Specyficzna dla miejsca acetylacja lizyny histonów do rekonstytucji nukleosomów przy użyciu ekspansji kodu genetycznego w Escherichia coli

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy metodę ekspresji acetylowanych białek histonowych za pomocą ekspansji kodu genetycznego i składania odtworzonych nukleosomów in vitro.

Streszczenie

Acetylowane białka histonowe mogą być łatwo wyrażane w Escherichia coli, kodując zmutowaną, specyficzną dla N ε-acetylo-lizyny (AcK) syntetazę tRNA (MmAcKRS1) i jej pokrewne tRNA (tRNA^Pyl) do łączenia odtworzonych mononukleosomów z specyficznymi dla miejsca acetylowanymi histonami. MmAcKRS1 i^{tRNA Pyl} dostarczają AcK do bursztynowego miejsca mutacji w wybranym mRNA podczas translacji w Escherichia coli. Technika ta była szeroko stosowana do włączania AcK w miejscach lizyny H3. Syntetaza pirolizylo-tRNA (PylRS) może być również łatwo ewoluowana w celu włączenia innych niekanonicznych aminokwasów (ncAA) w celu modyfikacji lub funkcjonalizacji białek specyficznych dla miejsca. Tutaj szczegółowo opisujemy metodę włączania AcK przy użyciu systemu MmAcKRS1 do histonu H3 i integracji acetylowanych białek H3 z odtworzonymi mononukleosomami. Acetylowane odtworzone mononukleosomy mogą być stosowane w testach biochemicznych i wiążących, określaniu struktury i nie tylko. Otrzymywanie zmodyfikowanych mononukleosomów ma kluczowe znaczenie dla projektowania eksperymentów związanych z odkrywaniem nowych oddziaływań i zrozumieniem epigenetyki.

Wprowadzenie

Wykorzystaliśmy^PylRS i tRNA Pyl do syntezy i montażu odtworzonych mononukleosomów z acetylowanymi histonami specyficznymi dla danego miejsca. PylRS okazał się nieoceniony jako narzędzie do rozszerzania kodu genetycznego do produkcji białek z modyfikacjami potranslacyjnymi (PTM) i został genetycznie wyewoluowany w celu włączenia około 200 różnych ncAA. PylRS zawiera bursztynowy kodon stop, usuwając konkurencję z innymi aminokwasami podczas translacji. PylRS został po raz pierwszy odkryty w archeonach metanogennych i od tego czasu jest wykorzystywany w biologii chemicznej do włączania nowych reaktywnych grup chemicznych do białek^1....

Protokół

1. Budowa plazmidu

1. Zacznij od podjęcia decyzji, które białko histonowe zostanie acetylowane i w którym miejscu lizyny. Zmutuj miejsce do bursztynowego kodonu stop (TAG) za pomocą mutagenezy skierowanej do miejsca.
   UWAGA: Istnieją cztery wcześniej zaprojektowane plazmidy wykorzystywane do ekspresji białek histonowych. Wszystkie cztery białka histonowe sklonowano do wektora pETDuet-1 z N-końcowym znacznikiem histydyny. Histone H4 zawiera również znacznik SUMO, pochodzenie replikacji colE1 o liczbie kopii około 40, oporny na ampicylinę i promotor T7.
   1. Zaprojektuj startery do przodu i do tyłu, które zawierają mutację TAG w pożądanym ....

Wyniki

Dimery, tetramery i oktamery można ocenić, przeprowadzając elektroforezę na żelu SDS PAGE 12% (Rysunek 1 oraz Rysunek 2). Tutaj widać, że niektóre acetylowane tetramery mają niższą wydajność niż inne (Rysunek 1). W rzeczywistości, im bliżej regionu rdzeniowego, tym niższa obserwowana wydajność. Najprawdopodobniej wynika to z faktu, że acetylacja utrudnia składanie tetrameru w miarę zbliżania się do r.......

Dyskusja

Niezbędne jest przestrzeganie tego protokołu w każdym szczególe podczas eksperymentu. Nukleosomy nie są zbyt stabilne i wiele prób i błędów włożono w określenie tego protokołu. Kluczowe jest usuwanie osadów na każdym etapie (lub zawsze, gdy jest obserwowane), ponieważ cząstki stałe mogą łatwo zakłócać procesy montażu. Próbki histonów należy zawsze przechowywać na lodzie. Jeśli nukleosomy są przechowywane w temperaturze 4 °C zbyt długo, mogą ulec spontanicznemu rozkładowi. Pamiętaj, aby sprawdzić wszystkie próbki za pomoc.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,5 M TE Bufor	NA		NA 0,5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8
1 M TE Bufor	NA		NA 1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8
100x TE
2 M TE Bufor	NA	NA	2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8
20 mM TE Bufor	NA		NA 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8
6 M GuHCl			6M chlorek guanidyny, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8,0
Bufor do płukania kolumny		NA NA NA	6 M mocznik, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazol pH 7,8
Bufor elucyjny	NA	NA
Pompa do transportu chemikaliów o zmiennym przepływie	Fischer Scientific	15-077-67
Proteaza
Bufor do lizy histonów	NA	NA 60	mM Tris, 100 mM NaCl, 0,5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8,0
Ni-NTA Żywica			6 M mocznik, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazol, pH 7,8
PCR Zestaw do czyszczenia	Epokowe godziny życia	2360050
Bufor do przemywania peletów	NA	NA 60	mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8,0
petDUET-His-SUMO-TEV-H4
petDUET-His-TEV-H2A
petDUET-His-TEV-H2B
petDUET-His-TEV-H3
pEVOL-AckRS	Addgene	137976
pGEM-3z/601	Addgene	26656
Bufor magazynujący	NA	NA 20	mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glicerolu, pH 7,8
Termocykler

Bufor NA NA acetylolizyny Fisherbrand His-TEV