Szerokokątne obrazowanie w czasie rzeczywistym lokalnych i układowych sygnałów rany u rzodkiewnika

Takuya Uemura; Jiaqi Wang; Yuri Aratani; Simon Gilroy; Masatsugu Toyota

doi:10.3791/62114

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Szerokokątne obrazowanie w czasie rzeczywistym lokalnych i układowych sygnałów rany u rzodkiewnika

4.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62114

⸱

4 czerwca 2021

Takuya Uemura¹ , Jiaqi Wang¹ , Yuri Aratani¹ , Simon Gilroy² , Masatsugu Toyota¹^,²

¹Department of Biochemistry and Molecular Biology, Saitama University, ²Department of Botany, University of Wisconsin

W tym artykule

Podsumowanie

Zewnątrzkomórkowa systemowa sygnalizacja wapniowa wywołana glutaminianem jest kluczowa dla indukcji reakcji obronnych roślin na mechaniczne zranienia i ataki roślinożerców u roślin. W artykule opisano metodę wizualizacji przestrzennej i czasowej dynamiki obu tych czynników przy użyciu roślin Arabidopsis thaliana wykazujących ekspresję wrażliwych na wapń i glutaminian biosensorów fluorescencyjnych.

Streszczenie

Rośliny reagują na mechaniczne obciążenia, takie jak zranienia i roślinożerność, wywołując reakcje obronne zarówno w uszkodzonych, jak i nieuszkodzonych dystalnych częściach. Po zranieniu liścia w miejscu rany następuje wzrost stężenia cytozolowych jonów wapnia (sygnał^Ca2+). Sygnał ten jest szybko przesyłany do nieuszkodzonych liści, gdzie aktywowane są reakcje obronne. Nasze ostatnie badania wykazały, że glutaminian wyciekający z uszkodzonych komórek liścia do otaczającego je apoplastu służy jako sygnał rany. Ten glutaminian aktywuje kanały przepuszczalne Ca²⁺ podobne do receptora glutaminianu, co następnie prowadzi do propagacji sygnału Ca²⁺ na duże odległości w całej roślinie. Przestrzenną i czasową charakterystykę tych zdarzeń można uchwycić za pomocą obrazowania w czasie rzeczywistym żywych roślin wykazujących ekspresję genetycznie kodowanych bioczujników fluorescencyjnych. W tym miejscu wprowadzamy metodę obrazowania w czasie rzeczywistym w całej roślinie w celu monitorowania dynamiki zarówno sygnałów Ca²⁺, jak i zmian w glutaminianu apoplastu, które zachodzą w odpowiedzi na zranienie. Podejście to wykorzystuje szerokokątny mikroskop fluorescencyjny i transgeniczne rośliny Arabidopsis wykazujące ekspresję biosensorów Ca²⁺ i glutaminianu opartych na zielonym białku fluorescencyjnym (GFP). Ponadto przedstawiamy metodologię łatwego wywoływania indukowanej ranami, wyzwalanej glutaminianem szybkiej i długodystansowej propagacji sygnału Ca²⁺. Protokół ten można również zastosować do badań nad innymi stresami roślinnymi, aby pomóc w zbadaniach, w jaki sposób sygnalizacja systemowa roślin może być zaangażowana w ich sieci sygnalizacyjne i reagowania.

Wprowadzenie

Rośliny nie mogą uciec przed stresami biotycznymi, np. owadami żywiącymi się nimi, dlatego rozwinęły zaawansowane systemy wykrywania stresu i transdukcji sygnału, aby wykrywać, a następnie chronić się przed wyzwaniami, takimi jak roślinożerność¹. Po zranieniu lub ataku roślinożercy rośliny inicjują szybkie reakcje obronne, w tym akumulację fitohormonu kwasu jasmonowego (JA) nie tylko w miejscu zranienia, ale także w nieuszkodzonych narządach dystalnych². Ten JA następnie zarówno wyzwala reakcje obronne w bezpośrednio uszkodzonych tkankach, jak i prewencyjnie indukuje obronę w nieuszkodzonych częściach rośliny. U rzodkiewnika nagromadzenie JA wywołane zranieniem wykryto w dystalnych, nienaruszonych liściach w ciągu zaledwie kilku minut od uszkodzenia w innym miejscu rośliny, co sugeruje, że z uszkodzonego liścia przesyłany jest szybki i długodystansowy sygnał³. Zaproponowano kilka kandydatów, takich jak Ca²⁺, reaktywne formy tlenu (ROS) i sygnały elektryczne, które mogą służyć jako te długodystansowe sygnały nawijane w roślinach⁴^,⁵.

Ca²⁺ jest jednym z najbardziej wszechstronnych i wszechobecnych elementów drugiego posłańca w organizmach eukariotycznych. U roślin żucie gąsienic i mechaniczne zranienia powodują drastyczny wzrost stężenia cytozolowego Ca²⁺ ([Ca²⁺]_cyt) zarówno w zranionym liściu, jak i w nieuszkodzonych odległych liściach⁶^,⁷. Ten ogólnoustrojowy sygnał Ca^{2 +} jest odbierany przez wewnątrzkomórkowe białka wykrywające Ca^{2 +}, co prowadzi do aktywacji dalszych szlaków sygnalizacji obronnej, w tym biosyntezy JA⁸^,⁹. Pomimo licznych doniesień potwierdzających znaczenie sygnałów Ca²⁺ w reakcjach na rany roślin, informacje na temat przestrzennej i czasowej charakterystyki sygnałów Ca²⁺ wywołanych zranieniem są ograniczone.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym za pomocą genetycznie kodowanych wskaźników Ca²⁺ jest potężnym narzędziem do monitorowania i ilościowego określania przestrzennej i czasowej dynamiki sygnałów Ca²⁺. Do tej pory opracowano wersje takich czujników, które umożliwiają wizualizację sygnałów Ca²⁺ na poziomie pojedynczej komórki, do tkanek, organów, a nawet całych roślin¹⁰. Pierwszym genetycznie kodowanym biosensorem Ca²⁺ zastosowanym w roślinach było bioluminescencyjne białko aequorin pochodzące z meduzy Aequorea victoria¹¹. Chociaż to chemiluminescencyjne białko było używane do wykrywania zmian Ca²⁺ w odpowiedzi na różne stresy u roślin¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸, nie nadaje się do obrazowania w czasie rzeczywistym ze względu na wytwarzany przez niego wyjątkowo niski sygnał luminescencyjny. Wskaźniki Ca²⁺ oparte na transferze energii rezonansu (FRET) Förster, takie jak żółte cameleony, zostały również z powodzeniem wykorzystane do zbadania dynamiki szeregu zdarzeń sygnalizacyjnych Ca²⁺ w roślinach¹⁹^,²⁰^,²¹^,²²^,²³^,²⁴. Czujniki te są kompatybilne z podejściami do obrazowania i najczęściej składają się z białka wiążącego Ca²⁺ kalmoduliny (CaM) i peptydu wiążącego CaM (M13) z kinazy łańcucha lekkiego miozyny, wszystkie połączone między dwoma białkami fluoroforowymi, zwykle cyjanem fluorescencyjnym białkiem (CFP) i wariantem żółtego białka fluorescencyjnego (YFP)¹⁰. Wiązanie Ca²⁺ z CaM sprzyja interakcji między CaM i M13, prowadząc do zmiany konformacyjnej czujnika. Zmiana ta sprzyja transferowi energii między CFP a YFP, co zwiększa intensywność fluorescencji YFP przy jednoczesnym zmniejszeniu emisji fluorescencji z CFP. Monitorowanie tego przejścia od fluorescencji CFP do fluorescencji YFP zapewnia następnie miarę wzrostu poziomu Ca²⁺. Oprócz tych czujników FRET, biosensory Ca²⁺ oparte na pojedynczym białku fluorescencyjnym (FP), takie jak GCaMP i R-GECO, są również kompatybilne z metodami obrazowania roślin i są szeroko stosowane do badania zmian [Ca²⁺]_cyt ze względu na ich wysoką czułość i łatwość użycia²⁵^,²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹^,³⁰. GCaMPs zawierają pojedynczy kołowo permutowany (cp) GFP, ponownie połączony z CaM i peptydem M13. Zależna od Ca²⁺ interakcja między CaM i M13 powoduje zmianę konformacyjną w czujniku, która sprzyja zmianie stanu protonacji cpGFP, wzmacniając jego sygnał fluorescencyjny. Tak więc, wraz ze wzrostem poziomu Ca²⁺, sygnał cpGFP wzrasta.

Aby zbadać dynamikę sygnałów Ca²⁺ generowanych w odpowiedzi na mechaniczne zranienie lub żerowanie roślinożerców, użyliśmy transgenicznych roślin Arabidopsis thaliana wyrażających wariant GCaMP, GCaMP3, oraz mikroskopu fluorescencyjnego o szerokim polu widzenia⁶. W ramach tego podejścia udało się zobrazować szybką transmisję sygnału Ca²⁺ na duże odległości z miejsca rany na liściu do całej rośliny. W ten sposób natychmiast wykryto wzrost [Ca^{2 +}] _cyt w miejscu rany, ale ten sygnał Ca^{2 +} był następnie propagowany do sąsiednich liści przez naczynia krwionośne w ciągu kilku minut od zranienia. Co więcej, odkryliśmy, że transmisja tego szybkiego ogólnoustrojowego sygnału rany jest zniesiona u roślin Arabidopsis z mutacjami w dwóch genach podobnych do receptora glutaminianu, Glutaminian Receptor Like (GLR), GLR3.3 i GLR3.6⁶. Wydaje się, że GLR funkcjonują jako kanały Ca²⁺ bramkowane aminokwasami, zaangażowane w różne procesy fizjologiczne, w tym reakcję na ranę³, wzrost łagiewki pyłkowej³¹, rozwój korzeni³², cold response³³ i odporność wrodzona³⁴. Pomimo tej dobrze poznanej, szerokiej funkcji fizjologicznej GLR, informacje na temat ich właściwości funkcjonalnych, takich jak specyficzność dla ligandów, selektywność jonowa i lokalizacja subkomórkowa, są ograniczone³⁵. Jednak ostatnie badania wykazały, że GLR3.3 i GLR3.6 są zlokalizowane odpowiednio w łyku i ksylemie. Roślinne GLR są podobne do jonotropowych receptorów glutaminianu (iGluRs)³⁶ u ssaków, które są aktywowane przez aminokwasy, takie jak glutaminian, glicyna i D-seryna w układzie nerwowym ssaków³⁷. Rzeczywiście, wykazaliśmy, że zastosowanie 100 mM glutaminianu, ale nie innych aminokwasów, w miejscu rany indukuje szybki, długodystansowy sygnał Ca^{2 +} u Arabidopsis, co wskazuje, że glutaminian zewnątrzkomórkowy prawdopodobnie działa jako sygnał rany u roślin⁶. Odpowiedź ta została zniesiona w mutancie glr3.3/glr3.6, co sugeruje, że glutaminian może działać przez jeden lub oba te kanały podobne do receptorów i rzeczywiście, ostatnio wykazano, że AtGLR3.6 jest bramkowany przez te poziomy glutaminianu³⁸.

W roślinach, oprócz swojej roli jako aminokwasu strukturalnego, glutaminian został również zaproponowany jako kluczowy regulator rozwoju³⁹; jednak jego przestrzenna i czasowa dynamika jest słabo poznana. Podobnie jak w przypadku^Ca2+, opracowano kilka genetycznie kodowanych wskaźników glutaminianu w celu monitorowania dynamiki tego aminokwasu w żywych komórkach⁴⁰^,⁴¹. iGluSnFR to oparty na GFP bioczujnik glutaminianu z pojedynczym FP, składający się z cpGFP i białka wiążącego glutaminian (GltI) z Escherichia coli⁴²^,⁴³. Zmiana konformacyjna iGluSnFR, która jest indukowana przez wiązanie glutaminianu z GltI, powoduje zwiększoną emisję fluorescencji GFP. Aby zbadać, czy zewnątrzkomórkowy glutaminian działa jako cząsteczka sygnałowa w odpowiedzi na rany roślinne, połączyliśmy sekwencję iGluSnFR z podstawową sekwencją wydzielania peptydu sygnału chitynazy (CHIB-iGluSnFR), aby zlokalizować ten bioczujnik w przestrzeni apoplastycznej⁶. Podejście to umożliwiło zobrazowanie wszelkich zmian w stężeniu glutaminianu apoplastycznego ([Glu]_apo) przy użyciu transgenicznych roślin Arabidopsis wykazujących ekspresję tego czujnika. Wykryliśmy gwałtowny wzrost sygnału iGluSnFR w miejscu zranienia. Dane te potwierdzają ideę, że glutaminian wycieka z uszkodzonych komórek/tkanek do apoplastu po zranieniu i działa jako sygnał uszkodzenia, aktywując GLR i prowadząc do długodystansowego sygnału Ca²⁺ w roślinach⁶.

Tutaj opisujemy metodę obrazowania w czasie rzeczywistym całej rośliny, wykorzystującą genetycznie kodowane biosensory do monitorowania i analizowania dynamiki długodystansowych sygnałów Ca²⁺ i zewnątrzkomórkowego glutaminianu w odpowiedzi na zranienie⁶. Dostępność szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej i biosensorów wykazujących ekspresję genetycznie kodowanych roślin transgenicznych zapewnia potężne, a jednocześnie łatwe do wdrożenia podejście do wykrywania szybko przesyłanych sygnałów na duże odległości, takich jak fale^Ca2+.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie materiału roślinnego

W mikroprobówce o pojemności 1,5 ml wysterylizuj powierzchniowo nasiona rośliny Arabidopsis thaliana (akcesja Col-0) wyrażającej GCaMP3 lub CHIB-iGluSnFR przez wstrząsanie 20% (v/v) NaClO przez 3 minuty, a następnie przemyj 5 razy sterylną wodą destylowaną.
UWAGA: Transgeniczne linie Arabidopsis wykazujące ekspresję GCaMP3 lub CHIB-iGluSnFR zostały opisane wcześniej⁶.
W sterylnym kapturze wysiewaj 13 wysterylizowanych powierzchniowo nasion na 10 cm kwadratowej plastikowej szalce Petriego wypełnionej 30 ml sterylnego (autoklawowanego) podłoża Murashige i Skoog (MS) [1x sole MS, 1% (w/v) sacharozy, 0,01% (w/v) mioinozytol, 0,05% (w/v) MES i 0,5% (w/v) gumy gellan; pH 5,7 skorygowane za pomocą 1N KOH]. Załóż pokrywkę i owiń taśmą chirurgiczną.
Po inkubacji w ciemności w temperaturze 4 °C przez 2 dni, umieścić płytki poziomo w temperaturze 22 °C w komorze wzrostowej w ciągłym świetle (90-100 μmol ^m-2 ^s-1) na około 2 tygodnie przed użyciem. Po 2 tygodniach policz liczbę liści Arabidopsis od najstarszego do najmłodszego⁴⁴ (Rysunek 1). Reakcje na rany preferencyjnie przesuwają się z uszkodzonego liścia (n) na liście o numerach n ± 3 i n ± 5⁶.
UWAGA: W tym protokole szalka Petriego zostanie otwarta w celu zobrazowania rany i efektów glutaminianu pod mikroskopem fluorescencyjnym. Dlatego kolejne etapy tego eksperymentu powinny być przeprowadzane w warunkach pokojowych o kontrolowanej temperaturze i wilgotności. Dzieje się tak, ponieważ sygnały Ca²⁺ są również wywoływane przez zmiany w tych warunkach środowiskowych. Wiadomo również, że niebieskie światło, emitowane z mikroskopu podczas rejestracji w celu wzbudzenia fluorescencji białka biosensora, może wywołać wzrost stężenia cytozolowego Ca²⁺ ⁴⁵ i dlatego roślina powinna być zaaklimatyzowana do naświetlania światłem niebieskim przez kilka minut przed rozpoczęciem eksperymentu.

2. Przygotowanie chemiczne

Rozpuść L-glutaminian w płynnym podłożu wzrostowym [1/2x sole MS, 1% (w/v) sacharozy i 0,05% (w/v) MES; pH 5,1 dostosowane za pomocą 1N KOH], aby uzyskać 100 mM roztwór roboczy.
UWAGA: Unikaj stosowania soli glutaminianu, takich jak glutaminian sodu, aby zapobiec potencjalnemu wpływowi kationów na dynamikę Ca^{2 +}.

3. Ustawienie mikroskopu i przeprowadzanie obrazowania w czasie rzeczywistym

Włącz zmotoryzowany stereomikroskop fluorescencyjny wyposażony w soczewkę obiektywu 1x (NA = 0,156) i kamerę sCMOS (Rysunek 2) i skonfiguruj ustawienia urządzenia tak, aby naświetlać światłem wzbudzającym 470/40 nm i uzyskiwać światło emisyjne przechodzące przez filtr 535/50 nm.
UWAGA: Każdy mikroskop fluorescencyjny wrażliwy na GFP może być używany do wykrywania sygnałów GCaMP3 i iGluSnFR w czasie rzeczywistym, ale do pozyskiwania sygnałów z całej instalacji zalecany jest obiektyw o małej mocy i bardzo czuła kamera z szerokim chipem sCMOS. Obiektyw o niskiej mocy pozwala na obrazowanie reakcji całej rośliny Arabidopsis, a użycie bardzo czułej kamery pozwala na szybkie pozyskiwanie danych potrzebnych do uchwycenia szybkiego przebiegu w czasie fali Ca²⁺ wyzwalanej przez ranę. Dla mikroskopu fluorescencyjnego użytego w tym badaniu maksymalne wartości pola widzenia i rozdzielczości czasowej wynoszą odpowiednio 3 cm x 3 cm i 30 klatek na sekundę (fps).
Zdejmij pokrywkę i umieść naczynie pod soczewką obiektywu.
Sprawdź sygnał fluorescencyjny z rośliny, a następnie odczekaj około 30 minut w ciemności, aż rośliny przystosują się do nowych warunków środowiskowych. Ten etap adaptacji jest wymagany, ponieważ zmiany wilgotności wywołują [Ca^{2 +}] _{wzrost cyt} u roślin, który może zakłócać wszelkie zdarzenia związane z ranami.
Dostosuj ostrość i powiększenie, aby zobaczyć całą roślinę w polu view. W obecnym protokole zastosowano powiększenie 0,63x.
Przed rozpoczęciem obrazowania w czasie rzeczywistym należy skonfigurować parametry akwizycji, aby wykryć sygnały fluorescencyjne za pomocą oprogramowania do obrazowania mikroskopowego. Ustawienia obrazowania w bieżącym protokole to: czasy ekspozycji i interwałów ustawione odpowiednio na 1,8 s i 2 s (tj. 0,5 kl./s). Ustaw czas nagrywania na 11 minut.
Obraz przez 5 minut przed rozpoczęciem eksperymentu, aby przyzwyczaić roślinę do napromieniowania światłem niebieskim z mikroskopu, a następnie rozpocznij nagrywanie, klikając Uruchom teraz lub równoważne polecenie w używanym oprogramowaniu mikroskopu. Aby określić średnią wyjściową fluorescencję, zapisz co najmniej 10 klatek (tj. co najmniej 20 s w obecnym protokole) przed zranieniem lub zastosowaniem glutaminianu (patrz sekcja 4).
1. Aby zobrazować w czasie rzeczywistym zmiany [Ca^{2 +}] _cyt i [Glu]_apo, należy przeciąć ogonek liściowy lub środkową część liścia L1 nożyczkami (Ryc. 3 i Ryc. 4).
2. Aby zobrazować w czasie rzeczywistym zmiany [Ca^{2 +}] _cyt wywołane glutaminianem, odetnij nożyczkami krawędź (około 1 mm od końca) liścia 1 w poprzek głównej żyły. Po co najmniej 20-minutowym okresie rekonwalescencji nałóż 10 μl 100 mM glutaminianu na powierzchnię cięcia liścia (Rysunek 5).
  UWAGA: To wstępne cięcie było konieczne, aby umożliwić dostęp glutaminianu do apoplastu liściowego w celu wywołania reakcji. Ponadto stwierdzono, że nałożenie kropli wody destylowanej na powierzchnię cięcia liścia L1 ma kluczowe znaczenie dla zapobieżenia wysuszeniu próbek podczas odzyskiwania przed zastosowaniem glutaminianu.
Po zakończeniu 11-minutowego nagrywania zapisz dane.

4. Analiza danych

Do analizy intensywności fluorescencji w czasie zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI) w miejscu, w którym ma być analizowana intensywność fluorescencji (Rysunek 6 i Rysunek 7). Aby obliczyć prędkość fali Ca²⁺, zdefiniuj 2 ROI (ROI1 i ROI2) do analizy. W oprogramowaniu do obrazowania kliknij Pomiar czasu | Definiowanie | Okrąg. Zmierz odległość między ROI1 i ROI2, klikając Adnotacje i pomiar | Długość | Prosta linia (Rysunek 6).
Zmierz surowe wartości fluorescencji (F) w każdym ROI w czasie, klikając Zmierz. Eksportuj surowe dane do arkusza kalkulacyjnego, aby przekonwertować sygnał fluorescencji na liczby w każdym punkcie czasu, klikając Wszystko do Excela | Eksport.
Określ wyjściową wartość fluorescencji, która jest zdefiniowana jako F₀, obliczając średnią F z pierwszych 10 klatek (tj. przed leczeniem) w zarejestrowanych danych.
Znormalizuj dane F (obliczając ΔF/F) za pomocą równania ΔF/F = (F−F₀)/F₀, gdzie ΔF jest zależną od czasu zmianą fluorescencji.
W przypadku analizy fali prędkości fali Ca²⁺ należy zdefiniować znaczący punkt narastania sygnału powyżej wstępnie stymulowanych wartości jako reprezentujący wykrycie wzrostu Ca²⁺ w każdym ROI (t₁ i _{t 2}) przy użyciu kryterium wzrostu do 2× odchylenia standardowego (2x SD) obliczonego na podstawie danych F₀ za pomocą oprogramowania statystycznego. 95% F₀ dane mieszczą się w granicach 2x SD od średniej, co wskazuje, że przypadkowy wzrost sygnału powyżej tego poziomu wynosi ≤5%. Oblicz różnicę czasu wzrostu Ca²⁺ między ROI1 i ROI2 [t₂- t₁ opóźnienie czasowe (Δt)] i zmierz odległość między ROI1 a ROI2, a następnie określ prędkości dowolnej fali Ca²⁺.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Propagacja sygnału [Ca²⁺]_cyt oraz [Glu]_apo w odpowiedzi na uszkodzenie została przedstawiona na Rysunku 3, Rysunku 4, w Filmie S1 oraz Filmie S2. Przecięcie ogonka liścia 1 u roślin wykazujących ekspresję GCaMP3 (w 0 s) doprowadziło do znaczącego wzrostu poziomu [Ca²⁺]_cyt, który został szybko indukowany lokalnie w tkankach przewodzących (w 40...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Sygnalizacja ogólnoustrojowa jest ważna, aby rośliny reagowały na zlokalizowane zewnętrzne bodźce środowiskowe, a następnie utrzymywały homeostazę na poziomie całej rośliny. Chociaż nie są wyposażone w zaawansowany układ nerwowy jak zwierzęta, wykorzystują szybką komunikację zarówno wewnątrz, jak i między narządami, w oparciu o takie czynniki, jak ruchome sygnały elektryczne (i ewentualnie hydrauliczne) oraz rozchodzące się fale ROS i Ca^{2 +} ^46,47. Opis...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki (17H05007 i 18H05491) dla MT, Narodowej Fundacji Nauki (IOS1557899 i MCB2016177) oraz Narodowej Agencji Aeronautyki i Przestrzeni Kosmicznej (NNX14AT25G i 80NSSC19K0126) dla SG.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Arabidopsis wyrażający GCaMP3	Saitama University
Arabidopsis wyrażający CHIB-iGluSnFR	Saitama University
GraphPad Prism 7	Oprogramowanie
L-glutaminian	FUJIFILM Wako	072-00501	Rozpuszczony w płynnym pożywce wzrostowej [1/2x sole MS, 1% (w/v) sacharozy i 0,05% (w/v) MES; pH 5,1 skorygowane za pomocą 1N KOH].
Microsoft Excel	Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) medium	FUJIFILM Wako	392-00591	skład: 1x sole MS, 1% (w/v) sacharoza, 0,01% (w/v) mioinozytol, 0,05% (w/v) MES i 0,5% (w/v) guma gellan; pH 5,7 skorygowane za pomocą 1N KOH.
Mikroskop stereoskopowy Nikon SMZ25	Nikon
NIS-Elements Analiza AR	Obiektyw Nikon
1x (P2-SHR PLAN APO)Aparat	Nikon
sCMOS (ORCA-Flash4.0 V2)	Hamamatsu Photonics	C11440-22CU
Kwadratowa plastikowa szalka Petriego	Simport	D210-16

GraphPad

Bibliografia

Wu, J., Baldwin, I. T. Herbivory-induced signalling in plants: perception and action. Plant, Cell & Environment. 32 (9), 1161-1174 (2009).
Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. Modularity in Jasmonate Signaling for Multistress Resilience. Annual Review of Plant Biology. 69 (1), 387-415 (2018).
Mousavi, S. A. R., Chauvin, A., Pascaud, F., Kellenberger, S., Farmer, E. E. GLUTAMATE RECEPTOR-LIKE genes mediate leaf-to-leaf wound signalling. Nature. 500 (7463), 422-426 (2013).
Gilroy, S., et al. Electric Signals: Key Mediators of Rapid Systemic Signaling in Plants. Plant Physiology. 171 (3), 1606-1615 (2016).
Choi, W. -G., Hilleary, R., Swanson, S. J., Kim, S. -H., Gilroy, S. Rapid, long-distance electrical and calcium signaling in plants. Annual Review of Plant Biology. 67 (1), 287-307 (2016).
Toyota, M., et al. Glutamate triggers long-distance, calcium-based plant defense signaling. Science. 361 (6407), 1112-1115 (2018).
Nguyen, C. T., Kurenda, A., Stolz, S., Chételat, A., Farmer, E. E. Identification of cell populations necessary for leaf-to-leaf electrical signaling in a wounded plant. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10178-10183 (2018).
Lecourieux, D., Ranjeva, R., Pugin, A. Calcium in plant defence-signalling pathways. New Phytologist. 171 (2), 249-269 (2006).
Farmer, E. E., Gao, Y. -Q., Lenzoni, G., Wolfender, J. -L., Wu, Q. Wound- and mechanostimulated electrical signals control hormone responses. New Phytologist. 227 (4), 1037-1050 (2020).
Palmer, A. E., Qin, Y., Park, J. G., McCombs, J. E. Design and application of genetically encoded biosensors. Trends in Biotechnology. 29 (3), 144-152 (2011).
Ridgway, E. B., Ashley, C. C. Calcium transients in single muscle fibers. Biochemical and Biophysical Research Communications. 29 (2), 229-234 (1967).
Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root. The Plant Journal. 23 (2), 267-278 (2000).
Zhu, X., Feng, Y., Liang, G., Liu, N., Zhu, J. -K. Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
Kwaaitaal, M., Huisman, R., Maintz, J., Reinstädler, A., Panstruga, R. Ionotropic glutamate receptor (iGluR)-like channels mediate MAMP-induced calcium influx in Arabidopsis thaliana. Biochemical Journal. 440 (3), 355-373 (2011).
Vatsa, P., et al. Involvement of putative glutamate receptors in plant defence signaling and NO production. Biochimie. 93 (12), 2095-2101 (2011).
Toyota, M., Furuichi, T., Sokabe, M., Tatsumi, H. Analyses of a gravistimulation-specific Ca2+ signature in Arabidopsis using parabolic flights. Plant Physiology. 163 (2), 543-554 (2013).
Toyota, M. Hypergravity stimulation induces changes in intracellular calcium concentration in Arabidopsis seedlings. Advances in Space Research. 39, 1190-1197 (2007).
Stephan, A. B., Kunz, H. -H., Yang, E., Schroeder, J. I. Rapid hyperosmotic-induced Ca2+ responses in Arabidopsis thaliana exhibit sensory potentiation and involvement of plastidial KEA transporters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 5242-5249 (2016).
Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca2+ by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (29), 10554-10559 (2004).
Choi, W. -G., Toyota, M., Kim, S. -H., Hilleary, R., Gilroy, S. Salt stress-induced Ca2+ waves are associated with rapid, long-distance root-to-shoot signaling in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (17), 6497-6502 (2014).
Evans, M. J., Choi, W. -G., Gilroy, S., Morris, R. J. A ROS-assisted calcium wave dependent on the AtRBOHD NADPH oxidase and TPC1 cation channel propagates the systemic response to salt stress. Plant Physiology. 171 (3), 1771-1784 (2016).
Hilleary, R., et al. Tonoplast-localized Ca2+ pumps regulate Ca2+ signals during pattern-triggered immunity in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (31), 18849-18857 (2020).
Lenglet, A., et al. Control of basal jasmonate signalling and defence through modulation of intracellular cation flux capacity. New Phytologist. 216 (4), 1161-1169 (2017).
Choi, W. -G., Swanson, S. J., Gilroy, S. High-resolution imaging of Ca2+, redox status, ROS and pH using GFP biosensors. The Plant Journal. 70 (1), 118-128 (2012).
Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3197-3202 (2001).
Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
Keinath, N. F., et al. Live cell imaging with R-GECO1 sheds light on flg22- and Chitin-induced transient [Ca2+]cyt patterns in Arabidopsis. Molecular Plant. 8 (8), 1188-1200 (2015).
Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).
Vincent, T. R., et al. Real-time in vivo recording of Arabidopsis calcium signals during insect feeding using a fluorescent biosensor. JoVE. (126), e56142(2017).
DeFalco, T. A., et al. Using GCaMP3 to study Ca2+ signaling in nicotiana species. Plant and Cell Physiology. 58 (7), 1173-1184 (2017).
Michard, E., et al. Glutamate receptor-like genes form Ca2+ channels in pollen tubes and are regulated by Pistil D-Serine. Science. 332 (6028), 434-437 (2011).
Singh, S. K., Chien, C. -T., Chang, I. -F. The Arabidopsis glutamate receptor-like gene GLR3.6 controls root development by repressing the Kip-related protein gene KRP4. Journal of Experimental Botany. 67 (6), 1853-1869 (2016).
Li, H., et al. Tomato GLR3.3 and GLR3.5 mediate cold acclimation-induced chilling tolerance by regulating apoplastic H2O2 production and redox homeostasis. Plant, Cell & Environment. 42 (12), 3326-3339 (2019).
Li, F., et al. Glutamate receptor-like channel3.3 is involved in mediating glutathione-triggered cytosolic calcium transients, transcriptional changes, and innate immunity responses in Arabidopsis. Plant Physiology. 162 (3), 1497-1509 (2013).
Wudick, M. M., Michard, E., Oliveira Nunes, C., Feijó, J. A. Comparing plant and animal glutamate receptors: common traits but different fates. Journal of Experimental Botany. 69 (17), 4151-4163 (2018).
De Bortoli, S., Teardo, E., Szabò, I., Morosinotto, T., Alboresi, A. Evolutionary insight into the ionotropic glutamate receptor superfamily of photosynthetic organisms. Biophysical Chemistry. 218, 14-26 (2016).
Janovjak, H., Sandoz, G., Isacoff, E. Y. A modern ionotropic glutamate receptor with a K+ selectivity signature sequence. Nature Communications. 2 (1), 232(2011).
Shao, Q., Gao, Q., Lhamo, D., Zhang, H., Luan, S. Two glutamate- and pH-regulated Ca2+ channels are required for systemic wound signaling in Arabidopsis. Science Signaling. 13 (640), (2020).
Forde, B. G., Lea, P. J. Glutamate in plants: metabolism, regulation, and signalling. Journal of Experimental Botany. 58 (9), 2339-2358 (2007).
Okumoto, S., et al. Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8740-8745 (2005).
Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4411-4416 (2008).
Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nature Methods. 10 (2), 162-170 (2013).
Marvin, J. S., et al. Stability, affinity, and chromatic variants of the glutamate sensor iGluSnFR. Nature Methods. 15 (11), 936-939 (2018).
Farmer, E., Mousavi, S. A. R., Lenglet, A. Leaf numbering for experiments on long distance signalling in Arabidopsis. Protocol Exchange: Preprint server. , (2013).
Harada, A., Shimazaki, K. -i Phototropins and blue light-dependent calcium signaling in higher plants. Photochemistry and Photobiology. 83 (1), 102-111 (2007).
Huber, A. E., Bauerle, T. L. Long-distance plant signaling pathways in response to multiple stressors: the gap in knowledge. Journal of Experimental Botany. 67 (7), 2063-2079 (2016).
Choi, W. -G., et al. Orchestrating rapid long-distance signaling in plants with Ca2+, ROS and electrical signals. The Plant Journal. 90 (4), 698-707 (2017).
Tallini, Y. N., et al. Imaging cellular signals in the heart in vivo: cardiac expression of the high-signal Ca2+ indicator GCaMP2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (12), 4753-4758 (2006).
Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
Vincent, T. R., et al. Interplay of plasma membrane and vacuolar ion channels, together with BAK1, elicits rapid cytosolic calcium elevations in Arabidopsis during aphid feeding. The Plant Cell. 29 (6), 1460-1479 (2017).
Meena, M. K., et al. The Ca2+ channel CNGC19 regulates Arabidopsis defense against spodoptera herbivory. The Plant Cell. 31 (7), 1539-1562 (2019).
Cheong, Y. H., et al. CBL1, a calcium sensor that differentially regulates salt, drought, and cold responses in arabidopsis. The Plant Cell. 15 (8), 1833-1845 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sygnalizacja wapniowa apoplastowy glutaminian uszkadzanie Arabidopsis sygnalizacja systemiczna fluorescencyjne biosensory mikroskopia szerokopolowa propagacja fali wapniowej reakcja obronna ro lin kana y receptor w glutaminianu

Szerokokątne obrazowanie w czasie rzeczywistym lokalnych i układowych sygnałów rany u rzodkiewnika