Artykuł metodologiczny

Barwienie całego wierzchu, wizualizacja i analiza grzybokształtnych, obwodowych i podniebienia kubków smakowych

DOI:

10.3791/62126

⸱

11 lutego 2021

 , 
1Anatomical Sciences and Neurobiology, University of Louisville

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje metody przygotowania tkanek, barwienia i analizy całych grzybów, obwodowych i podniebiennych kubków smakowych, które konsekwentnie dają całe i nienaruszone kubki smakowe (w tym włókna nerwowe, które je unerwiają) i utrzymują relacje między strukturami wewnątrz kubków smakowych a otaczającą je brodawką.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kubki smakowe to zbiory komórek przekazujących smak, wyspecjalizowanych w wykrywaniu podzbiorów bodźców chemicznych w jamie ustnej. Te transdukujące komórki komunikują się z włóknami nerwowymi, które przenoszą tę informację do mózgu. Ponieważ komórki przenoszące smak nieustannie umierają i są wymieniane przez całe dorosłe życie, środowisko kubków smakowych jest zarówno złożone, jak i dynamiczne, co wymaga szczegółowych analiz typów komórek, ich lokalizacji i wszelkich fizycznych relacji między nimi. Szczegółowe analizy były ograniczone ze względu na niejednorodność i gęstość tkanki języka, które znacznie zmniejszyły przepuszczalność przeciwciał. Przeszkody te wymagają protokołów sekcji, które skutkują podziałem kubków smakowych na sekcje, tak że pomiary są tylko przybliżone, a relacje komórkowe są tracone. Aby przezwyciężyć te wyzwania, opisane tutaj metody obejmują zbieranie, obrazowanie i analizowanie całych kubków smakowych i poszczególnych końcowych altan z trzech regionów smakowych: brodawek grzybowych, brodawek okołobrzegich i podniebienia. Zbieranie całych kubków smakowych zmniejsza stronniczość i zmienność techniczną i może być wykorzystywane do raportowania liczb bezwzględnych dla takich cech, jak objętość kubków smakowych, całkowite unerwienie kubków smakowych, liczba komórek transdukcyjnych i morfologia poszczególnych końcowych altan. Aby zademonstrować zalety tej metody, w niniejszym artykule przedstawiono porównania objętości kubków smakowych i unerwienia między grzybowatymi i obwodowymi kubkami smakowymi przy użyciu ogólnego znacznika kubków smakowych i etykiety dla wszystkich włókien smakowych. Przedstawiono również przepływ pracy do wykorzystania znakowania genetycznego neuronów smaku przez rzadkie komórki (z oznakowanymi podzbiorami komórek przekazujących smak). Ten przepływ pracy analizuje struktury poszczególnych altan nerwowych smakowych, liczbę typów komórek oraz fizyczne relacje między komórkami za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Razem te procesy robocze zapewniają nowatorskie podejście do przygotowania tkanek i analizy zarówno całych kubków smakowych, jak i pełnej morfologii ich unerwionych altan.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kubki smakowe to zbiory 50-100 wyspecjalizowanych komórek nabłonkowych, które wiążą podzbiory bodźców chemiczno-smakowych obecnych w jamie ustnej. Powszechnie uważa się, że komórki przekazujące smak istnieją jako typy1,2,3,4,5,6,7,8,9, początkowo oparty na kryteriach mikroskopii elektronowej, które później skorelowano z markerami molekularnymi. Komórki typu II wyrażają fosfolipazę C-beta 2 (PLCβ2)2 i kanał kationowy potencjału receptora przejściowego, podrodzina M członek 51 i obejmują komórki, które transdukują słodkie, gorzkie i umami1,10. Komórki typu III wyrażają anhydrazę węglanową 4 (Car4)11 i białko związane z synaptosomalami 258 i oznaczają komórki, które przede wszystkim reagują na kwaśny smak11. Komórki, które zmieniają zasolenie, nie zostały tak wyraźnie oznaczone12,13,14, ale potencjalnie mogą zawierać komórki typu I, Typu II i Typu III15,16,17,18,19. Środowisko kubków smakowych jest złożone i dynamiczne, biorąc pod uwagę, że komórki transdukujące smak nieustannie zmieniają się przez całe dorosłe życie i są zastępowane przez podstawowych przodków3,20,21. Te komórki przenoszące smak łączą się z pseudo-unipolarnymi włóknami nerwowymi z kolankowatych i zwojów petrosalnych, które przekazują informacje o smaku do pnia mózgu. Neurony te zostały przede wszystkim skategoryzowane na podstawie rodzaju informacji o smaku, które zawierają22,23, ponieważ informacje o ich morfologii były do niedawna nieuchwytne24. Komórki typu II komunikują się z włóknami nerwowymi za pośrednictwem kanałów jonowych białka modulatora homeostazy wapnia 125, podczas gdy komórki typu III komunikują się za pośrednictwem klasycznych synaps8,26. Dalsza charakterystyka komórek kubków smakowych, w tym transdukcja linii typów komórek, czynniki wpływające na ich różnicowanie oraz struktury łączących się trzpieni, są obszarami aktywnych badań.

Badania nad kubkami smakowymi zostały utrudnione przez kilka wyzwań technicznych. Heterogenne i gęste tkanki tworzące język znacznie zmniejszają przepuszczalność przeciwciał dla immunohistochemii27,28,29. Przeszkody te wymusiły protokoły podziału, które skutkują podziałem kubków smakowych na sekcje, tak że pomiary są albo przybliżone na podstawie reprezentatywnych sekcji, albo sumowane między sekcjami. Poprzednio reprezentatywne cienkie przekroje były używane do przybliżania zarówno wartości objętości, jak i liczby komórek transdukcyjnych30. Grubsze przekroje szeregowe pozwalają na obrazowanie wszystkich sekcji kubków smakowych i sumowanie pomiarów z każdej sekcji31. Wycinanie tak grubych odcinków i wybieranie tylko całych kubków smakowych skłania próbkowanie do mniejszych kubków smakowych32,33,34. Szacunki unerwienia nerwów z podzielonych kubków smakowych zostały oparte na analizach liczby pikseli13,35, jeśli w ogóle określono ilościowo36,37,38. Pomiary te całkowicie ignorują strukturę i liczbę poszczególnych altan nerwowych, ponieważ altany są podzielone (i zwykle słabo oznaczone). W końcu, mimo że odklejanie nabłonka pozwala na zabarwienie całych kubków smakowych39,40, usuwa również włókna nerwowe kubków smakowych i może zakłócić normalne relacje między komórkami. W związku z tym badania nad relacjami strukturalnymi w kubkach smakowych były ograniczone z powodu tego zakłócenia spowodowanego podejściami do barwienia.

Kolekcja całej struktury eliminuje potrzebę reprezentatywnych sekcji i pozwala na określenie pomiarów wartości bezwzględnej objętości, liczby komórek i morfologii struktury41. Takie podejście zwiększa również dokładność, ogranicza stronniczość i zmniejsza zmienność techniczną. Ten ostatni element jest ważny, ponieważ kubki smakowe wykazują znaczną zmienność biologiczną zarówno w obrębie 34,42, jak i między regionami43,44, a analizy całych kubków smakowych pozwalają na porównanie bezwzględnej liczby komórek między warunkami kontrolnymi i eksperymentalnymi. Co więcej, zdolność do zbierania nienaruszonych kubków smakowych pozwala na analizę fizycznych relacji między różnymi komórkami transdukującymi i powiązanymi z nimi włóknami nerwowymi. Ponieważ komórki przekazujące smak mogą komunikować się ze sobą45 i komunikują się z włóknami nerwowymi46, te relacje są ważne dla normalnego funkcjonowania. Tak więc warunki utraty funkcji mogą nie być spowodowane utratą komórek, ale zmianami w relacjach komórkowych. Przedstawiono tutaj metodę zbierania całych kubków smakowych w celu osiągnięcia korzyści płynących z pomiarów bezwzględnych w celu udoskonalenia analiz objętościowych zarówno kubków smakowych, jak i ich unerwienia, liczby i kształtów komórek smakowych, a także w celu ułatwienia analiz relacji między komórkami transdukcyjnymi i morfologii trzpieni nerwowych. Przedstawiono również dwa procesy robocze po tej nowatorskiej, całościowej metodzie przygotowania tkanek: 1) do analizy objętości kubków smakowych i całkowitego unerwienia oraz 2) do genetycznego znakowania neuronów smakowych w rzadkich komórkach (z oznakowanymi podzbiorami komórek przekazujących smak) i późniejszych analiz morfologii trzpienia nerwowego smakowego, liczby typów komórek smakowych i ich kształtów oraz wykorzystania oprogramowania do analizy oprogramowania do analizy fizycznych relacji między komórkami transdukującymi a komórkami między transdukującymi komórki i ich altany nerwowe. Razem te procesy robocze zapewniają nowatorskie podejście do przygotowania tkanek oraz do analizy całych kubków smakowych i pełnej morfologii ich unerwionych altan.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie zwierzęta były pod opieką zgodnie z wytycznymi określonymi przez Politykę Publicznej Służby Zdrowia Stanów Zjednoczonych dotyczącą humanitarnej opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych oraz Przewodnik NIH dotyczący opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Myszy Phox2b-Cre (szczep MMRRC 034613-UCD, NP91Gsat/Mmcd) lub myszy TrkBCreER (Ntrk2tm3.1(cre/ERT2)Ddg) wyhodowano z myszami reporterowymi tdTomato (Ai14). AdvillinCreER47 zostały wyhodowane z Phox2b-flpo48 i Ai65. Do wstrzyknięć 5-etynylo-2′-deoksyurydyny (EdU) przygotowano EdU i obliczono dawki zgodnie z Perea-Martinez i wsp.49.

1. Przygotowanie materiałów

  1. Przygotowanie roztworów
    1. Rozpuścić 5,244 g jednozasadowego fosforanu sodu i 23,004 g dwuzasadowego fosforanu sodu w wodzie podwójnie destylowanej (ddH2O) na płytce mieszającej. Doprowadzić pH do 7,4 i doprowadzić całkowitą objętość do uzyskania 1 l 0,2 M buforu fosforanu sodu (PB).
    2. Rozpuścić paraformaldehyd w ddH2O w dygestoriach przez ogrzewanie, mieszając na płytce mieszającej, aż roztwór osiągnie 90 °C. Dodać kroplami 4 M roztwór NaOH w celu usunięcia paraformaldehydu i przefiltrować roztwór za pomocą próżniowej kolby Erlenmeyera i filtra ceramicznego z bibułą filtracyjną. Dodać równą objętość 0,2 M PB i dostosować pH do 7,4, aby uzyskać 4% PFA w 0,1 M PB.

2. Przygotowanie tkanek

  1. Pobieranie tkanek
    1. Ofiarować myszy za pomocą przedawkowania środka znieczulającego roztworem roboczym zawierającym 10 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej i 0,25 ml roztworu podstawowego zawierającego 5 g 2,2,2-tribromoetanolu i 5 ml alkoholu tert-amylowego. Perfuzja przezsercowa z 4% PFA w 0,1 M PB; Usuń języki i podniebienie.
    2. Odizoluj okołokształtne kubki smakowe za pomocą koronalnego cięcia oddzielającego tylny język, za wyniosłością międzytrzonową; odetnij kubki smakowe żyletką; a następnie przetnij przedni język na pół w linii środkowej. Po utrwaleniu przez noc w temperaturze 4 °C z 4% PFA w 0,1 M PB.
    3. Krioprotekcja tkanki w 30% sacharozie przez noc w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Tkankę można zamrozić w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) przy użyciu 2-metylobutanu schłodzonego w zlewce na suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C, jeśli procedura musi zostać przerwana w tym miejscu.
  2. Grzybowe kubki smakowe
    1. Schłodzić 2-metylobutan w zlewce na suchym lodzie w ramach przygotowań do etapu 2.2.8.
    2. Rozmrozić i opłukać język w 0,1 M PB. Umieść połowę przedniego języka zawierającego brodawki grzybowate na szklanym szkiełku pod mikroskopem preparacyjnym.
    3. Użyj kleszczy i nożyczek preparacyjnych, aby usunąć mięsień. Użyj kleszczyków z końcami, aby utrzymać tkankę otwartą, gdy nabłonek językowy jest zakrzywiony, i zapewnij płaską orientację, trzymając ostrza gruboziarnistych nożyczek preparacyjnych równolegle do nabłonka.
    4. Wyrzuć brzuszny, niezrogowaciały nabłonek języka, ponieważ nie zawiera on kubków smakowych.
    5. Użyj cienkich nożyczek do preparacji, aby dokładniej wypreparować spód zrogowaciałego nabłonka.
      UWAGA: Ważne jest, aby przeprowadzić preparację blisko nabłonka, tak aby pozostały mięsień miał jednolitą grubość, a powierzchnia była gładka, aby zapewnić równomierną penetrację przeciwciał. Konsekwencją niejednolitej grubości pozostałego mięśnia będzie nierównomierne przecięcie na kriostacie, z ekspozycją nabłonka w obszarach o mniejszej ilości mięśni i grubszą warstwą mięśni w innych obszarach, co utrudnia penetrację przeciwciał.
    6. Użyj kleszczy z końcami, aby umieścić kawałek nabłonka w formie tkankowej (mięśnią do dołu) i upewnij się, że leży płasko. Gdy tkanka jest płaska, dodaj kroplę OCT do tkanki.
      UWAGA: Biorąc pod uwagę, że czubek języka jest zakrzywiony, może być konieczne wykonanie nacięcia w nabłonku w miejscu, w którym jest zakrzywiony, aby można było ułożyć tkankę płasko
      7. .
    7. Umieść formę do bibułek na metalowej podstawie (uprzednio schłodzonej w suchym lodzie) pod lunetą sekcyjną. Kontynuuj lekkie stukanie w tkankę kleszczami, aż OCT zamarznie, aby upewnić się, że tkanka zamarznie tak płasko, jak to możliwe.
    8. Po zamrożeniu OCT szybko dodaj więcej KOCT, a następnie umieść formę w zlewce z 2-metylobutanem (schłodzonym w suchym lodzie) do zamrożenia.
    9. Sekcja kriostatu
      UWAGA: Kriostat służy do dokładnego usuwania pozostałej tkanki podskórnej, która może hamować penetrację przeciwciał (Rysunek 1).
      1. Zamontuj formy OCT na kriostacie i wytnij odcinki 20 μm. Zbierz każdy fragment i obejrzyj go pod mikroskopem świetlnym, aby ocenić jego bliskość do podstawy nabłonka (Rysunek 1E - H).
      2. Po ogoleniu tkanki od spodu nabłonka należy rozmrozić nabłonek i spłukać go dwukrotnie w 0,1 M PB na shakerze.
  3. Krąż po kubkach smakowych
    1. Za pomocą cięcia koronalnego żyletką oddziel brodawkę obwodową od przedniego języka. Użyj dwóch cięć przystrzałkowych tym samym żyletką, aby usunąć tkankę boczną do brodawki pod lunetą preparacyjną. Umieść brodawkę w formie tkankowej za pomocą kleszczy tak, aby jedna boczna krawędź brodawki obwodowej była skierowana w stronę dolnej części formy tkankowej.
      UWAGA: Tkankę można zamrozić w OCT przy użyciu 2-metylobutanu schłodzonego w zlewce na suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C, jeśli procedura musi zostać przerwana w tym miejscu.
    2. Pokrój tkankę na pływające sekcje o długości 90 μm na kriostacie.
  4. Kubki smakowe na podniebieniu
    1. Przetnij podniebienie twarde przed połączeniem podniebienia miękkiego i twardego (Ryc. 2). Użyj nożyczek, aby oddzielić podniebienie miękkie od leżącej pod spodem tkanki, upewniając się, że wszelkie pozostałe fragmenty kości zostały odcięte. Usuń dodatkowe mięśnie i tkankę łączną.
      UWAGA: Po usunięciu cała tkanka, która pozostanie, będzie składać się z gruczołów i luźnej tkanki łącznej, które są lekko przylegające do spodu podniebienia.
    2. Przytrzymaj podniebienie tępo zakończonymi kleszczami i usuń pozostałe gruczoły i luźną tkankę łączną, delikatnie zeskrobując je żyletką.
      UWAGA: Tkankę można zamrozić w OCT przy użyciu 2-metylobutanu schłodzonego w zlewce na suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C, jeśli procedura musi zostać przerwana w tym miejscu.

3. Barwienie immunohistochemiczne

  1. Umyć chusteczki 0,1 M PB, 3 x 15 min. Umieścić tkanki w probówkach o pojemności 1 ml z roztworem blokującym (3% surowica osła, 0,5% niejonowy środek powierzchniowo czynny) w temperaturze 4 °C przez noc.
  2. Usunąć roztwór blokujący i inkubować tkankę w przeciwciałie pierwszorzędowym (króliczym anty-PCLβ2) w roztworze przeciwciała (0,1 M PB, 0,5% niejonowy środek powierzchniowo czynny) przez 5 dni w temperaturze 4 °C.
  3. Przemyć 0,1 M PB, 4 x 15 min każde przemycie i inkubować w wtórnym przeciwciałie przeciwko królikowi 488 (1:500) w roztworze przeciwciała przez 2 dni w temperaturze 4 °C.
  4. Przemyć 0,1 M PB, 4 x 15 min każde płukanie i zablokować 5% normalną surowicą króliczą w roztworze przeciwciał.
  5. Przemyć 0,1 M PB, 4 x 15 min. Inkubować z przeciwciałem blokującym osła (20 μg/ml) w roztworze przeciwciał przez 2 dni w temperaturze 4 °C.
  6. Przemyć 0,1 M PB, 4 x 15 min każde przemycie, a następnie inkubować z pierwszorzędowym przeciwciałem dsRed (królikiem) sprzężonym ze znacznikiem fluorescencyjnym (zgodnie z instrukcjami producenta) w roztworze przeciwciała przez 5 dni w temperaturze 4 °C.
  7. Przemyć 0,1 M PB, 4 x 15 min każde przemycie, a następnie inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym (kozie przeciwciało anty-Car4 (1:500)) w roztworze przeciwciała przez 5 dni w temperaturze 4 °C.
  8. Umyć 0,1 M PB, 4 x 15 min każde pranie. Inkubować z wtórnym przeciwciałem przeciwko kozom 647 (1:500) w roztworze przeciwciała przez 2 dni w temperaturze 4 °C.
  9. Przemyć 0,1 M PB, 4 x 15 min każde płukanie, zamontować (nabłonkiem do góry) w wodnym podłożu montażowym i umieścić szkiełko nakrywkowe na przekroju tkanki.
    UWAGA: W przypadku stosowania przeciwciał różnych gatunków, jak w przypadku tylko keratyny-8 i dsRed, przed przejściem do kroku 3.9 dodaj wszystkie przeciwciała pierwszorzędowe do roztworu przeciwciała w kroku 3.2 i wszystkie przeciwciała drugorzędowe w kroku 3.3.

4. Obrazowanie konfokalne i dekonwolucja

  1. Rejestruj obrazy konfokalne za pomocą mikroskopu konfokalnego z obiektywem 60x (apertura numeryczna = 1,40), 4 ms/piksel, zoom 3, Kalman 2 i rozmiar 1024 x 1024. Wybierz rozmiar kroku 0,47 mm wzdłuż osi z. Aby uchwycić unerwienie brodawki, użyj powiększenia 2,5, jeśli pole widzenia z zoomem 3 jest zbyt wąskie, aby uchwycić całe unerwienie brodawki.
  2. Aby zdekonwoluować obrazy, należy pamiętać, że niektóre ustawienia zostaną automatycznie zaimportowane wraz z obrazem, dlatego należy wypełnić pozostałe szczegóły dotyczące modalności, obiektywu, apertury numerycznej, medium immersyjnego, medium próbki i fluoroforów uchwyconych na obrazie. Następnie wybierz opcję Dekonwolucja 3D.

5. Analiza obrazu

  1. Kubek smakowy i objętość unerwienia
    1. Zaimportuj zdekonwolucyjne stosy obrazów do oprogramowania do analizy obrazu opartego na pikselach (patrz tabela materiałów), aby określić objętość kubków smakowych i objętość całkowitego unerwienia w kubku smakowym.
      1. Usuń zaznaczenie opcji Głośność w menu głównym Obiekt.
      2. Wybierz opcję Dodaj nowe powierzchnie z menu Obiekt. Wybierz opcję Pomiń automatyczne tworzenie, edytuj ręcznie, a następnie wybierz pozycję Kontur.
      3. Kliknij Wybierz i obserwuj strzałkę pojawiającą się jako +, aby pomóc prześledzić granicę kubka smakowego. Przesuń krajalnicę i obrysuj kubki smakowe w każdej sekcji optycznej. Po zakończeniu tworzenia konturów kliknij przycisk Utwórz powierzchnię.
      4. Zwróć uwagę na to, że obiekt głośności kubków smakowych pojawia się teraz w głównym menu obiektów. Znajdź objętość kubka smakowego w obszarze Narzędzia.
    2. Objętość unerwienia w kubku smakowym
      1. Wybierz ikonę ołówka pod obiektem kubka smakowego, a następnie wybierz opcję Maskuj wszystko.
      2. Z menu rozwijanego wybierz kanał fluorescencyjny, który odpowiada etykiecie włókna nerwowego. Zaznacz opcję Utwórz zduplikowany kanał.
      3. Zaznacz opcję Ustaw woksele na zewnątrz powierzchni na: i wpisz 0 w polu.
      4. Obserwuj nowy kanał pojawiający się w oknie Regulacja wyświetlacza, który jest niezmienioną kopią kanału fluorescencyjnego wybranego w kubku smakowym.
      5. Z menu głównego Obiekt wybierz opcję Utwórz nową powierzchnię. Odznacz Pomiń automatyczne tworzenie, edytuj ręcznie.
      6. Kliknij dwukrotnie niebieską strzałkę, aby przejść do następnego kroku.
      7. Kliknij Usuń, a następnie kliknij zieloną podwójną strzałkę, aby zakończyć powierzchnię, która reprezentuje objętość włókien nerwowych obecnych w kubku smakowym. Aby znaleźć wartość objętości, wybierz Narzędzia w menu Obiekt włókna nerwowego i wybierz Objętość z menu rozwijanego.
    3. Objętość unerwienia do brodawki
      1. Utworzyć objętość kubka smakowego zgodnie z opisem w sekcji 5.1.
      2. Wybierz ikonę ołówka pod obiektem kubka smakowego, a następnie wybierz opcję Maskuj wszystko.
      3. Z menu rozwijanego wybierz kanał fluorescencyjny, który odpowiada etykiecie włókna nerwowego. Zaznacz opcję Utwórz zduplikowany kanał.
      4. Zaznacz opcję Ustaw woksele wewnątrz powierzchni na: i wpisz 0 w polu. Kliknij przycisk OK.
      5. Wygeneruj powierzchnię, klikając pozycję Dodaj nową powierzchnię. Wybierz opcję Segmentuj tylko obszar zainteresowania.
      6. Kliknij niebieską strzałkę i zwiększ wartość Z, tak aby obszar zainteresowania zaczynał się u podstawy kubka smakowego.
      7. Kliknij dwukrotnie niebieską strzałkę, aby przejść do następnego kroku.
      8. Kliknij Usuń, a następnie kliknij zieloną podwójną strzałkę, aby zakończyć powierzchnię, która reprezentuje objętość unerwienia do brodawki. Aby znaleźć wartość objętości, wybierz Narzędzia w menu Obiekt włókna nerwowego i wybierz Objętość z menu rozwijanego.
    4. Analiza styku trzpienia zacisku
      1. Przygotowanie obrazu
        1. Przejdź do menu Edycja i wybierz opcję Przytnij 3D. Przytnij obraz ze wszystkich stron, usuwając przestrzeń poza kubkiem smakowym.
          UWAGA: Przytnij jak najbliżej kubka smakowego, nie usuwając żadnej istotnej struktury - nadmiar obrazu wydłuży czas przetwarzania.
        2. Wybierz Edytuj z menu głównego, kliknij Zmień typ danych. Wybierz Do: 32-bitowy zmiennoprzecinkowy z menu rozwijanego.
        3. Wybierz opcję Dodaj nowe powierzchnie z menu Obiekt. Kliknij Pomiń automatyczne tworzenie, edytuj ręcznie, wybierz Kontur, a następnie przeciągnij pozycję plasterka w prawo, aby znaleźć całkowitą liczbę plasterków optycznych.
        4. Wygeneruj woksele izometryczne i upewnij się, że woksele nie są prostokątami (0,0691 x 0,0691 x 0,474) jako XxYxZ, odpowiednio, woksele mają wymiary 0,0691 x 0,0691 x 0,0691, dzieląc prostokąty na sześciany o identycznych wartościach intensywności fluorescencji jak oryginalny, prostokątny woksel. Wybierz opcję Właściwości obrazu. Następnie podziel wartość Z dla rozmiaru woksela przez wartość X lub Y (= 0,474/0,0691) i pomnóż tę wartość przez liczbę plasterków (sekcji optycznych) znalezionych w poprzednim kroku.
        5. Wróć do opcji Edytuj w menu głównym i wybierz opcję Ponowne próbkowanie 3D.
        6. Zastąp wartość Z (liczbę wycinków) nowo obliczoną wartością.
      2. Tworzenie automatycznych powierzchni na podstawie fluorescencji
        1. Kliknij ponownie Dodaj nową powierzchnię, aby dodać nową powierzchnię, usuń zaznaczenie opcji Segmentuj tylko obszar zainteresowania i kliknij przycisk Dalej.
        2. Z menu rozwijanego Kanał źródłowy wybierz kanał dla jednego z typów komórek zmieniających smak. Usuń zaznaczenie opcji Wygładzanie i przejdź do następnego kroku.
        3. Nie zmieniaj niczego na następnym ekranie, który pokazuje zakres intensywności fluorescencji obecnych na obrazie. Kliknij ponownie niebieską strzałkę na dole, aby przejść do następnego kroku.
        4. Kliknij Usuń, a następnie kliknij zieloną podwójną strzałkę, aby zakończyć powierzchnię.
        5. Przejdź do menu Obiekt po lewej stronie ekranu, gdzie pojawi się ukończona powierzchnia komórki i będzie nazywana czymś ogólnym, takim jak Powierzchnia 2. Kliknij dwukrotnie nazwę powierzchni, aby nadać jej nazwę zgodnie z tym, co reprezentuje etykieta.
          UWAGA: W tym przypadku wygenerowana powierzchnia jest oparta na komórce oznaczonej przez PLCß2.
        6. Jeśli zamiast powierzchni znajdują się kropki, w menu w lewym dolnym rogu kliknij Powierzchnia zamiast Punkt środkowy. Następnie kliknij OK po wyświetleniu monitu.
        7. Powtórzyć kroki 5.3.2.1-5.3.2.5 dla pozostałych markerów komórkowych przenoszących smak i markera włókien nerwowych.
        8. Zapisz (wyeksportuj) postęp.
        9. Kliknij typ komórki Powierzchnia w menu głównym. W menu tego obiektu kliknij Narzędzia, a następnie kliknij Transformacja odległości.
        10. Poczekaj, aż pojawi się wyskakujące okienko o nazwie XTDistanceTransformation. Wybierz opcję Outside Surface Object (Obiekt na zewnątrz powierzchni). Zanotuj nowy kanał, który pojawia się w menu Dopasowanie wyświetlania o nazwie Nazwa odległości do powierzchni.
        11. Wybierz powierzchnię Nerve Fiber (Włókno nerwowe) z menu Object (Obiekt). Kliknij ikonę ołówka, a następnie Zamaskuj wszystko.
        12. Z wyświetlonego menu rozwijanego wybierz nazwę nowego kanału Odległość do powierzchni. Zanotuj nowy kanał, który pojawia się w oknie Dopasowanie wyświetlania o nazwie Zamaskowana odległość od powierzchni.
        13. Utwórz nowy obiekt, korzystając z głównego menu Obiekt. Usuń zaznaczenie opcji Segmentuj tylko obszar zainteresowania i kliknij niebieską strzałkę. Wybierz kanał Zamaskowana odległość do PLCß2 i odznacz opcję Wygładzony.
        14. Na następnym ekranie sprawdź, czy są jakieś obszary, w których komórki przenoszące smak znajdują się w najmniejszej odległości od włókien nerwowych dostrzegalnych przez to oprogramowanie. Aby to zrobić, ustaw limit 0,01-0,11 μm, aby sprawdzić, czy fluorescencja komórek receptorowych znajduje się tak blisko włókien nerwowych.
        15. Wpisz 0,01 w zielonym polu po lewej stronie, aby ustawić dolny próg, naciśnij Tab. Następnie kliknij czerwony przycisk i wpisz 0.11, aby ustawić górny próg. Naciśnij Tab, a następnie kliknij niebieską strzałkę u dołu, aby przejść do następnego kroku.
        16. Kliknij Usuń, a następnie zieloną podwójną strzałkę, aby zakończyć.
        17. Zmień nazwę tej powierzchni w ciągu 0.01-0.11 PLCß2 w menu Obiekt. Wybierz w zakresie 0,01 - 0,11 powierzchni PLCß2 w menu Obiekt.
        18. Wybierz ołówek, a następnie kliknij Maskuj wszystko. Wybierz kanał czerwony (światłowód nerwowy) z menu rozwijanego i kliknij OK. Zanotuj nowy kanał, który pojawia się w oknie Korekta wyświetlania o nazwie Masked CHS2.
        19. Kliknij na nazwę kanału; zmień nazwę kanału w zakresie 0.01 - 0.11 PLCß2.
          UWAGA: Jest to kanał fluorescencyjny, który reprezentuje duplikat kanału czerwonej fluorescencji obecnego na utworzonej powierzchni.
        20. Kliknij biały na środku selektora kolorów. Wybierz kolor, który kontrastuje z kolorami konstrukcji.
        21. Na tym etapie wyeksportuj (tj. zapisz) plik.
        22. Powtórzyć kroki 5.4.2.9-5.4.2.21 dla innych markerów komórkowych wywołujących smak.
        23. Na tym etapie wyeksportuj (tj. zapisz) plik.
          UWAGA: Aby przeanalizować bliskość jednego oznakowanego typu komórki do drugiego, po prostu zastąp powierzchnię włókna nerwowego w kroku 5.4.2.11 (i kolejnych krokach) obiektem zainteresowania i równoważnymi komponentami, które odnoszą się do każdego kolejnego kroku.

6. Rekonstrukcja trzpienia neuronów i kwantyfikacja bezwzględnej liczby komórek

  1. Śledzenie i analiza trzpienia terminala
    1. Otwórz plik obrazu z dekonwolucją w oprogramowaniu do analizy obrazów wektorowych 3D (patrz tabela materiałów), wybierz opcję Śledź, kliknij Neuron, a następnie kliknij pozycję Dendryt.
    2. Przewiń do podstawy kubka smakowego w stosie obrazów. Śledź każde włókno do końca, przewijając stos obrazów.
    3. Gdy na końcu gałęzi kliknij prawym przyciskiem myszy koniec i wybierz Zakończenie. W punktach rozgałęzień kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Bifurcating Node.
      UWAGA: Umożliwia to śledzenie jednej gałęzi do końca, a następnie powrót do punktu rozwidlenia i śledzenie drugiej gałęzi za pomocą programu rozpoznającego, że to śledzenie nadal dotyczy tego samego neuronu.
    4. Zapisz plik danych jako plik . DAT, który można następnie otworzyć do analizy w oprogramowaniu do analizy obrazów wektorowych 3D.

7. Kwantyfikacja liczby komórek

  1. Określ ilościowo znakowane komórki kubków smakowych w dowolnym pakiecie oprogramowania do analizy obrazu, o ile na poziomie jądrowym można umieścić odrębne markery do transdukcji typów komórek zakotwiczonych w pozycji z.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Barwienie nabłonka językowego przeciwciałami przeciwko dsRed i keratynie-8 (ogólny marker kubków smakowych) oznaczone zarówno całymi kubkami smakowymi, jak i całym unerwieniem kubków smakowych w Phox2b-Cre:tdMyszy pomidorowe50,51 (Rysunek 3A). Obrazowanie tych kubków smakowych od ich porów do podstawy dało obrazy o najwyższej rozdzielczości w płaszczyźnie xy (Rysunek 3A,B). Funkcja konturu programu do obraz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowanie podejścia do konsekwentnego zbierania i barwienia całych kubków smakowych z trzech regionów smakowych jamy ustnej (grzybowatych, okołosmakowych i podniebienia) zapewnia znaczące ulepszenia w analizie komórek transdukujących smak, śledzeniu nowo włączonych komórek, unerwieniu i związkach między tymi strukturami. Ponadto ułatwia lokalizację potencjalnego wtórnego markera neuronu zarówno w obrębie znakowanej populacji, jak i poza nią50. Jest to szczególnie istotne, biorąc pod uwagę, że br...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Kavisca Kuruparanantha za jej wkład w barwienie tkanek i obrazowanie okołokształtnych kubków smakowych, Jennifer Xu za barwienie i obrazowanie unerwienia brodawki, Kaytee Horn za opiekę nad zwierzętami i genotypowanie, oraz Liqun Ma za barwienie tkanek kubków smakowych podniebienia miękkiego. Projekt ten był wspierany przez R21 DC014857 i R01 DC007176 do R.F.K oraz F31 DC017660 do L.O.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2,2,2-tribromoetanolACROS OrganicsAC421430100
2-metylobutanACROS126470025
AffiniPure Fab Fragment Osioł Anty-Królik IgGJackson ImmunoResearch711-007-00315,5μ L/mL
Alexa Fluor® 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgGJackson Immuno Research712-605-150(1:500)
Oprogramowanie AutoQuant X3  Media Cybernetyka
Kleszcze z końcamiNarzędzia do nauki pięknej FST 91100-12
Click-iT&handel; Zestaw do proliferacji komórek Plus EdUSondy molekularneC10637Postępuj zgodnie z instrukcjami zestawu 
CoverglassMarienfeld107242
Cytokeratin-8Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), (RRID: AB_531826) Supernatant Troma1(1:50, przechowywać w 4° C)
Nożyczki preparacyjne (grube)RobozRS-5619
(drobne)MoriaMC19B
Donkey anty-Rabbit IgG (H + L) Wysoce adsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA21206(1:500)
Osioł anty-królik, Alexa Fluor® 555ThermoFisher ScientificA31572(1:500)
DyLight™ 405 AffiniPure Fab Fragment bydlęcy anty-kozi IgGJackson Immuno Research805-477-008(1:500)
Fluoromount GSouthern Biotech0100-01
Szkiełkaszklane Fisher Scientific (zjeżdżalnie Superfrost Plus Miscroscope)12-550-15
Kozia anty-Car4R& D Systems AF2414(1:500)
Identyfikator Płaszczyzna bitowa do analizy obrazu oparte na
pikselach Neurolucida 360 + ExplorerMBF BiosciencesOprogramowanie
Normalna surowica osłaJackson Immuno Research017-000-121
Normalna surowica królika Equitech-Bio, IncSR30
Olympus FV1000(laser multiargonowy o długościach fal 458, 488, 515 i dodatkowe lasery HeNe emitujące 543 i 633)
ParaformaldehydEMD PX0055-34% w 0,1 M PB
Królik anty-dsRedLiving Colors DsRed Przeciwciało poliklonalne; Clontech Clontech Laboratories, Inc. (632496)632496(1:500)
Królik anty-PLCβ 2 Santa Cruz BiotechnologyCat# sc-206(1:500)
Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodnyFisher ScientificBP332-500
Monopodstawowy fosforan soduFisher ScientificBP330-500
alkohol tert-amylowyAldrich Chemical Company8.06193
Formy tkankoweMikroskopia elektronowa Nauki70180
Tissue-Tek®  O.C.T. CompoundSakura4583
Triton X-100BIO-RAD#161-0407
Zenon™ Alexa Fluor&handel; 555 Zestaw do etykietowania IgG królikaThermoFisher ScientificZ25305Postępuj zgodnie z instrukcjami zestawu 
Nożyczki do preparowania oprogramowanie do analizy obrazów wektorowych 3D

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clapp, T. R., Medler, K. F., Damak, S., Margolskee, R. F., Kinnamon, S. C. Mouse taste cells with G protein-coupled taste receptors lack voltage-gated calcium channels and SNAP-25. BMC Biology. 4 (1), 7(2006).
  2. Clapp, T. R., Yang, R., Stoick, C. L., Kinnamon, S. C., Kinnamon, J. C. Morphologic characterization of rat taste receptor cells that express components of the phospholipase C signaling pathway. The Journal of Comparative Neurology. 468 (3), 311-321 (2004).
  3. Delay, R. J., Roper, S. D., Kinnamon, J. C. Ultrastructure of mouse vallate taste buds: II. Cell types and cell lineage. The Journal of Comparative Neurology. 253 (2), 242-252 (1986).
  4. Finger, T. E. Cell types and lineages in taste buds. Chemical Senses. 30, Supplement 1 54-55 (2005).
  5. Kataoka, S., et al. The candidate sour taste receptor, PKD2L1, is expressed by type III taste cells in the mouse. Chemical Senses. 33 (3), 243-254 (2008).
  6. Murray, R. Fine structure of gustatory cells in rabbit taste buds. Journal of Ultrastructure Research. 27 (5-6), 444(1969).
  7. Murray, R. G., Murray, A. Fine structure of taste buds of rabbit foliate papillae. Journal of Ultrastructure Research. 19 (3), 327-353 (1967).
  8. Yang, R., Crowley, H. H., Rock, M. E., Kinnamon, J. C. Taste cells with synapses in rat circumvallate papillae display SNAP-25-like immunoreactivity. The Journal of Comparative Neurology. 424 (2), 205-215 (2000).
  9. Yee, C. L., Yang, R., Böttger, B., Finger, T. E., Kinnamon, J. C. "Type III" cells of rat taste buds: Immunohistochemical and ultrastructural studies of neuron-specific enolase, protein gene product 9.5, and serotonin. Journal of Comparative Neurology. 440 (1), 97-108 (2001).
  10. Zhang, Y., et al. Coding of sweet, bitter, and umami tastes. Cell. 112 (3), 293-301 (2003).
  11. Chandrashekar, J., et al. The taste of carbonation. Science. 326 (5951), 443-445 (2009).
  12. Oka, Y., Butnaru, M., Von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
  13. Stratford, J. M., Larson, E. D., Yang, R., Salcedo, E., Finger, T. E. 5-HT3A-driven green fluorescent protein delineates gustatory fibers innervating sour-responsive taste cells: A labeled line for sour taste. Journal of Comparative Neurology. 525 (10), 2358-2375 (2017).
  14. Baumer-Harrison, C., et al. Optogenetic stimulation of type I GAD65(+) cells in taste buds activates gustatory neurons and drives appetitive licking behavior in sodium-depleted mice. The Journal of Neuroscience. 40 (41), 7795-7810 (2020).
  15. Nomura, K., Nakanishi, M., Ishidate, F., Iwata, K., Taruno, A. All-electrical Ca(2+)-independent signal transduction mediates attractive sodium taste in taste buds. Neuron. 106 (5), 816-829 (2020).
  16. Ohmoto, M., Jyotaki, M., Foskett, J. K., Matsumoto, I. Sodium-taste cells require Skn-1a for generation and share molecular features with sweet, umami, and bitter taste cells. eneuro. 7 (6), (2020).
  17. Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds. The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).
  18. Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
  19. Lewandowski, B. C., Sukumaran, S. K., Margolskee, R. F., Bachmanov, A. A. Amiloride-insensitive salt taste is mediated by two populations of type III taste cells with distinct transduction mechanisms. The Journal of Neuroscience. 36 (6), 1942-1953 (2016).
  20. Beidler, L. M., Smallman, R. L. Renewal of cells within taste buds. The Journal of Cell Biology. 27 (2), 263-272 (1965).
  21. Hamamichi, R., Asano-Miyoshi, M., Emori, Y. Taste bud contains both short-lived and long-lived cell populations. Neuroscience. 141 (4), 2129-2138 (2006).
  22. Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139 (2), 234-244 (2009).
  23. Spector, A. C., Travers, S. P. The representation of taste quality in the mammalian nervous system. Behavoiral and Cognitive Neuroscience Reviews. 4 (3), 143-191 (2005).
  24. Huang, T., Ohman, L. C., Clements, A. V., Whiddon, Z. D., Krimm, R. F. Variable branching characteristics of peripheral taste neurons indicates differential convergence. bioRxiv. , (2020).
  25. Taruno, A., et al. CALHM1 ion channel mediates purinergic neurotransmission of sweet, bitter and umami tastes. Nature. 495 (7440), 223-226 (2013).
  26. Kinnamon, J. C., Taylor, B. J., Delay, R. J., Roper, S. D. Ultrastructure of mouse vallate taste buds. I. Taste cells and their associated synapses. The Journal of comparative neurology. 235 (1), 48-60 (1985).
  27. Dando, R., et al. A permeability barrier surrounds taste buds in lingual epithelia. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 308 (1), 21-32 (2015).
  28. Mistretta, C. M. Permeability of tongue epithelium and its relation to taste. American Journal of Physiology. 220 (5), 1162-1167 (1971).
  29. Michlig, S., Damak, S., Le Coutre, J. Claudin-based permeability barriers in taste buds. The Journal of Comparative Neurology. 502 (6), 1003-1011 (2007).
  30. Kinnamon, S. C., Finger, T. E. Recent advances in taste transduction and signaling. F1000Research. 8, 2117(2019).
  31. Meng, L., Huang, T., Sun, C., Hill, D. L., Krimm, R. BDNF is required for taste axon regeneration following unilateral chorda tympani nerve section. Experimental Neurology. 293, 27-42 (2017).
  32. Meng, L., Ohman-Gault, L., Ma, L., Krimm, R. F. Taste bud-derived BDNF is required to maintain normal amounts of innervation to adult taste buds. eneuro. 2 (6), (2015).
  33. Tang, T., Rios-Pilier, J., Krimm, R. Taste bud-derived BDNF maintains innervation of a subset of TrkB-expressing gustatory nerve fibers. Molecular and Cellular Neuroscience. 82, 195-203 (2017).
  34. Zhang, G. H., Zhang, H. Y., Deng, S. P., Qin, Y. M. Regional differences in taste bud distribution and -gustducin expression patterns in the mouse fungiform papilla. Chemical Senses. 33 (4), 357-362 (2008).
  35. Huang, T., Ma, L., Krimm, R. F. Postnatal reduction of BDNF regulates the developmental remodeling of taste bud innervation. Developmental Biology. 405 (2), 225-236 (2015).
  36. Nosrat, I. V., Margolskee, R. F., Nosrat, C. A. Targeted taste cell-specific overexpression of brain-derived neurotrophic factor in adult taste buds elevates phosphorylated TrkB protein levels in taste cells, increases taste bud size, and promotes gustatory innervation. Journal of Biological Chemistry. 287 (20), 16791-16800 (2012).
  37. Liebl, D. J., Mbiene, J. -P., Parada, L. F. NT4/5 mutant mice have deficiency in gustatory papillae and taste bud formation. Developmental Biology. 213 (2), 378-389 (1999).
  38. Kumari, A., Yokota, Y., Li, L., Bradley, R. M., Mistretta, C. M. Species generalization and differences in Hedgehog pathway regulation of fungiform and circumvallate papilla taste function and somatosensation demonstrated with sonidegib. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
  39. Venkatesan, N., Boggs, K., Liu, H. X. Taste bud labeling in whole tongue epithelial sheet in adult mice. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (4), 332-337 (2016).
  40. Meisel, C. T., Pagella, P., Porcheri, C., Mitsiadis, T. A. Three-dimensional imaging and gene expression analysis upon enzymatic isolation of the tongue epithelium. Frontiers in Physiology. 11, 825(2020).
  41. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
  42. Guagliardo, N. A., Hill, D. L. Fungiform taste bud degeneration in C57BL/6J mice following chorda-lingual nerve transection. The Journal of Comparative Neurology. 504 (2), 206-216 (2007).
  43. Ohtubo, Y., Yoshii, K. Quantitative analysis of taste bud cell numbers in fungiform and soft palate taste buds of mice. Brain Research. 1367, 13-21 (2011).
  44. Ogata, T., Ohtubo, Y. Quantitative analysis of taste bud cell numbers in the circumvallate and foliate taste buds of mice. Chemical Senses. 45 (4), 261-273 (2020).
  45. Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).
  46. Finger, T. E. ATP signaling is crucial for communication from taste buds to gustatory nerves. Science. 310 (5753), 1495-1499 (2005).
  47. Lau, J., et al. Temporal control of gene deletion in sensory ganglia using a tamoxifen-inducible Advillin-CreERT2 recombinase mouse. Molecular Pain. 7 (1), 100(2011).
  48. Hirsch, M. -R., D'Autréaux, F., Dymecki, S. M., Brunet, J. -F., Goridis, C. APhox2b::FLPotransgenic mouse line suitable for intersectional genetics. genesis. 51 (7), 506-514 (2013).
  49. Perea-Martinez, I., Nagai, T., Chaudhari, N. Functional cell types in taste buds have distinct longevities. PLoS ONE. 8 (1), 53399(2013).
  50. Ohman-Gault, L., Huang, T., Krimm, R. The transcription factor Phox2b distinguishes between oral and non-oral sensory neurons in the geniculate ganglion. Journal of Comparative Neurology. 525 (18), 3935-3950 (2017).
  51. Dvoryanchikov, G., et al. Transcriptomes and neurotransmitter profiles of classes of gustatory and somatosensory neurons in the geniculate ganglion. Nature Communications. 8 (1), (2017).
  52. Whitehead, M. C., Ganchrow, J. R., Ganchrow, D., Yao, B. Organization of geniculate and trigeminal ganglion cells innervating single fungiform taste papillae: a study with tetramethylrhodamine dextran amine labeling. Neuroscience. 93 (3), 931-941 (1999).
  53. Suemune, S., et al. Trigeminal nerve endings of lingual mucosa and musculature of the rat. Brain Research. 586 (1), 162-165 (1992).
  54. Rutlin, M., et al. The cellular and molecular basis of direction selectivity of Aδ-LTMRs. Cell. 159 (7), 1640-1651 (2014).
  55. Abraira, V. E., Ginty, D. D. The sensory neurons of touch. Neuron. 79 (4), 618-639 (2013).
  56. Feng, P., Huang, L., Wang, H. Taste bud homeostasis in health, disease, and aging. Chemical Senses. 39 (1), 3-16 (2014).
  57. Cooper, K. W., et al. COVID-19 and the chemical senses: supporting players take center stage. Neuron. 107 (2), 219-233 (2020).
  58. Barlow, L. A. Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development. Development. 142 (21), 3620-3629 (2015).
  59. Roper, S. D. Taste buds as peripheral chemosensory processors. Seminars in Cell & Developmental Biology. 24 (1), 71-79 (2013).
  60. Ma, H., Yang, R., Thomas, S. M., Kinnamon, J. C. BMC. Neuroscience. 8 (1), 5(2007).
  61. Kinnamon, J. C., Sherman, T. A., Roper, S. D. Ultrastructure of mouse vallate taste buds: III. Patterns of synaptic connectivity. The Journal of Comparative Neurology. 270 (1), 1-10 (1988).
  62. Romanov, R. A., et al. Chemical synapses without synaptic vesicles: Purinergic neurotransmission through a CALHM1 channel-mitochondrial signaling complex. Science Signaling. 11 (529), 1815(2018).
  63. Dani, A., Huang, B., Bergan, J., Dulac, C., Zhuang, X. Superresolution imaging of chemical synapses in the brain. Neuron. 68 (5), 843-856 (2010).
  64. Vandenbeuch, A., Clapp, T. R., Kinnamon, S. C. Amiloride-sensitive channels in type I fungiform taste cells in mouse. BMC Neuroscience. 9 (1), 1(2008).
  65. Bartel, D. L., Sullivan, S. L., Lavoie, ÉG., Sévigny, J., Finger, T. E. Nucleoside triphosphate diphosphohydrolase-2 is the ecto-ATPase of type I cells in taste buds. The Journal of Comparative Neurology. 497 (1), 1-12 (2006).
  66. Wilson, C. E., Vandenbeuch, A., Kinnamon, S. C. Physiological and behavioral responses to optogenetic stimulation of PKD2L1+ type III taste cells. eneuro. 6 (2), (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza kubk w smakowychbrodawki grzybiastebrodawki waleczkowatedrzewa nerw w smakowychkom rki transdukcyjne smakusekcja tkanekbarwienie przeciwcia amianaliza obrazu

Powiązane artykuły