Szerokokątne obrazowanie w czasie rzeczywistym lokalnych i układowych sygnałów rany u rzodkiewnika

Rośliny nie mogą uciec przed stresami biotycznymi, np. owadami żywiącymi się nimi, dlatego rozwinęły zaawansowane systemy wykrywania stresu i transdukcji sygnału, aby wykrywać, a następnie chronić się przed wyzwaniami, takimi jak roślinożerność¹. Po zranieniu lub ataku roślinożercy rośliny inicjują szybkie reakcje obronne, w tym akumulację fitohormonu kwasu jasmonowego (JA) nie tylko w miejscu zranienia, ale także w nieuszkodzonych narządach dystalnych². Ten JA następnie zarówno wyzwala reakcje obronne w bezpośrednio uszkodzonych tkankach, jak i prewencyjnie indukuje obronę w nieuszkodzonych częściach rośliny. U rzodkiewnika nagromadzenie JA wywołane zranieniem wykryto w dystalnych, nienaruszonych liściach w ciągu zaledwie kilku minut od uszkodzenia w innym miejscu rośliny, co sugeruje, że z uszkodzonego liścia przesyłany jest szybki i długodystansowy sygnał³. Zaproponowano kilka kandydatów, takich jak Ca²⁺, reaktywne formy tlenu (ROS) i sygnały elektryczne, które mogą służyć jako te długodystansowe sygnały nawijane w roślinach^4,5.

Ca²⁺ jest jednym z najbardziej wszechstronnych i wszechobecnych elementów drugiego posłańca w organizmach eukariotycznych. U roślin żucie gąsienic i mechaniczne zranienia powodują drastyczny wzrost stężenia cytozolowego Ca²⁺ ([Ca²⁺]_cyt) zarówno w zranionym liściu, jak i w nieuszkodzonych odległych liściach^6,7. Ten ogólnoustrojowy sygnał Ca^{2 +} jest odbierany przez wewnątrzkomórkowe białka wykrywające Ca^{2 +}, co prowadzi do aktywacji dalszych szlaków sygnalizacji obronnej, w tym biosyntezy JA^8,9. Pomimo licznych doniesień potwierdzających znaczenie sygnałów Ca²⁺ w reakcjach na rany roślin, informacje na temat przestrzennej i czasowej charakterystyki sygnałów Ca²⁺ wywołanych zranieniem są ograniczone.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym za pomocą genetycznie kodowanych wskaźników Ca²⁺ jest potężnym narzędziem do monitorowania i ilościowego określania przestrzennej i czasowej dynamiki sygnałów Ca²⁺. Do tej pory opracowano wersje takich czujników, które umożliwiają wizualizację sygnałów Ca²⁺ na poziomie pojedynczej komórki, do tkanek, organów, a nawet całych roślin¹⁰. Pierwszym genetycznie kodowanym biosensorem Ca²⁺ zastosowanym w roślinach było bioluminescencyjne białko aequorin pochodzące z meduzy Aequorea victoria¹¹. Chociaż to chemiluminescencyjne białko było używane do wykrywania zmian Ca²⁺ w odpowiedzi na różne stresy u roślin^{12,13,14,15,16,17,18}, nie nadaje się do obrazowania w czasie rzeczywistym ze względu na wytwarzany przez niego wyjątkowo niski sygnał luminescencyjny. Wskaźniki Ca²⁺ oparte na transferze energii rezonansu (FRET) Förster, takie jak żółte cameleony, zostały również z powodzeniem wykorzystane do zbadania dynamiki szeregu zdarzeń sygnalizacyjnych Ca²⁺ w roślinach^{19,20,21,22,23,24}. Czujniki te są kompatybilne z podejściami do obrazowania i najczęściej składają się z białka wiążącego Ca²⁺ kalmoduliny (CaM) i peptydu wiążącego CaM (M13) z kinazy łańcucha lekkiego miozyny, wszystkie połączone między dwoma białkami fluoroforowymi, zwykle cyjanem fluorescencyjnym białkiem (CFP) i wariantem żółtego białka fluorescencyjnego (YFP)¹⁰. Wiązanie Ca²⁺ z CaM sprzyja interakcji między CaM i M13, prowadząc do zmiany konformacyjnej czujnika. Zmiana ta sprzyja transferowi energii między CFP a YFP, co zwiększa intensywność fluorescencji YFP przy jednoczesnym zmniejszeniu emisji fluorescencji z CFP. Monitorowanie tego przejścia od fluorescencji CFP do fluorescencji YFP zapewnia następnie miarę wzrostu poziomu Ca²⁺. Oprócz tych czujników FRET, biosensory Ca²⁺ oparte na pojedynczym białku fluorescencyjnym (FP), takie jak GCaMP i R-GECO, są również kompatybilne z metodami obrazowania roślin i są szeroko stosowane do badania zmian [Ca²⁺]_cyt ze względu na ich wysoką czułość i łatwość użycia^{25,26,27,28,29,30}. GCaMPs zawierają pojedynczy kołowo permutowany (cp) GFP, ponownie połączony z CaM i peptydem M13. Zależna od Ca²⁺ interakcja między CaM i M13 powoduje zmianę konformacyjną w czujniku, która sprzyja zmianie stanu protonacji cpGFP, wzmacniając jego sygnał fluorescencyjny. Tak więc, wraz ze wzrostem poziomu Ca²⁺, sygnał cpGFP wzrasta.

Aby zbadać dynamikę sygnałów Ca²⁺ generowanych w odpowiedzi na mechaniczne zranienie lub żerowanie roślinożerców, użyliśmy transgenicznych roślin Arabidopsis thaliana wyrażających wariant GCaMP, GCaMP3, oraz mikroskopu fluorescencyjnego o szerokim polu widzenia⁶. W ramach tego podejścia udało się zobrazować szybką transmisję sygnału Ca²⁺ na duże odległości z miejsca rany na liściu do całej rośliny. W ten sposób natychmiast wykryto wzrost [Ca^{2 +}] _cyt w miejscu rany, ale ten sygnał Ca^{2 +} był następnie propagowany do sąsiednich liści przez naczynia krwionośne w ciągu kilku minut od zranienia. Co więcej, odkryliśmy, że transmisja tego szybkiego ogólnoustrojowego sygnału rany jest zniesiona u roślin Arabidopsis z mutacjami w dwóch genach podobnych do receptora glutaminianu, Glutaminian Receptor Like (GLR), GLR3.3 i GLR3.6⁶. Wydaje się, że GLR funkcjonują jako kanały Ca²⁺ bramkowane aminokwasami, zaangażowane w różne procesy fizjologiczne, w tym reakcję na ranę³, wzrost łagiewki pyłkowej³¹, rozwój korzeni³², cold response³³ i odporność wrodzona³⁴. Pomimo tej dobrze poznanej, szerokiej funkcji fizjologicznej GLR, informacje na temat ich właściwości funkcjonalnych, takich jak specyficzność dla ligandów, selektywność jonowa i lokalizacja subkomórkowa, są ograniczone³⁵. Jednak ostatnie badania wykazały, że GLR3.3 i GLR3.6 są zlokalizowane odpowiednio w łyku i ksylemie. Roślinne GLR są podobne do jonotropowych receptorów glutaminianu (iGluRs)³⁶ u ssaków, które są aktywowane przez aminokwasy, takie jak glutaminian, glicyna i D-seryna w układzie nerwowym ssaków³⁷. Rzeczywiście, wykazaliśmy, że zastosowanie 100 mM glutaminianu, ale nie innych aminokwasów, w miejscu rany indukuje szybki, długodystansowy sygnał Ca^{2 +} u Arabidopsis, co wskazuje, że glutaminian zewnątrzkomórkowy prawdopodobnie działa jako sygnał rany u roślin⁶. Odpowiedź ta została zniesiona w mutancie glr3.3/glr3.6, co sugeruje, że glutaminian może działać przez jeden lub oba te kanały podobne do receptorów i rzeczywiście, ostatnio wykazano, że AtGLR3.6 jest bramkowany przez te poziomy glutaminianu³⁸.

W roślinach, oprócz swojej roli jako aminokwasu strukturalnego, glutaminian został również zaproponowany jako kluczowy regulator rozwoju³⁹; jednak jego przestrzenna i czasowa dynamika jest słabo poznana. Podobnie jak w przypadku^Ca2+, opracowano kilka genetycznie kodowanych wskaźników glutaminianu w celu monitorowania dynamiki tego aminokwasu w żywych komórkach^40,41. iGluSnFR to oparty na GFP bioczujnik glutaminianu z pojedynczym FP, składający się z cpGFP i białka wiążącego glutaminian (GltI) z Escherichia coli^42,43. Zmiana konformacyjna iGluSnFR, która jest indukowana przez wiązanie glutaminianu z GltI, powoduje zwiększoną emisję fluorescencji GFP. Aby zbadać, czy zewnątrzkomórkowy glutaminian działa jako cząsteczka sygnałowa w odpowiedzi na rany roślinne, połączyliśmy sekwencję iGluSnFR z podstawową sekwencją wydzielania peptydu sygnału chitynazy (CHIB-iGluSnFR), aby zlokalizować ten bioczujnik w przestrzeni apoplastycznej⁶. Podejście to umożliwiło zobrazowanie wszelkich zmian w stężeniu glutaminianu apoplastycznego ([Glu]_apo) przy użyciu transgenicznych roślin Arabidopsis wykazujących ekspresję tego czujnika. Wykryliśmy gwałtowny wzrost sygnału iGluSnFR w miejscu zranienia. Dane te potwierdzają ideę, że glutaminian wycieka z uszkodzonych komórek/tkanek do apoplastu po zranieniu i działa jako sygnał uszkodzenia, aktywując GLR i prowadząc do długodystansowego sygnału Ca²⁺ w roślinach⁶.

Tutaj opisujemy metodę obrazowania w czasie rzeczywistym całej rośliny, wykorzystującą genetycznie kodowane biosensory do monitorowania i analizowania dynamiki długodystansowych sygnałów Ca²⁺ i zewnątrzkomórkowego glutaminianu w odpowiedzi na zranienie⁶. Dostępność szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej i biosensorów wykazujących ekspresję genetycznie kodowanych roślin transgenicznych zapewnia potężne, a jednocześnie łatwe do wdrożenia podejście do wykrywania szybko przesyłanych sygnałów na duże odległości, takich jak fale^Ca2+.

1. Przygotowanie materiału roślinnego

1. W mikroprobówce o pojemności 1,5 ml wysterylizuj powierzchniowo nasiona rośliny Arabidopsis thaliana (akcesja Col-0) wyrażającej GCaMP3 lub CHIB-iGluSnFR przez wstrząsanie 20% (v/v) NaClO przez 3 minuty, a następnie przemyj 5 razy sterylną wodą destylowaną.
   UWAGA: Transgeniczne linie Arabidopsis wykazujące ekspresję GCaMP3 lub CHIB-iGluSnFR zostały opisane wcześniej⁶.
2. W sterylnym kapturze wysiewaj 13 wysterylizowanych powierzchniowo nasion na 10 cm kwadratowej plastikowej szalce Petriego wypełnionej 30 ml sterylnego (autoklawowanego) podłoża Murashige i Skoog (MS) [1x sole MS, 1% (w/v) sacharozy, 0,01% (w/v) mioinozytol, 0,05% (w/v) MES i 0,5% (w/v) gumy gellan; pH 5,7 skorygowane za pomocą 1N KOH]. Załóż pokrywkę i owiń taśmą chirurgiczną.
3. Po inkubacji w ciemności w temperaturze 4 °C przez 2 dni, umieścić płytki poziomo w temperaturze 22 °C w komorze wzrostowej w ciągłym świetle (90-100 μmol ^{m-2 s-1}) na około 2 tygodnie przed użyciem. Po 2 tygodniach policz liczbę liści Arabidopsis od najstarszego do najmłodszego⁴⁴ (Rysunek 1). Reakcje na rany preferencyjnie przesuwają się z uszkodzonego liścia (n) na liście o numerach n ± 3 i n ± 5⁶.
   UWAGA: W tym protokole szalka Petriego zostanie otwarta w celu zobrazowania rany i efektów glutaminianu pod mikroskopem fluorescencyjnym. Dlatego kolejne etapy tego eksperymentu powinny być przeprowadzane w warunkach pokojowych o kontrolowanej temperaturze i wilgotności. Dzieje się tak, ponieważ sygnały Ca²⁺ są również wywoływane przez zmiany w tych warunkach środowiskowych. Wiadomo również, że niebieskie światło, emitowane z mikroskopu podczas rejestracji w celu wzbudzenia fluorescencji białka biosensora, może wywołać wzrost stężenia cytozolowego Ca^{2+ 45} i dlatego roślina powinna być zaaklimatyzowana do naświetlania światłem niebieskim przez kilka minut przed rozpoczęciem eksperymentu.

2. Przygotowanie chemiczne

1. Rozpuść L-glutaminian w płynnym podłożu wzrostowym [1/2x sole MS, 1% (w/v) sacharozy i 0,05% (w/v) MES; pH 5,1 dostosowane za pomocą 1N KOH], aby uzyskać 100 mM roztwór roboczy.
   UWAGA: Unikaj stosowania soli glutaminianu, takich jak glutaminian sodu, aby zapobiec potencjalnemu wpływowi kationów na dynamikę Ca^{2 +}.

3. Ustawienie mikroskopu i przeprowadzanie obrazowania w czasie rzeczywistym

1. Włącz zmotoryzowany stereomikroskop fluorescencyjny wyposażony w soczewkę obiektywu 1x (NA = 0,156) i kamerę sCMOS (Rysunek 2) i skonfiguruj ustawienia urządzenia tak, aby naświetlać światłem wzbudzającym 470/40 nm i uzyskiwać światło emisyjne przechodzące przez filtr 535/50 nm.
   UWAGA: Każdy mikroskop fluorescencyjny wrażliwy na GFP może być używany do wykrywania sygnałów GCaMP3 i iGluSnFR w czasie rzeczywistym, ale do pozyskiwania sygnałów z całej instalacji zalecany jest obiektyw o małej mocy i bardzo czuła kamera z szerokim chipem sCMOS. Obiektyw o niskiej mocy pozwala na obrazowanie reakcji całej rośliny Arabidopsis, a użycie bardzo czułej kamery pozwala na szybkie pozyskiwanie danych potrzebnych do uchwycenia szybkiego przebiegu w czasie fali Ca²⁺ wyzwalanej przez ranę. Dla mikroskopu fluorescencyjnego użytego w tym badaniu maksymalne wartości pola widzenia i rozdzielczości czasowej wynoszą odpowiednio 3 cm x 3 cm i 30 klatek na sekundę (fps).
2. Zdejmij pokrywkę i umieść naczynie pod soczewką obiektywu.
3. Sprawdź sygnał fluorescencyjny z rośliny, a następnie odczekaj około 30 minut w ciemności, aż rośliny przystosują się do nowych warunków środowiskowych. Ten etap adaptacji jest wymagany, ponieważ zmiany wilgotności wywołują [Ca^{2 +}] _{wzrost cyt} u roślin, który może zakłócać wszelkie zdarzenia związane z ranami.
4. Dostosuj ostrość i powiększenie, aby zobaczyć całą roślinę w polu view. W obecnym protokole zastosowano powiększenie 0,63x.
5. Przed rozpoczęciem obrazowania w czasie rzeczywistym należy skonfigurować parametry akwizycji, aby wykryć sygnały fluorescencyjne za pomocą oprogramowania do obrazowania mikroskopowego. Ustawienia obrazowania w bieżącym protokole to: czasy ekspozycji i interwałów ustawione odpowiednio na 1,8 s i 2 s (tj. 0,5 kl./s). Ustaw czas nagrywania na 11 minut.
6. Obraz przez 5 minut przed rozpoczęciem eksperymentu, aby przyzwyczaić roślinę do napromieniowania światłem niebieskim z mikroskopu, a następnie rozpocznij nagrywanie, klikając Uruchom teraz lub równoważne polecenie w używanym oprogramowaniu mikroskopu. Aby określić średnią wyjściową fluorescencję, zapisz co najmniej 10 klatek (tj. co najmniej 20 s w obecnym protokole) przed zranieniem lub zastosowaniem glutaminianu (patrz sekcja 4).
   1. Aby zobrazować w czasie rzeczywistym zmiany [Ca^{2 +}] _cyt i [Glu]_apo, należy przeciąć ogonek liściowy lub środkową część liścia L1 nożyczkami (Ryc. 3 i Ryc. 4).
   2. Aby zobrazować w czasie rzeczywistym zmiany [Ca^{2 +}] _cyt wywołane glutaminianem, odetnij nożyczkami krawędź (około 1 mm od końca) liścia 1 w poprzek głównej żyły. Po co najmniej 20-minutowym okresie rekonwalescencji nałóż 10 μl 100 mM glutaminianu na powierzchnię cięcia liścia (Rysunek 5).
      UWAGA: To wstępne cięcie było konieczne, aby umożliwić dostęp glutaminianu do apoplastu liściowego w celu wywołania reakcji. Ponadto stwierdzono, że nałożenie kropli wody destylowanej na powierzchnię cięcia liścia L1 ma kluczowe znaczenie dla zapobieżenia wysuszeniu próbek podczas odzyskiwania przed zastosowaniem glutaminianu.
7. Po zakończeniu 11-minutowego nagrywania zapisz dane.

4. Analiza danych

1. Do analizy intensywności fluorescencji w czasie zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI) w miejscu, w którym ma być analizowana intensywność fluorescencji (Rysunek 6 i Rysunek 7). Aby obliczyć prędkość fali Ca²⁺, zdefiniuj 2 ROI (ROI1 i ROI2) do analizy. W oprogramowaniu do obrazowania kliknij Pomiar czasu | Definiowanie | Okrąg. Zmierz odległość między ROI1 i ROI2, klikając Adnotacje i pomiar | Długość | Prosta linia (Rysunek 6).
2. Zmierz surowe wartości fluorescencji (F) w każdym ROI w czasie, klikając Zmierz. Eksportuj surowe dane do arkusza kalkulacyjnego, aby przekonwertować sygnał fluorescencji na liczby w każdym punkcie czasu, klikając Wszystko do Excela | Eksport.
3. Określ wyjściową wartość fluorescencji, która jest zdefiniowana jako F₀, obliczając średnią F z pierwszych 10 klatek (tj. przed leczeniem) w zarejestrowanych danych.
4. Znormalizuj dane F (obliczając ΔF/F) za pomocą równania ΔF/F = (F−F₀)/F₀, gdzie ΔF jest zależną od czasu zmianą fluorescencji.
5. W przypadku analizy fali prędkości fali Ca²⁺ należy zdefiniować znaczący punkt narastania sygnału powyżej wstępnie stymulowanych wartości jako reprezentujący wykrycie wzrostu Ca²⁺ w każdym ROI (t₁ i _{t 2}) przy użyciu kryterium wzrostu do 2× odchylenia standardowego (2x SD) obliczonego na podstawie danych F₀ za pomocą oprogramowania statystycznego. 95% F₀ dane mieszczą się w granicach 2x SD od średniej, co wskazuje, że przypadkowy wzrost sygnału powyżej tego poziomu wynosi ≤5%. Oblicz różnicę czasu wzrostu Ca²⁺ między ROI1 i ROI2 [t₂- t₁ opóźnienie czasowe (Δt)] i zmierz odległość między ROI1 a ROI2, a następnie określ prędkości dowolnej fali Ca²⁺.

Propagacja sygnału [Ca2+]cyt i [Glu]apo w odpowiedzi na zranienie jest przedstawiona w Rysunek 3, Rysunek 4, Film S1 i Film S2. Cięcie ogonka liściowego liścia 1 u roślin wykazujących ekspresję GCaMP3 (w 0 s) doprowadziło do znacznego wzrostu [Ca2 +] cyt, który został szybko indukowany lokalnie przez układ krwionośny (po 40 s) (Rysunek 3 i Film S1). Następnie, sygnał został szybko rozpropagowany do sąsiednich liści (liść 3 i 6) w ciągu kilku minut (po 80 s) (Rysunek 3 i Film S1).

Po ścięciu liścia 1 u roślin wykazujących ekspresję CHIB-iGluSnFR, zaobserwowano szybki wzrost [Glu]apo wokół obszaru cięcia (po 2 s). Sygnał ten był rozchodzony przez układ krwionośny lokalnie w ciągu kilku minut (po 160 s), ale nie został zaobserwowany w liściach układowych (Rysunek 4 i Film S2).

Do obrazowania w czasie rzeczywistym propagacji sygnału Ca2+ wywołanej przez zastosowanie glutaminianu, krawędź (około 1 mm od wierzchołka) liścia 1 u roślin wykazujących ekspresję GCaMP3 została przecięta, jak pokazano na Rysunek 5A i film S3. Przecięcie krawędzi liścia 1 spowodowało lokalny wzrost [Ca2+]cyt (po 40 s), ale sygnał ten zniknął w ciągu kilku minut (po 124 s). Po odczekaniu około 10 minut, aż roślina się zregeneruje, 10 μL 100 mM glutaminianu nałożono na powierzchnię cięcia liścia 1, co spowodowało szybki, znaczący wzrost [Ca2 +] cyt lokalnie (przy 56 s) i propagację sygnału do dystalnych liści (po 104 s) (Rysunek 5B i film S4).

Aby zmierzyć zmiany w [Ca2+]cyt wywołane zranieniem w liściu systemowym, dwa ROI (ROI1 i ROI2) ustawiono w obszarze podstawy i na końcu liścia 6 u roślin wyrażających GCaMP3, jak pokazano w Rysunek 6A. Zmierzono zmianę natężenia sygnału GCaMP3 w czasie w ROI1 i ROI2 po przecięciu ogonka liściowego 1 (Rysunek 6B). Znaczący wzrost [Ca2 +] cyt przy ROI1 został wykryty wcześniej niż w przypadku ROI2 (Rysunek 6B). [Ca2+]cyt osiągnął szczyt po około 100 s po zranieniu, trwał ponad 10 minut i wykazywał dwie fazy (Ryc. 6B).

Aby określić prędkości fali Ca2+ po mechanicznym zranieniu, określono punkt czasowy znaczącego wzrostu sygnału powyżej wstępnie stymulowanych wartości w ROI1 i ROI2 (opóźnienie czasowe; patrz sekcja 4) (Rysunek 6C). Ponieważ odległość między ROI1 a ROI2 wynosiła w tym przypadku 2,7 mm (Rysunek 6A), prędkość sygnału Ca2+ w liściu 6 została obliczona jako 0,15 mm/s. Aby zmierzyć zmiany [Glu]apo w odpowiedzi na uszkodzenia mechaniczne, ROI1 ustawiono w pobliżu miejsca cięcia liścia oznaczonego jako L1, jak pokazano na Rysunek 7A. [Klej]Sygnatura apo przy ROI1 wykazała pojedynczy pik po około 100 s po zranieniu (Rysunek 7B).

Rysunek 1: Numeracja liści rozety Arabidopsis. Liście Arabidopsis są ponumerowane od najstarszego do najmłodszego (lewy panel). Schemat ideowy przedstawiający położenie skrzydeł znajduje się w prawym panelu. L: liść, C: liścienie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Mikroskop fluorescencyjny użyty w tym badaniu. Dynamika [Ca2+]cyt i [Glu]apo zostały zobrazowane za pomocą stereomikroskopu fluorescencyjnego o szerokim polu widzenia. R: Pilot zdalnego sterowania, O: soczewka obiektywu 1x, C: kamera sCMOS, T: Rurka uchylna trójokularowa, S: Stage, P: Materiał roślinny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Wywołana przez ranę transmisja sygnału Ca2+ na duże odległości. Przecięcie ogonka liściowego (biała strzałka, 0 s) liścia 1 (L1) w roślinie wyrażającej GCaMP3 wywołało miejscowy wzrost [Ca2+] cyt (czerwona strzałka, 40 s), który został przekazany na liście systemiczne [liść 3 (L3) i liść 6 (L6)] (pomarańczowe strzałki, 80 s). Podziałka, 5 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Uniesienie [Glu]apo wywołane raną. Cięcie liścia 1 (L1) (biała strzałka, 0 s) u roślin wykazujących ekspresję CHIB-iGluSnFR spowodowało gwałtowne podniesienie [Glu]apo (czerwona strzałka, 80 s), który rozprzestrzeniał się przez układ naczyniowy (pomarańczowa strzałka, 160 s). Podziałka, 2 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Długodystansowa transmisja sygnału Ca2+ wywołana glutaminianem. (A) Przecięcie krawędzi (około 1 mm od końca) liścia 1 (L1) u roślin wykazujących ekspresję GCaMP3 (biała strzałka, 0 s) spowodowało wzrost [Ca2+]cyt (czerwona strzałka, 40 s). (B) Nałożenie 100 mM glutaminianu na powierzchnię cięcia L1 (biała strzałka, 0 s) spowodowało miejscowy wzrost [Ca2+]cyt (czerwona strzałka, 56 s), który szybko rozchodził się do dystalnych liści [np. liścia 3 (L3), liścia 4 (L4) i liścia 6 (L6)] (pomarańczowe strzałki, 104 s). Podziałka liniowa, 5 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: [Ca2+]cyt sygnatura w liściach systemowych w odpowiedzi na mechaniczne zranienie. (A) Rozszerzony obraz liścia 6 (L6) u roślin wyrażających GCaMP3 jest pokazany w Rysunek 3. ROI1 (niebieskie kółko) i ROI2 (różowe kółko) zostały ustawione odpowiednio w obszarze podstawy i końcówki. Biała strzałka wskazuje miejsce przecięcia ogonka liściowego liścia 1 (L1). W tym przypadku odległość między ROI1 a ROI2 wynosiła 2,7 mm. (B) Kwantyfikacja sygnatur [Ca2 +] cyt w ROI1 i ROI2. Zmiany intensywności fluorescencji analizowano za pomocą oprogramowania do obrazowania. (C) Rozszerzony ślad danych w (B) między 0 s a 80 s. Punkty detekcji wzrostu Ca2+ ROI1 i ROI2 zdefiniowano odpowiednio jako t1 i t 2, przyjmując jako kryterium wzrost do 2x odchylenia standardowego wartości prestymulacji (2x SD, linia przerywana). Wartość t2 - t1 została zdefiniowana jako opóźnienie czasowe (Δt) w obecnym protokole. strzałka wskazuje czas cięcia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Podpis [Glu]apo w odpowiedzi na mechaniczne zranienie. (A) Rozszerzony obraz liścia 1 (L1) u roślin wyrażających CHIB-iGluSnFR jest pokazany w Rysunek 4. Zwrot z inwestycji1 został ustalony w pobliżu miejsca wycięcia. Biała strzałka wskazuje obszar cięcia. (B) Kwantyfikacja sygnatury [Glu]apo w ROI1 jest monitorowana za pomocą oprogramowania do obrazowania. strzałka wskazuje czas cięcia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Film S1: Transmisja Ca2+ na duże odległości po mechanicznym zranieniu. Mechaniczne zranienie ogonka liściowego liścia 1 (L1) spowodowało wzrost [Ca2+]cyt przenoszony na dystalne liście [np. liść 3 (L3) i liść 6 (L6)]. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film S2: Podniesienie poziomu glutaminianu apoplastycznego w odpowiedzi na cięcie. Mechaniczne zranienie liścia 1 (L1) spowodowało natychmiastowy wzrost [Glu]apo. Kliknij tutaj aby pobrać ten film.

Film S3: Podniesienie poziomu [Ca2+]cyt w odpowiedzi na cięcie. Mechaniczne zranienie na krawędzi liścia 1 (L1) spowodowało natychmiastowe, miejscowe [Ca2+]uniesienie cyt. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film S4: Zastosowanie glutaminianu powoduje wzrost ogólnoustrojowego [Ca2+]cyt. Zastosowanie 100 mM glutaminianu wywołało transmisję Ca2+ do liści układowych [np. liść 3 (L3), liść 4 (L4) i liść 6 (L6)]. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.