Analiza w czasie przebywania pojedynczej cząsteczki rozszczepienia DNA za pośrednictwem endonukleazy restrykcyjnej

Endonukleazy restrykcyjne (REazy) to enzymy, które powodują specyficzne dla sekwencji dwuniciowe pęknięcia w DNA. Odkrycie REaz w latach siedemdziesiątych XX wieku doprowadziło do rozwoju technologii rekombinacji DNA, a enzymy te są obecnie niezbędnymi narzędziami laboratoryjnymi do modyfikacji i manipulacji genetycznych¹. REazy typu II są najczęściej stosowanymi enzymami w tej klasie, ponieważ rozszczepiają DNA w ustalonym miejscu w obrębie lub w pobliżu sekwencji rozpoznawania. Istnieje jednak duża zmienność między REazami typu II i są one podzielone na kilka podtypów w oparciu o określone właściwości enzymatyczne, a nie są klasyfikowane zgodnie z ich pokrewieństwem ewolucyjnym. Wśród każdego podtypu istnieją częste wyjątki od schematu klasyfikacji, a wiele enzymów należy do wielu podtypów². Zidentyfikowano tysiące REaz typu II, a setki z nich są dostępne na rynku.

Jednakże, pomimo różnorodności wśród REaz typu II, bardzo niewiele REaz zostało szczegółowo zbadanych. Według REBASE, bazy danych enzymów restrykcyjnych założonej przez Sir Richarda Robertsa w 1975 roku³, opublikowane dane kinetyki są dostępne dla mniej niż 20 z tych enzymów. Ponadto, podczas gdy niektóre REazy zostały bezpośrednio zaobserwowane na poziomie pojedynczej cząsteczki podczas dyfuzji wzdłuż DNA przed napotkaniem i związaniem się z ich sekwencją rozpoznawania^4,5,6,7, istnieje bardzo niewiele badań pojedynczych cząsteczek dotyczących kinetyki reakcji rozszczepienia. Istniejące badania albo nie dostarczają odpowiednich danych statystycznych, aby przeprowadzić szczegółową analizę zmienności w czasie, w którym mają miejsce pojedyncze zdarzenia rozszczepienia^8,9,10 lub nie są w stanie uchwycić pełnego rozkładu czasów rozszczepienia¹¹. Tego typu analiza może ujawnić obecność stosunkowo długożyciowych kinetycznych produktów pośrednich i może prowadzić do lepszego zrozumienia mechanizmów rozszczepienia DNA za pośrednictwem REazy.

Na poziomie pojedynczej cząsteczki procesy biochemiczne są stochastyczne - czas oczekiwania na wystąpienie pojedynczego wystąpienia procesu, τ, jest zmienny. Można jednak oczekiwać, że wiele pomiarów τ będzie przestrzeganych rozkładu prawdopodobieństwa, p(τ), który wskazuje na rodzaj zachodzącego procesu. Na przykład proces jednoetapowy, taki jak uwolnienie cząsteczki produktu z enzymu, będzie zgodny ze statystykami Poissona, a p(τ) przyjmie postać ujemnego rozkładu wykładniczego:

gdzie β oznacza średni czas oczekiwania. Należy pamiętać, że szybkość procesu, k, będzie równa 1/β, co jest odwrotnością średniego czasu oczekiwania. W przypadku procesów, które wymagają więcej niż jednego kroku, p(τ) będzie splotem rozkładów jednowykładniczych dla każdego z poszczególnych kroków. Ogólnym rozwiązaniem dla splotu N funkcji rozpadu jednowykładniczego o identycznym średnim czasie oczekiwania, β, jest rozkład prawdopodobieństwa gamma:

gdzie Γ(N) to funkcja gamma, która opisuje interpolację silni N-1 do niecałkowitych wartości N. Chociaż to ogólne rozwiązanie może być stosowane jako przybliżenie, gdy średnie czasy oczekiwania na poszczególne kroki są podobne, należy rozumieć, że obecność stosunkowo szybkich kroków będzie maskowana przez kroki o znacznie dłuższym czasie oczekiwania. Innymi słowy, wartość N reprezentuje dolny limit liczby kroków¹². Przy odpowiedniej liczbie pomiarów czasu oczekiwania, parametry β i N można oszacować, łącząc zdarzenia i dopasowując rozkład gamma do otrzymanego histogramu lub stosując podejście estymacji maksymalnego prawdopodobieństwa. Ten rodzaj analizy może zatem ujawnić obecność kroków kinetycznych, które nie mogą być łatwo rozwiązane w testach zespołowych i wymagają dużej liczby obserwacji w celu dokładnego oszacowania parametrów^12,13.

Ten artykuł opisuje metodę użycia mikroskopii DNA znakowanego kwantowo kropkami i mikroskopii całkowitej fluorescencji wewnętrznej odbicia (TIRF) do obserwacji setek indywidualnych zdarzeń rozszczepienia DNA za pośrednictwem REazy równolegle. Konstrukcja testu umożliwia łączenie wyników kilku eksperymentów i tworzenie rozkładów czasu przebywania zawierających tysiące zdarzeń. Wysoka fotostabilność i jasność kropek kwantowych pozwala na uzyskanie rozdzielczości czasowej na poziomie 10 Hz bez poświęcania możliwości obserwacji zdarzeń rozszczepienia zachodzących nawet wiele minut po rozpoczęciu eksperymentu. Dobra rozdzielczość czasowa i szeroki zakres dynamiki, w połączeniu z możliwością zebrania dużego zestawu danych, pozwalają na dokładną charakterystykę rozkładów czasu przebywania w celu odkrycia obecności wielu kroków kinetycznych w szlakach cięcia REaz, które mają wskaźniki rotacji w zakresie 1 ^min-1. W przypadku EcoRV można rozwiązać trzy etapy kinetyczne, z których wszystkie zostały zidentyfikowane za pomocą innych środków, co potwierdza, że test jest czuły na obecność takich etapów.

Duplex DNA zawierające interesującą nas sekwencję rozpoznawania są wytwarzane przez wyżarzanie biotynylowanego oligonukleotydu do komplementarnej nici znakowanej pojedynczą, kowalencyjnie dołączoną półprzewodnikową nanokrystaliczną kropką kwantową. Substraty te są wprowadzane do kanału przepływowego zbudowanego na szklanym szkiełku nakrywkowym z trawnikiem z cząsteczkami glikolu polietylenowego (PEG) o wysokiej masie cząsteczkowej kowalencyjnie przymocowanymi do jego powierzchni. Substraty DNA są wychwytywane przez wiązanie biotyna-streptawidyna-biotyna przez frakcję cząsteczek PEG, które mają biotynę na wolnym końcu. W mikroskopii TIRF ulotna fala, która zanika wykładniczo wraz z odległością od granicy faz szkło-ciecz, zapewnia oświetlenie; Głębokość penetracji jest rzędu długości fali użytego światła. W tych warunkach wzbudzone zostaną tylko kropki kwantowe, które są przywiązane do powierzchni przez cząsteczkę DNA, która została uchwycona na funkcjonalizowanej powierzchni szkła. Kropki kwantowe, które są wolne w roztworze, nie będą ograniczone w oświetlonym obszarze, a zatem nie będą świecić. Jeśli DNA wiążące kropkę kwantową z powierzchnią zostanie rozszczepione, ta kropka kwantowa będzie mogła swobodnie dyfundować z dala od powierzchni i zniknie z obrazu fluorescencyjnego.

Chociaż wiadomo, że wiele REaz typu II wiąże DNA przy braku magnezu¹⁴, wszystkie wymagają magnezu do pośredniczenia w rozszczepianiu DNA¹⁵. Te REazy mogą wiązać unieruchomione powierzchniowo DNA przy braku magnezu. Kiedy bufor zawierający magnez przepływa przez kanał z REazą wstępnie związaną z DNA, rozszczepienie rozpoczyna się natychmiast, na co wskazuje zniknięcie kropek kwantowych. Synchronizacja osiągnięta przez wstępne wiązanie cząsteczek REazy, a następnie zainicjowanie rozszczepienia DNA poprzez wprowadzenie magnezu, ułatwia pomiar czasu opóźnienia do zakończenia rozszczepienia DNA niezależnie dla każdej cząsteczki w populacji enzymów obserwowanych w eksperymencie. Fluoresceina jest zawarta w postaci barwnika znacznikowego w buforze zawierającym magnez w celu wskazania pojawienia się magnezu w polu widzenia. Ponieważ w buforze zawierającym magnez nie ma enzymu, czas opóźnienia od przybycia buforu zawierającego magnez do zniknięcia każdej kropki kwantowej wskazuje czas potrzebny REazie, która jest już związana z DNA, na rozszczepienie DNA i uwolnienie kropki kwantowej z powierzchni szkła. Zanikanie kropek kwantowych następuje szybko i powoduje gwałtowny spadek trajektorii intensywności, co stanowi wyraźne wskazanie czasu, w którym dana cząsteczka DNA jest rozszczepiana. Określenie czasów zdarzeń odbywa się poprzez matematyczną analizę trajektorii intensywności, a typowy eksperyment skutkuje setkami możliwych do zidentyfikowania zdarzeń rozszczepienia. Wyniki wielu eksperymentów mogą być łączone w celu uzyskania odpowiednich statystyk umożliwiających oszacowanie parametrów, N i β, za pomocą nieliniowej analizy najmniejszych kwadratów lub analizy maksymalnego prawdopodobieństwa.

1. Informacje ogólne

1. Konstrukcja oligonukleotydu
   UWAGA: Substrat DNA o długości 60 par zasad (bp) jest utworzony z pary komplementarnych oligonukleotydów o temperaturze topnienia duplex 75 °C w 100 mM NaCl.
   1. Zamów jeden oligonukleotyd zsyntetyzowany z pojedynczą modyfikacją biotyny 5', a drugi z modyfikacją tiolu 5' (z sześciowęglowym przekładką). Umieść miejsce rozpoznawania na środku obszaru dupleksu.
      UWAGA: Sekwencje oligonukleotydowe do stosowania z EcoRV są pokazane poniżej (miejsce rozpoznawania pogrubioną czcionką).
      5' Biotyna - AAA ACC GAC ATG TTG ATT TCC TGA AACGG G ATA TCA TCA AAG CCA CCA TGA ACA AAG CAG CCG - 3'
      5' tiol - CGG CTG CTT TGT TCA TGG CTT TGAT GA TAT CCC GTT TCA GGA AAT CAA CAT GTC GGT TTT - 3'
2. Używaj ultraczystej wody o rezystywności 18 MOhm na wszystkich etapach.
3. Chroń wszystkie roztwory zawierające kropki kwantowe przed światłem, aby zapobiec fotowybielaniu.
4. Użyj źródła sprężonego powietrza, aby wypełnić ten protokół.

2. Przygotowanie materiałów substratowych DNA znakowanych kropkami kwantowo

UWAGA: Oprócz oligonukleotydów opisanych powyżej, zobacz Tabelę materiałów dla innych materiałów i Tabelę 1 dla wymaganych do przygotowania substratów DNA znakowanych kropkami kwantowymi.

1. Zredukuj grupy tiolowe 5' na oligonukleotydzie, który ma być sprzężony z kropkami kwantowymi.
   1. Zawiesić każdy tiolowany oligonukleotyd w wodzie o stężeniu 100 μM.
   2. Odpipetować 650 μl wody do kolumny wirowej z wyłączeniem wielkości dla każdej próbki oligonukleotydu i wirować przez ~15 s. Pozostaw kolumnę do zapakowania na 30 minut.
   3. Przygotuj świeży roztwór 100 mM ditiotreitolu (DTT) bezpośrednio przed każdym użyciem, ponieważ DTT szybko ulega degradacji w roztworze. Ostrożnie otworzyć jedną fiolkę zawierającą 7,7 mg DTT i odpipetować 500 μl buforu fosforanu sodu do fiolki; wirować, aby dokładnie wymieszać.
   4. Dla każdego zawieszonego oligonukleotydu przygotuj świeżą probówkę i dodaj do niej 50 μl oligonukleotydu i 50 μl roztworu DTT. Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu zmniejszenia wiązań dwusiarczkowych między utlenionymi grupami tiolowymi na końcu 5' oligonukleotydów.
   5. Zdejmij nasadki kolumny wirującej i umieść każdą kolumnę w probówce zbiorczej. Odwirować kolumny wirowe o masie 750 × g przez 2 minuty i wyrzucić eluat.
   6. Przenieś kolumny wirujące do świeżych probówek wirówkowych. Delikatnie odpipetować całą objętość (100 μl) jednej próbki mieszaniny DNA/DTT na każdą przygotowaną kolumnę. Odwirować przy 750 × g przez 2 minuty i zmierzyć absorbancję eluatu przy 260 nm, aby potwierdzić, że stężenie wynosi około 40 μM.
   7. Wszelkie próbki, które nie zostaną natychmiast użyte, należy przechowywać w temperaturze -20 °C, aby zapobiec utlenianiu grup tiolowych i tworzeniu się wiązań dwusiarczkowych.
2. Sprzężenie DNA z kropkami kwantowymi
   1. Odpipetować jedną porcję 50 μl materiału z kropkami kwantowymi do urządzenia do dializy dla każdej konstrukcji, która ma być wykonana, uważając, aby nie dotykać membrany końcówką pipety. Dializować z objętością buforu kwasu N-cykloheksylo-2-aminoetanosulfonowego (CHES) co najmniej 1000 razy większą od objętości próbki, mieszając z prędkością ~100 obr./min przez 15 minut.
   2. Przygotować świeży 6 mM roztwór sulfosukcynimidylo-4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylanu (sulfo-SMCC) w buforze CHES bezpośrednio przed każdym użyciem. Ostrożnie otworzyć jedną fiolkę zawierającą 2 mg sulfo-SMCC i odpipetować 800 μl buforu CHES do fiolki. Wirować, aby dokładnie wymieszać.
   3. Za pomocą pipetora ostrożnie pobrać zawieszone kropki kwantowe z urządzenia do dializy i przenieść do świeżej probówki zawierającej równą objętość roztworu sulfo-SMCC; pipetować w górę i w dół do wymieszania. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem z prędkością 1000 obr./min, aby umożliwić sulfo-SMCC reakcję z pierwszorzędowymi aminami na kropkach kwantowych.
   4. Za pomocą pipetora ostrożnie przenieś każdą próbkę do nowego urządzenia do dializy. W celu usunięcia nadmiaru sulfo-SMCC należy dializować z objętością buforu CHES co najmniej 1000 razy większą niż objętość zawarta w urządzeniu(-ach) do dializy, mieszając, przez 15 minut. Wymień bufor 2x i wykonaj dializę ze świeżym buforem CHES w sumie 3x, co pozwala na kontynuowanie dializy 15 minut po każdej wymianie bufora.
   5. W celu wymiany buforu w ramach przygotowań do drugiej reakcji, należy przenieść urządzenia do dializy do zlewki zawierającej objętość soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) co najmniej 1000 razy większą niż objętość zawarta w urządzeniu (urządzeniach). Dializować mieszając przez 15 minut, wymieniać bufor 2x i wykonywać dializę z użyciem świeżego PBS w sumie 3x, pozwalając na kontynuowanie dializy przez 15 minut po każdej wymianie buforu.
   6. Za pomocą pipetora ostrożnie odzyskać roztwór zawierający kropki kwantowe z urządzenia (urządzeń) do dializy i przenieść każdą próbkę do świeżej probówki zawierającej równomolową ilość tiolowanego oligonukleotydu rozcieńczonego w PBS. Połączyć równą objętość PBS i 1/10^objętości zredukowanej i oczyszczonej próbki oligonukleotydowej (stężenie około 40 μM), ponieważ stężenie kropek kwantowych w tym momencie wynosi ~4 μM. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, wytrząsając przy 1000 obr./min.
   7. Dodać albuminę surowicy bydlęcej (BSA, 10 mg/ml) do każdej próbki, aby uzyskać końcowe stężenie BSA 0,5 mg/ml. Za pomocą pipetora ostrożnie przenieść każdą próbkę do nowego urządzenia do dializy i dializować w stosunku do objętości bufora do przechowywania, która jest co najmniej 1000 razy większa niż objętość zawarta w urządzeniu do dializy. Wymień bufor 2 razy i wykonaj dializę z nowym buforem magazynowym w sumie 3 razy, co pozwala na kontynuowanie dializy przez 15 minut po każdej wymianie buforu.
   8. Za pomocą pipetora ostrożnie odzyskać każdą próbkę, umieścić ją w świeżej probówce i przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Nie przechowywać w temperaturze -20 °C, ponieważ kropki kwantowe ulegają uszkodzeniu w wyniku zamrożenia.
3. Wyżarzanie oligonukleotydu znakowanego kropkami kwantowymi do biotynylowanego oligonukleotydu
   1. Zawiesić każdy biotynylowany oligonukleotyd w buforze do przechowywania o stężeniu 100 μM. Niewykorzystane próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
   2. Połącz próbkę oligonukleotydu znakowanego kropkami kwantowymi z 10-krotnym nadmiarem molowym biotynylowanego oligonukleotydu. Ponieważ szacowane stężenie DNA w próbce znakowanej kropkami kwantowymi wynosi 2 μM, należy dodać 0,2 μl biotynylowanego oligonukleotydu na każde 10 μl tej próbki.
   3. Podgrzać mieszaninę w bloku grzewczym do temperatury 75 °C (temperatura topnienia dla obszaru komplementarnego). Trzymaj w tej temperaturze przez 5 minut. Wyłącz blok grzewczy i pozwól mu powoli ostygnąć. Gotową konstrukcję należy przechowywać w temperaturze 4 °C; Nie zamrażać.

3. Funkcjonalizacja powierzchni szkiełek nakrywkowych

UWAGA: Ten proces został już wcześniej opisany w innych protokołach wideo JoVE^16,17. Protokół ten opisuje dostosowaną wersję procedury z niewielkimi zmianami w celu uwzględnienia mniejszego szkiełka podstawowego. Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby zapoznać się z innymi materiałami wymaganymi do funkcjonalizacji powierzchni szkiełek nakrywkowych.

1. Umieść 5 szkiełek nakrywkowych w każdym uchwycie szkiełka nakrywkowego. Upewnij się, że pominiesz jedną spację między każdą parą szkiełek nakrywkowych, aby nie sklejały się ze sobą. Umieść szkiełka nakrywkowe w uchwycie w słoiku z pokrywką, dodaj etanol do słoika, aż szkiełka nakrywkowe zostaną przykryte i mocno przykręć nakrętkę. Umieść cały słoik w wodzie w soniku do kąpieli, nie zanurzając go całkowicie, i sonikuj przez 30 minut.
2. Napełnij czystą zlewkę lub słoik ultraczystą wodą. Użyj metalowej pęsety, aby usunąć szkiełka nakrywkowe z ich uchwytu z etanolu i zanurz je w wodzie w celu spłukania. Następnie przenieść szkiełka nakrywkowe i uchwyt do słoika zawierającego 1 M roztwór wodorotlenku potasu (KOH). Mocno przykręć nakrętkę, umieść słoik w kąpieli sonicyjnej i sonikuj przez 30 minut.
   UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z roztworem KOH, ponieważ jest on i drażniący.
3. Powtórzyć sonikację w roztworze etanolu i KOH, spłukując szkiełka nakrywkowe w wodzie, jak opisano powyżej, między każdym krokiem.
4. Przenieś szkiełka nakrywkowe w uchwycie do czystego słoika wypełnionego czystym acetonem. Zakończ czyszczenie, poddając słoik sonikacją zgodnie z powyższym opisem przez 30 minut. Po tym kroku nie spłukuj wodą.
5. Za pomocą metalowej pęsety przenieś szkiełka nakrywkowe w uchwycie do czystej zlewki o pojemności 100 ml zawierającej 80 ml świeżego acetonu i mieszadła w mikroskali. Umieść zlewkę na magnetycznej płycie mieszającej ustawionej na co najmniej 1 000 obr./min. Podczas energicznego mieszania acetonu odpipetować 1,6 ml 3-aminopropylotrietoksysilanu (APTES) do zlewki, aby uzyskać 2% roztwór v/v.
   UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas pipetowania APTES, ponieważ jest on.
6. Pozostaw szkiełka nakrywkowe do inkubacji w roztworze przez 2 minuty, a następnie użyj metalowej pęsety, aby przenieść szkiełka nakrywkowe w uchwycie do zlewki z wodą, aby wygasić reakcję. Opłucz szkiełka nakrywkowe jeszcze dwa razy, wymieniając wodę w zlewce.
7. Szkło silanizowane utwardzać w piekarniku w temperaturze 120 °C przez 75 minut. Jeśli nie przejdziesz od razu do następnego kroku, przechowuj szkiełka nakrywkowe w próżni przez maksymalnie kilka dni.
8. Rozpuścić N-hydroksysukcynimid (NHS) derywatyzowane estrami glikole polietylenowe (PEG) w 100 mM wodorowęglanu sodu (pH 8,2). Użyj stosunku 10:1 PEG zakończonego metoksylacją do PEG zakończonego biotyną, z ~100 mg / ml PEG zakończonego metoksy.
9. Odmierzyć pipetą 100 μl roztworu PEG na połowę suchych, silanizowanych szkiełek nakrywkowych i przykryć każde z nich drugim szkiełkiem nakrywkowym. Użyj małych kawałków parafilmu umieszczonych w każdym rogu jako przekładek, aby zapobiec sklejaniu się szkiełek nakrywkowych.
10. Inkubować szkiełka nakrywkowe w wilgotnym środowisku przez 3,5 godziny. Oddziel kanapki z szkiełkami nakrywkowymi. Użyj butelki ze spryskiwaczem, aby umyć każde szkiełko nakrywkowe dużą ilością wody i osuszyć sprężonym powietrzem.
11. Funkcjonalne szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w próżni. Upewnij się, że strona nasączona PEG jest podniesiona, ponieważ druga strona nie przechwyci substratu DNA.

4. Budowa urządzenia mikroprzepływowego

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów, aby zapoznać się z innymi materiałami wymaganymi do budowy urządzenia mikroprzepływowego.

1. Za pomocą ręcznego obrotowego narzędzia wielofunkcyjnego wyposażonego w stożkowe wiertło diamentowe wywierć dwa otwory w przeciwległych rogach zjeżdżalni kwarcowej, aby służyły jako wlot i wylot. Pamiętaj, aby zabezpieczyć suwak na miejscu, nasmarować wiertło i stale przesuwać się wodą podczas wiercenia. Po każdym eksperymencie odzyskaj przygotowane szkiełko kwarcowe do ponownego użycia poprzez namoczenie zużytego urządzenia w acetonie w celu rozpuszczenia kleju i żywicy epoksydowej; Wyrzuć pozostałe składniki.
   UWAGA: Wiercenie można wykonać ręcznie, ale użycie uchwytu typu prasowego do narzędzia wielofunkcyjnego ułatwia ten proces.
2. Połączyć 25 μl roztworu streptawidyny z 80 μl PBS i 20 μl buforu blokującego. Pokryj szkiełko nakrywkowe nasączone PEG tą mieszaniną i inkubuj w wilgotnym środowisku przez 30 minut.
3. Podczas inkubacji szkiełka nakrywkowego należy przygotować przekładkę obrazową, aby utworzyć kanał przepływowy. Wytnij kwadratowy kawałek materiału dystansowego o średnicy 1 cala, a następnie zaznacz kanał o szerokości 2 mm wyrównany z końcami otworów wywierconych w szkiełku kwarcowym (Rysunek 2). Wytnij kanał z materiału dystansowego za pomocą skalpela.
4. Oderwij jedną stronę podkładu od przekładki obrazu i ostrożnie umieść ją na szkiełku kwarcowym, uważając, aby nie zakryć otworów wlotowych i wylotowych. Pamiętaj, aby dokładnie wyczyścić szkiełko kwarcowe acetonem, aby usunąć wszelkie pozostałości kleju z wcześniejszych eksperymentów.
5. Umyj szkiełko nakrywkowe wodą i osusz sprężonym powietrzem. Usuń drugą stronę podkładu z przekładki obrazowej i umieść ją między szkiełkiem kwarcowym a funkcjonalizowanym, pokrytym streptawidyną szkiełkiem nakrywkowym, używając plastikowej pęsety do dociśnięcia zespołu i usunięcia pęcherzyków powietrza z kleju.
6. Włóż jedną rurkę polietylenową o długości 30 cm do każdego otworu w zjeżdżalni kwarcowej. Pamiętaj, aby przyciąć końce rurki pod kątem, aby zapewnić swobodny przepływ roztworu. Użyj stojaka na probówki lub innego wspornika, aby przytrzymać rurki na miejscu i uszczelnij rurki na miejscu oraz krawędzie zmontowanego urządzenia żywicą epoksydową.
   UWAGA: Dobrze sprawdza się zbudowanie urządzenia na kawałku parafilmu, który można łatwo oderwać od dna po związaniu żywicy epoksydowej.
7. Po związaniu żywicy epoksydowej włóż igłę pustej strzykawki do rurki wylotowej urządzenia i zanurz koniec rurki wlotowej w pojemniku wypełnionym buforem blokującym. Odciągnąć tłok strzykawki, aby napełnić urządzenie buforem blokującym. Pozostaw urządzenie do inkubacji na co najmniej 30 minut przed użyciem.

5. Wiązanie powierzchniowe substratu DNA znakowanego kropkami kwantowymi

UWAGA: Oprócz urządzenia mikroprzepływowego, substratu DNA i bufora blokującego opisanego powyżej, zobacz Tabelę materiałów dla innych materiałów i Tabelę 1 dla wymaganych do wiązania powierzchni substratów DNA znakowanych kropkami kwantowymi.

1. Przymocuj urządzenie mikroprzepływowe do płytki stolika mikroskopu za pomocą taśmy, doprowadź obiektyw do kontaktu z dolną częścią urządzenia i ustaw obiektyw tak, aby pole view znajdował się w kanale mikroprzepływowym.
2. Przepłukać kanał mikroprzepływowy świeżym buforem blokującym, odciągając tłok strzykawki po podłączeniu rurki wylotowej do pompy strzykawkowej. Sprawdź, czy w rurce lub w kanale nie ma pęcherzyków uwięzionych.
   UWAGA: Od tego momentu upewnij się, że rurka dolotowa jest w cieczy, aby do urządzenia nie dostały się pęcherzyki powietrza.
3. Rozcieńczyć 1 μl przygotowanego substratu DNA w 1 ml buforu blokującego. Umieścić rurkę wlotową w rozcieńczonym substracie DNA i przepuścić 800 μl roztworu substratu przez kanał z szybkością 200 μl/min. Pozostawić roztwór DNA do inkubacji w kanale w spokoju przez 15 minut po ustaniu przepływu.
4. Przepuścić co najmniej 800 μl buforu blokującego przez kanał z szybkością 200 μl/min, aby wypłukać niezwiązane DNA z kanału.
5. Dostosuj moc lasera, ostrość mikroskopu i kąt TIRF tak, aby kropki kwantowe na uwięzi powierzchniowej były wyraźnie widoczne.
   UWAGA: Chociaż kropki kwantowe nie blakną szybko, najlepiej jest utrzymywać moc na jak najniższym poziomie, aby zminimalizować mruganie.

6. Rozszczepienie DNA za pośrednictwem REazy

UWAGA: Zobacz Tabelę materiałów dla materiałów i Tabelę 1 dla wymaganych do rozszczepienia DNA za pośrednictwem REazy.

1. Upewnij się, że kamera jest schłodzona do optymalnej temperatury roboczej i skonfigurowana do szybkiego przesyłania strumieniowego z czasem naświetlania 0.10 s. Przygotuj się na zbieranie danych przez ~4 min.
2. Przepłukać urządzenie mikroprzepływowe 800 μl eksperymentalnego buforu bez magnezu przy natężeniu przepływu 200 μl/min.
3. Dodać REazę do podwielokrotności (1 ml) eksperymentalnego buforu bez magnezu i delikatnie wymieszać pipetując. Użyj 4 μl ze 100 000 jednostek/ml zapasu, co odpowiada 400 jednostkom/ml EcoRV. Przepuścić 800 μl rozcieńczonego enzymu przez kanał z natężeniem przepływu 200 μl/min.
4. Rozpocznij eksperyment od przelania eksperymentalnego buforu zawierającego magnez i fluoresceinę z szybkością przepływu 200 μl/min. Rozpocznij rejestrowanie danych natychmiast po uruchomieniu pompy strzykawkowej. Po przelaniu 800 μL buforu zatrzymaj akwizycję danych.

7. Analiza danych

UWAGA: Zobacz Tabelę materiałów dla oprogramowania do analizy danych używanego dla tego protokołu i dokonaj korekt, jeśli używasz innej platformy analitycznej.

1. Wyznaczanie zerowego punktu czasowego
   1. Odejmij fluorescencję tła od każdej klatki filmu eksperymentalnego za pomocą funkcji imtophat, wbudowanej w przybornik przetwarzania obrazu funkcji filtrowania cylindra. Wybierz dysk o promieniu trzech pikseli jako element strukturyzacji. Intensywność tła można uzyskać, odejmując przefiltrowany obraz od obrazu oryginalnego.
      UWAGA: Filtr zachowuje tylko te cechy obrazu, które są jaśniejsze niż tło i mniejsze niż element strukturyzujący.
   2. Uśrednia odjęte tło z każdej klatki filmu. Użyj trajektorii tej wartości, aby określić zerowy punkt czasowy eksperymentu (Rysunek 3A). Określ czas rozpoczęcia, znajdując pierwszą klatkę, przy której szybkość wzrostu przekracza 3-krotność odchylenia standardowego szybkości zmian podczas przepływu objętości martwej.
      UWAGA: Gwałtowny wzrost tempa zmian średniej wartości odjętego tła dla każdej klatki filmu wskazuje na czas, w którym końcowy eksperymentalny bufor zawierający barwnik znacznikowy wszedł do komórki przepływowej (Rysunek 3B).
2. Obliczanie i analiza trajektorii intensywności kropek kwantowych
   1. Obliczyć projekcję o maksymalnej intensywności dla zestawu klatek filmu z korekcją tła nagranych przed przybyciem barwnika znacznikowego. Określ położenie kropek kwantowych z dokładnością do jednego piksela na tym obrazie projekcyjnym za pomocą funkcji znajdowania pików, takiej jak pkfnd.
   2. Wygeneruj trajektorie intensywności dla poszczególnych kropek kwantowych, obliczając średnią intensywność w każdej klatce filmu w kwadratowym obszarze po trzy piksele z każdej strony otaczającej lokalizację zwróconą przez funkcję znajdowania pików.
      UWAGA: Opisana powyżej korekcja tła usuwa artefakty wprowadzone przez barwnik smugowy. Wynikowe trajektorie intensywności powinny być względnie płaskie, ale nadal uwzględniać naturalnie występujące fluktuacje intensywności (Rysunek 4).
   3. Identyfikacja zdarzeń zaniku kropek kwantowych poprzez analizę statystyczną trajektorii intensywności. Dla każdej trajektorii intensywności kropki kwantowej należy obliczyć natężenie progowe, które jest wyższe od wartości minimalnej o odpowiedni ułamek różnicy między wartościami maksymalnymi i minimalnymi dla tej trajektorii, w zależności od szumu zaobserwowanego na trajektoriach.
      UWAGA: Fluktuacja intensywności kropki kwantowej jest zazwyczaj znacznie większa niż fluktuacja tła. Odpowiednią wartość można wyznaczyć, porównując te wartości: wybrany próg musi być wyższy niż najwyższa wartość tła, ale najlepiej niższy niż najniższa wartość dla fluorescencji kropek kwantowych. W odniesieniu do przedstawionych danych obliczono, że zastosowany próg jest wyższy od wartości minimalnej dla każdej trajektorii powiększonej o jedną trzecią różnicy między wartościami maksymalnymi i minimalnymi dla tej trajektorii. Można uznać, że kropka kwantowa zniknęła w ostatnim punkcie czasowym, w którym obserwowane natężenie w jej lokalizacji przekroczyło ten próg.
   4. Potwierdź domniemane zdarzenia związane z zaginięciem. W analizie końcowej należy uwzględnić zdarzenia tylko wtedy, gdy obserwowana intensywność przekracza punkt środkowy między minimalnymi i maksymalnymi wartościami intensywności trajektorii dla ponad połowy klatek filmu przed czasem zniknięcia, a odchylenie standardowe trajektorii intensywności zmniejszyło się po zdarzeniu.
      UWAGA: Można zastosować inne testy statystyczne, aby upewnić się, że rejestrowane są tylko prawidłowe zdarzenia zaginięcia.

Komórka przepływowa jest bezpośrednio sprzężona z obiektywem o dużym powiększeniu z olejkiem o dużej aperturze numerycznej i 60-krotnym powiększeniu na mikroskopie odwróconym, wyposażonym w oświetlenie laserowe do obrazowania TIRF przez obiektyw (Rysunek 5A). Po wprowadzeniu substratu DNA i zmyciu nadmiaru DNA i kropek kwantowych, w polu widzenia znajdują się zazwyczaj tysiące pojedynczych kropek kwantowych (Rysunek 5B). Te kropki kwantowe są stabilnie przymocowane do powierzchni szkła i nie ulegają zauważalnemu przyciemnieniu lub znacznemu wybieleniu w skali czasowej eksperymentu. Jeśli jednak przez kanał przepływowy przepłynie bufor zawierający zarówno magnez, jak i odpowiednią REazę, pod koniec typowego czterominutowego okresu obserwacji co najmniej 30% kropek kwantowych obecnych na początku eksperymentu zniknie z pola widzenia. Potwierdzając zapotrzebowanie na magnez, gdy REaza przepływa przez kanał pod nieobecność magnezu, co najmniej 95% kropek kwantowych obecnych na początku eksperymentu można nadal zobaczyć pod koniec okresu obserwacji (Rysunek 5C). Jednakże, gdy bufor zawierający magnez jest przepływany natychmiast po umożliwieniu REazie związania związanego z powierzchnią DNA pod nieobecność magnezu, do połowy kropek kwantowych zniknie do końca okresu obserwacji (Rysunek 5D), podobnie jak obserwuje się, gdy REaza i magnez przepływają razem przez kanał. Dokładny przebieg zdarzeń będzie zależał od skuteczności enzymu w zastosowanych warunkach. Gdy bufor zawierający magnez jest przepływany bez uprzedniego wprowadzenia odpowiedniej REazy do kanału przepływu, mniej niż 5% kropek kwantowych znika w okresie obserwacji i nie ma dostrzegalnego piku dla histogramu zdarzeń. Wynik ten wskazuje, że wstępnie związane cząsteczki REazy pośredniczą w rozszczepianiu DNA, które wiąże kropki kwantowe z powierzchnią szkła, a to rozszczepienie DNA jest odpowiedzialne za zdecydowaną większość obserwowanych zdarzeń zaniku kropek kwantowych w tych eksperymentach.

Znikanie kropek kwantowych następuje szybko i powoduje gwałtowny spadek trajektorii intensywności, co stanowi wyraźne wskazanie czasu, w którym dana cząsteczka DNA jest rozszczepiana (Rysunek 5E). Wyznaczanie czasów zdarzeń odbywa się poprzez matematyczną analizę trajektorii intensywności. Pojedyncze kropki kwantowe generują trajektorie intensywności o znacznie wyższej wariancji niż tło w zastosowanych warunkach obrazu, więc przypuszczalne zdarzenia są potwierdzane, gdy wariancja trajektorii intensywności spada do poziomu porównywalnego z wariancją tła po obserwowanym spadku intensywności. Ponadto trajektorie, które obejmują duży stopień mrugania przed domniemanym zdarzeniem zaniku, są wyłączone z ostatecznej analizy. Jednak typowy eksperyment skutkuje setkami zdarzeń, które spełniają te kryteria, a wyniki wielu eksperymentów można zebrać w celu uzyskania odpowiednich statystyk umożliwiających oszacowanie parametrów N i β za pomocą nieliniowego dopasowania krzywej najmniejszych kwadratów lub oszacowania parametru maksymalnego prawdopodobieństwa.

Przedstawione reprezentatywne dane zostały zebrane podczas przeprowadzania tego eksperymentu z dobrze zbadanym Typem IIP REazą, EcoRV (Wideo 1). Substrat DNA duplex o długości 60 pz jest zbudowany z cząsteczki biotyny na końcu 5' jednej nici dupleksu i kropki kwantowej kowalencyjnie przyłączonej do końca 5' drugiej nici. Substrat DNA zawiera pojedynczą kopię sekwencji rozpoznawania, GAT↓ATC, która jest rozszczepiana przez EcoRV w środku, jak wskazuje strzałka skierowana w dół (↓). EcoRV został wstępnie związany z substratem DNA pod nieobecność magnezu, a następnie przepłynęto bufor zawierający magnez w celu zainicjowania rozszczepienia DNA. Reprezentatywne dane obejmują zbiorcze wyniki pięciu oddzielnych eksperymentów, które dały w sumie 3451 zaobserwowanych zdarzeń rozszczepienia. Po wykluczeniu zdarzeń, które miały miejsce przed punktem zerowym lub poza widocznym szczytem aktywności, pozostało 2987 zdarzeń, które wystarczyły do wypełnienia histogramu jednosekundowymi przedziałami. Do wyodrębnienia wartości N i β z danych wykorzystano zarówno nieliniowe dopasowanie krzywej najmniejszych kwadratów, jak i estymację parametru maksymalnego prawdopodobieństwa. Dwie metody szacowania parametrów były zgodne (Rysunek 6A), z N = 3,52 (95% przedział ufności: 3,32-3,71) i β = 5,78 s (95% przedział ufności: 5,41-6,15 s) dla nieliniowego dopasowania metodą najmniejszych kwadratów i N = 3,41 (95% przedział ufności: 3,25-3,58) i β = 6,06 s (95% przedział ufności: 5,75-6,39 s) dla oszacowania maksymalnego prawdopodobieństwa.

Oszacowanie co najmniej trzech kroków kinetycznych jest rozsądne, biorąc pod uwagę to, co wiadomo o mechanizmie EcoRV. Wiadomo, że enzym ten wiąże DNA niespecyficznie przy braku magnezu14. Obserwacje w fazie roztworu masowego zmian we wewnętrznej fluorescencji reszt tryptofanu w EcoRV w warunkach zatrzymanego przepływu sugerowały, że EcoRV, który związał się z DNA przy braku magnezu, musi przejść zmianę konformacyjną przed wejściem magnezu do miejsca aktywnego18. Obserwację tę potwierdzają dane o strukturze krystalicznej19. Wyniki badań fluorescencji tryptofanu wskazują również, że rozszczepienie DNA i uwolnienie produktu są oddzielnymi etapami, które zachodzą z podobnym tempem18. Dlatego rozsądnym mechanizmem reakcji na rozszczepienie DNA za pośrednictwem EcoRV w tym eksperymencie jest:

ES → ES* → EP → E+P

W tym mechanizmie, ES, początkowy kompleks enzym-substrat, powstaje, gdy EcoRV jest wstępnie związany z DNA przy braku magnezu. Kiedy magnez dostaje się do komórki przepływowej, kompleks enzym-substrat ulega zmianie konformacyjnej, stając się ES*, aktywowanym kompleksem enzym-substrat. Ten aktywowany kompleks następnie rozszczepia DNA, ale nie uwalnia natychmiast cząsteczek produktu, stając się kompleksem enzym-produkt (EP). Wreszcie produkt P jest uwalniany w ostatnim etapie. Mechanizm ten wymaga trzech kroków, które są zgodne z przedstawionymi danymi. Wynikowe oszacowanie średniego czasu oczekiwania dla każdego kroku wynosi ~6 s, co odpowiada wskaźnikowi 0,17 s-1 dla każdego kroku. Obliczenia te są ogólnie zgodne z wcześniejszymi szacunkami szybkości tych procesów - rzędu 0,3-0,4 s-1 dla rozszczepienia DNA i uwolnienia produktu oraz ~0,5 s-1 dla rearanżacji konformacyjnej.

Rysunek 1: Schemat oznakowanego DNA i reakcji enzymatycznej. Cząsteczki DNA znakowane kropkami kwantowymi są wiązane z funkcjonalizowaną powierzchnią szkła za pomocą połączenia biotyna-streptawidyna-biotyna i obserwowane za pomocą mikroskopii TIRF. Cząsteczki DNA zawierają miejsce rozpoznawania interesującej nas REazy. Kiedy cząsteczka DNA jest rozszczepiana przez REazę, kropka kwantowa może swobodnie dyfundować z dala od powierzchni i poza strefę oświetlenia. Skróty: REaza = endonukleaza restrykcyjna; PEG = glikol polietylenowy; TIRF = fluorescencja całkowitego odbicia wewnętrznego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Mikroprzepływowe urządzenie przepływowe. (A) Widok rozstrzelony pokazujący trzy warstwy użyte do stworzenia urządzenia: funkcjonalizowany szklany szkiełko nakrywkowe na dole, szkiełko kwarcowe z otworami wlotowymi i wylotowymi na górze oraz dwustronny samoprzylepny przekład obrazowy z wyciętym w nim kanałem umieszczonym pośrodku. (B) Gotowe urządzenie z rurkami polietylenowymi uszczelnionymi na miejscu i z krawędziami pokrytymi żywicą epoksydową. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Wyznaczanie zerowego punktu czasowego. (A) Średnia intensywność tła określona za pomocą funkcji filtrowania morfologicznego cylindra dla każdej klatki filmu. Intensywność tła znacznie wzrasta, gdy eksperymentalny bufor zawierający fluoresceinę wchodzi w pole widzenia. Wyniki trzech różnych eksperymentów są pokazane tutaj. Istnieje znaczna różnica w czasie opóźnienia między eksperymentami. (B) Gwałtowny wzrost szybkości zmian trajektorii intensywności fluorescencji tła ułatwia dokładne określenie punktu zerowego w czasie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Korekta tła. Wzrost intensywności tła spowodowany barwnikiem znacznikowym fluoresceiny wskazującym na nadejście magnezu można zaobserwować w surowych trajektoriach intensywności fluorescencji dla poszczególnych kropek kwantowych (trajektoria szara). Po odjęciu tła za pomocą morfologicznej funkcji filtrowania cylindra, artefakty wprowadzone przez barwnik znacznikowy zostały usunięte z trajektorii (trajektoria). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Eksperyment TIRF z pojedynczą cząsteczką do równoległych obserwacji zdarzeń rozszczepienia DNA. (A) Komórka przepływowa zbudowana na funkcjonalizowanej powierzchni szkła, zaprojektowana do wychwytywania DNA znakowanego kropkami kwantowymi, jest bezpośrednio sprzężona z obiektywem mikroskopu olejowego o wysokiej aperturze numerycznej i 60-krotnym zanurzeniu w oleju do obrazowania TIRF. (B) Reprezentatywny obraz z początku eksperymentu. DNA znakowane kropkami kwantowymi zostało załadowane do komórki przepływowej, a nadmiar niezwiązanych kropek kwantowych został zmyty. Poszczególne kropki kwantowe na uwięzi DNA mogą być oddzielone od siebie. (C) To samo pole widzenia po tym, jak bufor zawierający REazę zdolną do rozszczepienia pęt DNA był przepływany przez kanał przepływowy pod nieobecność magnezu przez cztery minuty. Nie nastąpiła znacząca utrata kropek kwantowych na uwięzi DNA. (D) To samo pole widzenia na zakończenie eksperymentu. Bufor zawierający magnez przepływał przez kanał przepływowy natychmiast po przepuszczeniu REazy w buforze bez magnezu. Zdjęcie zostało uzyskane po około czterech minutach przepływu bufora. Wstępnie związane REazy rozszczepiły wiele więzi DNA, uwalniając kropki kwantowe z powierzchni. Aby ułatwić oglądanie, na każdym obrazie pokazany jest tylko środkowy kwadrant pola widzenia obiektywu. Dziesięć klatek filmu (co odpowiada jednej sekundzie czasu obserwacji) zostało uśrednionych, aby zmniejszyć efekty mrugania kropkami kwantowymi. Ustawienia jasności i kontrastu są identyczne dla wszystkich trzech obrazów. (E) Reprezentatywne trajektorie intensywności fluorescencji z miejsc obrazu, w których kropka kwantowa była obecna na początku eksperymentu. Trajektorie uzyskane z lokalizacji obrazu odpowiadających kropkom kwantowym, które nie są uwalniane z powierzchni (szare), mogą wykazywać krótkie spadki do niższego poziomu intensywności, ale zaczynają się i kończą na wysokim poziomie intensywności. Trajektorie uzyskane z lokalizacji obrazu, odpowiadające kropkom kwantowym, które są uwalniane z powierzchni (kolor), wykazują szybki spadek intensywności do niskiego poziomu tła, który jest natychmiastowy w stosunku do rozdzielczości czasowej eksperymentu (10 Hz). Uwolnione kropki kwantowe nie pojawiają się ponownie w ciągu czterominutowego okresu obserwacji. Skróty: REaza = endonukleaza restrykcyjna; TIRF = fluorescencja całkowitego odbicia wewnętrznego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Analiza rozkładu w czasie przebywania rozszczepienia DNA za pośrednictwem EcoRV. (A) Histogram i przewidywane obwiednie dla 2987 zdarzeń rozszczepienia, które występują w obrębie głównego piku aktywności w zestawie pięciu połączonych eksperymentów z EcoRV. Dwie przewidywane krzywe są prawie identyczne, a reszty dopasowania (poniżej histogramu) nie wskazują na błąd systematyczny w nieliniowym dopasowaniu metodą najmniejszych kwadratów. (B) Histogram całego zestawu 3393 zdarzeń rozszczepienia, które miały miejsce po punkcie zerowym. Krzywa przewidziana przez oszacowanie maksymalnego prawdopodobieństwa parametrów (linia nieprzerwana, krzywa MLE) przy założeniu rozkładu prawdopodobieństwa gamma nie obejmuje histogramu. Krzywa przewidziana przez nieliniowe dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów wzoru na rozkład prawdopodobieństwa gamma do wysokości przedziału (linia przerywana, krzywa NLS) jest lepsza, ale reszty dopasowania (poniżej histogramu) wykazują błąd systematyczny. Skróty: MLE: maximum-probability estimation (oszacowanie maksymalnego prawdopodobieństwa); NLS = nieliniowe metody najmniejszych kwadratów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Tabela.

Wideo 1: Przykładowy film o pojedynczej cząsteczce. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów