Artykuł metodologiczny

Akumulacja i dystrybucja fluorescencyjnych mikrodrobin plastiku we wczesnych stadiach życia danio pręgowanego

DOI:

10.3791/62117

⸱

4 lipca 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Environment, Zhejiang University of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zarodki/larwy danio pręgowanego rozwijają się zewnętrznie i są optycznie przezroczyste. Bioakumulację mikrodrobin plastiku u ryb we wczesnych stadiach życia można łatwo ocenić za pomocą znakowanych fluorescencyjnie mikrogranulek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jako nowy rodzaj zanieczyszczenia środowiska, mikroplastik jest powszechnie stosowany w środowisku wodnym i stanowi duże zagrożenie dla organizmów wodnych. Bioakumulacja mikrodrobin plastiku odgrywa kluczową rolę w ich toksycznym skutkach; Jednak jako cząstki stałe, ich bioakumulacja różni się od wielu innych zanieczyszczeń. Opisano tutaj wykonalną metodę wizualnego określania akumulacji i dystrybucji mikroplastiku w zarodkach lub larwach danio pręgowanego przy użyciu fluorescencyjnych mikroplastików. Zarodki są poddawane działaniu różnych stężeń (0,1, 1 i 10 mg/l) fluorescencyjnych mikroplastików o średnicy 500 nm przez 120 godzin. Wyniki pokazują, że mikrodrobiny plastiku mogą ulegać bioakumulacji w zarodkach/larwach danio pręgowanego w sposób zależny od stężenia. Przed wykluciem stwierdza się silną fluorescencję wokół zarodkowej kosmówki; Natomiast w larwach danio pręgowanego głównymi miejscami nagromadzenia mikroplastików są woreczek żółtkowy, osierdzie i przewód pokarmowy. Wyniki wskazują na absorpcję i internalizację mikrodrobin plastiku u danio pręgowanego we wczesnych stadiach życia, co będzie stanowić podstawę do lepszego zrozumienia wpływu mikrodrobin plastiku na zwierzęta wodne.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Od momentu pierwszej syntezy w 1900 roku, tworzywa sztuczne są szeroko stosowane w różnych dziedzinach, co spowodowało szybki wzrost globalnej produkcji1. W 2018 roku na całym świecie wyprodukowano około 360 milionów ton tworzyw sztucznych2. Tworzywa sztuczne w środowisku naturalnym ulegają degradacji do drobnych cząstek w wyniku procesów chemicznych, fizycznych lub biologicznych3. Ogólnie rzecz biorąc, drobne cząstki plastiku o wielkości <5 mm są definiowane jako mikroplastiki4. Mikroplastik jest również projektowany do konkretnych zastosowań, takich jak mikrogranulki z produktów kosmetycznych5. Jako niemal trwałe zanieczyszczenia, mikroplastiki gromadzą się w środowisku i przyciągają coraz większą uwagę naukowców, decydentów i opinii publicznej1,6. Wcześniejsze badania udokumentowały, że mikroplastiki mogą powodować niekorzystne skutki u ryb, takie jak uszkodzenie przewodu pokarmowego7, neurotoksyczność8, zaburzenia endokrynologiczne9, stres oksydacyjny10 i uszkodzenia DNA11. Jednak do tej pory toksyczność mikroplastiku nie została w pełni ujawniona12,13.

Zarodki zebry dają wiele korzyści eksperymentalnych, w tym małe rozmiary, zewnętrzne zapłodnienie, przezroczystość optyczną i duże lęgi, i są uważane za idealny organizm modelowy do badania in vivo wpływu zanieczyszczeń na ryby we wczesnych stadiach życia. Ponadto, tylko ograniczone ilości substancji badanych są potrzebne do oceny reakcji biologicznych. W tym przypadku zarodki danio pręgowanego są wystawione na działanie różnych stężeń mikrodrobin plastiku (0,1, 1, 10 mg/l) przez 5 dni, a także oceniana jest bioakumulacja i dystrybucja mikrodrobin plastiku w zarodkach/larwach danio pręgowanego. Wynik ten poszerzy naszą wiedzę na temat toksyczności mikroplastików dla ryb, a opisaną tutaj metodę można potencjalnie uogólnić w celu określenia akumulacji i dystrybucji innych rodzajów materiałów fluorescencyjnych we wczesnych stadiach życia danio pręgowanego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dorosłe rybki pręgowane pochodzą z China Danio Pręgowany (Wuhan, Chiny). Eksperymenty przeprowadzono zgodnie z krajowym przewodnikiem "Wytyczne dotyczące zwierząt laboratoryjnych dotyczące etycznego przeglądu dobrostanu zwierząt (GB/T35892-2018).

1. Pobieranie zarodków

  1. Utrzymuj ryby w szklanych zbiornikach o pojemności 20 l z systemem wody wodociągowej z recyrkulacją węgla drzewnego (pH 7,0 ± 0,2) w stałej temperaturze (28 ± 0,5 °C) w fotoperiodzie 14:10 h jasno: ciemno.
  2. Karm ryby dwa razy dziennie naupliami artemii. Zaleca się, aby karma była podawana w maksymalnej ilości 3% masy ryb dziennie i powinna być spożywana w ciągu 5 minut za każdym razem14.
  3. Dobrze rozwinięte dorosłe rybo pręgowane (o długości ciała 3-4 cm) przenieść do zbiornika tarłowego w stosunku jeden samiec na dwie samice w noc poprzedzającą rozmnażanie.
    UWAGA: Następnego ranka ryby zaczynają składać ikrę po nadejściu cyklu świetlnego.
  4. Zbierz jajka za pomocą pipety Pasteura. Kilkakrotnie spłucz 10% roztworem Hanka, a następnie sprawdź pod kątem zapłodnienia pod mikroskopem. Zapłodnione jaja przechodzą okres rozszczepienia po około 2 godzinach od zapłodnienia (HPF) i można je łatwo zidentyfikować15.
  5. Inkubować zapłodnione zarodki w zlewce o pojemności 500 ml zawierającej 200 ml 10% roztworu Hanka z 1% błękitem metylenowym w celu dezynfekcji w temperaturze 28 °C. Nie należy przekraczać dawki nasycania 1 zarodek/2 ml roztworu.
    UWAGA: 10% roztwór Hanka składa się ze 137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,25 mM Na2HPO4, 0,44 mM KH2PO4, 1,3 mM CaCl2, 1,0 mMMgSO4 i 4,2 mM NaHCO3.

2. Przygotowanie zawiesin mikroplastiku

  1. Sonikować roztwór podstawowy zielonych, znakowanych fluorescencyjnie kulek polistyrenowych (10 mg/ml) o średnicy nominalnej 500 nm (wzbudzenie/emisja: 460/500 nm) przez 10 minut.
  2. Rozcieńczyć roztwór podstawowy 10% roztworem Hanka, aby uzyskać pożądane roztwory ekspozycyjne (0,1, 1 i 10 mg/l).
  3. Zawsze przygotowuj roztwory ekspozycyjne mikroplastiku przed ekspozycją.
    UWAGA: Należy zachować ostrożność przy ocenie toksycznego działania mikrodrobin plastiku, ponieważ obecność konserwantów, takich jak azydek sodu, w komercyjnych preparatach cząstek, może być toksyczna dla różnych organizmów 16. W związku z tym dodatki te powinny zostać usunięte lub uwzględnione w kontrolach przed przeprowadzeniem eksperymentu toksyczności.

3. Ekspozycja na mikroplastik

  1. Losowo wybierz 6 nowo zapłodnionych zarodków (4 hpf), a następnie przenieś do każdej studzienki 6-dołkowej płytki zawierającej 5 ml roztworów mikroplastiku o różnych stężeniach. Uwzględnij grupy kontrolne zawierające 10% roztwór Hanka.
    1. Do każdego zabiegu należy użyć trzech studzienek (w sumie 18 zarodków).
  2. Inkubować zarodki w tym samym cyklu światła: ciemności i temperatury, co dorosłe osobniki (patrz 1.2) i obserwować co 12 godzin. Natychmiast usuń zmarłych.
  3. Roztwory mikroplastiku należy odnawiać w 90% co 24 godziny. W okresie ekspozycji ryby nie są karmione.
    UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, wykluwanie się zarodka rozpoczyna się przy 48 hpf i kończy się przy około 72 hpf.

4. Ocena dystrybucji mikroplastiku

  1. Po 24, 48, 72, 96 i 120 godzinach od zapłodnienia losowo wybierz zarodki/larwy (po jednym z każdej z trzech kontrprób) i przepłucz 10% roztworem Hanka.
  2. Przenieś larwy na szalkę Petriego i poddaj działaniu 0,016% trikainy w celu znieczulenia.
    1. Przygotować roztwór podstawowy trikainy: 4 mg proszku tricainy rozpuszcza się w 100 ml podwójnie destylowanej wody i dostosować pH do 7,0 za pomocą Tris-HCl (pH 9,0). Roztwór podstawowy należy przechowywać w zamrażarce.
    2. Przygotuj roztwór roboczy. Rozcieńczyć roztwór podstawowy do pożądanego stężenia (0,016%) 10% roztworem Hanka w temperaturze pokojowej14.
  3. Ułóż zarodki/larwy i przygotuj się do obserwacji.
  4. Obserwuj ryby za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i obrazu za pomocą oprogramowania do obrazowania.
  5. Określ ilościowo intensywność fluorescencji u ryb za pomocą ImageJ.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozkład i akumulacja fluorescencyjnych mikroplastików są pokazane w Rysunek 1 i Tabela 1. W grupie nienarażonej (kontrolnej) nie obserwuje się widocznej fluorescencji. Jednak wokół kosmówki stwierdza się nagromadzenie fluorescencji po ekspozycji na różne stężenia mikroplastików (24 hpf). Zielona fluorescencja jest również wykrywana u larw, a poziomy fluorescencji wydają się wzrastać w sposób zależny od stężenia i czasu. Woreczek żółtkowy, osierdzie i przewód pokarmowy są głó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z wytycznymi dotyczącymi ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych, takimi jak dyrektywa UE 2010/63/UE, zezwolenie na stosowanie zasad etyki zwierząt nie jest obowiązkowe w przypadku eksperymentu z wczesnymi etapami życia danio pręgowanego do momentu, gdy staną się one zdolne do samodzielnego żywienia (5 dni po zapłodnieniu)17. Dla optymalizacji wykorzystania danio pręgowanego ważne są jednak najlepsze praktyki w zakresie dobrostanu, a także na przykład humanitarne metody zniecz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor deklaruje brak konkurencyjnych interesów lub interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (21777145, 22076170) oraz Program dla Naukowców Changjiang i Innowacyjnego Zespołu Badawczego na Uniwersytecie (IRT_17R97).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroskop fluorescencyjnyNikon, JaponiaEclipse Ti-S Zielony
fluorescencyjnie znakowane kulki polistyrenowePhosphorex, USA2103A
TricaineSigma-Aldrich, USAA5040

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. SAPEA (Science Advice for Policy by European Academies). A Scientific Perspective on Microplastics in Nature and Society. , SAPEA. Berlin. (2019).
  2. Plastics Europe. Plastics-the facts 2019. , Plastics Europe. Brussels. (2019).
  3. Andrady, A. L. Microplastics in the marine environment. Marine Pollution Bulletin. 62, 1596-1605 (2011).
  4. Arthur, C., Baker, J., Bamford, H. Proceedings of the International Research Workshop on the Occurrence, Effects and Fate of Microplastic Marine Debris. National Oceanic and Atmospheric Administration Technical Memorandum. , (2009).
  5. Ivleva, N. P., Wiesheu, A. C., Niessner, R. Microplastic in aquatic ecosystems. Angewandte Chemie International Edition. 56, 1720-1739 (2017).
  6. Lu, T., et al. Pollutant toxicology with respect to microalgae and cyanobacteria. Journal of Environmental Sciences. 99, 175-186 (2021).
  7. Huang, J. N., et al. Exposure to microplastics impairs digestive performance, stimulates immune response and induces microbiota dysbiosis in the gut of juvenile guppy (Poecilia reticulata). Science of the Total Environment. 733, 138929(2020).
  8. Prüst, M., Meijer, J., Westerink, R. H. S. The plastic brain: neurotoxicity of micro- and nanoplastics. Particle and Fibre Toxicology. 17, 24(2020).
  9. Jakubowska, M., et al. Effects of chronic exposure to microplastics of different polymer types on early life stages of sea trout Salmo trutta. Science of the Total Environment. 740, 139922(2020).
  10. Qiang, L., Cheng, J. Exposure to polystyrene microplastics impairs gonads of zebrafish (Danio rerio). Chemosphere. 263, 128161(2021).
  11. Hamed, M., Soliman, H. A. M., Osman, A. G. M., Sayed, A. E. H. Antioxidants and molecular damage in Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) after exposure to microplastics. Environmental Science and Pollution Research. 27, 14581-14588 (2020).
  12. Burns, E. E., Boxall, A. B. A. Microplastics in the aquatic environment: Evidence for or against adverse impacts and major knowledge gaps. Environmental Toxicology and Chemistry. 37, 2776-2796 (2018).
  13. Ma, H., Pu, S., Liu, S., Bai, Y., Mandal, S., Xing, B. Microplastics in aquatic environments: Toxicity to trigger ecological consequences. Environmental Pollution. 261, 114089(2020).
  14. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio reio). 4th ed. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
  15. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  16. Pikuda, O., Xu, E. G., Berk, D., Tufenkji, N. Toxicity assessments of micro- and nanoplastics can be confounded by preservatives in commercial formulations. Environmental Science & Technology Letters. 6, 21-25 (2019).
  17. Lidster, K., Readman, G. D., Prescott, M. J., Owen, S. F. International survey on the use and welfare of zebrafish Danio rerio in research. Journal of Fish Biology. 90, 1891-1905 (2017).
  18. Pitt, J. A., et al. Uptake, tissue distribution, and toxicity of polystyrene nanoparticles in developing zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 194, 185-194 (2018).
  19. Lin, S. J., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies. Small. 9, 1608-1618 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zarodki ryby danio przebrakumulacja mikroplastikubioakumulacja mikroplastikudystrybucja mikroplastikumikroskopia fluorescencyjnaekspozycja na mikroplastikkulki polistyrenowetoksykologia wodna

Powiązane artykuły