Analiza w czasie przebywania pojedynczej cząsteczki rozszczepienia DNA za pośrednictwem endonukleazy restrykcyjnej

Podsumowanie

Korzystając z DNA znakowanego kwantowo kropkami i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem, możemy badać mechanizm reakcji endonukleaz restrykcyjnych, używając nieznakowanego białka. Ta technika jednocząsteczkowa pozwala na masowo multipleksowaną obserwację poszczególnych interakcji białko-DNA, a dane mogą być łączone w celu wygenerowania dobrze wypełnionych rozkładów czasu przebywania.

Streszczenie

Ten nowatorski test oparty na mikroskopii fluorescencyjnej z pełnym wewnętrznym odbiciem umożliwia jednoczesny pomiar długości cyklu katalitycznego dla setek pojedynczych cząsteczek endonukleazy restrykcyjnej (REazy) w jednym eksperymencie. Test ten nie wymaga znakowania białek i można go przeprowadzić za pomocą jednego kanału obrazowania. Ponadto wyniki wielu indywidualnych eksperymentów można łączyć w celu wygenerowania dobrze wypełnionych rozkładów czasu przebywania. Analiza uzyskanych rozkładów czasu przebywania może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmu rozszczepienia DNA, ujawniając obecność kroków kinetycznych, których nie można bezpośrednio zaobserwować. Przykładowe dane zebrane za pomocą tego testu z dobrze zbadaną REazą, EcoRV - dimeryczną endonukleazą restrykcyjną typu IIP, która rozszczepia sekwencję palindromiczną GAT↓ATC (gdzie ↓ jest miejscem cięcia) - są zgodne z wcześniejszymi badaniami. Wyniki te sugerują, że istnieją co najmniej trzy etapy na ścieżce do rozszczepienia DNA, która jest inicjowana przez wprowadzenie magnezu po tym, jak EcoRV wiąże DNA pod jego nieobecność, ze średnią szybkością 0,17 ^s-1 dla każdego etapu.

Wprowadzenie

Endonukleazy restrykcyjne (REazy) to enzymy, które powodują specyficzne dla sekwencji dwuniciowe pęknięcia w DNA. Odkrycie REaz w latach siedemdziesiątych XX wieku doprowadziło do rozwoju technologii rekombinacji DNA, a enzymy te są obecnie niezbędnymi narzędziami laboratoryjnymi do modyfikacji i manipulacji genetycznych¹. REazy typu II są najczęściej stosowanymi enzymami w tej klasie, ponieważ rozszczepiają DNA w ustalonym miejscu w obrębie lub w pobliżu sekwencji rozpoznawania. Istnieje jednak duża zmienność między REazami typu II i są one podzielone na kilka podtypów w oparciu o określone właściwości enzymatyczne, a nie są klasyfikowane zgodnie z ich pokrewieństwem ewolucyjnym. Wśród każdego podtypu istnieją częste wyjątki od schematu klasyfikacji, a wiele enzymów należy do wielu podtypów². Zidentyfikowano tysiące REaz typu II, a setki z nich są dostępne na rynku.

Jednakże, pomimo różnorodności wśród REaz typu II, bardzo niewiele REaz zostało szczegółowo zbadanych. Według REBASE, bazy danych enzymów restrykcyjnych założonej przez Sir Richarda Robertsa w 1975 roku³, opublikowane dane kinetyki są dostępne dla mniej niż 20 z tych enzymów. Ponadto, podczas gdy niektóre REazy zostały bezpośrednio zaobserwowane na poziomie pojedynczej cząsteczki podczas dyfuzji wzdłuż DNA przed napotkaniem i związaniem się z ich sekwencją rozpoznawania^4,5,6,7, istnieje bardzo niewiele badań pojedynczych cząsteczek dotyczących kinetyki reakcji rozszczepienia. Istniejące badania albo nie dostarczają odpowiednich danych statystycznych, aby przeprowadzić szczegółową analizę zmienności w czasie, w którym mają miejsce pojedyncze zdarzenia rozszczepienia^8,9,10 lub nie są w stanie uchwycić pełnego rozkładu czasów rozszczepienia¹¹. Tego typu analiza może ujawnić obecność stosunkowo długożyciowych kinetycznych produktów pośrednich i może prowadzić do lepszego zrozumienia mechanizmów rozszczepienia DNA za pośrednictwem REazy.

Na poziomie pojedynczej cząsteczki procesy biochemiczne są stochastyczne - czas oczekiwania na wystąpienie pojedynczego wystąpienia procesu, τ, jest zmienny. Można jednak oczekiwać, że wiele pomiarów τ będzie przestrzeganych rozkładu prawdopodobieństwa, p(τ), który wskazuje na rodzaj zachodzącego procesu. Na przykład proces jednoetapowy, taki jak uwolnienie cząsteczki produktu z enzymu, będzie zgodny ze statystykami Poissona, a p(τ) przyjmie postać ujemnego rozkładu wykładniczego:

gdzie β oznacza średni czas oczekiwania. Należy pamiętać, że szybkość procesu, k, będzie równa 1/β, co jest odwrotnością średniego czasu oczekiwania. W przypadku procesów, które wymagają więcej niż jednego kroku, p(τ) będzie splotem rozkładów jednowykładniczych dla każdego z poszczególnych kroków. Ogólnym rozwiązaniem dla splotu N funkcji rozpadu jednowykładniczego o identycznym średnim czasie oczekiwania, β, jest rozkład prawdopodobieństwa gamma:

gdzie Γ(N) to funkcja gamma, która opisuje interpolację silni N-1 do niecałkowitych wartości N. Chociaż to ogólne rozwiązanie może być stosowane jako przybliżenie, gdy średnie czasy oczekiwania na poszczególne kroki są podobne, należy rozumieć, że obecność stosunkowo szybkich kroków będzie maskowana przez kroki o znacznie dłuższym czasie oczekiwania. Innymi słowy, wartość N reprezentuje dolny limit liczby kroków¹². Przy odpowiedniej liczbie pomiarów czasu oczekiwania, parametry β i N można oszacować, łącząc zdarzenia i dopasowując rozkład gamma do otrzymanego histogramu lub stosując podejście estymacji maksymalnego prawdopodobieństwa. Ten rodzaj analizy może zatem ujawnić obecność kroków kinetycznych, które nie mogą być łatwo rozwiązane w testach zespołowych i wymagają dużej liczby obserwacji w celu dokładnego oszacowania parametrów^12,13.

Ten artykuł opisuje metodę użycia mikroskopii DNA znakowanego kwantowo kropkami i mikroskopii całkowitej fluorescencji wewnętrznej odbicia (TIRF) do obserwacji setek indywidualnych zdarzeń rozszczepienia DNA za pośrednictwem REazy równolegle. Konstrukcja testu umożliwia łączenie wyników kilku eksperymentów i tworzenie rozkładów czasu przebywania zawierających tysiące zdarzeń. Wysoka fotostabilność i jasność kropek kwantowych pozwala na uzyskanie rozdzielczości czasowej na poziomie 10 Hz bez poświęcania możliwości obserwacji zdarzeń rozszczepienia zachodzących nawet wiele minut po rozpoczęciu eksperymentu. Dobra rozdzielczość czasowa i szeroki zakres dynamiki, w połączeniu z możliwością zebrania dużego zestawu danych, pozwalają na dokładną charakterystykę rozkładów czasu przebywania w celu odkrycia obecności wielu kroków kinetycznych w szlakach cięcia REaz, które mają wskaźniki rotacji w zakresie 1 ^min-1. W przypadku EcoRV można rozwiązać trzy etapy kinetyczne, z których wszystkie zostały zidentyfikowane za pomocą innych środków, co potwierdza, że test jest czuły na obecność takich etapów.

Duplex DNA zawierające interesującą nas sekwencję rozpoznawania są wytwarzane przez wyżarzanie biotynylowanego oligonukleotydu do komplementarnej nici znakowanej pojedynczą, kowalencyjnie dołączoną półprzewodnikową nanokrystaliczną kropką kwantową. Substraty te są wprowadzane do kanału przepływowego zbudowanego na szklanym szkiełku nakrywkowym z trawnikiem z cząsteczkami glikolu polietylenowego (PEG) o wysokiej masie cząsteczkowej kowalencyjnie przymocowanymi do jego powierzchni. Substraty DNA są wychwytywane przez wiązanie biotyna-streptawidyna-biotyna przez frakcję cząsteczek PEG, które mają biotynę na wolnym końcu. W mikroskopii TIRF ulotna fala, która zanika wykładniczo wraz z odległością od granicy faz szkło-ciecz, zapewnia oświetlenie; Głębokość penetracji jest rzędu długości fali użytego światła. W tych warunkach wzbudzone zostaną tylko kropki kwantowe, które są przywiązane do powierzchni przez cząsteczkę DNA, która została uchwycona na funkcjonalizowanej powierzchni szkła. Kropki kwantowe, które są wolne w roztworze, nie będą ograniczone w oświetlonym obszarze, a zatem nie będą świecić. Jeśli DNA wiążące kropkę kwantową z powierzchnią zostanie rozszczepione, ta kropka kwantowa będzie mogła swobodnie dyfundować z dala od powierzchni i zniknie z obrazu fluorescencyjnego.

Chociaż wiadomo, że wiele REaz typu II wiąże DNA przy braku magnezu¹⁴, wszystkie wymagają magnezu do pośredniczenia w rozszczepianiu DNA¹⁵. Te REazy mogą wiązać unieruchomione powierzchniowo DNA przy braku magnezu. Kiedy bufor zawierający magnez przepływa przez kanał z REazą wstępnie związaną z DNA, rozszczepienie rozpoczyna się natychmiast, na co wskazuje zniknięcie kropek kwantowych. Synchronizacja osiągnięta przez wstępne wiązanie cząsteczek REazy, a następnie zainicjowanie rozszczepienia DNA poprzez wprowadzenie magnezu, ułatwia pomiar czasu opóźnienia do zakończenia rozszczepienia DNA niezależnie dla każdej cząsteczki w populacji enzymów obserwowanych w eksperymencie. Fluoresceina jest zawarta w postaci barwnika znacznikowego w buforze zawierającym magnez w celu wskazania pojawienia się magnezu w polu widzenia. Ponieważ w buforze zawierającym magnez nie ma enzymu, czas opóźnienia od przybycia buforu zawierającego magnez do zniknięcia każdej kropki kwantowej wskazuje czas potrzebny REazie, która jest już związana z DNA, na rozszczepienie DNA i uwolnienie kropki kwantowej z powierzchni szkła. Zanikanie kropek kwantowych następuje szybko i powoduje gwałtowny spadek trajektorii intensywności, co stanowi wyraźne wskazanie czasu, w którym dana cząsteczka DNA jest rozszczepiana. Określenie czasów zdarzeń odbywa się poprzez matematyczną analizę trajektorii intensywności, a typowy eksperyment skutkuje setkami możliwych do zidentyfikowania zdarzeń rozszczepienia. Wyniki wielu eksperymentów mogą być łączone w celu uzyskania odpowiednich statystyk umożliwiających oszacowanie parametrów, N i β, za pomocą nieliniowej analizy najmniejszych kwadratów lub analizy maksymalnego prawdopodobieństwa.

Protokół

1. Informacje ogólne

1. Konstrukcja oligonukleotydu
   UWAGA: Substrat DNA o długości 60 par zasad (bp) jest utworzony z pary komplementarnych oligonukleotydów o temperaturze topnienia duplex 75 °C w 100 mM NaCl.
   1. Zamów jeden oligonukleotyd zsyntetyzowany z pojedynczą modyfikacją biotyny 5', a drugi z modyfikacją tiolu 5' (z sześciowęglowym przekładką). Umieść miejsce rozpoznawania na środku obszaru dupleksu.
      UWAGA: Sekwencje oligonukleotydowe do stosowania z EcoRV są pokazane poniżej (miejsce rozpoznawania pogrubioną czcionką).
      5' Biotyna - AAA ACC GAC ATG TTG ATT TCC TGA AACGG G ATA TCA TCA AAG CCA CCA TGA ACA AAG CAG CCG - 3'
      5' tiol - CGG CTG CTT TGT TCA TGG CTT TGAT GA TAT CCC GTT TCA GGA AAT CAA CAT GTC GGT TTT - 3'
2. Używaj ultraczystej wody o rezystywności 18 MOhm na wszystkich etapach.
3. Chroń wszystkie roztwory zawierające kropki kwantowe przed światłem, aby zapobiec fotowybielaniu.
4. Użyj źródła sprężonego powietrza, aby wypełnić ten protokół.

2. Przygotowanie materiałów substratowych DNA znakowanych kropkami kwantowo

UWAGA: Oprócz oligonukleotydów opisanych powyżej, zobacz Tabelę materiałów dla innych materiałów i Tabelę 1 dla wymaganych do przygotowania substratów DNA znakowanych kropkami kwantowymi.

1. Zredukuj grupy tiolowe 5' na oligonukleotydzie, który ma być sprzężony z kropkami kwantowymi.
   1. Zawiesić każdy tiolowany oligonukleotyd w wodzie o stężeniu 100 μM.
   2. Odpipetować 650 μl wody do kolumny wirowej z wyłączeniem wielkości dla każdej próbki oligonukleotydu i wirować przez ~15 s. Pozostaw kolumnę do zapakowania na 30 minut.
   3. Przygotuj świeży roztwór 100 mM ditiotreitolu (DTT) bezpośrednio przed każdym użyciem, ponieważ DTT szybko ulega degradacji w roztworze. Ostrożnie otworzyć jedną fiolkę zawierającą 7,7 mg DTT i odpipetować 500 μl buforu fosforanu sodu do fiolki; wirować, aby dokładnie wymieszać.
   4. Dla każdego zawieszonego oligonukleotydu przygotuj świeżą probówkę i dodaj do niej 50 μl oligonukleotydu i 50 μl roztworu DTT. Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu zmniejszenia wiązań dwusiarczkowych między utlenionymi grupami tiolowymi na końcu 5' oligonukleotydów.
   5. Zdejmij nasadki kolumny wirującej i umieść każdą kolumnę w probówce zbiorczej. Odwirować kolumny wirowe o masie 750 × g przez 2 minuty i wyrzucić eluat.
   6. Przenieś kolumny wirujące do świeżych probówek wirówkowych. Delikatnie odpipetować całą objętość (100 μl) jednej próbki mieszaniny DNA/DTT na każdą przygotowaną kolumnę. Odwirować przy 750 × g przez 2 minuty i zmierzyć absorbancję eluatu przy 260 nm, aby potwierdzić, że stężenie wynosi około 40 μM.
   7. Wszelkie próbki, które nie zostaną natychmiast użyte, należy przechowywać w temperaturze -20 °C, aby zapobiec utlenianiu grup tiolowych i tworzeniu się wiązań dwusiarczkowych.
2. Sprzężenie DNA z kropkami kwantowymi
   1. Odpipetować jedną porcję 50 μl materiału z kropkami kwantowymi do urządzenia do dializy dla każdej konstrukcji, która ma być wykonana, uważając, aby nie dotykać membrany końcówką pipety. Dializować z objętością buforu kwasu N-cykloheksylo-2-aminoetanosulfonowego (CHES) co najmniej 1000 razy większą od objętości próbki, mieszając z prędkością ~100 obr./min przez 15 minut.
   2. Przygotować świeży 6 mM roztwór sulfosukcynimidylo-4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylanu (sulfo-SMCC) w buforze CHES bezpośrednio przed każdym użyciem. Ostrożnie otworzyć jedną fiolkę zawierającą 2 mg sulfo-SMCC i odpipetować 800 μl buforu CHES do fiolki. Wirować, aby dokładnie wymieszać.
   3. Za pomocą pipetora ostrożnie pobrać zawieszone kropki kwantowe z urządzenia do dializy i przenieść do świeżej probówki zawierającej równą objętość roztworu sulfo-SMCC; pipetować w górę i w dół do wymieszania. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem z prędkością 1000 obr./min, aby umożliwić sulfo-SMCC reakcję z pierwszorzędowymi aminami na kropkach kwantowych.
   4. Za pomocą pipetora ostrożnie przenieś każdą próbkę do nowego urządzenia do dializy. W celu usunięcia nadmiaru sulfo-SMCC należy dializować z objętością buforu CHES co najmniej 1000 razy większą niż objętość zawarta w urządzeniu(-ach) do dializy, mieszając, przez 15 minut. Wymień bufor 2x i wykonaj dializę ze świeżym buforem CHES w sumie 3x, co pozwala na kontynuowanie dializy 15 minut po każdej wymianie bufora.
   5. W celu wymiany buforu w ramach przygotowań do drugiej reakcji, należy przenieść urządzenia do dializy do zlewki zawierającej objętość soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) co najmniej 1000 razy większą niż objętość zawarta w urządzeniu (urządzeniach). Dializować mieszając przez 15 minut, wymieniać bufor 2x i wykonywać dializę z użyciem świeżego PBS w sumie 3x, pozwalając na kontynuowanie dializy przez 15 minut po każdej wymianie buforu.
   6. Za pomocą pipetora ostrożnie odzyskać roztwór zawierający kropki kwantowe z urządzenia (urządzeń) do dializy i przenieść każdą próbkę do świeżej probówki zawierającej równomolową ilość tiolowanego oligonukleotydu rozcieńczonego w PBS. Połączyć równą objętość PBS i 1/10^objętości zredukowanej i oczyszczonej próbki oligonukleotydowej (stężenie około 40 μM), ponieważ stężenie kropek kwantowych w tym momencie wynosi ~4 μM. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, wytrząsając przy 1000 obr./min.
   7. Dodać albuminę surowicy bydlęcej (BSA, 10 mg/ml) do każdej próbki, aby uzyskać końcowe stężenie BSA 0,5 mg/ml. Za pomocą pipetora ostrożnie przenieść każdą próbkę do nowego urządzenia do dializy i dializować w stosunku do objętości bufora do przechowywania, która jest co najmniej 1000 razy większa niż objętość zawarta w urządzeniu do dializy. Wymień bufor 2 razy i wykonaj dializę z nowym buforem magazynowym w sumie 3 razy, co pozwala na kontynuowanie dializy przez 15 minut po każdej wymianie buforu.
   8. Za pomocą pipetora ostrożnie odzyskać każdą próbkę, umieścić ją w świeżej probówce i przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Nie przechowywać w temperaturze -20 °C, ponieważ kropki kwantowe ulegają uszkodzeniu w wyniku zamrożenia.
3. Wyżarzanie oligonukleotydu znakowanego kropkami kwantowymi do biotynylowanego oligonukleotydu
   1. Zawiesić każdy biotynylowany oligonukleotyd w buforze do przechowywania o stężeniu 100 μM. Niewykorzystane próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
   2. Połącz próbkę oligonukleotydu znakowanego kropkami kwantowymi z 10-krotnym nadmiarem molowym biotynylowanego oligonukleotydu. Ponieważ szacowane stężenie DNA w próbce znakowanej kropkami kwantowymi wynosi 2 μM, należy dodać 0,2 μl biotynylowanego oligonukleotydu na każde 10 μl tej próbki.
   3. Podgrzać mieszaninę w bloku grzewczym do temperatury 75 °C (temperatura topnienia dla obszaru komplementarnego). Trzymaj w tej temperaturze przez 5 minut. Wyłącz blok grzewczy i pozwól mu powoli ostygnąć. Gotową konstrukcję należy przechowywać w temperaturze 4 °C; Nie zamrażać.

3. Funkcjonalizacja powierzchni szkiełek nakrywkowych

UWAGA: Ten proces został już wcześniej opisany w innych protokołach wideo JoVE^16,17. Protokół ten opisuje dostosowaną wersję procedury z niewielkimi zmianami w celu uwzględnienia mniejszego szkiełka podstawowego. Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby zapoznać się z innymi materiałami wymaganymi do funkcjonalizacji powierzchni szkiełek nakrywkowych.

1. Umieść 5 szkiełek nakrywkowych w każdym uchwycie szkiełka nakrywkowego. Upewnij się, że pominiesz jedną spację między każdą parą szkiełek nakrywkowych, aby nie sklejały się ze sobą. Umieść szkiełka nakrywkowe w uchwycie w słoiku z pokrywką, dodaj etanol do słoika, aż szkiełka nakrywkowe zostaną przykryte i mocno przykręć nakrętkę. Umieść cały słoik w wodzie w soniku do kąpieli, nie zanurzając go całkowicie, i sonikuj przez 30 minut.
2. Napełnij czystą zlewkę lub słoik ultraczystą wodą. Użyj metalowej pęsety, aby usunąć szkiełka nakrywkowe z ich uchwytu z etanolu i zanurz je w wodzie w celu spłukania. Następnie przenieść szkiełka nakrywkowe i uchwyt do słoika zawierającego 1 M roztwór wodorotlenku potasu (KOH). Mocno przykręć nakrętkę, umieść słoik w kąpieli sonicyjnej i sonikuj przez 30 minut.
   UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z roztworem KOH, ponieważ jest on i drażniący.
3. Powtórzyć sonikację w roztworze etanolu i KOH, spłukując szkiełka nakrywkowe w wodzie, jak opisano powyżej, między każdym krokiem.
4. Przenieś szkiełka nakrywkowe w uchwycie do czystego słoika wypełnionego czystym acetonem. Zakończ czyszczenie, poddając słoik sonikacją zgodnie z powyższym opisem przez 30 minut. Po tym kroku nie spłukuj wodą.
5. Za pomocą metalowej pęsety przenieś szkiełka nakrywkowe w uchwycie do czystej zlewki o pojemności 100 ml zawierającej 80 ml świeżego acetonu i mieszadła w mikroskali. Umieść zlewkę na magnetycznej płycie mieszającej ustawionej na co najmniej 1 000 obr./min. Podczas energicznego mieszania acetonu odpipetować 1,6 ml 3-aminopropylotrietoksysilanu (APTES) do zlewki, aby uzyskać 2% roztwór v/v.
   UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas pipetowania APTES, ponieważ jest on.
6. Pozostaw szkiełka nakrywkowe do inkubacji w roztworze przez 2 minuty, a następnie użyj metalowej pęsety, aby przenieść szkiełka nakrywkowe w uchwycie do zlewki z wodą, aby wygasić reakcję. Opłucz szkiełka nakrywkowe jeszcze dwa razy, wymieniając wodę w zlewce.
7. Szkło silanizowane utwardzać w piekarniku w temperaturze 120 °C przez 75 minut. Jeśli nie przejdziesz od razu do następnego kroku, przechowuj szkiełka nakrywkowe w próżni przez maksymalnie kilka dni.
8. Rozpuścić N-hydroksysukcynimid (NHS) derywatyzowane estrami glikole polietylenowe (PEG) w 100 mM wodorowęglanu sodu (pH 8,2). Użyj stosunku 10:1 PEG zakończonego metoksylacją do PEG zakończonego biotyną, z ~100 mg / ml PEG zakończonego metoksy.
9. Odmierzyć pipetą 100 μl roztworu PEG na połowę suchych, silanizowanych szkiełek nakrywkowych i przykryć każde z nich drugim szkiełkiem nakrywkowym. Użyj małych kawałków parafilmu umieszczonych w każdym rogu jako przekładek, aby zapobiec sklejaniu się szkiełek nakrywkowych.
10. Inkubować szkiełka nakrywkowe w wilgotnym środowisku przez 3,5 godziny. Oddziel kanapki z szkiełkami nakrywkowymi. Użyj butelki ze spryskiwaczem, aby umyć każde szkiełko nakrywkowe dużą ilością wody i osuszyć sprężonym powietrzem.
11. Funkcjonalne szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w próżni. Upewnij się, że strona nasączona PEG jest podniesiona, ponieważ druga strona nie przechwyci substratu DNA.

4. Budowa urządzenia mikroprzepływowego

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów, aby zapoznać się z innymi materiałami wymaganymi do budowy urządzenia mikroprzepływowego.

1. Za pomocą ręcznego obrotowego narzędzia wielofunkcyjnego wyposażonego w stożkowe wiertło diamentowe wywierć dwa otwory w przeciwległych rogach zjeżdżalni kwarcowej, aby służyły jako wlot i wylot. Pamiętaj, aby zabezpieczyć suwak na miejscu, nasmarować wiertło i stale przesuwać się wodą podczas wiercenia. Po każdym eksperymencie odzyskaj przygotowane szkiełko kwarcowe do ponownego użycia poprzez namoczenie zużytego urządzenia w acetonie w celu rozpuszczenia kleju i żywicy epoksydowej; Wyrzuć pozostałe składniki.
   UWAGA: Wiercenie można wykonać ręcznie, ale użycie uchwytu typu prasowego do narzędzia wielofunkcyjnego ułatwia ten proces.
2. Połączyć 25 μl roztworu streptawidyny z 80 μl PBS i 20 μl buforu blokującego. Pokryj szkiełko nakrywkowe nasączone PEG tą mieszaniną i inkubuj w wilgotnym środowisku przez 30 minut.
3. Podczas inkubacji szkiełka nakrywkowego należy przygotować przekładkę obrazową, aby utworzyć kanał przepływowy. Wytnij kwadratowy kawałek materiału dystansowego o średnicy 1 cala, a następnie zaznacz kanał o szerokości 2 mm wyrównany z końcami otworów wywierconych w szkiełku kwarcowym (Rysunek 2). Wytnij kanał z materiału dystansowego za pomocą skalpela.
4. Oderwij jedną stronę podkładu od przekładki obrazu i ostrożnie umieść ją na szkiełku kwarcowym, uważając, aby nie zakryć otworów wlotowych i wylotowych. Pamiętaj, aby dokładnie wyczyścić szkiełko kwarcowe acetonem, aby usunąć wszelkie pozostałości kleju z wcześniejszych eksperymentów.
5. Umyj szkiełko nakrywkowe wodą i osusz sprężonym powietrzem. Usuń drugą stronę podkładu z przekładki obrazowej i umieść ją między szkiełkiem kwarcowym a funkcjonalizowanym, pokrytym streptawidyną szkiełkiem nakrywkowym, używając plastikowej pęsety do dociśnięcia zespołu i usunięcia pęcherzyków powietrza z kleju.
6. Włóż jedną rurkę polietylenową o długości 30 cm do każdego otworu w zjeżdżalni kwarcowej. Pamiętaj, aby przyciąć końce rurki pod kątem, aby zapewnić swobodny przepływ roztworu. Użyj stojaka na probówki lub innego wspornika, aby przytrzymać rurki na miejscu i uszczelnij rurki na miejscu oraz krawędzie zmontowanego urządzenia żywicą epoksydową.
   UWAGA: Dobrze sprawdza się zbudowanie urządzenia na kawałku parafilmu, który można łatwo oderwać od dna po związaniu żywicy epoksydowej.
7. Po związaniu żywicy epoksydowej włóż igłę pustej strzykawki do rurki wylotowej urządzenia i zanurz koniec rurki wlotowej w pojemniku wypełnionym buforem blokującym. Odciągnąć tłok strzykawki, aby napełnić urządzenie buforem blokującym. Pozostaw urządzenie do inkubacji na co najmniej 30 minut przed użyciem.

5. Wiązanie powierzchniowe substratu DNA znakowanego kropkami kwantowymi

UWAGA: Oprócz urządzenia mikroprzepływowego, substratu DNA i bufora blokującego opisanego powyżej, zobacz Tabelę materiałów dla innych materiałów i Tabelę 1 dla wymaganych do wiązania powierzchni substratów DNA znakowanych kropkami kwantowymi.

1. Przymocuj urządzenie mikroprzepływowe do płytki stolika mikroskopu za pomocą taśmy, doprowadź obiektyw do kontaktu z dolną częścią urządzenia i ustaw obiektyw tak, aby pole view znajdował się w kanale mikroprzepływowym.
2. Przepłukać kanał mikroprzepływowy świeżym buforem blokującym, odciągając tłok strzykawki po podłączeniu rurki wylotowej do pompy strzykawkowej. Sprawdź, czy w rurce lub w kanale nie ma pęcherzyków uwięzionych.
   UWAGA: Od tego momentu upewnij się, że rurka dolotowa jest w cieczy, aby do urządzenia nie dostały się pęcherzyki powietrza.
3. Rozcieńczyć 1 μl przygotowanego substratu DNA w 1 ml buforu blokującego. Umieścić rurkę wlotową w rozcieńczonym substracie DNA i przepuścić 800 μl roztworu substratu przez kanał z szybkością 200 μl/min. Pozostawić roztwór DNA do inkubacji w kanale w spokoju przez 15 minut po ustaniu przepływu.
4. Przepuścić co najmniej 800 μl buforu blokującego przez kanał z szybkością 200 μl/min, aby wypłukać niezwiązane DNA z kanału.
5. Dostosuj moc lasera, ostrość mikroskopu i kąt TIRF tak, aby kropki kwantowe na uwięzi powierzchniowej były wyraźnie widoczne.
   UWAGA: Chociaż kropki kwantowe nie blakną szybko, najlepiej jest utrzymywać moc na jak najniższym poziomie, aby zminimalizować mruganie.

6. Rozszczepienie DNA za pośrednictwem REazy

UWAGA: Zobacz Tabelę materiałów dla materiałów i Tabelę 1 dla wymaganych do rozszczepienia DNA za pośrednictwem REazy.

1. Upewnij się, że kamera jest schłodzona do optymalnej temperatury roboczej i skonfigurowana do szybkiego przesyłania strumieniowego z czasem naświetlania 0.10 s. Przygotuj się na zbieranie danych przez ~4 min.
2. Przepłukać urządzenie mikroprzepływowe 800 μl eksperymentalnego buforu bez magnezu przy natężeniu przepływu 200 μl/min.
3. Dodać REazę do podwielokrotności (1 ml) eksperymentalnego buforu bez magnezu i delikatnie wymieszać pipetując. Użyj 4 μl ze 100 000 jednostek/ml zapasu, co odpowiada 400 jednostkom/ml EcoRV. Przepuścić 800 μl rozcieńczonego enzymu przez kanał z natężeniem przepływu 200 μl/min.
4. Rozpocznij eksperyment od przelania eksperymentalnego buforu zawierającego magnez i fluoresceinę z szybkością przepływu 200 μl/min. Rozpocznij rejestrowanie danych natychmiast po uruchomieniu pompy strzykawkowej. Po przelaniu 800 μL buforu zatrzymaj akwizycję danych.

7. Analiza danych

UWAGA: Zobacz Tabelę materiałów dla oprogramowania do analizy danych używanego dla tego protokołu i dokonaj korekt, jeśli używasz innej platformy analitycznej.

1. Wyznaczanie zerowego punktu czasowego
   1. Odejmij fluorescencję tła od każdej klatki filmu eksperymentalnego za pomocą funkcji imtophat, wbudowanej w przybornik przetwarzania obrazu funkcji filtrowania cylindra. Wybierz dysk o promieniu trzech pikseli jako element strukturyzacji. Intensywność tła można uzyskać, odejmując przefiltrowany obraz od obrazu oryginalnego.
      UWAGA: Filtr zachowuje tylko te cechy obrazu, które są jaśniejsze niż tło i mniejsze niż element strukturyzujący.
   2. Uśrednia odjęte tło z każdej klatki filmu. Użyj trajektorii tej wartości, aby określić zerowy punkt czasowy eksperymentu (Rysunek 3A). Określ czas rozpoczęcia, znajdując pierwszą klatkę, przy której szybkość wzrostu przekracza 3-krotność odchylenia standardowego szybkości zmian podczas przepływu objętości martwej.
      UWAGA: Gwałtowny wzrost tempa zmian średniej wartości odjętego tła dla każdej klatki filmu wskazuje na czas, w którym końcowy eksperymentalny bufor zawierający barwnik znacznikowy wszedł do komórki przepływowej (Rysunek 3B).
2. Obliczanie i analiza trajektorii intensywności kropek kwantowych
   1. Obliczyć projekcję o maksymalnej intensywności dla zestawu klatek filmu z korekcją tła nagranych przed przybyciem barwnika znacznikowego. Określ położenie kropek kwantowych z dokładnością do jednego piksela na tym obrazie projekcyjnym za pomocą funkcji znajdowania pików, takiej jak pkfnd.
   2. Wygeneruj trajektorie intensywności dla poszczególnych kropek kwantowych, obliczając średnią intensywność w każdej klatce filmu w kwadratowym obszarze po trzy piksele z każdej strony otaczającej lokalizację zwróconą przez funkcję znajdowania pików.
      UWAGA: Opisana powyżej korekcja tła usuwa artefakty wprowadzone przez barwnik smugowy. Wynikowe trajektorie intensywności powinny być względnie płaskie, ale nadal uwzględniać naturalnie występujące fluktuacje intensywności (Rysunek 4).
   3. Identyfikacja zdarzeń zaniku kropek kwantowych poprzez analizę statystyczną trajektorii intensywności. Dla każdej trajektorii intensywności kropki kwantowej należy obliczyć natężenie progowe, które jest wyższe od wartości minimalnej o odpowiedni ułamek różnicy między wartościami maksymalnymi i minimalnymi dla tej trajektorii, w zależności od szumu zaobserwowanego na trajektoriach.
      UWAGA: Fluktuacja intensywności kropki kwantowej jest zazwyczaj znacznie większa niż fluktuacja tła. Odpowiednią wartość można wyznaczyć, porównując te wartości: wybrany próg musi być wyższy niż najwyższa wartość tła, ale najlepiej niższy niż najniższa wartość dla fluorescencji kropek kwantowych. W odniesieniu do przedstawionych danych obliczono, że zastosowany próg jest wyższy od wartości minimalnej dla każdej trajektorii powiększonej o jedną trzecią różnicy między wartościami maksymalnymi i minimalnymi dla tej trajektorii. Można uznać, że kropka kwantowa zniknęła w ostatnim punkcie czasowym, w którym obserwowane natężenie w jej lokalizacji przekroczyło ten próg.
   4. Potwierdź domniemane zdarzenia związane z zaginięciem. W analizie końcowej należy uwzględnić zdarzenia tylko wtedy, gdy obserwowana intensywność przekracza punkt środkowy między minimalnymi i maksymalnymi wartościami intensywności trajektorii dla ponad połowy klatek filmu przed czasem zniknięcia, a odchylenie standardowe trajektorii intensywności zmniejszyło się po zdarzeniu.
      UWAGA: Można zastosować inne testy statystyczne, aby upewnić się, że rejestrowane są tylko prawidłowe zdarzenia zaginięcia.

Wyniki

Komórka przepływowa jest bezpośrednio sprzężona z obiektywem o dużym powiększeniu z olejkiem o dużej aperturze numerycznej i 60-krotnym powiększeniu na mikroskopie odwróconym, wyposażonym w oświetlenie laserowe do obrazowania TIRF przez obiektyw (Rysunek 5A). Po wprowadzeniu substratu DNA i zmyciu nadmiaru DNA i kropek kwantowych, w polu widzenia znajdują się zazwyczaj tysiące pojedynczych kropek kwantowych (Rysunek 5B). Te kropki kwantowe są stabilnie przymocowane do powierzchni s...

Dyskusja

Substrat DNA do tego testu jest znakowany kropką kwantową przy użyciu dwuetapowego schematu reakcji z użyciem sulfo-SMCC. Ten dwufunkcyjny środek sieciujący składa się z ugrupowania estrowego NHS, które może reagować z pierwszorzędową aminą, oraz ugrupowania maleimidowego, które może reagować z grupą sulfhydrylową²⁰. Tiolowane oligonukleotydy używane do przygotowania substratu są wysyłane w postaci utlenionej. Ważne jest, aby je zredukować i oczyścić, zgodnie z opisem, przed przystąpieniem do proc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
3-aminopropylotrietoksysilan (APTS)	Sigma Aldrich	440140-100ML	Przechowywać w pudełku eksykatora
5 Minute Epoxy	Devcon	20845	służy do uszczelniania urządzenia mikroprzepływowego
aceton	Pharmco	329000ACS	służy do czyszczenia szkiełek nakrywkowych
sonikator do kąpieli	Fisher Scientific	CPXH Model 2800	numer katalogowy 15-337-410
Zlewka, szklana, 100 ml
Wirówka
Biotyna-PEG-Walerianian sukcynimidylu (MW 5,000)	Laysan Bio	BIO-SVA-5K	Walerianian sukcynimidylu ma dłuższy okres półtrwania niż węglan sukcynimidylu
Biotynylowany oligonukleotyd	Zintegrowane technologie DNA	- patrz protokół, aby zapoznać się z rozważaniami projektowymi	Poproś o modyfikację 5' Biotyny i Oczyszczanie HPLC
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	VWR	0903-5G	przygotować roztwór o stężeniu 10 mg/ml (woda) i podgrzać do 95 & stopni; C przed użyciem
Centri-Spin-10 Wykluczenie rozmiaru Kolumny wirowe	Princeton Separacje	CS-100 lub CS-101	służy do oczyszczania tiolowanych oligonukleotydów po redukcji wiązania dwusiarczkowego
Probówki wirówkowe 1,5. ml
Szkiełka nakrywkowe, 1-calowe kwadratowe szklane
uchwyty
diamentowe koło punktowe	Dremel	7134	zastosowanie do wiercenia otworów w kwarcowej nakładce na komory przepływowe
ditiotreitol (DTT)	Thermo Scientific	A39255	No-Weigh Format, 7,7 mg/fiolkę
wiertarka obrotowa narzędzie Stacja robocza Stojak	Dremel	220-01	ułatwia wiercenie kwarcowe
EcoRV (REase używane do generowania przykładowych danych)	New England Biolabs	R0195T lub R0195M	Użyj 100 000 jednostek/ml, aby uniknąć dodawania nadmiaru glicerolu Sprawdź REBASE dla dostawców innych REaz
etanolu	różnych	CAS 64-17-5	denaturowanych lub 95% są dopuszczalne, używaj do czyszczenia szkiełek nakrywkowych
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Sigma Aldrich	EDS	BioUltra, bezwodny, przechowywać w pudełku eksykatora
Pchły Micro Spinbar	Fisherbrand	14-513-65	Rozmiar 3 mm x 10 mm pasujący pod stojakiem na szkiełka nakrywkowe
fluoresceina	Acros Organics	17324	służy do produkcji eksperymentalnych
grawitacyjnych pieca konwekcyjnego	Binder	9010-0131
ręczne obrotowe narzędzie wielofunkcyjne	Dremel	8220	służy do wiercenia otworów w kwarcowej komorze przepływowym
Topper ImagEM X2 EM-CCD Kamera	Hamamatsu	C9100-23B	chłodzenie powietrzem jest odpowiednie do tego eksperymentu, użyj oprogramowania HCImage lub podobnego do sterowania
Dystans obrazowania, dwustronny, samoprzylepny
Słoik, szkło z zakrętką, (około 50 mm średnicy i 50 mm wysokości)
chlorek magnezu sześciowodny	Fisher Bioreagents	BP214-500	służy do tworzenia eksperymentalnego bufora z magnezem
Oprogramowanie		MATLAB	Metalowa
pęseta	Fisher Brand	16-100-110
metoksy-PEG-Sukcynimidyl Walerianian (MW 5,000)	Laysan Bio	M-SVA-5K	Oba PEG-i powinny mieć ten sam ester NHS, aby szybkość reakcji była spójna
mikrowirówka	Eppendorf	5424
	VWR	12621-022
Kwas N-cykloheksylo-2-aminoetanosulfonowy (CHES)	Acros Organics	AC20818	CAS 103-47-9, służy do produkcji bufora CHES
wytrząsarka orbitalna i grzałka do probówek do mikrowirówek	Q Instruments	1808-0506	z adapterem 1808-1061 do probówek 24 x 2,0 ml lub 15 x 0,5 ml
Parafilm
PE60 Rurka polietylenowa (średnica wewnętrzna 0,76 mm, średnica zewnętrzna 1,22 mm)	Intramedic	6258917	igły 22 G dobrze pasują do tego rozmiaru rurki
buforowana fosforanami (PBS) 10x	Sigma Aldrich	P7059	Stosować przy sile
1x wodorotlenek potasu	VWR Chemicals BDH	BDH9262	użyć 1 M roztworu do czyszczenia szkiełek nakrywkowych
Qdot 655 ITK Amino (PEG) Quantum Dots	Invitrogen	Q21521MP
Szkiełko kwarcowe, 1 cal kwadratowy, grubość 1 mm	Mikroskopia elektronowa Sciences	72250-10	W rogach należy wywiercić otwory do wprowadzania rurek doprowadzających i wylotowych
wzmocniona pęseta z tworzywa sztucznego	Rubis	K35a	służy do przenoszenia szkiełek nakrywkowych i budowy urządzenia mikroprzepływowego
Arkusze samoprzylepne SecureSeal	Grace Biolabs	SA-S-1L	przycięte w celu utworzenia przekładki do urządzenia mikroprzepływowego
Jednokanałowa pompa strzykawkowa do mikrofluidyki	Systemy	pompowe nowej eryNE-1002X-US	wyposażony w strzykawkę o pojemności 50 ml i igłę 22 G
Slide-a-Lyzer MINI urządzenia do dializy, 10 kDa MWCO, 0,1 ml	Thermo Scientific	69570 lub 69572	używane do wymiany buforu podczas sprzęgania kropek kwantowych z
wodorowęglanem sodu	DNA EMD Millipore	SX0320	służy do tworzenia buforu do funkcjonalizacji powierzchni; 100 mM, pH 8
chlorek sodu	Macron	7581-12	używać do wytwarzania eksperymentalnych
Dwuzasadowy roztwór fosforanu sodu (BioUltra, 0,5 M w wodzie)	Sigma Aldrich	94046	służy do wytwarzania 100 mM buforu fosforanu sodu
Monozasadowy roztwór fosforanu sodu (BioUltra, 5M w wodzie)	Sigma Aldrich	74092	służy do regulacji pH 100 mM buforu fosforanu sodu
Streptawidyna z Streptomyces avidinii	Sigma Aldrich	S4762	rozpuścić w stężeniu 1 mg/ml i przechowywać 25 ml roztworu w temperaturze -20 ?
Sulfosuccinimidylo-4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylan (sulfo-SMCC)	Thermo Scientific	A39268	No-Weigh Format, 2 mg / fiolkę
Strzykawka wyposażona w igłę
Pompka
Tiolowany oligonukleotyd	Zintegrowane technologie DNA niestandardowe	- zobacz protokół, aby zapoznać się z rozważaniami projektowymi	Poproś o 5-calowy modyfikator tiolu C6 S-S i system obrazowania HPLC purificaiton
TIRF z oświetleniem laserowym 488 nm,	różnymi		niestandardowymi konstrukcjami
Tris -HCl	Research Products International	T60050	do tworzenia eksperymentalnych
Tris base	JT Baker	4101	służy do tworzenia eksperymentalnych
Tween-20	Sigma	P7949	służy do blokowania bufor
Mieszalnik wirowy
Wash-N-Dry Coverslip Rack Mikroskopia	elektronowa Sciences	70366-16	służy do funkcjonalizacji powierzchni szkiełek nakrywkowych