Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza w czasie przebywania pojedynczej cząsteczki rozszczepienia DNA za pośrednictwem endonukleazy restrykcyjnej

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62112

⸱

7 lutego 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Tufts University, 2Department of Physics, Wesleyan University, 3Wyss Institute at Harvard University

W tym artykule

Podsumowanie

Korzystając z DNA znakowanego kwantowo kropkami i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem, możemy badać mechanizm reakcji endonukleaz restrykcyjnych, używając nieznakowanego białka. Ta technika jednocząsteczkowa pozwala na masowo multipleksowaną obserwację poszczególnych interakcji białko-DNA, a dane mogą być łączone w celu wygenerowania dobrze wypełnionych rozkładów czasu przebywania.

Streszczenie

Ten nowatorski test oparty na mikroskopii fluorescencyjnej z pełnym wewnętrznym odbiciem umożliwia jednoczesny pomiar długości cyklu katalitycznego dla setek pojedynczych cząsteczek endonukleazy restrykcyjnej (REazy) w jednym eksperymencie. Test ten nie wymaga znakowania białek i można go przeprowadzić za pomocą jednego kanału obrazowania. Ponadto wyniki wielu indywidualnych eksperymentów można łączyć w celu wygenerowania dobrze wypełnionych rozkładów czasu przebywania. Analiza uzyskanych rozkładów czasu przebywania może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmu rozszczepienia DNA, ujawniając obecność kroków kinetycznych, których nie można bezpośrednio zaobserwować. Przykładowe dane zebrane za pomocą tego testu z dobrze zbadaną REazą, EcoRV - dimeryczną endonukleazą restrykcyjną typu IIP, która rozszczepia sekwencję palindromiczną GAT↓ATC (gdzie ↓ jest miejscem cięcia) - są zgodne z wcześniejszymi badaniami. Wyniki te sugerują, że istnieją co najmniej trzy etapy na ścieżce do rozszczepienia DNA, która jest inicjowana przez wprowadzenie magnezu po tym, jak EcoRV wiąże DNA pod jego nieobecność, ze średnią szybkością 0,17 s-1 dla każdego etapu.

Wprowadzenie

Endonukleazy restrykcyjne (REazy) to enzymy wywołujące swoiste dla sekwencji pęknięcia obu nici DNA. Odkrycie REaz w latach 70. XX wieku doprowadziło do rozwoju technologii rekombinowanego DNA, a enzymy te są obecnie niezastąpionymi narzędziami laboratoryjnymi służącymi do modyfikacji i manipulacji genetycznych1. Endonukleazy restrykcyjne typu II są najszerzej stosowanymi enzymami z tej klasy, ponieważ przecinają one DNA w stałym miejscu, w obrębie lub w pobliżu ich sekwencji rozpoznawania. Istnieje jednak znaczna zmienność wśród REaz typu II i są one podzielone na kilka podtypów w oparciu o konkretne właściwości enzymatyczne, a nie klasyfikowane według pokrewieństwa ewolucyjnego. W obrębie każdego podtypu często występują wyjątki od schematu klasyfikacji, a wiele enzymów należy do kilku podtypów jednocześnie2. Zidentyfikowano tysiące REaz typu II, z czego setki są dostępne komercyjnie.

Pomimo jednak różnorodności wśród REaz typu II, bardzo niewielu REaz przebadano szczegółowo. Według REBASE, bazy danych enzymów restrykcyjnych założonej przez Sir Richarda Robertsa w 1975 roku3, opublikowane dane kinetyczne są dostępne dla mniej niż 20 z tych enzymów. Co więcej, choć niektóre REazy były bezpośrednio obserwowane na poziomie pojedynczych cząsteczek podczas dyfuzji wzdłuż DNA przed napotkaniem i związaniem sekwencji rozpoznawczej4,5,6,7, istnieje bardzo mało badań kinetyki ich reakcji cięcia na poziomie pojedynczych cząsteczek. Istniejące badania albo nie raportują wystarczających statystyk, aby przeprowadzić szczegółową analizę zmienności czasów, w których następują pojedyncze zdarzenia cięcia8,9,10, albo nie są w stanie uchwycić pełnego rozkładu czasów cięcia11. Tego typu analiza może ujawnić obecność stosunkowo długo żyjących produktów pośrednich kinetycznie i mogłaby prowadzić do lepszego zrozumienia mechanizmów cięcia DNA katalizowanego przez REazy.

Na poziomie pojedynczych cząsteczek procesy biochemiczne mają charakter stochastyczny – czas oczekiwania na wystąpienie pojedynczego zdarzenia w procesie, τ, jest zmienny. Można się jednak spodziewać, że wiele pomiarów τ będzie zgodnych z rozkładem prawdopodobieństwa, p(τ), który wskazuje na rodzaj zachodzącego procesu. Na przykład proces jednowykroczny, taki jak uwalnianie cząsteczki produktu z enzymu, będzie zgodny ze statystyką Poissona, a p(τ) będzie przyjmować formę ujemnego rozkładu wykładniczego:

Równanie funkcji gęstości prawdopodobieństwa dla rozkładu wykładniczego; wzór: p(τ)=(1/β)e^(-τ/β).

gdzie β jest średnim czasem oczekiwania. Należy zauważyć, że szybkość procesu, k, będzie równa 1/β, czyli odwrotności średniego czasu oczekiwania. W przypadku procesów wymagających więcej niż jednego kroku, p(τ) będzie splotem rozkładów pojedynczych wykładniczych dla każdego z poszczególnych kroków. Ogólnym rozwiązaniem splotu N funkcji pojedynczego rozpadu wykładniczego o identycznych średnich czasach oczekiwania, β, jest rozkład prawdopodobieństwa gamma:

Rozkład prawdopodobieństwa gamma; równanie do modelowania statystycznego; p(τ)=1/Γ(N)βⁿτⁿ⁻¹e⁻ᵗ/ᵦ.

gdzie Γ(N) jest funkcją gamma, która opisuje interpolację silni N-1 dla wartości N niebędących liczbami całkowitymi. Chociaż to ogólne rozwiązanie może być stosowane jako przybliżenie, gdy średnie czasy oczekiwania poszczególnych etapów są podobne, należy przyjąć, że obecność etapów stosunkowo szybkich zostanie zamaskowana przez etapy o znacznie dłuższych czasach oczekiwania. Innymi słowy, wartość N reprezentuje dolną granicę liczby etapów12. Przy odpowiedniej liczbie pomiarów czasu oczekiwania parametry β i N można oszacować poprzez binning zdarzeń i dopasowanie rozkładu gamma do otrzymanego histogramu lub stosując metodę największej wiarygodności. Tego rodzaju analiza może zatem ujawnić obecność etapów kinetycznych, których nie można łatwo rozdzielić w testach populacyjnych i która wymaga dużej liczby obserwacji w celu dokładnego oszacowania parametrów12,13.

Niniejsza praca opisuje metodę wykorzystującą DNA znakowane kropkami kwantowymi oraz mikroskopię fluorescencyjną z całkownym wewnętrznym odbiciem (TIRF) do równoległej obserwacji setek pojedynczych zdarzeń cięcia DNA katalizowanego przez nukleazy restrykcyjne (REaza). Projekt tego testu umożliwia agregowanie wyników z wielu eksperymentów, co pozwala na stworzenie rozkładów czasu przebywania obejmujących tysiące zdarzeń. Wysoka fotostabilność i jasność kropek kwantowych pozwalają na uzyskanie rozdzielczości czasowej 10 Hz bez utraty zdolności do obserwacji zdarzeń cięcia występujących nawet wiele minut po rozpoczęciu eksperymentu. Dobra rozdzielczość czasowa i szeroki zakres dynamiczny, w połączeniu z możliwością zgromadzenia dużego zestawu danych, pozwalają na dokładną charakterystykę rozkładów czasu przebywania w celu wykrycia obecności wielu etapów kinetycznych w szlakach cięcia REaz, których szybkość obrotu mieści się w zakresie 1 min-1. W przypadku EcoRV możliwe jest rozróżnienie trzech etapów kinetycznych, z których każdy został zidentyfikowany za pomocą innych metod, co potwierdza, że test jest czuły na obecność takich etapów.

Substraty dwuniciowego DNA zawierające interesującą sekwencję rozpoznawczą są wytwarzane poprzez hybrydyzację biotynilowanego oligonukleotydu z nicią komplementarną znakowaną pojedynczą, kowalencyjnie przyłączoną kropką kwantową z nanokryształu półprzewodnika. Substraty te wprowadza się do kanału przepływowego zbudowanego na szkiełku podstawowym z warstwą cząsteczek wysokocząsteczkowego glikolu polietylenowego (PEG) kowalencyjnie przyłączonych do jego powierzchni. Substraty DNA są wychwytywane poprzez powiązanie biotyna-streptawidyna-biotyna przez frakcję cząsteczek PEG posiadających biotynę na wolnym końcu. W mikroskopii TIRF oświetlenie zapewnia fala ewanescentna, której amplituda zanika wykładniczo wraz z odległością od interfejsu szkło-ciecz; głębokość penetracji jest rzędu długości fali użytego światła. W tych warunkach wzbudzone zostaną tylko kropki kwantowe przytwierdzone do powierzchni za pomocą cząsteczki DNA wychwyconej na funkcjonalizowanej powierzchni szkła. Kropki kwantowe swobodne w roztworze nie będą ograniczone do obszaru oświetlonego, a zatem nie będą luminescować. Jeśli DNA przytwierdzające kropkę kwantową do powierzchni zostanie przecięte, kropka kwantowa ta będzie mogła swobodnie dyfundować w kierunku oddalenia od powierzchni i zniknie z obrazu fluorescencyjnego.

Choć wiadomo, że wiele REaz typu II wiąże DNA w obecności magnezu14, wszystkie one wymagają magnezu do przeprowadzenia cięcia DNA15. REazy te mogą wiązać DNA unieruchomione na powierzchni w warunkach braku magnezu. Gdy przez kanał z REazą uprzednio związaną z DNA przepływa bufor zawierający magnez, cięcie rozpoczyna się natychmiast, co objawia się znikaniem kropek kwantowych. Synchronizacja osiągnięta poprzez uprzednie związanie cząsteczek REazy, a następnie zainicjowanie cięcia DNA poprzez wprowadzenie magnezu, ułatwia pomiar czasu opóźnienia do momentu zakończenia cięcia DNA niezależnie dla każdej cząsteczki w populacji enzymów obserwowanych w eksperymencie. Jako barwnik śledzący w buforze zawierającym magnez zastosowano fluoresceinę, aby wskazać moment dotarcia magnezu do pola widzenia. Ponieważ w buforze z magnezem nie znajduje się enzym, czas opóźnienia od momentu dotarcia bufora z magnezem do zniknięcia każdej kropki kwantowej wskazuje czas potrzebny REazie, która jest już związana z DNA, na przecięcie DNA i uwolnienie kropki kwantowej z powierzchni szkła. Zniknięcie kropki kwantowej następuje szybko i skutkuje gwałtownym spadkiem trajektorii intensywności, co daje jasną wskazówkę co do czasu, w którym dana cząsteczka DNA została przecięta. Wyznaczenie czasu zdarzeń odbywa się poprzez matematyczną analizę trajektorii intensywności, a typowy eksperyment dostarcza setek identyfikowalnych zdarzeń cięcia. Wyniki z wielu eksperymentów można połączyć, aby uzyskać odpowiednią statystykę pozwalającą na oszacowanie parametrów N i β za pomocą nieliniowej metody najmniejszych kwadratów lub analizy maksymalnej wiarygodności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Informacje ogólne

  1. Konstrukcja oligonukleotydu
    UWAGA: Substrat DNA o długości 60 par zasad (bp) jest utworzony z pary komplementarnych oligonukleotydów o temperaturze topnienia duplex 75 °C w 100 mM NaCl.
    1. Zamów jeden oligonukleotyd zsyntetyzowany z pojedynczą modyfikacją biotyny 5', a drugi z modyfikacją tiolu 5' (z sześciowęglowym przekładką). Umieść miejsce rozpoznawania na środku obszaru dupleksu.
      UWAGA: Sekwencje oligonukleotydowe do stosowania z EcoRV są pokazane poniżej (miejsce rozpoznawania pogrubioną czcionką).
      5' Biotyna - AAA ACC GAC ATG TTG ATT TCC TGA AACGG G ATA TCA TCA AAG CCA CCA TGA ACA AAG CAG CCG - 3'
      5' tiol - CGG CTG CTT TGT TCA TGG CTT TGAT GA TAT CCC GTT TCA GGA AAT CAA CAT GTC GGT TTT - 3'
  2. Używaj ultraczystej wody o rezystywności 18 MOhm na wszystkich etapach.
  3. Chroń wszystkie roztwory zawierające kropki kwantowe przed światłem, aby zapobiec fotowybielaniu.
  4. Użyj źródła sprężonego powietrza, aby wypełnić ten protokół.

2. Przygotowanie materiałów substratowych DNA znakowanych kropkami kwantowo

UWAGA: Oprócz oligonukleotydów opisanych powyżej, zobacz Tabelę materiałów dla innych materiałów i Tabelę 1 dla wymaganych do przygotowania substratów DNA znakowanych kropkami kwantowymi.

  1. Zredukuj grupy tiolowe 5' na oligonukleotydzie, który ma być sprzężony z kropkami kwantowymi.
    1. Zawiesić każdy tiolowany oligonukleotyd w wodzie o stężeniu 100 μM.
    2. Odpipetować 650 μl wody do kolumny wirowej z wyłączeniem wielkości dla każdej próbki oligonukleotydu i wirować przez ~15 s. Pozostaw kolumnę do zapakowania na 30 minut.
    3. Przygotuj świeży roztwór 100 mM ditiotreitolu (DTT) bezpośrednio przed każdym użyciem, ponieważ DTT szybko ulega degradacji w roztworze. Ostrożnie otworzyć jedną fiolkę zawierającą 7,7 mg DTT i odpipetować 500 μl buforu fosforanu sodu do fiolki; wirować, aby dokładnie wymieszać.
    4. Dla każdego zawieszonego oligonukleotydu przygotuj świeżą probówkę i dodaj do niej 50 μl oligonukleotydu i 50 μl roztworu DTT. Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu zmniejszenia wiązań dwusiarczkowych między utlenionymi grupami tiolowymi na końcu 5' oligonukleotydów.
    5. Zdejmij nasadki kolumny wirującej i umieść każdą kolumnę w probówce zbiorczej. Odwirować kolumny wirowe o masie 750 × g przez 2 minuty i wyrzucić eluat.
    6. Przenieś kolumny wirujące do świeżych probówek wirówkowych. Delikatnie odpipetować całą objętość (100 μl) jednej próbki mieszaniny DNA/DTT na każdą przygotowaną kolumnę. Odwirować przy 750 × g przez 2 minuty i zmierzyć absorbancję eluatu przy 260 nm, aby potwierdzić, że stężenie wynosi około 40 μM.
    7. Wszelkie próbki, które nie zostaną natychmiast użyte, należy przechowywać w temperaturze -20 °C, aby zapobiec utlenianiu grup tiolowych i tworzeniu się wiązań dwusiarczkowych.
  2. Sprzężenie DNA z kropkami kwantowymi
    1. Odpipetować jedną porcję 50 μl materiału z kropkami kwantowymi do urządzenia do dializy dla każdej konstrukcji, która ma być wykonana, uważając, aby nie dotykać membrany końcówką pipety. Dializować z objętością buforu kwasu N-cykloheksylo-2-aminoetanosulfonowego (CHES) co najmniej 1000 razy większą od objętości próbki, mieszając z prędkością ~100 obr./min przez 15 minut.
    2. Przygotować świeży 6 mM roztwór sulfosukcynimidylo-4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylanu (sulfo-SMCC) w buforze CHES bezpośrednio przed każdym użyciem. Ostrożnie otworzyć jedną fiolkę zawierającą 2 mg sulfo-SMCC i odpipetować 800 μl buforu CHES do fiolki. Wirować, aby dokładnie wymieszać.
    3. Za pomocą pipetora ostrożnie pobrać zawieszone kropki kwantowe z urządzenia do dializy i przenieść do świeżej probówki zawierającej równą objętość roztworu sulfo-SMCC; pipetować w górę i w dół do wymieszania. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem z prędkością 1000 obr./min, aby umożliwić sulfo-SMCC reakcję z pierwszorzędowymi aminami na kropkach kwantowych.
    4. Za pomocą pipetora ostrożnie przenieś każdą próbkę do nowego urządzenia do dializy. W celu usunięcia nadmiaru sulfo-SMCC należy dializować z objętością buforu CHES co najmniej 1000 razy większą niż objętość zawarta w urządzeniu(-ach) do dializy, mieszając, przez 15 minut. Wymień bufor 2x i wykonaj dializę ze świeżym buforem CHES w sumie 3x, co pozwala na kontynuowanie dializy 15 minut po każdej wymianie bufora.
    5. W celu wymiany buforu w ramach przygotowań do drugiej reakcji, należy przenieść urządzenia do dializy do zlewki zawierającej objętość soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) co najmniej 1000 razy większą niż objętość zawarta w urządzeniu (urządzeniach). Dializować mieszając przez 15 minut, wymieniać bufor 2x i wykonywać dializę z użyciem świeżego PBS w sumie 3x, pozwalając na kontynuowanie dializy przez 15 minut po każdej wymianie buforu.
    6. Za pomocą pipetora ostrożnie odzyskać roztwór zawierający kropki kwantowe z urządzenia (urządzeń) do dializy i przenieść każdą próbkę do świeżej probówki zawierającej równomolową ilość tiolowanego oligonukleotydu rozcieńczonego w PBS. Połączyć równą objętość PBS i 1/10objętości zredukowanej i oczyszczonej próbki oligonukleotydowej (stężenie około 40 μM), ponieważ stężenie kropek kwantowych w tym momencie wynosi ~4 μM. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, wytrząsając przy 1000 obr./min.
    7. Dodać albuminę surowicy bydlęcej (BSA, 10 mg/ml) do każdej próbki, aby uzyskać końcowe stężenie BSA 0,5 mg/ml. Za pomocą pipetora ostrożnie przenieść każdą próbkę do nowego urządzenia do dializy i dializować w stosunku do objętości bufora do przechowywania, która jest co najmniej 1000 razy większa niż objętość zawarta w urządzeniu do dializy. Wymień bufor 2 razy i wykonaj dializę z nowym buforem magazynowym w sumie 3 razy, co pozwala na kontynuowanie dializy przez 15 minut po każdej wymianie buforu.
    8. Za pomocą pipetora ostrożnie odzyskać każdą próbkę, umieścić ją w świeżej probówce i przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Nie przechowywać w temperaturze -20 °C, ponieważ kropki kwantowe ulegają uszkodzeniu w wyniku zamrożenia.
  3. Wyżarzanie oligonukleotydu znakowanego kropkami kwantowymi do biotynylowanego oligonukleotydu
    1. Zawiesić każdy biotynylowany oligonukleotyd w buforze do przechowywania o stężeniu 100 μM. Niewykorzystane próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
    2. Połącz próbkę oligonukleotydu znakowanego kropkami kwantowymi z 10-krotnym nadmiarem molowym biotynylowanego oligonukleotydu. Ponieważ szacowane stężenie DNA w próbce znakowanej kropkami kwantowymi wynosi 2 μM, należy dodać 0,2 μl biotynylowanego oligonukleotydu na każde 10 μl tej próbki.
    3. Podgrzać mieszaninę w bloku grzewczym do temperatury 75 °C (temperatura topnienia dla obszaru komplementarnego). Trzymaj w tej temperaturze przez 5 minut. Wyłącz blok grzewczy i pozwól mu powoli ostygnąć. Gotową konstrukcję należy przechowywać w temperaturze 4 °C; Nie zamrażać.

3. Funkcjonalizacja powierzchni szkiełek nakrywkowych

UWAGA: Ten proces został już wcześniej opisany w innych protokołach wideo JoVE16,17. Protokół ten opisuje dostosowaną wersję procedury z niewielkimi zmianami w celu uwzględnienia mniejszego szkiełka podstawowego. Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby zapoznać się z innymi materiałami wymaganymi do funkcjonalizacji powierzchni szkiełek nakrywkowych.

  1. Umieść 5 szkiełek nakrywkowych w każdym uchwycie szkiełka nakrywkowego. Upewnij się, że pominiesz jedną spację między każdą parą szkiełek nakrywkowych, aby nie sklejały się ze sobą. Umieść szkiełka nakrywkowe w uchwycie w słoiku z pokrywką, dodaj etanol do słoika, aż szkiełka nakrywkowe zostaną przykryte i mocno przykręć nakrętkę. Umieść cały słoik w wodzie w soniku do kąpieli, nie zanurzając go całkowicie, i sonikuj przez 30 minut.
  2. Napełnij czystą zlewkę lub słoik ultraczystą wodą. Użyj metalowej pęsety, aby usunąć szkiełka nakrywkowe z ich uchwytu z etanolu i zanurz je w wodzie w celu spłukania. Następnie przenieść szkiełka nakrywkowe i uchwyt do słoika zawierającego 1 M roztwór wodorotlenku potasu (KOH). Mocno przykręć nakrętkę, umieść słoik w kąpieli sonicyjnej i sonikuj przez 30 minut.
    UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z roztworem KOH, ponieważ jest on i drażniący.
  3. Powtórzyć sonikację w roztworze etanolu i KOH, spłukując szkiełka nakrywkowe w wodzie, jak opisano powyżej, między każdym krokiem.
  4. Przenieś szkiełka nakrywkowe w uchwycie do czystego słoika wypełnionego czystym acetonem. Zakończ czyszczenie, poddając słoik sonikacją zgodnie z powyższym opisem przez 30 minut. Po tym kroku nie spłukuj wodą.
  5. Za pomocą metalowej pęsety przenieś szkiełka nakrywkowe w uchwycie do czystej zlewki o pojemności 100 ml zawierającej 80 ml świeżego acetonu i mieszadła w mikroskali. Umieść zlewkę na magnetycznej płycie mieszającej ustawionej na co najmniej 1 000 obr./min. Podczas energicznego mieszania acetonu odpipetować 1,6 ml 3-aminopropylotrietoksysilanu (APTES) do zlewki, aby uzyskać 2% roztwór v/v.
    UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas pipetowania APTES, ponieważ jest on.
  6. Pozostaw szkiełka nakrywkowe do inkubacji w roztworze przez 2 minuty, a następnie użyj metalowej pęsety, aby przenieść szkiełka nakrywkowe w uchwycie do zlewki z wodą, aby wygasić reakcję. Opłucz szkiełka nakrywkowe jeszcze dwa razy, wymieniając wodę w zlewce.
  7. Szkło silanizowane utwardzać w piekarniku w temperaturze 120 °C przez 75 minut. Jeśli nie przejdziesz od razu do następnego kroku, przechowuj szkiełka nakrywkowe w próżni przez maksymalnie kilka dni.
  8. Rozpuścić N-hydroksysukcynimid (NHS) derywatyzowane estrami glikole polietylenowe (PEG) w 100 mM wodorowęglanu sodu (pH 8,2). Użyj stosunku 10:1 PEG zakończonego metoksylacją do PEG zakończonego biotyną, z ~100 mg / ml PEG zakończonego metoksy.
  9. Odmierzyć pipetą 100 μl roztworu PEG na połowę suchych, silanizowanych szkiełek nakrywkowych i przykryć każde z nich drugim szkiełkiem nakrywkowym. Użyj małych kawałków parafilmu umieszczonych w każdym rogu jako przekładek, aby zapobiec sklejaniu się szkiełek nakrywkowych.
  10. Inkubować szkiełka nakrywkowe w wilgotnym środowisku przez 3,5 godziny. Oddziel kanapki z szkiełkami nakrywkowymi. Użyj butelki ze spryskiwaczem, aby umyć każde szkiełko nakrywkowe dużą ilością wody i osuszyć sprężonym powietrzem.
  11. Funkcjonalne szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w próżni. Upewnij się, że strona nasączona PEG jest podniesiona, ponieważ druga strona nie przechwyci substratu DNA.

4. Budowa urządzenia mikroprzepływowego

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów, aby zapoznać się z innymi materiałami wymaganymi do budowy urządzenia mikroprzepływowego.

  1. Za pomocą ręcznego obrotowego narzędzia wielofunkcyjnego wyposażonego w stożkowe wiertło diamentowe wywierć dwa otwory w przeciwległych rogach zjeżdżalni kwarcowej, aby służyły jako wlot i wylot. Pamiętaj, aby zabezpieczyć suwak na miejscu, nasmarować wiertło i stale przesuwać się wodą podczas wiercenia. Po każdym eksperymencie odzyskaj przygotowane szkiełko kwarcowe do ponownego użycia poprzez namoczenie zużytego urządzenia w acetonie w celu rozpuszczenia kleju i żywicy epoksydowej; Wyrzuć pozostałe składniki.
    UWAGA: Wiercenie można wykonać ręcznie, ale użycie uchwytu typu prasowego do narzędzia wielofunkcyjnego ułatwia ten proces.
  2. Połączyć 25 μl roztworu streptawidyny z 80 μl PBS i 20 μl buforu blokującego. Pokryj szkiełko nakrywkowe nasączone PEG tą mieszaniną i inkubuj w wilgotnym środowisku przez 30 minut.
  3. Podczas inkubacji szkiełka nakrywkowego należy przygotować przekładkę obrazową, aby utworzyć kanał przepływowy. Wytnij kwadratowy kawałek materiału dystansowego o średnicy 1 cala, a następnie zaznacz kanał o szerokości 2 mm wyrównany z końcami otworów wywierconych w szkiełku kwarcowym (Rysunek 2). Wytnij kanał z materiału dystansowego za pomocą skalpela.
  4. Oderwij jedną stronę podkładu od przekładki obrazu i ostrożnie umieść ją na szkiełku kwarcowym, uważając, aby nie zakryć otworów wlotowych i wylotowych. Pamiętaj, aby dokładnie wyczyścić szkiełko kwarcowe acetonem, aby usunąć wszelkie pozostałości kleju z wcześniejszych eksperymentów.
  5. Umyj szkiełko nakrywkowe wodą i osusz sprężonym powietrzem. Usuń drugą stronę podkładu z przekładki obrazowej i umieść ją między szkiełkiem kwarcowym a funkcjonalizowanym, pokrytym streptawidyną szkiełkiem nakrywkowym, używając plastikowej pęsety do dociśnięcia zespołu i usunięcia pęcherzyków powietrza z kleju.
  6. Włóż jedną rurkę polietylenową o długości 30 cm do każdego otworu w zjeżdżalni kwarcowej. Pamiętaj, aby przyciąć końce rurki pod kątem, aby zapewnić swobodny przepływ roztworu. Użyj stojaka na probówki lub innego wspornika, aby przytrzymać rurki na miejscu i uszczelnij rurki na miejscu oraz krawędzie zmontowanego urządzenia żywicą epoksydową.
    UWAGA: Dobrze sprawdza się zbudowanie urządzenia na kawałku parafilmu, który można łatwo oderwać od dna po związaniu żywicy epoksydowej.
  7. Po związaniu żywicy epoksydowej włóż igłę pustej strzykawki do rurki wylotowej urządzenia i zanurz koniec rurki wlotowej w pojemniku wypełnionym buforem blokującym. Odciągnąć tłok strzykawki, aby napełnić urządzenie buforem blokującym. Pozostaw urządzenie do inkubacji na co najmniej 30 minut przed użyciem.

5. Wiązanie powierzchniowe substratu DNA znakowanego kropkami kwantowymi

UWAGA: Oprócz urządzenia mikroprzepływowego, substratu DNA i bufora blokującego opisanego powyżej, zobacz Tabelę materiałów dla innych materiałów i Tabelę 1 dla wymaganych do wiązania powierzchni substratów DNA znakowanych kropkami kwantowymi.

  1. Przymocuj urządzenie mikroprzepływowe do płytki stolika mikroskopu za pomocą taśmy, doprowadź obiektyw do kontaktu z dolną częścią urządzenia i ustaw obiektyw tak, aby pole view znajdował się w kanale mikroprzepływowym.
  2. Przepłukać kanał mikroprzepływowy świeżym buforem blokującym, odciągając tłok strzykawki po podłączeniu rurki wylotowej do pompy strzykawkowej. Sprawdź, czy w rurce lub w kanale nie ma pęcherzyków uwięzionych.
    UWAGA: Od tego momentu upewnij się, że rurka dolotowa jest w cieczy, aby do urządzenia nie dostały się pęcherzyki powietrza.
  3. Rozcieńczyć 1 μl przygotowanego substratu DNA w 1 ml buforu blokującego. Umieścić rurkę wlotową w rozcieńczonym substracie DNA i przepuścić 800 μl roztworu substratu przez kanał z szybkością 200 μl/min. Pozostawić roztwór DNA do inkubacji w kanale w spokoju przez 15 minut po ustaniu przepływu.
  4. Przepuścić co najmniej 800 μl buforu blokującego przez kanał z szybkością 200 μl/min, aby wypłukać niezwiązane DNA z kanału.
  5. Dostosuj moc lasera, ostrość mikroskopu i kąt TIRF tak, aby kropki kwantowe na uwięzi powierzchniowej były wyraźnie widoczne.
    UWAGA: Chociaż kropki kwantowe nie blakną szybko, najlepiej jest utrzymywać moc na jak najniższym poziomie, aby zminimalizować mruganie.

6. Rozszczepienie DNA za pośrednictwem REazy

UWAGA: Zobacz Tabelę materiałów dla materiałów i Tabelę 1 dla wymaganych do rozszczepienia DNA za pośrednictwem REazy.

  1. Upewnij się, że kamera jest schłodzona do optymalnej temperatury roboczej i skonfigurowana do szybkiego przesyłania strumieniowego z czasem naświetlania 0.10 s. Przygotuj się na zbieranie danych przez ~4 min.
  2. Przepłukać urządzenie mikroprzepływowe 800 μl eksperymentalnego buforu bez magnezu przy natężeniu przepływu 200 μl/min.
  3. Dodać REazę do podwielokrotności (1 ml) eksperymentalnego buforu bez magnezu i delikatnie wymieszać pipetując. Użyj 4 μl ze 100 000 jednostek/ml zapasu, co odpowiada 400 jednostkom/ml EcoRV. Przepuścić 800 μl rozcieńczonego enzymu przez kanał z natężeniem przepływu 200 μl/min.
  4. Rozpocznij eksperyment od przelania eksperymentalnego buforu zawierającego magnez i fluoresceinę z szybkością przepływu 200 μl/min. Rozpocznij rejestrowanie danych natychmiast po uruchomieniu pompy strzykawkowej. Po przelaniu 800 μL buforu zatrzymaj akwizycję danych.

7. Analiza danych

UWAGA: Zobacz Tabelę materiałów dla oprogramowania do analizy danych używanego dla tego protokołu i dokonaj korekt, jeśli używasz innej platformy analitycznej.

  1. Wyznaczanie zerowego punktu czasowego
    1. Odejmij fluorescencję tła od każdej klatki filmu eksperymentalnego za pomocą funkcji imtophat, wbudowanej w przybornik przetwarzania obrazu funkcji filtrowania cylindra. Wybierz dysk o promieniu trzech pikseli jako element strukturyzacji. Intensywność tła można uzyskać, odejmując przefiltrowany obraz od obrazu oryginalnego.
      UWAGA: Filtr zachowuje tylko te cechy obrazu, które są jaśniejsze niż tło i mniejsze niż element strukturyzujący.
    2. Uśrednia odjęte tło z każdej klatki filmu. Użyj trajektorii tej wartości, aby określić zerowy punkt czasowy eksperymentu (Rysunek 3A). Określ czas rozpoczęcia, znajdując pierwszą klatkę, przy której szybkość wzrostu przekracza 3-krotność odchylenia standardowego szybkości zmian podczas przepływu objętości martwej.
      UWAGA: Gwałtowny wzrost tempa zmian średniej wartości odjętego tła dla każdej klatki filmu wskazuje na czas, w którym końcowy eksperymentalny bufor zawierający barwnik znacznikowy wszedł do komórki przepływowej (Rysunek 3B).
  2. Obliczanie i analiza trajektorii intensywności kropek kwantowych
    1. Obliczyć projekcję o maksymalnej intensywności dla zestawu klatek filmu z korekcją tła nagranych przed przybyciem barwnika znacznikowego. Określ położenie kropek kwantowych z dokładnością do jednego piksela na tym obrazie projekcyjnym za pomocą funkcji znajdowania pików, takiej jak pkfnd.
    2. Wygeneruj trajektorie intensywności dla poszczególnych kropek kwantowych, obliczając średnią intensywność w każdej klatce filmu w kwadratowym obszarze po trzy piksele z każdej strony otaczającej lokalizację zwróconą przez funkcję znajdowania pików.
      UWAGA: Opisana powyżej korekcja tła usuwa artefakty wprowadzone przez barwnik smugowy. Wynikowe trajektorie intensywności powinny być względnie płaskie, ale nadal uwzględniać naturalnie występujące fluktuacje intensywności (Rysunek 4).
    3. Identyfikacja zdarzeń zaniku kropek kwantowych poprzez analizę statystyczną trajektorii intensywności. Dla każdej trajektorii intensywności kropki kwantowej należy obliczyć natężenie progowe, które jest wyższe od wartości minimalnej o odpowiedni ułamek różnicy między wartościami maksymalnymi i minimalnymi dla tej trajektorii, w zależności od szumu zaobserwowanego na trajektoriach.
      UWAGA: Fluktuacja intensywności kropki kwantowej jest zazwyczaj znacznie większa niż fluktuacja tła. Odpowiednią wartość można wyznaczyć, porównując te wartości: wybrany próg musi być wyższy niż najwyższa wartość tła, ale najlepiej niższy niż najniższa wartość dla fluorescencji kropek kwantowych. W odniesieniu do przedstawionych danych obliczono, że zastosowany próg jest wyższy od wartości minimalnej dla każdej trajektorii powiększonej o jedną trzecią różnicy między wartościami maksymalnymi i minimalnymi dla tej trajektorii. Można uznać, że kropka kwantowa zniknęła w ostatnim punkcie czasowym, w którym obserwowane natężenie w jej lokalizacji przekroczyło ten próg.
    4. Potwierdź domniemane zdarzenia związane z zaginięciem. W analizie końcowej należy uwzględnić zdarzenia tylko wtedy, gdy obserwowana intensywność przekracza punkt środkowy między minimalnymi i maksymalnymi wartościami intensywności trajektorii dla ponad połowy klatek filmu przed czasem zniknięcia, a odchylenie standardowe trajektorii intensywności zmniejszyło się po zdarzeniu.
      UWAGA: Można zastosować inne testy statystyczne, aby upewnić się, że rejestrowane są tylko prawidłowe zdarzenia zaginięcia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Komora przepływowa jest bezpośrednio sprzężona z obiektywem imersyjnym olejowym o wysokiej aperturze numerycznej i powiększeniu 60x w mikroskopie odwróconym, wyposażonym w oświetlenie laserowe do obrazowania TIRF przez obiektyw (Rycina 5A). Po wprowadzeniu substratu DNA i wypłukaniu nadmiaru DNA oraz kropek kwantowych, w polu widzenia znajduje się zazwyczaj tysiące pojedynczych kropek kwantowych (Rycina 5B). Kropki kwantowe te są stabilnie przytwierdzone do szkl...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Substrat DNA do tego testu jest znakowany kropką kwantową przy użyciu dwuetapowego schematu reakcji z użyciem sulfo-SMCC. Ten dwufunkcyjny środek sieciujący składa się z ugrupowania estrowego NHS, które może reagować z pierwszorzędową aminą, oraz ugrupowania maleimidowego, które może reagować z grupą sulfhydrylową20. Tiolowane oligonukleotydy używane do przygotowania substratu są wysyłane w postaci utlenionej. Ważne jest, aby je zredukować i oczyścić, zgodnie z opisem, przed przystąpieniem do proc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów

Podziękowania

Ta praca została wsparta przez Nagrodę Numer K12GM074869 dla CME od Narodowego Instytutu Ogólnych Nauk Medycznych. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów Narodowego Instytutu Ogólnych Nauk Medycznych lub Narodowych Instytutów Zdrowia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
3-aminopropylotrietoksysilan (APTS)Sigma Aldrich440140-100MLPrzechowywać w pudełku eksykatora
5 Minute EpoxyDevcon20845służy do uszczelniania urządzenia mikroprzepływowego
acetonPharmco329000ACSsłuży do czyszczenia szkiełek nakrywkowych
sonikator do kąpieliFisher ScientificCPXH Model 2800numer katalogowy 15-337-410
Zlewka, szklana, 100 ml
Wirówka
Biotyna-PEG-Walerianian sukcynimidylu (MW 5,000)Laysan BioBIO-SVA-5KWalerianian sukcynimidylu ma dłuższy okres półtrwania niż węglan sukcynimidylu
Biotynylowany oligonukleotydZintegrowane technologie DNA- patrz protokół, aby zapoznać się z rozważaniami projektowymiPoproś o modyfikację 5' Biotyny i Oczyszczanie HPLC
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)VWR0903-5Gprzygotować roztwór o stężeniu 10 mg/ml (woda) i podgrzać do 95 & stopni; C przed użyciem
Centri-Spin-10 Wykluczenie rozmiaru Kolumny wirowePrinceton SeparacjeCS-100 lub CS-101służy do oczyszczania tiolowanych oligonukleotydów po redukcji wiązania dwusiarczkowego
Probówki wirówkowe 1,5. ml
Szkiełka nakrywkowe, 1-calowe kwadratowe szklane
uchwyty
diamentowe koło punktoweDremel7134zastosowanie do wiercenia otworów w kwarcowej nakładce na komory przepływowe
ditiotreitol (DTT)Thermo ScientificA39255No-Weigh Format, 7,7 mg/fiolkę
wiertarka obrotowa narzędzie Stacja robocza StojakDremel220-01ułatwia wiercenie kwarcowe
EcoRV (REase używane do generowania przykładowych danych)New England BiolabsR0195T lub R0195MUżyj 100 000 jednostek/ml, aby uniknąć dodawania nadmiaru glicerolu Sprawdź REBASE dla dostawców innych REaz
etanoluróżnychCAS 64-17-5denaturowanych lub 95% są dopuszczalne, używaj do czyszczenia szkiełek nakrywkowych
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Sigma AldrichEDSBioUltra, bezwodny, przechowywać w pudełku eksykatora
Pchły Micro SpinbarFisherbrand14-513-65Rozmiar 3 mm x 10 mm pasujący pod stojakiem na szkiełka nakrywkowe
fluoresceinaAcros Organics17324służy do produkcji eksperymentalnych
grawitacyjnych pieca konwekcyjnegoBinder9010-0131
ręczne obrotowe narzędzie wielofunkcyjneDremel8220służy do wiercenia otworów w kwarcowej komorze przepływowym
Topper ImagEM X2 EM-CCD KameraHamamatsuC9100-23Bchłodzenie powietrzem jest odpowiednie do tego eksperymentu, użyj oprogramowania HCImage lub podobnego do sterowania
Dystans obrazowania, dwustronny, samoprzylepny
Słoik, szkło z zakrętką, (około 50 mm średnicy i 50 mm wysokości)
chlorek magnezu sześciowodnyFisher BioreagentsBP214-500służy do tworzenia eksperymentalnego bufora z magnezem
OprogramowanieMATLABMetalowa
pęsetaFisher Brand16-100-110
metoksy-PEG-Sukcynimidyl Walerianian (MW 5,000)Laysan BioM-SVA-5KOba PEG-i powinny mieć ten sam ester NHS, aby szybkość reakcji była spójna
mikrowirówkaEppendorf5424
VWR12621-022
Kwas N-cykloheksylo-2-aminoetanosulfonowy (CHES)Acros OrganicsAC20818CAS 103-47-9, służy do produkcji bufora CHES
wytrząsarka orbitalna i grzałka do probówek do mikrowirówekQ Instruments1808-0506z adapterem 1808-1061 do probówek 24 x 2,0 ml lub 15 x 0,5 ml
Parafilm
PE60 Rurka polietylenowa (średnica wewnętrzna 0,76 mm, średnica zewnętrzna 1,22 mm)Intramedic6258917igły 22 G dobrze pasują do tego rozmiaru rurki
buforowana fosforanami (PBS) 10xSigma AldrichP7059Stosować przy sile
1x wodorotlenek potasuVWR Chemicals BDHBDH9262użyć 1 M roztworu do czyszczenia szkiełek nakrywkowych
Qdot 655 ITK Amino (PEG) Quantum DotsInvitrogenQ21521MP
Szkiełko kwarcowe, 1 cal kwadratowy, grubość 1 mmMikroskopia elektronowa Sciences72250-10W rogach należy wywiercić otwory do wprowadzania rurek doprowadzających i wylotowych
wzmocniona pęseta z tworzywa sztucznegoRubisK35asłuży do przenoszenia szkiełek nakrywkowych i budowy urządzenia mikroprzepływowego
Arkusze samoprzylepne SecureSealGrace BiolabsSA-S-1Lprzycięte w celu utworzenia przekładki do urządzenia mikroprzepływowego
Jednokanałowa pompa strzykawkowa do mikrofluidykiSystemypompowe nowej eryNE-1002X-USwyposażony w strzykawkę o pojemności 50 ml i igłę 22 G
Slide-a-Lyzer MINI urządzenia do dializy, 10 kDa MWCO, 0,1 mlThermo Scientific69570 lub 69572używane do wymiany buforu podczas sprzęgania kropek kwantowych z
wodorowęglanem soduDNA EMD MilliporeSX0320służy do tworzenia buforu do funkcjonalizacji powierzchni; 100 mM, pH 8
chlorek soduMacron7581-12używać do wytwarzania eksperymentalnych
Dwuzasadowy roztwór fosforanu sodu (BioUltra, 0,5 M w wodzie)Sigma Aldrich94046służy do wytwarzania 100 mM buforu fosforanu sodu
Monozasadowy roztwór fosforanu sodu (BioUltra, 5M w wodzie)Sigma Aldrich74092służy do regulacji pH 100 mM buforu fosforanu sodu
Streptawidyna z Streptomyces avidiniiSigma AldrichS4762rozpuścić w stężeniu 1 mg/ml i przechowywać 25 ml roztworu w temperaturze -20 ?
Sulfosuccinimidylo-4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylan (sulfo-SMCC)Thermo ScientificA39268No-Weigh Format, 2 mg / fiolkę
Strzykawka wyposażona w igłę
Pompka
Tiolowany oligonukleotydZintegrowane technologie DNA niestandardowe- zobacz protokół, aby zapoznać się z rozważaniami projektowymiPoproś o 5-calowy modyfikator tiolu C6 S-S i system obrazowania HPLC purificaiton
TIRF z oświetleniem laserowym 488 nm,różnyminiestandardowymi konstrukcjami
Tris -HClResearch Products InternationalT60050do tworzenia eksperymentalnych
Tris baseJT Baker4101służy do tworzenia eksperymentalnych
Tween-20SigmaP7949służy do blokowania bufor
Mieszalnik wirowy
Wash-N-Dry Coverslip Rack Mikroskopiaelektronowa Sciences70366-16służy do funkcjonalizacji powierzchni szkiełek nakrywkowych
stołowa niestandardowe na szkiełka nakrywkowe, do analizy danych Wielopozycyjne mieszadło magnetyczne Sól fizjologiczna 21 Gstrzykawkowa wody ultraczystej VWR 10153-842

Bibliografia

  1. Roberts, R. J. How restriction enzymes became the workhorses of molecular biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (17), 5905-5908 (2005).
  2. Loenen, W. A., Dryden, D. T., Raleigh, E. A., Wilson, G. G., Murray, N. E. Highlights of the DNA cutters: a short history of the restriction enzymes. Nucleic Acids Research. 42 (1), 3-19 (2014).
  3. Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. REBASE--a database for DNA restriction and modification: enzymes, genes and genomes. Nucleic Acids Research. 43, Database issue 298-299 (2015).
  4. Bonnet, I., et al. Sliding and jumping of single EcoRV restriction enzymes on non-cognate DNA. Nucleic Acids Research. 36 (12), 4118-4127 (2008).
  5. Biebricher, A., Wende, W., Escude, C., Pingoud, A., Desbiolles, P. Tracking of single quantum dot labeled EcoRV sliding along DNA manipulated by double optical tweezers. Biophysical Journal. 96 (8), 50-52 (2009).
  6. Blainey, P. C., et al. Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1224-1229 (2009).
  7. Huang, C. -F., et al. Direct visualization of DNA recognition by restriction endonuclease EcoRI. Journal of Experimental & Clinical Medicine. 5 (1), 25-29 (2013).
  8. Palma, M., et al. Selective biomolecular nanoarrays for parallel single-molecule investigations. Journal of American Chemical Society. 133 (20), 7656-7659 (2011).
  9. Reinhard, B. M., Sheikholeslami, S., Mastroianni, A., Alivisatos, A. P., Liphardt, J. Use of plasmon coupling to reveal the dynamics of DNA bending and cleavage by single EcoRV restriction enzymes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (8), 2667-2672 (2007).
  10. van den Broek, B., Noom, M. C., Wuite, G. J. DNA-tension dependence of restriction enzyme activity reveals mechanochemical properties of the reaction pathway. Nucleic Acids Research. 33 (8), 2676-2684 (2005).
  11. Gambino, S., et al. A single molecule assay for measuring site-specific DNA cleavage. Analytical Biochemistry. 495, 3-5 (2016).
  12. Floyd, D. L., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Analysis of kinetic intermediates in single-particle dwell-time distributions. Biophysical Journal. 99 (2), 360-366 (2010).
  13. Loparo, J. J., van Oijen, A. Single-molecule enzymology. Handbook of Single-Molecule Biophysics. Hinterdorfer, P., Oijen, A. , Springer. New York, NY. 165-182 (2009).
  14. Taylor, J. D., Badcoe, I. G., Clarke, A. R., Halford, S. E. EcoRV restriction endonuclease binds all DNA sequences with equal affinity. Biochemistry. 30 (36), 8743-8753 (1991).
  15. Pingoud, A., Jeltsch, A. Structure and function of type II restriction endonucleases. Nucleic Acids Research. 29 (18), 3705-3727 (2001).
  16. Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (32), e1529(2009).
  17. Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Direct observation of enzymes replicating DNA using a single-molecule DNA stretching assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1689(2010).
  18. Baldwin, G. S., Vipond, I. B., Halford, S. E. Rapid reaction analysis of the catalytic cycle of the EcoRV restriction endonuclease. Biochemistry. 34 (2), 705-714 (1995).
  19. Winkler, F. K., et al. The crystal-structure of Ecorv endonuclease and of Its complexes with cognate and non-cognate DNA fragments. EMBO Journal. 12 (5), 1781-1795 (1993).
  20. Sioss, J. A., Stoermer, R. L., Sha, M. Y., Keating, C. D. Silica-coated, Au/Ag striped nanowires for bioanalysis. Langmuir. 23 (22), 11334-11341 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza pojedynczych cząsteczekcałkowite wewnętrzne odbiciemikroskopia fluorescencyjnaendonukleaza EcoRVznakowanie kropkami kwantowymiurządzenie mikroprzepływowepomiar cyklu katalitycznego
Analiza w czasie przebywania pojedynczej cząsteczki rozszczepienia DNA za pośrednictwem endonukleazy restrykcyjnej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.