodą wolną od nukleaz (NF-H2O) do stężenia 10 mM. Przygotować próbki do sekwencjonowania, dodając 1 μl 10 ng/μl DNA, 1 μl startera i 8 μl NF-H2O do probówki o pojemności 0,2 ml. Powtórz to dla każdego podkładu.
      UWAGA: Po przygotowaniu próbek należy je wrzucić do zakładu sekwencjonowania i porównać wyniki z sekwencją plazmidu za pomocą oprogramowania do klonowania molekularnego.
  19. Na tym etapie należy wygenerować około 100-1000 ng/μl próbki DNA w celu zintegrowania plazmidów zawierających obwody genowe z odpowiednią linią komórkową.

2. Stabilna inżynieria linii komórkowych

  1. Zamów linię komórkową ssaków przeznaczoną do szybkiego generowania stabilnych podlinii, które zapewniają wysoki poziom ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania z wektora ekspresji ssaków. Typ ogniwa i łatwość inżynierii linii komórkowych mogą być różne w zależności od tego, co użytkownicy preferują lub do czego dążą.
    1. Na przykład, jeśli użytkownicy preferują inżynierię linii komórkowych z minimalnymi etapami pośrednimi, uporządkuj komórki, które zawierają pojedyncze stabilne miejsce integracji (np. FRT) w transkrypcyjnie aktywnym locus genomowym. Jeśli preferowana jest bardziej zniuansowana inżynieria komórkowa, utwórz miejsca integracji w preferowanych lokalizacjach za pomocą narzędzi inżynierii genetycznej, takich jak CRISPR/Cas9.
  2. Hoduj komórki w 5% CO2 w wilgotnym powietrzu o temperaturze 37 °C. Dostosuj warunki wzrostu w razie potrzeby do typu komórek.
  3. Transfekcja obwodów genowych zaprojektowanych powyżej w pożądanych komórkach uzyskanych z poprzednich kroków, aby rozpocząć stabilny proces generowania linii komórkowej. Aby to osiągnąć, użyj mieszaniny liposomów45 DNA obwodu genu z odpowiednią rekombinazą (na przykład rekombinaza Flp do rekombinacji Flp-FRT) lub innymi metodami, takimi jak elektroporacja.
  4. Dwa dni po transfekcji podziel komórki do 25% zbiegu.
  5. Sześć godzin po podziale komórek rozpocznij selekcję antybiotyków od wymiany pożywki na świeżą pożywkę zawierającą 50 μg/ml antybiotyku higromycyny (lub innego antybiotyku odpowiadającego genowi oporności na antybiotyki u ssaków wybranemu podczas budowy plazmidu).
    UWAGA: Istnieje wiele genów oporności ssaków na antybiotyki wykorzystywanych w budowie obwodów genowych, z których każdy ma inną krzywą zabijania. W związku z tym, niezależnie od tego, który gen oporności na antybiotyki u ssaków zostanie wybrany do budowy obwodu, należy zbadać odpowiednią krzywą zabijania w komórkach będących przedmiotem zainteresowania. Ten krok zapewnia, że komórki zawierające ładunek obwodu genu są wzbogacone, podczas gdy te bez systemu są zabijane.
  6. Pozwól komórkom rosnąć w pożywce selekcyjnej antybiotyku, zmieniaj pożywkę na świeżą co 2-3 dni, aż na płytce lub kolbie pojawi się kilkadziesiąt ognisk. Przejdź kultury przylegające, gdy są w fazie logarytmicznej, zanim dotrą do konfluencji.
  7. Gdy jest wystarczająco dużo ognisk, trypsynizuj komórki 1 ml 0,25% trypsyny, 0,1% EDTA w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS) bez wodorowęglanu wapnia, magnezu i sodu przez kilka minut. Zneutralizuj trypsynę świeżą pożywką i przełóż wszystkie komórki do nowego pojemnika.
  8. Gdy komórki w świeżym pojemniku zlewają się w 80%-100%, zamroź je w mieszance 45% starych pożyw, 45% świeżych pożywek i 10% DMSO. Przenieś pozostałe komórki do sterylnej probówki i przeprowadź sortowanie pojedynczych komórek w celu wyizolowania komórek monoklonalnych na 96-dołkowej płytce.
  9. Około 2-3 tygodnie po sortowaniu monoklonalnym studzienki w 96-dołkowej płytce powinny mieć ogniska. Gdy około 50%-60% zlewa się, podziel komórki na 12-dołkową płytkę.
  10. Gdy 12-dołkowa płytka będzie zlewać się w 80%-100%, podziel ją na kolbę T-25 poddaną działaniu kultury tkankowej. Gdy komórki w kolbie T-25 zlewają się w 80%-100%, należy zamrozić komórki i utrzymać pasaż w celu scharakteryzowania i przetestowania linii komórek monoklonalnych.
    1. Scharakteryzuj monoklonalne linie komórkowe za pomocą mikroskopii i testów cytometrii przepływowej, aby przedstawić profile ekspresji genów w oparciu o indukowaną produkcję fluorescencyjną reportera. Zweryfikuj funkcjonalną produkcję białek za pomocą znakowania przeciwciałami fluorescencyjnymi i testu immunofluorescencyjnego. Przetestuj indukcję ekspresji genów na poziomie transkrypcji za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR). Walidacja sekwencji genetycznej i dokładności integracji poprzez sekwencjonowanie lokalne i całego genomu klonów.

3. Testy indukcji aparatury do lekkich płytek

  1. Zbuduj urządzenie LPA31,46, które będzie używane do indukcji światła w zmodyfikowanych komórkach. Krótko mówiąc, kilka szerokich kroków ma kluczowe znaczenie dla stworzenia LPA, które można wykorzystać do kontrolowania ekspresji genów. Obejmują one druk 3D elementów ramy LPA, budowę płytki drukowanej, programowanie obwodu za pomocą programatora mikrokontrolera, składanie komponentów w ostateczną wersję LPA, programowanie karty pamięci za pomocą oprogramowania IRIS oraz kalibrację gotowego urządzenia. Aby uzyskać bardziej szczegółowe wyjaśnienie, zapoznaj się z powyższymi odniesieniami.
    1. Wydrukuj części 3D zgodnie z opisem w Gerhardt et al. (2016 i 2019)31,46.
    2. Zmontuj płytkę drukowaną zgodnie z opisem w Gerhardt et al. (2016 i 2019)31,46.
    3. Dodaj oprogramowanie układowe do zmontowanego obwodu LPA za pomocą programatora mikrokontrolera, jak opisano w Gerhardt et al. (2016 i 2019)31,46.
    4. Połącz części drukowane w 3D i zmontowaną płytkę drukowaną, jak opisano w Gerhardt et al. (2016 i 2019)31,46. Obejmuje to zabranie płytki montażowej, płytki drukowanej, przekładki LED (diod elektroluminescencyjnych), adaptera płytki, płytki 24-dołkowej, pokrywy płytki, mocujących i nakrętek motylkowych oraz elementów do układania w stosy, jak pokazano na nakręconym filmie i Rysunek 2.
    5. Aby zaprogramować kartę pamięci i skalibrować urządzenie, postępuj zgodnie z instrukcjami opisanymi poniżej.
  2. Użyj oprogramowania IRIS dostępnego na stronie internetowej Tabor Lab47, aby zaprogramować kartę SD dla Light Plate Apparatus (LPA)31 i zbadaj odpowiednie warunki oświetleniowe potrzebne do rozpoczęcia eksperymentu optogenetycznego.
    UWAGA: Oprogramowanie IRIS to aplikacja internetowa do programowania optogenetycznego sprzętu elektronicznego, znanego jako LPA, opracowanego przez Tabor Lab. Oprogramowanie umożliwia programowanie względnych wartości IRIS, które sterują poszczególnymi diodami elektroluminescencyjnymi (LED) w każdej studzience sprzętu LPA.
  3. Wybierz opcję rozwijaną LPA (4 x 6), a następnie kliknij odpowiednie podejście do oświetlenia (Steady-state, Dynamic, Advanced).
    UWAGA: W tym manuskrypcie wszystkie testy skupią się na przykładach w stanie ustalonym. Można jednak użyć przykładów ustawień zaawansowanych dla czasów trwania impulsów i reżimów cyklu pracy.
  4. Wybierz, czy górne, czy dolne diody LED będą podświetlane, wprowadzając wartości w komórkach odpowiadających dołkom płytki. W przypadku LPA użytych w tej pracy we wszystkich eksperymentach zastosowano niebieskie diody LED umieszczone w górnej pozycji. Każda dioda LED, raz zaprogramowana, może zapewnić ciągłą ekspozycję na światło o stałym natężeniu światła. Oprogramowanie IRIS pozwala na 4096 poziomów intensywności, które można zaprogramować.
  5. Po wybraniu lokalizacji diod LED wprowadź wartości intensywności dla żądanego konspektu eksperymentu. Na przykład wprowadź 8 różnych natężeń światła (lub czasy trwania impulsów lub cykle pracy) z trzema kontrpróbami technicznymi na płytkę (tabela 2). GS odnosi się do jednostek skali szarości - wartości pomiaru poziomu natężenia światła używane do programowania LPA w oprogramowaniu IRIS.
    1. Projektując pliki eksperymentalne IRIS, należy pamiętać o efektach krawędziowych z sąsiednich studzienek na urządzeniu LPA, toksyczności światła wynikającej ze wzrostu intensywności ekspozycji na światło niebieskie oraz określeniu rodzaju pożądanej reakcji na dawkę (np. monotoniczna vs. niemonotoniczna).
    2. Jeśli użytkownicy zaprogramują komórki w LPA w kolejności rosnącej/malejącej określonego parametru światła (np. intensywności), studnie mogą wytwarzać efekty krawędziowe przesłuchów świetlnych, a nawet ciepło, które mogą wpływać na sąsiednie studnie. Może to nieumyślnie wpłynąć na wynik zmierzonych wyników po zakończeniu eksperymentów. Aby temu zaradzić, użytkownicy mogą zaimplementować macierz randomizacji w oprogramowaniu IRIS, aby zaszyfrować lokalizacje studni, minimalizując efekty krawędziowe. Przykład jest opisany w Reprezentatywnych Wynikach poniżej (Rysunek 4A-B).
    3. Ponadto stwierdzono, że wyższe natężenie niebieskiego światła zakłóca wzrost i żywotność komórek48. Dlatego, aby złagodzić toksyczność światła, ważne jest, aby uzyskać natężenie światła, czas trwania impulsu lub krzywą odpowiedzi cyklu pracy w zależności od badanej modalności.
      1. Na przykład zaprogramuj 8 wartości natężenia światła z trzema powtórzeniami na płytkę 24-dołkową, w zakresie od braku światła do maksymalnej intensywności LPA. Następnie uruchom te próbki na cytometrze przepływowym z bramką SSC-FSC lub żywym barwnikiem, takim jak jodek propidyny, aby określić ilościowo przeżywalność komórek populacyjnych (żywe komórki w porównaniu z całkowitymi zdarzeniami, w tym martwymi komórkami/szczątkami komórkowymi) przy każdej wartości światła.
      2. Następnie określ idealną przeżywalność populacji dla konfiguracji eksperymentalnej, ponieważ każdy bodziec może niekorzystnie wpłynąć na proliferację, ekspresję genów lub przeżycie (np. ustawienie 80% przeżycia komórek jako odpowiedniego kompromisu). Na przykład w tej pracy, po kalibracji, intensywność nie przekraczała 3000 jednostek g.s. (~3/4 maksymalnej intensywności urządzenia LPA). Przykład tego jest opisany w reprezentatywnych wynikach poniżej.
    4. Oprócz ograniczenia wartości światła ze względu na toksyczność, użytkownicy mogą chcieć ograniczyć wartości światła w celu scharakteryzowania określonej części reakcji na dawkę, takiej jak zakres odpowiedzi monotonnej.
      1. Aby to osiągnąć, należy najpierw zeskanować szeroki zakres natężeń światła, czasów trwania impulsów lub cykli pracy w zależności od modalności analizowanej podczas określania pożądanej odpowiedzi na dawkę (Tabela 2), aby zawęzić interesujący reżim świetlny, np. gdzie ekspresja genów koreluje dodatnio ze wzrostem wartości światła dla monotonnej odpowiedzi na dawkę.
      2. Aby określić interesujący nas zakres światła, zaprogramuj pojedynczy LPA z maksymalnie 24 dołkami o różnej intensywności / czasie trwania impulsu / cyklu pracy / itp. lub więcej dołków (np. 48, 72, 96 itd.) w zależności od tego, czy wiele LPA jest skalibrowanych w celu dostarczania równoważnych ilości światła i kontynuuj prace nad hodowlą komórkową lub testy opisane poniżej. Dlatego należy rozpocząć charakterystykę systemu optogenetycznego z szerokim zakresem dawek bodźców świetlnych, aby określić przedział zakresu, który daje pożądaną ekspresję genu, a następnie przeprowadzić eksperymenty w tym wyrafinowanym zakresie dawek.
      3. Na przykład w tej pracy raz określono 3000 g.s. jednostek jako próg natężenia toksycznego światła; próg ten został użyty jako górna granica światła dla testów opisanych poniżej (np. immunofluorescencja).
        UWAGA: Powyższe kroki są niezależne od kalibracji optycznej LPA i odnoszą się do kalibracji na poziomie molekularnym dla każdego systemu optogenetycznego.
  6. Po zaprogramowaniu odpowiednich wartości natężenia światła w IRIS włóż kartę pamięci z gniazdem USB 3.0 do LPA, aby pobrać i przesłać files.
  7. Jeśli kalibracja LPA została zakończona31, przejdź do prac nad hodowlą komórkową w celu rozpoczęcia testu indukcji światła. Jeśli kalibracja nie została wykonana, skalibruj LPA za pomocą metody analizy obrazu (kroki 3.7.1-3.7.3) po zaprogramowaniu LPA za pomocą programatora mikrokontrolera.
    1. Krótko zaprogramuj LPA tak, aby miał ten sam poziom IRIS, jak opisano przez Gerhardt et al. (2016)31.
      UWAGA: Do kalibracji LPA został zaprogramowany na wartość 2000 g.s.
    2. Po zaprogramowaniu urządzenia za pomocą karty pamięci i naciśnięciu przycisku resetowania (fizyczny przycisk na LPA) uzyskaj obraz całego urządzenia (np. imagera stacji żelowej, skanera itp.). W celu kalibracji należy uzyskać dwa obrazy przy urządzeniu obróconym o 180°.
    3. Następnie użyj oprogramowania typu open source zaprojektowanego przez Gerhardt et al. (2016)31, aby pokazać zmienność intensywności diod LED na płycie LPA i obliczyć wartości kompensacji LED, aby intensywność była równa we wszystkich studzienkach. Przykład tego jest opisany w przedstawionych poniżej wynikach (Rysunek 3). Po zakończeniu kalibracji przystąp do prac związanych z hodowlą komórkową w celu zainicjowania testu indukcji światła.
  8. Zaopatrz się w kolby ze zmodyfikowanymi komórkami monoklonalnymi z poprzedniej sekcji, aby zbadać wpływ indukcji światła na ekspresję genów.
  9. Usunąć stare podłoże z kolby.
  10. Dodaj 1 ml trypsyny do komórek i inkubuj przez 5 minut.
  11. Po 5 minutach zneutralizuj trypsynę, dodając 4 ml zmodyfikowanej Dulbecco pożywki Eagle's (DMEM lub innej pożądanej pożywki) uzupełnionej niezbędnymi chemikaliami (w tej pracy użyto 50 μg/ml higromycyny, 1% roztworu penicyliny/streptomycyny, 10% płodowej surowicy bydlęcej, FBS).
  12. Dodaj ~ 75 000 komórek na studzienkę w 24-dołkowej czarnej płytce o łącznej objętości 500 μL. Liczba zasianych komórek może się różnić w zależności od czasu trwania pożądanego eksperymentu i użytego typu komórki.
    UWAGA: Dodatkowo należy pamiętać, że gęstość wysiewu komórek wpływa na utrzymanie kultury i potencjalnie czas trwania eksperymentu. Rozpoczęcie od mniejszej liczby komórek w studzience zapewnia dłuższy czas trwania, zanim kultura osiągnie konfluencję. Co więcej, rodzaj komponentów optogenetycznych zintegrowanych z obwodami genów będącymi przedmiotem zainteresowania będzie miał wpływ na to, kiedy ekspresja genów osiągnie stan ustalony, a tym samym wpłynie na czas trwania eksperymentów. Inne czynniki, które można wziąć pod uwagę, to tempo wzrostu specyficzne dla linii komórkowej, skład pożywki i warunkowe efekty wzrostu (tj. światło).
  13. Po posianiu umieść komórki w nawilżonym inkubatorze z 5% CO2 , aby mogły osiąść przez 2-6 godzin.
  14. Po inkubacji przenieś komórki do kaptura do hodowli tkankowej, zdejmij plastikową pokrywkę i dodaj samoprzylepny pasek folii na wierzch płytki (Rysunek 2D). Ten krok pozwala na minimalny transfer światła między studzienkami, ponieważ górna i boczna część studni są powlekane, a światło może teraz wchodzić tylko z dołu studni, w której znajduje się dioda LED.
  15. Umieść płytkę w dopasowanych częściach 3D LPA. Następnie przykryj płytkę wydrukowaną w 3D pokrywką LPA, która pasuje do urządzenia w każdym rogu.
  16. Podłącz urządzenie do źródła zasilania i naciśnij przycisk resetowania na urządzeniu LPA, aby upewnić się, że zaktualizowane ustawienia eksperymentu LPA zostały zastosowane.
  17. Inkubować komórki w systemie eksperymentalnym przez odpowiednią ilość czasu, w zależności od pierwotnej gęstości wysiewu, prędkości wzrostu specyficznej dla linii komórkowej i warunków wzrostu. W tym przykładzie linie komórkowe były indukowane przez 3 dni w sposób ciągły, aby ekspresja genów osiągnęła stan ustalony. Należy jednak zauważyć, że wiele systemów optogenetycznych (np. VVD) może osiągnąć ekspresję genów w stanie stacjonarnym znacznie wcześniej (np. 24 godziny), a zatem czasy indukcji eksperymentalnej mogą być skracane lub wydłużane w zależności od potrzeb.
  18. Pod koniec eksperymentu z indukcją światła wykorzystaj próbki do dowolnego z poniższych czterech testów, aby scharakteryzować zmodyfikowane linie komórkowe (sekcje 4-7).

4. Mikroskopia fluorescencyjna komórek inżynierii wywołanej światłem

  1. 24-72 godziny po indukcji usunąć komórki z LPA z inkubatora i umieścić je w kapturze do hodowli tkankowych.
  2. Usuń pasek folii i pozostaw talerz na 1-2 minuty. Zapobiega to tworzeniu się kondensatu na plastikowej pokrywce, jeśli zostanie umieszczona bezpośrednio na talerzu.
  3. Po 1-2 minutach siedzenia połóż oryginalną plastikową pokrywkę z powrotem na talerzu.
  4. Zobrazuj komórki za pomocą odpowiedniego kontrastu fazowego lub mikroskopu fluorescencyjnego.
  5. W zależności od instrumentu dostosuj czas ekspozycji, intensywność źródła światła i wzmocnienie, aby wyświetlić zmodyfikowane komórki. W tym eksperymencie zastosowano następujące parametry: 50 ms dla czasu ekspozycji źródła światła FITC/GFP (zielone białko fluorescencyjne) i 1-5 ms dla czasu ekspozycji z kontrastem fazowym przy 100% intensywności dla każdego.
    UWAGA: Należy zauważyć, że optymalne czasy ekspozycji, poziomy wzmocnienia i intensywności źródła światła są często uzyskiwane empirycznie z doświadczenia tej pracy, aby zminimalizować przesycenie reportera fluorescencji, zminimalizować uszkodzenia komórek i uchwycić odpowiednie obrazy do analizy jakościowej i ilościowej. Określając poziomy każdego z tych parametrów, aspekty, o których należy pamiętać, obejmują maksymalizację stosunku sygnału do szumu, minimalizację fototoksyczności, minimalizację przesycenia sygnałów fluorescencyjnych oraz zwiększenie zdolności do wzmacniania słabych sygnałów fluorescencyjnych.
    1. Optymalizuj te parametry rażąco ad hoc, jednak poprzednie wartości eksperymentalne (np. natężenie źródła światła powodujące przesycenie reportera fluorescencji) mogą kierować przyszłymi ustawieniami eksperymentalnymi, jeśli ma to zastosowanie. Na przykład ustawienia wzmocnienia, czasy ekspozycji i wartości początkowe natężenia światła z jednego obwodu (LITer1.0) lub konfiguracji eksperymentalnej (np. natężenie światła) mogą być wykorzystane jako punkt wyjścia przy przechodzeniu do podobnego, ale innego obwodu genowego (LITer2.0)11 lub innej modalności światła (np. lekki cykl pracy).
  6. Usprawnij obrazowanie płytek za pomocą szablonu współrzędnych zaprogramowanego w oprogramowaniu mikroskopowym, co pozwala na automatyczne pozyskiwanie obrazu dla całego rozmiaru płytki (np. 24 dołków) z wielu lokalizacji obrazu na studzienkę.

5. Cytometria przepływowa komórek inżynierii wywołanej światłem

  1. 24-72 godziny po indukcji, po obrazowaniu wyjąć komórki z LPA w inkubatorze lub z mikroskopu i umieścić je w kapturze do hodowli tkankowej.
  2. W przypadku wyjęcia bezpośrednio z LPA usuń pasek folii i pozostaw płytkę na minutę lub dwie.
  3. Odessać pożywkę z każdej studzienki (z całej płytki 24-dołkowej, jeśli wszystkie studzienki są używane).
  4. Dodaj 100 μl 0,25% trypsyny do każdej studzienki, przykryj płytkę plastikową pokrywką i umieść ją z powrotem w inkubatorze.
  5. Pozostawić komórki w inkubatorze w spokoju przez 5 minut.
  6. Po 5 minutach wyjąć płytkę i umieścić ją z powrotem w kapturze do hodowli tkankowej.
  7. Zneutralizuj każdą trypsynizację dobrze za pomocą 400 μl DMEM.
  8. Oznacz probówkę okrągłodenną o pojemności 5 ml z polistyrenu z sitkiem do komórek (lub odpowiednią probówką do cytometrii przepływowej, którą można przefiltrować w celu usunięcia dużych grudek komórek, które nie są w pełni trypsynizowane) nazwą odpowiadającą każdej studzience.
  9. Użyj pipety P1000, aby pipetować zawartość każdej studzienki w górę i w dół 6-8 razy, aby rozbić grudki komórek i utworzyć próbki jednokomórkowe do cytometrii przepływowej49.
  10. Przenieś całą zawartość każdej studzienki (~500 μL) do oznaczonych probówek z sitkiem.
  11. Przynieś komórki do odpowiedniego przyrządu do cytometrii przepływowej z laserami o odpowiednich długościach fal (można umieścić probówki z komórkami na lodzie lub z lodu).
    UWAGA: Cytometr przepływowy używany w tej pracy był częścią głównego obiektu znajdującego się w szpitalu uniwersyteckim.
  12. Utwórz bramkę rozproszenia do przodu i z boku (odpowiednio FSC i SSC), aby wychwycić pojedyncze komórki o odpowiedniej wielkości i ziarnistości, aby wykluczyć zanieczyszczenia i grudki komórkowe w oprogramowaniu do cytometrii przepływowej.
  13. Po ustawieniu bramki przechwyć około 10 000 komórek za pomocą odpowiedniej bramki. Dostosuj tę liczbę w zależności od ilości danych komórkowych, których szukają użytkownicy. Powtórz te czynności dla każdej probówki zawierającej komórki z eksperymentu.
  14. Po zakończeniu eksperymentu zaimportuj dane do dostępnego oprogramowania do danych cytometrii przepływowej w celu analizy.
  15. Utwórz bramkę FSC-SSC (tak jak wcześniej podczas akwizycji) i zastosuj ją do każdej partii danych eksperymentalnych. Studnia referencyjna nieindukowanej populacji komórek jest używana do tworzenia tej bramki w tym manuskrypcie, ale istnieją inne metryki do tworzenia bramek, takie jak bramki oparte na gęstości.
  16. W warunkach eksperymentalnych bramkowanych bramką FSC-SSC, należy wykreślić dane cytometrii przepływowej w postaci histogramów lub przedstawić w inny sposób, aby zilustrować uzyskane wzorce ekspresji. W tym eksperymencie fluorescencja została uchwycona przez kanały GFP/FITC lub PE/TexasRed.

6. Ekstrakcja RNA i ilościowy PCR składników obwodu genu

  1. 24-72 godziny po indukcji, po obrazowaniu wyjąć komórki z LPA w inkubatorze lub z mikroskopu i umieścić je w kapturze do hodowli tkankowej.
  2. W przypadku wyjęcia bezpośrednio z LPA usuń pasek folii i pozostaw płytkę na minutę lub dwie.
  3. Odessać pożywkę z każdej studzienki (z całej płytki 24-dołkowej, jeśli wszystkie studzienki są używane).
  4. Przystąp do ekstrakcji RNA z komórek za pomocą odpowiedniego zestawu do ekstrakcji RNA.
  5. Po zakończeniu ekstrakcji RNA należy przeprowadzić reakcję odwrotnej transkrypcji każdej próbki (Tabela 3).
  6. Następnie należy przeprowadzić ilościową reakcję PCR każdej próbki (Tabela 4). Wykorzystaj polimerazę DNA i powiązany protokół do skonfigurowania reakcji PCR. Na tym etapie skonfiguruj reakcję multipleksowaną z genem porządkowym i genem będącym przedmiotem zainteresowania lub utwórz oddzielne reakcje. W tym przykładzie zbadano poziomy GFP, KRAS i dehydrogenazy gliceryno-3-fosforanowej (GAPDH). Po zakończeniu eksperymentu qRT-PCR należy przystąpić do analizy za pomocą dostępnego oprogramowania, aby zilustrować zmianę fałdowania obwodu genu na poziomie RNA.

7. Immunofluorescencja składników obwodu genu

  1. Użyj łaźni lodowej lub zamrażarki, aby schłodzić metanol.
  2. 24-72 godziny po indukcji, po obrazowaniu wyjąć komórki z LPA w inkubatorze lub z mikroskopu i umieścić je w kapturze do hodowli tkankowej.
  3. W przypadku wyjęcia bezpośrednio z LPA usuń pasek folii i pozostaw płytkę na 1-2 minuty.
  4. Odessać pożywkę z każdej studzienki (z całej płytki 24-dołkowej, jeśli wszystkie studzienki są używane).
  5. Dodaj 100 μl 0,25% trypsyny do każdej studzienki, przykryj płytkę plastikową pokrywką i umieść ją z powrotem w inkubatorze.
  6. Pozostawić komórki w inkubatorze w spokoju przez 5 minut.
  7. Po 5 minutach wyjąć płytkę i umieścić ją z powrotem w kapturze do hodowli tkankowej.
  8. Zneutralizuj każdą trypsynizację dobrze za pomocą 400 μl DMEM.
  9. Oznacz mini-probówki wirówkowe nazwami odpowiadającymi każdej studzience.
  10. Użyj pipety P1000 i odpipetuj zawartość każdej studzienki w górę iw dół 6-8 razy, aby rozbić grudki komórek.
  11. Przenieś całą zawartość każdej studzienki (~500 μL) do oznaczonych probówek.
  12. Odwirowywać komórki przez 5 minut przy 400 x g.
  13. Po zakończeniu odrzucić supernatant i przenieść próbki do dygestorium chemicznego.
  14. Ponownie zawiesić komórki (użyj pipety P1000 i pipety w górę iw dół 6-8 razy w każdej probówce, aby rozbić grudki komórek) w 750-1000 μl 4% paraformaldehydu (rozcieńczonego w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej, PBS).
  15. Pozostaw komórki na 15 minut w temperaturze pokojowej.
  16. Po inkubacji dodać 750-1000 μL PBS. Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół.
  17. Odwirowywać komórki przez 5 minut przy 400 x g.
  18. Po zakończeniu odrzucić supernatant i przenieść próbki do dygestorium chemicznego.
  19. Ponownie zawiesić komórki (użyj pipety P1000 i pipetuj w górę i w dół 6-8 razy w każdej probówce, aby rozbić grudki komórek) w 750-1000 μl lodowatego metanolu.
  20. Pozostaw komórki na 30 minut na lodzie lub w zamrażarce o temperaturze -20 °C.
  21. Po inkubacji dodać 750-1000 μL PBS. Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół.
  22. Odwirowywać komórki przez 5 minut przy 400 x g.
  23. Po zakończeniu odrzucić supernatant i przenieść próbki do dygestorium chemicznego.
  24. W zależności od rodzaju zastosowanych przeciwciał należy od tego momentu zmodyfikować protokół. Wykonaj kroki 7.24.1-7.24.14 lub 7.24.15-7.24.22.
    1. W przypadku stosowania przeciwciała pierwszorzędowego i wtórnego należy ponownie zawiesić komórki za pomocą pipety P1000/P200 i pipetować w górę i w dół 6-8 razy w każdej probówce, aby rozbić grudki komórek w 100 μl przeciwciała pierwszorzędowego. W tym przypadku wykonano rozcieńczenie w stosunku 1:800 dla przeciwciał podstawowych, w tym przeciwciała KRAS lub przeciwciała ERK, i pozostawiono na 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przeciwciała rozcieńczano w buforze inkubacyjnym wykonanym z 1x PBS z 0,5 g BSA.
      UWAGA: Określ empirycznie dokładne rozcieńczenie przeciwciała, tworząc standardową krzywą rozcieńczeń przeciwciał w funkcji antygenu będącego przedmiotem zainteresowania.
    2. Po dodaniu przeciwciał przykryj probówki folią, aby zapobiec wpływowi światła na znakowane przeciwciała.
    3. Po inkubacji dodać 750-1000 μl buforu do inkubacji. Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół.
    4. Odwirowywać komórki przez 5 minut przy 400 x g.
    5. Po zakończeniu odrzucić supernatant i przenieść próbki do dygestorium chemicznego.
    6. Ponownie zawiesić komórki za pomocą pipety P1000/P200 i pipetować w górę iw dół 6-8 razy w każdej probówce, aby rozbić grudki komórek w 100 μl przeciwciała wtórnego. W tym przypadku komórki zawieszono ponownie w 100 μl przeciwciała drugorzędowego w rozcieńczeniu 1:800 dla przeciwciała KRAS lub 1:2000 dla przeciwciała ERK i pozostawiono na 30 minut w temperaturze pokojowej. Podobnie jak w przypadku przeciwciał pierwszorzędowych, rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w buforze inkubacyjnym, jak opisano powyżej. Określić rozcieńczenia przeciwciał drugorzędowych na podstawie empirycznych wyników krzywej wzorcowej.
    7. Po dodaniu przeciwciał przykryj probówki folią, aby zapobiec wpływowi światła na znakowane przeciwciała.
    8. Po inkubacji dodać 750-1000 μl buforu do inkubacji. Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół.
    9. Odwirowywać komórki przez 5 minut przy 400 x g.
    10. Po zakończeniu odrzucić supernatant i przenieść próbki do dygestorium chemicznego.
    11. Ponownie zawiesić komórki za pomocą pipety P1000 i pipetować w górę iw dół 6-8 razy w każdej probówce, aby rozbić grudki komórek w 500 μl PBS.
    12. Przenieś całą zawartość każdej probówki (~500 μL) do oznaczonych probówek z sitkami.
    13. Przynieś komórki do odpowiednich przyrządów do cytometrii przepływowej z laserami o odpowiednich długościach fal (można umieścić probówki z komórkami na lodzie lub z lodu).
      UWAGA: Należy zauważyć, że posiadanie kilku kontroli jest ważne dla postępu w pomiarze cytometrii przepływowej i analizie ekspresji genów w zmodyfikowanych komórkach. Na przykład posiadanie całkowicie niebarwionych komórek, komórek wybarwionych samym przeciwciałem pierwszorzędowym i komórek barwionych samym przeciwciałem drugorzędowym może być przydatne do porównywania wyników z sygnałami tła od przeciwciał.
    14. Następnie kontynuuj analizę zgodnie z opisem w sekcji 5.
    15. Jeśli używasz tylko przeciwciała pierwszorzędowego, ponownie zawieś komórki za pomocą pipety P1000/P200 i pipetuj w górę iw dół 6-8 razy w każdej probówce, aby rozbić grudki komórek w 100 μl znakowanego przeciwciała pierwszorzędowego. Określić odpowiednie rozcieńczenie przeciwciał i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Empirycznie określić rozcieńczenie przeciwciał na podstawie krzywej wzorcowej.
    16. Po dodaniu przeciwciał przykryj probówki folią, aby zapobiec wpływowi światła na znakowane przeciwciała.
    17. Po inkubacji dodać 750-1000 μl buforu do inkubacji. Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół.
    18. Odwirowywać komórki przez 5 minut przy 400 x g.
    19. Ponownie zawiesić komórki za pomocą pipety P1000 i pipetować w górę iw dół 6-8 razy w każdej probówce, aby rozbić grudki komórek w 500 μl PBS.
    20. Przenieś całą zawartość każdej probówki (~500 μL) do oznakowanych probówek z sitkami.
    21. Przynieś komórki do odpowiednich przyrządów do cytometrii przepływowej z laserami o odpowiednich długościach fal (można umieścić probówki z komórkami na lodzie lub z lodu).
      UWAGA: Należy zauważyć, że posiadanie kilku kontroli jest ważne dla postępu w pomiarze cytometrii przepływowej i analizie ekspresji genów w zmodyfikowanych komórkach. Posiadanie całkowicie niewybarwionych komórek i komórek wybarwionych samym przeciwciałem pierwszorzędowym jest przydatne do porównywania wyników z sygnałami tła od przeciwciał.
    22. Od tego momentu należy przystąpić do analizy opisanej w punkcie 5.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Montaż obwodów genowych i generowanie stabilnych linii komórkowych opisane w tym artykule oparto na komercyjnych, zmodyfikowanych komórkach HEK-293 zawierających transkrypcyjnie aktywny, pojedynczy stabilny punkt FRT (Rysunek 1). Obwody genowe skonstruowano w wektorach zawierających miejsca FRT w plazmidzie, umożliwiając integrację Flp-FRT do genomu komórek HEK-293. Takie podejście nie ogranicza się wyłącznie do komórek Flp-In, ponieważ miejsca FRT można wprowadzić do dowolnej linii komórkow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Czytelnicy tego artykułu mogą uzyskać wgląd w kroki niezbędne do scharakteryzowania optogenetycznych obwodów genowych (a także innych systemów ekspresji genów), w tym: 1) projektowanie, budowę i walidację obwodów genów; 2) inżynieria komórkowa służąca do wprowadzania obwodów genowych do stabilnych linii komórkowych (np. rekombinacja Flp-FRT); 3) indukcja zmodyfikowanych ogniw za pomocą platformy opartej na świetle, takiej jak LPA; 4) wstępna charakterystyka testów indukcji światła za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej; ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować laboratorium Balázsi za komentarze i sugestie, dr Karlowi P. Gerhardtowi i dr Jeffreyowi J. Taborowi za pomoc w budowie pierwszego LPA, oraz dr Wilfriedowi Weberowi za udostępnienie plazmidów LOV2-degron. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health [R35 GM122561 i T32 GM008444]; Centrum Biologii Fizycznej i Ilościowej im. Laufera; oraz stypendium National Defense Science and Engineering Graduate (NDSEG) Fellowship. Finansowanie opłaty za otwarty dostęp: NIH [R35 GM122561].

Wkład autora: M.T.G. i G.B. byli pomysłodawcami projektu. M.T.G., D.C. i L.G. przeprowadzili eksperymenty. M.T.G., D.C., L.G. i G.B. przeanalizowali dane i przygotowali manuskrypt. Nadzór nad projektem sprawowali G.B. i M.T.G.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2 ml probówki do PCREppendorf951010006odczynnik do przeprowadzania PCR
0,25% Trypsyna EDTA 1XThermo Fisher ScientificMT25053CIodczynnik do rozszczepiania i pobierania komórek ssaków
0,5-10 μ L Pipeta o regulowanej objętościEppendorf3123000020narzędzie używane do reakcji pipetowania
100-1000 μ l Pipeta o regulowanej objętościEppendorf3123000039narzędzie używane do reakcji pipetowania
20-200 μ L Pipeta o regulowanej objętościEppendorf3123000055narzędzie służące do reakcji pipetowania
2-20 μ L Pipeta o regulowanej objętościEppendorf3123000039narzędzie używane do reakcji pipetowania
5 ml polistyenowej probówki z okrągłym dnem z nasadką sitka komórkowegoOdczynnik Corning352235do cytometrii przepływowej
Wirówka 5702R, z 4 x 100 Rotor, adaptery 15 i 50 ml, 120 VEppendorf22628113sprzęt do pracy z hodowlą ssaków
AgarozaDenville ScientificGR140-500odczynnik do elektroforezy
żelowej Folie aluminiowe do płytek 96-dołkowychVWR®60941-126narzędzie używane do pokrywania płytek w eksperymentach z indukcją światła
AmpicillinSigma AldrichA9518-5Godczynnik do selekcji bakterii z prawidłowym plazmidem
Analogowy mieszalnik wirowyThermo Fisher Scientific02215365PRnarzędzie do przeprowadzania reakcji PCR, transformacji lub ekstrakcji żelu
Bacto Dehydrated AgarFisher ScientificDF0140010odczynnik do hodowla bakterii
BD LSRAriaBD656700narzędzie do sortowania zmodyfikowanych linii komórkowych w populacje monoklonalne
BD LSRFortessaBD649225narzędzie do charakteryzowania zmodyfikowanych linii komórkowych
BSA, Albumina surowicy bydlęcejŹródło naukowe OdczynnikSIGA4919-1Gdo buforu
inkubacyjnego IFPłytka do hodowli komórkowych 12-dołkowa, przezroczysta, z płaskim dnem i pokrywką, polistyren, niepirogenna, standard-TCPłytka 353043 Corningsłużąca do hodowli komórek monoklonalnych
WirówkaVWR22628113przyrząd do hodowli komórek ssaków
Chemiczny dygestoriumNiePrzyrząd do przeprowadzania reakcji IF
Przezroczysta płytka do hodowli komórkowych 24-dołkowa płaska z pokrywkąBD353047płytka używana do hodowli komórek monoklonalnych
Nasadka filtra CytoOne T25 Kolba TCUSA ScientificCC7682-4825pojemnik do hodowli komórek ssaków
Fischer ScientificBP231-100stosowany do zamrażania zmodyfikowanych komórek ssaków
Bromek etydynyThermo Fisher Scientific15-585-011odczynnik do elektroforezy żelowej
Falcon 96 Well Clear Flat Bottom Mikropłytka hodowlana poddana działaniu TC, z pokrywkąna 353072Corningdo hodowli posortowanych komórek monoklonalnych
Oprogramowanie FCSExpress De Novo:dotyczyoprogramowania do charakteryzowania danych cytometrii przepływowej
Surowica bydlęca płodu, zwykła, USDA 500 mlOdczynnik Corning35-010-CVdo hodowli komórek
ssakówFisherbrand Szalki Petriego z przezroczystą pokrywką - podniesiony grzbiet; 100 x 15 mmFisher ScientificFB0875712sprzęt do hodowli bakterii
Gibco  DMEM, Odczynnik High GlucoseThermo Scientific11-965-092do hodowli komórek ssaków
Hs00932330_m1 izoforma KRAS A Test ekspresji genów TaqmanTechnologies4331182qPCR Probe
Hygromycyna B (50 mg/mL), 20 mLLife Technologies10687-010odczynnik do selekcji komórek z prawidłową integracją obwodów genowych
iScript Odwrotna transkrypcja SupermixBio-Rad Laboratories1708890odczynnik do konwersji RNA do cDNA
Zamrażarka Laboratoryjna -20 ° CVWR76210-392sprzęt do przechowywania odczynników eksperymentalnych
Zamrażarka laboratoryjna -80 ° CSprzęt PanasonicMDF-U74VCdo przechowywania odczynników eksperymentalnych
Lodówka laboratoryjna +4 ° CVWR76359-220sprzęt do przechowywania odczynników eksperymentalnych
LB Broth (Lennox), 1 kgSigma-AldrichL3022-250Godczynnik do hodowli bakterii
LIPOFECTAMINE 3000Life TechnologiesL3000008reagemt do transfekcji obwodów genowych do komórek ssaków
MATLAB 2019MathWorksN/Aoprogramowanie do analizy danych
eksperymentalnychMetanolAcros Organics413775000odczynnik do reakcji immunofluorescencyjnej
Probówki do mikrowirówek, polipropylen 1,7 mlPojemnik z tworzywa sztucznegoVWR20170-333
Mr04097229_mr EGFP/YFP Test ekspresji genów TaqmanTechnologie 4331182qPCR Sonda MultiTherm
ShakerBenchmark ScientificH5000-HCdo badań bakteryjnych transformacja
Spektrofotometr NanoDrop LiteThermo Fisher ScientificSprzęt ND-NDL-US-CANdo pomiaru stężenia DNA/RNA
NEB Q5 Polimeraza DNA o wysokiej wierności 2x Master MixNEBM0492Sodczynnik do PCR fragmentów obwodu genu
NEB10-beta Kompetentny E. coli (wysoka wydajność)New England Biolabs (NEB)C3019Hdo amplifikacji obwodu genowego Interesujące
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNew England Biolabs (NEB)E2621Lodczynnik do łączenia frakcji obwodów genowych
Mikroskop odwrócony Nikon Eclipse Ti-E z kamerą DS-Qi2Nikon Instruments Inc.Instrument N/Ado ilościowego oznaczania ekspresji genów
NIS-ElementsNikon Instruments Inc.Oprogramowanie N/Ado charakteryzowania danych z mikroskopii fluorescencyjnej
oligonukleotydyIDTN/Aodczynnik używany do PCR składników obwodu genowego
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Inkubator z UV i H2O2 SterowaniePanasonicMCO-170AICUVHL-PAInstrument do hodowli komórek
ssakówParaformaldehyd, 16% mikroskopia elektronowa klasyelektronowej Mikroskopia elektronowa Sciences15710-S
odczynnik PBS, sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (D-PBS) (1x) Odczynnik14190144 dohodowli komórek ssaków, odczynnik do buforu inkubacyjnego IF
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL), 100xFisher Scientific15140-122odczynnik do hodowli komórek
ssakówpierwotne przeciwciało ERKTechnologia sygnalizacji komórkowej4370Spodstawowe przeciwciało ERK do immunofluorescencji
pierwotne przeciwciało KRASSigma-AldrichWH0003845M1podstawowe przeciwciało KRAS do immunofluorescencji
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)Qiagen27106do oczyszczania plazmidów obwodu genowego
Zestaw do ekstrakcji żelu QIAquick (50)Qiagen28704zestaw odczynników do oczyszczania fragmentów obwodu genowego
QuantStudio 3 Real-Time PCR SystemEppendorfA28137qRT-PCR
Oprogramowanie Thermo Fisher ScientificN/Ado ilościowego oznaczania amplificaitonu RNA/cDNA
RNeasy Plus Mini KitQiagen74134zestaw do ekstrakcji RNA z komórek zmodyfikowanych ssaków
Wtórne przeciwciałoERKTechnologia sygnalizacji komórkowej8889Swtórne przeciwciało ERK do immunofluorescencji
wtórne przeciwciało KRASInvitrogenA11005wtórne przeciwciało KRAS do immunofluorescencji
Pipety serologiczne 5,0 mlOdczynniki Olympus Plastics12-102używane do wywoływania różnych reakcji chemicznych
System obrazowania SmartView ProGłówna naukaUVCI-1200narzędzie do obrazowania prawidłowych prążków PCR
SnapGene Viewer (darmowy) lub SnapGeneOprogramowanie SnapGeneN/AProjektowanie i analiza sekwencji DNA
Inkubator TopStage Tokai HitINU-TIZnarzędzie do przeprowadzania reakcji PCR, transformacji lub ekstrakcji żelu
Odczynnik TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific4444557do PCR fragmentów
obwodów genowychTaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (sonda VIC/MGB), starter limited, 2500 rxnLife Technologies4326317EqPCR Probe
TermocyklerBio-Rad1851148narzędzie do przeprowadzania reakcji PCR, transformacji lub ekstrakcji żelu
VisiPlate-24, 24-dołkowa mikropłytka z przezroczystym dnem, sterylna i poddana hodowli tkankowejPłytka PerkinElmer1450-605używana do indukcji światła
eksperymenty Jednorazowe pipety Pasteura VWR, szkło, szkło borokrzemianowe Pipet, krótka końcówka, pojemność=2 mL, długość całkowita=14,6 cmVWR14673-010do hodowli komórek ssaków
VWR Mini poziome systemy elektroforetyczne, system żelowy Mini10VWR89032-290do elektroforezy żelowej DNA
Flp-In 293Thermo Fisher ScientificR75007Inżynierska linia komórkowa z FRT miejsce
dotyczy Odczynnik Pojemnik Nie Life Komórki bakteryjne mikroskopii Zestaw odczynników sprzęt do aplikacji do względnej kwantyfikacji Odczynnik Sprzęt

Bibliografia

  1. Sedlmayer, F., Hell, D., Muller, M., Auslander, D., Fussenegger, M. Designer cells programming quorum-sensing interference with microbes. Nature Communications. 9 (1), 1822(2018).
  2. Cho, J. H., Collins, J. J., Wong, W. W. Universal chimeric antigen receptors for multiplexed and logical control of T cell responses. Cell. 173 (6), 1426-1438 (2018).
  3. Saxena, P., et al. A programmable synthetic lineage-control network that differentiates human IPSCs into glucose-sensitive insulin-secreting beta-like cells. Nature Communications. 7, 11247(2016).
  4. Nevozhay, D., Zal, T., Balazsi, G. Transferring a synthetic gene circuit from yeast to mammalian cells. Nature Communications. 4, 1451(2013).
  5. Chang, H. H., Hemberg, M., Barahona, M., Ingber, D. E., Huang, S. Transcriptome-wide noise controls lineage choice in mammalian progenitor cells. Nature. 453 (7194), 544-547 (2008).
  6. Balazsi, G., van Oudenaarden, A., Collins, J. J. Cellular decision making and biological noise: from microbes to mammals. Cell. 144 (6), 910-925 (2011).
  7. Lee, J., et al. Network of mutually repressive metastasis regulators can promote cell heterogeneity and metastatic transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 364-373 (2014).
  8. Dar, R. D., Hosmane, N. N., Arkin, M. R., Siliciano, R. F., Weinberger, L. S. Screening for noise in gene expression identifies drug synergies. Science. 344 (6190), 1392-1396 (2014).
  9. Becskei, A., Seraphin, B., Serrano, L. Positive feedback in eukaryotic gene networks: cell differentiation by graded to binary response conversion. EMBO Journal. 20 (10), 2528-2535 (2001).
  10. Nevozhay, D., Adams, R. M., Murphy, K. F., Josic, K., Balazsi, G. Negative autoregulation linearizes the dose-response and suppresses the heterogeneity of gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5123-5128 (2009).
  11. Guinn, M. T., Balazsi, G. Noise-reducing optogenetic negative-feedback gene circuits in human cells. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7703-7714 (2019).
  12. Shimoga, V., White, J. T., Li, Y., Sontag, E., Bleris, L. Synthetic mammalian transgene negative autoregulation. Molecular Systems Biology. 9, 670(2013).
  13. Ye, H., Daoud-El Baba, M., Peng, R. W., Fussenegger, M. A synthetic optogenetic transcription device enhances blood-glucose homeostasis in mice. Science. 332 (6037), New York, N.Y. 1565-1568 (2011).
  14. Pudasaini, A., El-Arab, K. K., Zoltowski, B. D. LOV-based optogenetic devices: light-driven modules to impart photoregulated control of cellular signaling. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, 18(2015).
  15. Liu, Y., et al. Robust and intensity-dependent synaptic inhibition underlies the generation of non-monotonic neurons in the mouse inferior colliculus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 131(2019).
  16. Benzinger, D., Khammash, M. Pulsatile inputs achieve tunable attenuation of gene expression variability and graded multi-gene regulation. Nature Communications. 9 (1), 3521(2018).
  17. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  18. Duan, L., et al. Understanding CRY2 interactions for optical control of intracellular signaling. Nature Communications. 8 (1), 547(2017).
  19. Kim, N., et al. Spatiotemporal control of fibroblast growth factor receptor signals by blue light. Chemistry & Biology. 21 (7), 903-912 (2014).
  20. Jung, H., et al. Noninvasive optical activation of Flp recombinase for genetic manipulation in deep mouse brain regions. Nature Communications. 10 (1), 314(2019).
  21. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. Light-inducible gene regulation with engineered zinc finger proteins. Methods in Molecular Biology. 1148, 89-107 (2014).
  22. Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo activities of light-inducible dimers: A cellular optogenetics guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
  23. Lee, D., Hyun, J. H., Jung, K., Hannan, P., Kwon, H. B. A calcium- and light-gated switch to induce gene expression in activated neurons. Nature Biotechnology. 35 (9), 858-863 (2017).
  24. Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
  25. Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546(2016).
  26. Chen, R., et al. Rhythmic PER abundance defines a critical nodal point for negative feedback within the circadian clock mechanism. Molecular Cell. 36 (3), 417-430 (2009).
  27. Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
  28. Sato, T. K., et al. Feedback repression is required for mammalian circadian clock function. Nature Genetics. 38 (3), 312-319 (2006).
  29. Kramer, B. P., Fischer, C., Fussenegger, M. BioLogic gates enable logical transcription control in mammalian cells. Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 478-484 (2004).
  30. Madar, D., Dekel, E., Bren, A., Alon, U. Negative auto-regulation increases the input dynamic-range of the arabinose system of Escherichia coli. BMC Systems Biology. 5, 111(2011).
  31. Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6, 35363(2016).
  32. Szczesny, R. J., et al. Versatile approach for functional analysis of human proteins and efficient stable cell line generation using FLP-mediated recombination system. PLoS One. 13 (3), 0194887(2018).
  33. Taxis, C. Development of a synthetic switch to control protein stability in eukaryotic cells with light. Methods in Molecular Biology. 1596, 241-255 (2017).
  34. Grav, L. M., et al. Minimizing clonal variation during mammalian cell line engineering for improved systems biology data generation. ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2148-2159 (2018).
  35. Brophy, J. A., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nature Methods. 11 (5), 508-520 (2014).
  36. Yeoh, J. W., et al. An automated biomodel selection system (BMSS) for gene circuit designs. ACS Synthetic Biology. 8 (7), 1484-1497 (2019).
  37. Usherenko, S., et al. Photo-sensitive degron variants for tuning protein stability by light. BMC Systems Biology. 8, 128(2014).
  38. Muller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. An optogenetic upgrade for the Tet-OFF system. Biotechnology and Bioengineering. 112 (7), 1483-1487 (2015).
  39. Klotzsche, M., Berens, C., Hillen, W. A peptide triggers allostery in tet repressor by binding to a unique site. Journal of Biological Chemistry. 280 (26), 24591(2005).
  40. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  41. Herrou, J., Crosson, S. Function, structure and mechanism of bacterial photosensory LOV proteins. Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 713-723 (2011).
  42. Yao, F., et al. Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. Human Gene Therapy. 9 (13), 1939-1950 (1998).
  43. Erlich, H. A. PCR technology : Principles and Applications for DNA Amplification. , Stockton Press. New York. (1989).
  44. Sambrook, J., Russell, D. W., Sambrook, J. The condensed protocols from Molecular cloning : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2006).
  45. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
  46. Gerhardt, K. P., Castillo-Hair, S. M., Tabor, J. J. DIY optogenetics: Building, programming, and using the Light Plate Apparatus. Methods in Enzymology. 6224, 197-226 (2019).
  47. TaborLab IRIS. TaborLab IRIS Software. , Available from: http://taborlab.github.io/Iris/index.html (2021).
  48. Stockley, J. H., et al. Surpassing light-induced cell damage in vitro with novel cell culture media. Scientific Reports. 7 (1), 849(2017).
  49. Gordon, A., et al. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nature Methods. 4 (2), 175-181 (2007).
  50. Ordovas, L., et al. Efficient recombinase-mediated cassette exchange in hPSCs to study the hepatocyte lineage reveals AAVS1 locus-mediated transgene inhibition. Stem Cell Reports. 5 (5), 918-931 (2015).
  51. Gomez Tejeeda Zanudo, J., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002(2019).
  52. Sweeney, K., Moreno Morales, N., Burmeister, Z., Nimunkar, A. J., McClean, M. N. Easy calibration of the Light Plate Apparatus for optogenetic experiments. MethodsX. 6, 1480-1488 (2019).
  53. Ravindran, P. T., Wilson, M. Z., Jena, S. G., Toettcher, J. E. Engineering combinatorial and dynamic decoders using synthetic immediate-early genes. Communications Biology. 3 (1), 436(2020).
  54. Chen, X., Wang, X., Du, Z., Ma, Z., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression in mammalian cells and in mice using the LightOn system. Current Protocols in Chemical Biology. 5 (2), 111-129 (2013).
  55. Guinn, M. T. Engineering human cells with synthetic gene circuits elucidates how protein levels generate phenotypic landscapes. State University of New York at Stony Brook. , Ann Arbor. Ph.D (2020).
  56. Farquhar, K. S., et al. Role of network-mediated stochasticity in mammalian drug resistance. Nature Communications. 10 (1), 2766(2019).
  57. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nature Chemistry & Biology. 11 (3), 198-200 (2015).
  58. Guinn, M. T., et al. Observation and control of gene expression noise: Barrier crossing analogies between drug resistance and metastasis. Frontiers in Genetics. 11, 586726(2020).
  59. Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342 (6163), 1193-1200 (2013).
  60. Rullan, M., Benzinger, D., Schmidt, G. W., Milias-Argeitis, A., Khammash, M. An optogenetic platform for real-time, single-cell interrogation of stochastic transcriptional regulation. Molecular Cell. 70 (4), 745-756 (2018).
  61. Perkins, M. L., Benzinger, D., Arcak, M., Khammash, M. Cell-in-the-loop pattern formation with optogenetically emulated cell-to-cell signaling. Nature Communications. 11 (1), 1355(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kontrola ekspresji genówekspresja indukowana światłemstabilne linie komórkowecytometria przepływowamikroskopia fluorescencyjnaujemne sprzężenie zwrotneszum ekspresji genówkwantyfikacja ekspresji białek
Niezawodna inżynieria i kontrola stabilnych optogenetycznych obwodów genowych w komórkach ssaków
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.