Artykuł metodologiczny

Test na płytce do pomiaru endogennego uwalniania monoamin w ostrych wycinkach mózgu

2.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62127

⸱

11 sierpnia 2021

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, School of Medicine, Universidad de Atacama, 2Department of Molecular, Cellular, and Biomedical Sciences, City University of New York School of Medicine at City College, 3Department of Pharmacology and Therapeutics, University of Florida College of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ta metoda wprowadza prostą technikę wykrywania endogennego uwalniania monoamin za pomocą ostrych wycinków mózgu. Zestaw wykorzystuje 48-dołkową płytkę zawierającą uchwyt na tkankę do uwalniania monoamin. Uwolniona monoamina jest analizowana za pomocą HPLC w połączeniu z detekcją elektrochemiczną. Ponadto technika ta zapewnia metodę przesiewową w celu odkrywania leków.

Streszczenie

Neuroprzekaźniki monoaminowe są związane z licznymi dolegliwościami neurologicznymi i psychiatrycznymi. Modele zwierzęce takich stanów wykazały zmiany w dynamice uwalniania i wychwytu neuroprzekaźników monoaminowych. Do badania funkcji monoamin wymagane są technicznie złożone metody, takie jak elektrofizjologia, woltamperometria cykliczna Fast Scan (FSCV), obrazowanie, mikrodializa in vivo, optogenetyka lub wykorzystanie radioaktywności. Przedstawiona tutaj metoda jest zoptymalizowanym dwuetapowym podejściem do wykrywania uwalniania monoamin w ostrych wycinkach mózgu przy użyciu 48-dołkowej płytki zawierającej uchwyty tkankowe do badania uwalniania monoamin oraz wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej z detekcją elektrochemiczną (HPLC-ECD) do pomiaru uwalniania monoamin. Krótko mówiąc, skrawki mózgu szczura zawierające obszary zainteresowania, w tym korę przedczołową, hipokamp i prążkowie grzbietowe, uzyskano za pomocą krajalnicy do tkanek lub wibratomu. Te obszary zainteresowania wypreparowano z całego mózgu i inkubowano w natlenionym buforze fizjologicznym. Żywotność badano przez cały okres eksperymentu za pomocą testu bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolium (MTT). Ostro wypreparowane obszary mózgu inkubowano w różnych warunkach lekowych, o których wiadomo, że indukują uwalnianie monoamin przez transporter (amfetaminę) lub poprzez aktywację egzocytotycznego uwalniania pęcherzykowego (KCl). Po inkubacji produkty uwolnione w supernatancie zebrano i przeanalizowano za pomocą systemu HPLC-ECD. W tym przypadku podstawowe uwalnianie monoamin jest wykrywane przez HPLC z ostrych wycinków mózgu. Dane te potwierdzają wcześniejsze wyniki in vivo i in vitro, które wykazały, że AMPH i KCl indukują uwalnianie monoamin. Metoda ta jest szczególnie przydatna do badania mechanizmów związanych z uwalnianiem zależnym od transportera monoamin i daje możliwość badania przesiewowego związków wpływających na uwalnianie monoamin w szybki i tani sposób.

Wprowadzenie

Mnóstwo chorób neurologicznych i psychiatrycznych wiąże się z rozregulowaniem lub niedostatecznym utrzymaniem neuroprzekaźnika monoaminowego (dopaminy [DA], serotoniny [5-HT], noradrenaliny [NE]) homeostazy1,2,3. Do tych schorzeń należą między innymi: depresja1,2, schizofrenia2, anxiety2, addiction4, menopauza5,6,7, ból8 oraz choroba Parkinsona3. Na przykład kilka szczurzych modeli menopauzy wykazało, że rozregulowanie lub zmniejszenie monoamin w hipokampie, korze przedczołowej i prążkowiu może być związane zarówno z depresją, jak i pogorszeniem funkcji poznawczych, co obserwuje się u kobiet doświadczających menopauzy. Rozregulowanie monoamin w tych modelach zostało szeroko zbadane przy użyciu HPLC-ECD, chociaż badania nie rozróżniały między zmierzoną zawartością neuroprzekaźników a uwalnianiem neuroprzekaźników5,6,7. Monoaminy są klasycznie uwalniane do przestrzeni zewnątrzkomórkowej poprzez zależne od Ca2+ uwalnianie pęcherzykowe9 i są zawracane z powrotem przez odpowiedni system wychwytu zwrotnego błony komórkowej (transporter dopaminy, DAT; transporter serotoniny, SERT; transporter noradrenaliny, NET)10,11. Z drugiej strony, dane sugerują, że te transportery są w stanie uwalniać lub wypływać monoaminy, ponieważ wiadomo, że narkotyki, takie jak amfetamina (AMPH) i 3,4-metylenodioksymetamfetamina (MDMA), uwalniają odpowiednio DA i 5-HT za pośrednictwem swoich systemów transportowych12,13,14,15,16,17. W związku z tym właściwe mechanistyczne zrozumienie dynamiki uwalniania monoamin ma kluczowe znaczenie dla opracowania specyficznych i celowanych farmakoterapii.

Do badania uwalniania monoamin zastosowano szeroki zakres technik, takich jak Szybka Woltamperometria Cykliczna (FSCV)18, mikrodializy in vivo13, obrazowanie19, preinkubacja z radioznakowanymi monoaminami20, optogenetyka, a ostatnio genetycznie kodowane czujniki fluorescencyjne i fotometria21,22. FSCV i mikrodializa in vivo są podstawowymi technikami stosowanymi do badania uwalniania monoamin. FSCV jest używany do badania stymulowanego uwalniania egzocytotyki, przede wszystkim, DA w ostrych wycinkach mózgu i in vivo23. Ponieważ FSCV wykorzystuje elektrody do stymulowania lub wywoływania uwalniania, głównym źródłem uwalniania neuroprzekaźników jest zależne od Ca2+ uwalnianie pęcherzyków18,24,25,26,27,28,29,30,31. Mikrodializa in vivo w połączeniu z HPLC mierzy zmiany w poziomach neuroprzekaźników zewnątrzkomórkowych za pomocą sondy umieszczonej w obszarze zainteresowania mózgu13,32. Podobnie jak w przypadku FSCV, głównym ograniczeniem mikrodializy in vivo jest trudność w określeniu źródła uwalniania neuroprzekaźników: zależnego od Ca2+ uwalniania pęcherzykowego lub zależnego od transportera. Warto zauważyć, że obie metody pozwalają na bezpośredni pomiar uwalniania monoamin. Dzięki niedawnemu postępowi w optogenetyce, badania wykazały wykrywanie uwalniania 5-HT i DA w krótkim czasie z wyjątkową specyficznością typu komórki21,22. Jednak strategie te wymagają złożonych i kosztownych technik i sprzętu oraz pośrednio mierzą uwalnianie monoamin, w szczególności poprzez wiązanie monoamin z receptorami. Co więcej, znakowane radioizotopowo monoaminy są również wykorzystywane do badania dynamiki monoamin. Monoaminy znakowane radioizotopowo mogą być wstępnie załadowane do różnych systemów modelowych, takich jak komórki heterologiczne z nadekspresją każdego transportera monoamin20,33,34,35,36,37,38,39,40, primary neurons20, synaptosomes33,39,41,42, oraz acute brain slices43,44. Jednak radioaktywność stanowi potencjalną szkodę dla eksperymentatora, a anality znakowane trytem mogą nie odzwierciedlać wiernie endogennej dynamiki monoamin45,46. Systemy superfuzyjne w połączeniu z metodami detekcji off-line, takimi jak HPLC-ECD, pozwoliły na wykrycie monoamin z wielu źródeł tkankowych. W tym przypadku protokół ten zapewnia zoptymalizowaną i tanią, prostą i precyzyjną metodę wykorzystującą ostre wycinki mózgu do bezpośredniego pomiaru endogennego podstawowego i stymulowanego uwalniania monoamin.

Ostre wycinki mózgu pozwalają na testowanie hipotez mechanistycznych, przede wszystkim dlatego, że zachowują mikrośrodowisko anatomiczne in vivo i utrzymują nienaruszone synapsy47,48,49,50,51,52. W kilku badaniach ostre wycinki mózgu lub posiekana tkanka mózgowa były używane w połączeniu z techniką superfuzji przy użyciu KCl w celu stymulacji uwalniania za pośrednictwem Ca2+53,54,55,56. Systemy superfuzji odegrały kluczową rolę w pogłębieniu wiedzy na temat mechanizmów uwalniania neuroprzekaźników, w tym monoamin. Systemy te są jednak stosunkowo drogie, a liczba dostępnych komór do analizy tkanek waha się od 4 do 12. Dla porównania, przedstawiona tutaj metoda jest niedroga, pozwala na pomiar 48 próbek tkanek i może być udoskonalona do wykorzystania do 96 próbek tkanek. Każda studzienka w 48-dołkowej płytce zawiera uchwyty tkanek, które wykorzystują filtry do oddzielenia uwolnionego produktu od tkanki, a uwolnione monoaminy są następnie zbierane i analizowane przez HPLC-ECD. Co ważne, metoda ta pozwala na jednoczesny pomiar uwalniania 5-HT, DA i NE z różnych obszarów mózgu, takich jak kora przedczołowa, hipokamp i prążkowie grzbietowe po leczeniu środkami farmakologicznymi modulującymi uwalnianie monoamin. W ten sposób eksperymentator może odpowiedzieć na wiele pytań za pomocą niedrogiego systemu wielodołkowego, który zwiększa liczbę badanych próbek, a tym samym zmniejsza liczbę wykorzystywanych zwierząt.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty, w tym postępowanie ze zwierzętami i pobieranie tkanek, były przeprowadzane zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnych Komitetów ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (IACUC) University of Florida oraz City College of New York, zgodnie z zatwierdzonymi protokołami 201508873 (UF) i 1071 (CCNY). W kwestii odczynników i buforów należy zapoznać się z plikiem uzupełniającym.

1. Przygotowanie świeżych skrawków mózgu szczura

UWAGA: W tym eksperymencie wykorzystano dorosłe samce szczurów (250-350 g). Układ ten jest jednak funkcjonalny dla różnych etapów rozwojowych, samic szczurów oraz innych gatunków. W przypadku użycia mniejszych zwierząt, np. myszy, eksperymentator może dostosować i zoptymalizować protokół, stosując inną liczbę skrawków mózgu lub wycinków (punches) na warunek. Bufor do sekcji będzie określany jako Bufor 1; bufor do wypływu będzie określany jako Bufor 2.

  1. Przygotować Bufor 1 zgodnie z opisem w pliku uzupełniającym (Supplementary File). Nasycić Bufor 1 tlenem, przepuszczając przez niego mieszaninę 95%/5% (O2/CO2) przez 20 min w temperaturze 0°C. Odlać 50 mL Buforu 1 i schłodzić na lodzie w małym zlewce lub czarszce Petriego. Bufor ten służy do przechowywania świeżo pobranego całego mózgu.
  2. Zanurzyć jedną lub dwie dorosłe szczury (250-350 g) w 1%-2% izofluranie, zdekapitować je za pomocą gilotyny i szybko usunąć mózgi. Natychmiast umieścić mózg w lodowatym, natlenionym Buforze 1 w pojemniku z kroku 1.1.
    UWAGA: Należy zapewnić bezpieczne użytkowanie izofluranu i gilotyny. Otwierać izofluran pod wyciągiem 화학icznym.
  3. Za pomocą wibratomu lub compresstomu wykonać koronalne przekroje mózgu o grubości 300 µm z każdego obszaru zainteresowania (Rysunek 1). Podczas wykonywania przekrojów musi być obecny napowietrzany Bufor 1. Używając stalowej szpatułki, ostrożnie i niezwłocznie przenieść plastry mózgu do nowej czarszki Petriego wypełnionej lodowatym, natlenionym Buforem 1 (Rysunek 2).
  4. Dalszą dyssekcję plastrów mózgu (np. wycinanie fragmentów/punchy) przeprowadzić, ostrożnie przenosząc plastry na szkiełka przedmiotowe (Rysunek 1G), korzystając z atlasu mózgu szczura57. Na przykład: zidentyfikować prążkowie grzbietowe na podstawie jego ciemnej, prążkowanej struktury oraz hipokamp na podstawie jego bliskości do kory i charakterystycznej struktury spiralnej. Półkule prawa i lewa mogą zostać rozdzielone, aby służyć odpowiednio jako plastry kontrolne i eksperymentalne (Rysunki 2G - H). W tym przypadku prążkowie grzbietowe zostało dalej wycięte w formie fragmentów o średnicy 2 mm (Rysunek 1G).
  5. Używając plastikowej pipety transferowej z odciętą końcówką, przenieść plastry lub wycinki mózgu do małych pojemników zanurzonych w natlenionym, lodowatym Buforze 1 z przepływem tlenu. Pojemniki te mogą stanowić stalowa siatka lub małe czarszki Petriego wypełnione buforem (Rysunek 1H).

2. Uwalnianie endogennych monoamin ex vivo z przekrojów lub wycinków mózgu

UWAGA: Urządzenie wykorzystane w tej sekcji składa się z płytki 48-dołkowej oraz uchwytu do tkanek wykonanego z sześciu jednostek filtracyjnych do mikrocentryfugi (bez wkładów filtrujących) podłączonych do linii z karbogenem (Rycina 2). Aby wykonać uchwyt, należy użyć wytrzymałego plastikowego pręta (np. z zeskrobaka do komórek) i przykleić do niego jednostki filtracyjne do mikrocentryfugi (bez wkładów filtrujących) za pomocą superglue. Pozostawić do wyschnięcia na 1-2 dni. Czas wymagany dla eksperymentu uwalniania endogennych monoamin oraz stężenia amfetaminy, fluoksetyny i kokainy oparto na aktualnej literaturze oraz poprzednich protokołach13,20,58.

  1. Aktywacja tkanki
    1. Przenieść tkankę mózgową z etapu 1.1.5 do każdej studzienki komory odpływu i pozostawić do regeneracji na 30-50 min w temperaturze 37 °C na podgrzewaczu do szkiełek w 0,5-1 mL napowietrzonego Buforu 2, przy stałym, łagodnym bąbelkowaniu (Rysunek 2B1).
    2. Podczas tej inkubacji rozcieńczyć leki do pożądanego stężenia dla danego eksperymentu. Wszystkie leki muszą być rozpuszczone w Buforze 2, a stężenia powinny być zgodne z aktualną literaturą.
  2. Pierwsza inkubacja
    1. Przenieść uchwyt z tkanką mózgową do studzienek zawierających 500 µL napowietrzonego Buforu 2 i inkubować przez 20 min w temperaturze 37 °C. Należy upewnić się, że przeniesiono minimalną ilość lub żadną ilość buforu, opukując uchwyt o krawędź studzienki, aż do usunięcia nadmiaru buforu z uchwytu.
    2. W eksperymentach z zastosowaniem czynników farmakologicznych, takich jak inhibitory transporterów monoamin, inkubować próbki tkanki z lekami rozcieńczonymi w napowietrzeniu Buforze 2 (np. 10 µM fluoksetyny, 40 µM kokainy; patrz Rysunek 2B2). Końcowa objętość w każdej studience powinna wynosić 500 µL.
  3. Druga inkubacja
    1. Przenieść uchwyt z tkanką do nowego zestawu studzienek zawierających łącznie 500 µL Buforu 2 z pożądanym stężeniem każdego leku lub bez niego. Upewnić się, że nie pozostał nadmiar buforu. Każda studzieńka stanowi n = 1 dla warunków eksperymentalnych. Każdy warunek eksperymentalny wykonuje się w trzech powtórzeniach.
    2. Jedna studzieńka zawiera napowietrzony Bufor 2, kolejna 10-30 µM AMPH, a ostatnia studzieńka zawiera 10-30 µM AMPH oraz inhibitory transporterów monoamin. Każdy lek jest rozpuszczony w napowietrzonym Buforze 2.
    3. Inkubować tkankę przez 20 min w temperaturze 37 °C w 500 µL roztworu leku dla danego warunku.
      UWAGA: Dodatkowe studzienki mogą zawierać napowietrzony Bufor 2 z wysokim stężeniem K+ z inhibitorami transporterów monoamin lub bez nich. Rozpuścić każdy lek w napowietrzonym Buforze 2 (500 µL).
    4. Podczas tej drugiej 20-minutowej inkubacji zebrać roztwór ze studzienek z pierwszej inkubacji z etapu 2.2.1 i przenieść do probówek do mikrocentryfugi zawierających 50 µL 1 N kwasu nadchlorowego lub kwasu fosforowego (w zależności od rodzaju HPLC, stężenie końcowe 0,1 N). Końcowa objętość próbki wyniesie 550 µL. Próbówki do mikrocentryfugi należy przechowywać na lodzie i oznaczyć jako nr 1.
    5. Po drugiej 20-minutowej inkubacji przenieść uchwyt z przekrojami lub wycinkami mózgu do pustej studzienki i utrzymać płytkę na lodzie. Przenieść nadsącz do probówek do mikrocentryfugi zawierających 50 µL 1 N kwasu nadchlorowego lub kwasu fosforowego. Końcowa objętość próbki wyniesie 550 µL. Próbówki do mikrocentryfugi należy przechowywać na lodzie i oznaczyć jako nr 2.
    6. Dodać 1 mL schłodzonego do temperatury lodowej Buforu 1 do każdej studzienki zawierającej tkankę. Zebrać całą tkankę za pomocą małej pęsety i przenieść do czystych probówek do mikrocentryfugi.
    7. Przechowywać probówki z tkanką mózgową w temperaturze -80 °C. Odrzucić 1 mL Buforu 1 (Rysunek 2B4).
    8. Przefiltrować roztwory uzyskane z każdej inkubacji przy użyciu filtrów do mikrocentryfugi (0,22 µm) przy 2 500 x g przez 2 min. Wykorzystać filtrat do oznaczenia zawartości monoamin za pomocą HPLC z detekcją elektrochemiczną (Rysunek 2B5).

3. Żywotność tkanek

  1. Test MTT
    ​UWAGA: Istotnym problemem w tym układzie doświadczalnym jest żywotność tkanki, ponieważ tkanka może być wykorzystywana przez kilka godzin59. Do określenia żywotności tkanki po zakończeniu eksperymentu stosuje się test MTT60,61. Test ten opiera się na konwersji żółtej soli tetrazoliowej MTT (bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-yl)-2,5-difenylotetrazoliu) w fioletowe kryształy formazanu przez żywe komórki o odpowiednim metabolizmie.
    1. Po eksperymencie zachowaj oddzielną grupę próbek tkankowych i podziel je na dwie grupy.
    2. Inkubuj jedną grupę przez 20 min w 37 °C w Triton X-100 (1%) rozpuszczonym w Buforze 2 jako kontrolę. Traktowanie Triton X-100 prowadzi do śmierci komórek. Drugą grupę utrzymuj w Buforze 2, nie inkubując jej w Triton X-100 (kontrola żywotności tkanki).
    3. Do obu grup w natlenionym Buforze 2 dodaj MTT (roztwór zapasowy 5 mg/mL w PBS, pH 7.4) do stężenia końcowego 0.5 mg/mL.
    4. Inkubuj próbki tkankowe przez 20 min w 37 °C, przemyj PBS i przenieś do probówek do mikrocentryfugi zawierających 250 µL mieszaniny SDS (10%, w/v), DMF (25%, v/v) i wody w celu rozpuszczenia kryształów formazanu.
    5. Inkubuj próbki przez 24 h.
    6. Wiruj probówki przy 10,000 x g przez 10 min i zmierz absorbancję supernatantu (200 µL) przy 562 nm i 690 nm za pomocą czytnika mikroplatek. Żywotność tkanki oblicza się następująco: (A562-A690)/masa tkanki.

4. Analiza monoamin metodą HPLC

  1. Ilościowo określ uwalnianie monoamin w każdej z warunków doświadczalnych przy użyciu HPLC-ECD zgodnie z poprzednimi protokołami13,44, stosując kolumnę w fazie odwróconej.
    1. Przygotuj fazę ruchomą niezbędną do detekcji. Składa się ona z 100 mM kwasu fosforowego, 100 mM kwasu cytrynowego, 0,1 mM EDTA-Na2, 600 mg/L kwasu oktanosulfonowego oraz 8% v/v acetonitrylu (końcowe pH 6,0). Skład fazy ruchomej zależy od rodzaju zastosowanego urządzenia HPLC i kolumny.
    2. Ustaw potencjał detektora elektrochemicznego (elektroda z węgla szklistego 2 mm) na 0,46 V oraz ustaw szybkość przepływu na 0,05 mL/min.
    3. Wprowadź 5 µL każdej próbki, w tym standardów neurotransmiterów, do urządzenia HPLC w celu autowtrysku i detekcji. Ilość dodanej każdej próbki zależy od rodzaju użytego urządzenia HPLC.
    4. Po zakończeniu analizy przez HPLC, użyj odpowiedniego oprogramowania analitycznego HPLC do pozyskania i analizy danych chromatograficznych.
    5. Przeanalizuj zawartość monoamin, korzystając z krzywej wzorcowej dla każdej monoaminy (dopaminy: DA, norepinefryny: NE i serotoniny: 5-HT; Rysunek 2C). Na podstawie uzyskanych chromatogramów wyznacz pole pod krzywą (AUC) zgodnie z wytycznymi producenta.

5. Przygotowanie lizatów tkankowych do oznaczania ilości białka

  1. Oznaczenie białka
    1. Do każdej probówki do mikrocentryfugi zawierającej przekroje lub wycinki mózgu dodać lodowaty bufor lizujący z inhibitorami proteaz (0,1 g/1 mL) i homogenizować za pomocą homogenizatora tłuczkowego. Podczas homogenizacji probówki muszą znajdować się w lodzie, aby zapobiec degradacji białek.
    2. Homogenizaty tkanek inkubować przez 1 h w temperaturze 4 °C przy lekkim obrocie.
    3. Homogenizaty tkanek wirować z prędkością 16,000 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C i zebrać nadsącz.
    4. Oznaczyć stężenie białka w nadsączach, stosując albuminę surowicy bydlęcej (BSA) jako wzorzec.
    5. Znormalizować zawartość monoamin w każdej próbce mózgu do całkowitej zawartości białka (µg) zmierzonej w 250 µL lizowanej tkanki mózgowej. Do obliczenia nmol monoaminy/g białka zastosować poniższy wzór. df = czynnik rozcieńczenia.

Wzór na oznaczanie ilości monoamin, schemat obliczeń dla analizy nmol na gram białka.

6. Analiza statystyczna

  1. Przeanalizuj uwalnianie monoamin (nmol/g), stosując jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA), a następnie test wielokrotnych porównań Sidaka dla analiz post-hoc.
  2. Przeanalizuj żywotność tkanek, stosując nieparzysty test t Studenta dla grup niezależnych (Kontrola vs. 1% Triton X-100).
  3. Dla wszystkich analiz statystycznych przyjmij poziom istotności alfa ≤ 0,05.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejsza technika opisuje zastosowanie skrawków mózgu do pomiaru uwalniania endogennych monoamin przy użyciu HPLC z detekcją elektrochemiczną, z wykorzystaniem płytki 48-dołkowej z wewnętrznym uchwytem do tkanek. Układ eksperymentalny przedstawiono na Rysunku 1 oraz Rysunku 2. Początkowo, w celu zapewnienia żywotności tkanki do końca eksperymentu, przeprowadzono test MTT (bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-yl)-2,5-difenylotetrazoliu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pomiary uwalniania monoamin są wykonywane od lat w wielu systemach, takich jak komórki heterologiczne, kultury neuronalne, synaptosomy mózgu, ostre wycinki mózgu ex vivo i całe zwierzęta 13,20,41,42,58,64,65,66,67,68<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty Fondecyt Initiation Fund N 11191049 dla J.A.P. oraz granty NIH DA038598 dla G.E.T.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
48 Płytka dołkowaTest NANA
AcetonitrylFischer ScientificA998-1Faza ruchoma
Chlorek wapnia AhydrousSigma AldrichC1016Zmodyfikowany sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy LUB Oprogramowanie do klarowności bufora wypływu
Anetc
Kwas cytrynowySigma AldrichFaza ruchoma
D-(+)-GlukozaSigma1002608421Bufor rozpiskowy
DMFSigma AldrichD4551Test MTT
EDTA-Na2Sigma Aldrich
Phase GraphPad Software GraphpadSoftware, IncAnaliza statystyczna
GlycerolSigma AldrichG5516Bufor do lizy
HEPESSigma AldrichH3375Bufor do lizy
HPLC, dekada amperometrycznaAnetcHPLC, system LC-EC
HPLC AmuzaHPLC HTEC-510.
Kwas L-asrobinowySigma AldrichA5960Bufor rozdzielczy
Siarczan magnezuSigma7487-88-9KH
Jednostki filtrujące do mikrowirówek UltraFreeMilliporeC7554Test - 6 pasujący do 48-dołkowej płytki
MTTThermo FisherM6494MTT
NanosepVWR29300-606; Test białka
Kwas oktanosulfonowySigma AldrichV800010Faza ruchoma
Pargyline ClorohydrateSigma AldrichP8013Zmodyfikowany sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy OR Bufor Deflux
Kwas fosforowySigma AldrichFaza ruchoma
Chlorek potasuSigma12636KH Bufor
Fosforan potasu MonobasicSigma1001655559KH Bufor
Precyzonarny VF-21-0ZPrecissonaryCompresstome
Inhibitor Inhibitor KoktajlSigma AldrichP2714Bufor do lizy.
Wodorowęglan soduSigmaS5761Bufor rozdzielczy
Wodorowęglan soduSigma AldrichS5761Bufor rozwarstwiający
Chlorek soduSigmaS3014KH Bufor
Dodecylosiarczan soduSigma AldrichL3771Bufor do lizy
Triton X-100Sigma AldrichT8787MTT Test / Bufor do lizy
Mobile Test

Bibliografia

  1. Jesulola, E., Micalos, P., Baguley, I. J. Understanding the pathophysiology of depression: From monoamines to the neurogenesis hypothesis model - are we there yet. Behavioural Brain Research. 341, 79-90 (2018).
  2. Krystal, J. H., D'Souza, D. C., Sanacora, G., Goddard, A. W., Charney, D. S. Current perspectives on the pathophysiology of schizophrenia, depression, and anxiety disorders. Medical Clinics of North America. 85 (3), 559-577 (2001).
  3. Barone, P. Neurotransmission in Parkinson's disease: beyond dopamine. European Journal of Neurology. 17 (3), 364-376 (2010).
  4. Howell, L. L., Kimmel, H. L. Monoamine transporters and psychostimulant addiction. Biochemical Pharmacology. 75 (1), 196-217 (2008).
  5. Kirshner, Z. Z., et al. Impact of estrogen receptor agonists and model of menopause on enzymes involved in brain metabolism, acetyl-CoA production and cholinergic function. Life Sciences. 256, 117975(2020).
  6. Long, T., et al. Comparison of transitional vs surgical menopause on monoamine and amino acid levels in the rat brain. Molecular and Cellular Endocrinology. 476, 139-147 (2018).
  7. Long, T., et al. Estradiol and selective estrogen receptor agonists differentially affect brain monoamines and amino acids levels in transitional and surgical menopausal rat models. Molecular and Cellular Endocrinology. 496, 110533(2019).
  8. Burke, N. N., et al. Enhanced nociceptive responding in two rat models of depression is associated with alterations in monoamine levels in discrete brain regions. Neuroscience. 171 (4), 1300-1313 (2010).
  9. Lane, J. D., Aprison, M. H. Calciumm-dependent release of endogenous serotonin, dopamine and norepinephrine from nerve endings. Life Sciences. 20 (4), 665-671 (1977).
  10. Ramamoorthy, S., Shippenberg, T. S., Jayanthi, L. D. Regulation of monoamine transporters: Role of transporter phosphorylation. Pharmacology and Therapeutics. 129 (2), 220-238 (2011).
  11. Torres, G. E., Gainetdinov, R. R., Caron, M. G. Plasma membrane monoamine transporters: structure, regulation and function. Nature Reviews. Neuroscience. 4 (1), 13-25 (2003).
  12. Hilber, B., et al. Serotonin-transporter mediated efflux: A pharmacological analysis of amphetamines and non-amphetamines. Neuropharmacology. 49 (6), 811-819 (2005).
  13. Mauna, J. C., et al. G protein βγ subunits play a critical role in the actions of amphetamine. Translational Psychiatry. 9 (1), 81(2019).
  14. Sitte, H. H., Freissmuth, M. Amphetamines, new psychoactive drugs and the monoamine transporter cycle. Trends in Pharmacological Sciences. 36 (1), 41-50 (2015).
  15. Johnson, L. A., Guptaroy, B., Lund, D., Shamban, S., Gnegy, M. E. Regulation of amphetamine-stimulated dopamine efflux by protein kinase C β. Journal of Biological Chemistry. 280 (12), 10914-10919 (2005).
  16. Kahlig, K. M., et al. Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (9), 3495-3500 (2005).
  17. Kantor, L., Hewlett, G. H. K., Gnegy, M. E. Enhanced amphetamine- and K+ -mediated dopamine release in rat striatum after repeated amphetamine: differential requirements for Ca 2+ - and calmodulin-dependent phosphorylation and synaptic vesicles. The Journal of Neuroscience. 19 (10), 3801-3808 (2018).
  18. Brodnik, Z. D., et al. Susceptibility to traumatic stress sensitizes the dopaminergic response to cocaine and increases motivation for cocaine. Neuropharmacology. 125, 295-307 (2017).
  19. Henke, A., et al. Toward serotonin fluorescent false neurotransmitters: development of fluorescent dual serotonin and vesicular monoamine transporter substrates for visualizing serotonin neurons. ACS Chemical Neuroscience. 9 (5), 925-934 (2018).
  20. Garcia-Olivares, J., et al. Gβγ subunit activation promotes dopamine efflux through the dopamine transporter. Molecular Psychiatry. 22 (12), 1673-1679 (2017).
  21. Xiao, N., Privman, E., Venton, B. J. Optogenetic control of serotonin and dopamine release in Drosophila larvae. ACS Chemical Neuroscience. 5 (8), 666-673 (2014).
  22. Bass, C. E., et al. Optogenetic control of striatal dopamine release in rats. Journal of Neurochemistry. 114 (5), 1344-1352 (2010).
  23. Stamford, J. A. Fast cyclic voltammetry: measuring transmitter release in "real time". Journal of Neuroscience Methods. 34 (1-3), 67-72 (1990).
  24. Brodnik, Z. D., Ferris, M. J., Jones, S. R., España, R. A. Reinforcing doses of intravenous cocaine produce only modest dopamine uptake inhibition. ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 281-289 (2017).
  25. Brodnik, Z. D., España, R. A. Dopamine uptake dynamics are preserved under isoflurane anesthesia. Neuroscience Letters. 606, 129-134 (2015).
  26. Ferris, M. J., Calipari, E. S., Yorgason, J. T., Jones, S. R. Examining the complex regulation and drug-induced plasticity of dopamine release and uptake using voltammetry in brain slices. ACS Chemical Neuroscience. 4 (5), 693-703 (2013).
  27. Siciliano, C. A., Calipari, E. S., Ferris, M. J., Jones, S. R. Biphasic mechanisms of amphetamine action at the dopamine terminal. The Journal of Neuroscience The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (16), 5575-5582 (2014).
  28. Rice, M. E., et al. Direct monitoring of dopamine and 5-HT release in substantia nigra and ventral tegmental area in vitro. Experimental Brain Research. 100 (3), 395-406 (1994).
  29. Bunin, M. A., Prioleau, C., Mailman, R. B., Wightman, R. M. Release and uptake rates of 5-hydroxytryptamine in the dorsal raphe and substantia nigra reticulata of the rat brain. Journal of Neurochemistry. 70 (3), 1077-1087 (1998).
  30. Park, J., Takmakov, P., Wightman, R. M. In vivo comparison of norepinephrine and dopamine release in rat brain by simultaneous measurements with fast-scan cyclic voltammetry. Journal of Neurochemistry. 119 (5), 932-944 (2011).
  31. Park, J., Bhimani, R. V., Bass, C. E. In vivo electrochemical measurements of norepinephrine in the brain: current status and remaining challenges. Journal of the Electrochemical Society. 165 (12), 3051-3056 (2018).
  32. Butcher, S. P., Fairbrother, I. S., Kelly, J. S., Arbuthnott, G. W. Amphetamine-induced dopamine release in the rat striatum: an in vivo microdialysis study. Journal of Neurochemistry. 50 (2), 346-355 (1988).
  33. Garcia-Olivares, J., et al. Inhibition of dopamine transporter activity by G protein βγ subunits. PLoS One. 8 (3), 1-9 (2013).
  34. Carneiro, A. M. D., Blakely, R. D. Serotonin-, protein kinase C-, and Hic-5-associated redistribution of the platelet serotonin transporter. Journal of Biological Chemistry. 281 (34), 24769-24780 (2006).
  35. Rajamanickam, J., et al. Akt-mediated regulation of antidepressant-sensitive serotonin transporter function, cell-surface expression and phosphorylation. The Biochemical Journal. 468 (1), 177-190 (2015).
  36. Egaña, L. A., et al. Physical and functional interaction between the dopamine transporter and the synaptic vesicle protein synaptogyrin-3. The Journal of Neuroscience The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (14), 4592-4604 (2009).
  37. Guptaroy, B., Fraser, R., Desai, A., Zhang, M., Gnegy, M. E. Site-directed mutations near transmembrane domain 1 alter conformation and function of norepinephrine and dopamine transporters. Molecular Pharmacology. 79 (3), 520-532 (2011).
  38. Ordway, G. A., et al. Norepinephrine transporter function and desipramine: Residual drug effects versus short-term regulation. Journal of Neuroscience Methods. 143 (2), 217-225 (2005).
  39. Steinkellner, T., et al. Amphetamine action at the cocaine- and antidepressant-sensitive serotonin transporter is modulated by CaMKII. Journal of Neuroscience. 35 (21), 8258-8271 (2015).
  40. Guptaroy, B., et al. A juxtamembrane mutation in the N terminus of the dopamine transporter induces preference for an inward-facing conformation. Molecular Pharmacology. 75 (3), 514-524 (2009).
  41. Carpenter, C., et al. Direct and systemic administration of a CNS-permeant tamoxifen analog reduces amphetamine-induced dopamine release and reinforcing effects. Neuropsychopharmacology. 42 (10), 1940-1949 (2017).
  42. Aquino-Miranda, G., Escamilla-Sánchez, J., González-Pantoja, R., Bueno-Nava, A., Arias-Montaño, J. -A. Histamine H3 receptor activation inhibits dopamine synthesis but not release or uptake in rat nucleus accumbens. Neuropharmacology. 106, 91-101 (2016).
  43. Reddy, I. A., et al. Glucagon-like peptide 1 receptor activation regulates cocaine actions and dopamine homeostasis in the lateral septum by decreasing arachidonic acid levels. Translational Psychiatry. 6 (5), 809(2016).
  44. Koutzoumis, D. N., et al. Alterations of the gut microbiota with antibiotics protects dopamine neuron loss and improve motor deficits in a pharmacological rodent model of Parkinson's disease. Experimental Neurology. 325, 113159(2020).
  45. Herdon, H., Strupish, J., Nahorski, S. R. Differences between the release of radiolabelled and endogenous dopamine from superfused rat brain slices: Effects of depolarizing stimuli, amphetamine and synthesis inhibition. Brain Research. 348 (2), 309-320 (1985).
  46. Thongsaard, W., Kendall, D. A., Bennett, G. W., Marsden, C. A. A simple method for measuring dopamine release from rat brain slices. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 37 (3), 143-148 (1997).
  47. Dorris, D. M., Hauser, C. A., Minnehan, C. E., Meitzen, J. An aerator for brain slice experiments in individual cell culture plate wells. Journal of Neuroscience Methods. 238, 1-10 (2014).
  48. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
  49. Papouin, T., Haydon, P. Obtaining acute brain slices. BIO-PROTOCOL. 8 (2), 477-491 (2018).
  50. Collingridge, G. L. The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain. Journal of Neuroscience Methods. 59 (1), 5-9 (1995).
  51. Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. Journal of Neurochemistry. 13 (12), 1333-1343 (1966).
  52. Buskila, Y., et al. Extending the viability of acute brain slices. Scientific Reports. 4, 4-10 (2014).
  53. Kako, H., Fukumoto, S., Kobayashi, Y., Yokogoshi, H. Effects of direct exposure of green odour components on dopamine release from rat brain striatal slices and PC12 cells. Brain Research Bulletin. 75 (5), 706-712 (2008).
  54. McBride, W. J., Murphy, J. M., Lumeng, L., Li, T. -K. Effects of ethanol on monoamine and amino acid release from cerebral cortical slices of the alcohol-preferring P line of rats. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 10 (2), 205-208 (1986).
  55. Chen, J. C., Turiak, G., Galler, J., Volicer, L. Effect of prenatal malnutrition on release of monoamines from hippocampal slices. Life Sciences. 57 (16), 1467-1475 (1995).
  56. Becker, J. B., Castañeda, E., Robinson, T. E., Beer, M. E. A simple in vitro technique to measure the release of endogenous dopamine and dihydroxyphenylacetic acid from striatal tissue using high performance liquid chromatography with electrochemical detection. Journal of Neuroscience Methods. 11 (1), 19-28 (1984).
  57. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. London. (2007).
  58. Dailey, J. W., Reith, M. E. A., Steidley, K. R., Milbrandt, J. C., Jobe, P. C. Carbamazepine-induced release of serotonin from rat hippocampus in vitro. Epilepsia. 39 (10), 1054-1063 (1998).
  59. Buskila, Y., et al. Extending the viability of acute brain slices. Scientific Reports. 4, 5309(2014).
  60. Mewes, A., Franke, H., Singer, D. Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice-A model for tauopathy studies. PLoS One. 7 (9), (2012).
  61. Rönicke, R., et al. AB mediated diminution of MTT reduction - An artefact of single cell culture. PLoS One. 3 (9), (2008).
  62. Ihalainen, J. A., Riekkinen, P., Feenstra, M. G. P. Comparison of dopamine and noradrenaline release in mouse prefrontal cortex, striatum and hippocampus using microdialysis. Neuroscience Letters. 277 (2), 71-74 (1999).
  63. Richards, D. A., Obrenovitch, T. P., Symon, L., Curzon, G. Extracellular dopamine and serotonin in the rat striatum during transient ischaemia of different severities: a microdialysis study. Journal of Neurochemistry. 60 (1), 128-136 (1993).
  64. Fog, J. U., et al. Calmodulin kinase II interacts with the dopamine transporter C terminus to regulate amphetamine-induced reverse transport. Neuron. 51 (4), 417-429 (2006).
  65. Balázsa, T., Bíró, J., Gullai, N., Ledent, C., Sperlágh, B. CB1-cannabinoid receptors are involved in the modulation of non-synaptic [3H]serotonin release from the rat hippocampus. Neurochemistry International. 52 (1), 95-102 (2008).
  66. Schechter, L. E. The potassium channel blockers 4-aminopyridine and tetraethylammonium increase the spontaneous basal release of [3H]5-hydroxytryptamine in rat hippocampal slices. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 282 (1), 262-270 (1997).
  67. Boudanova, E., Navaroli, D. M., Stevens, Z., Melikian, H. E. Dopamine transporter endocytic determinants: carboxy terminal residues critical for basal and PKC-stimulated internalization. Molecular and Cellular Neuroscience. 39 (2), 211-217 (2008).
  68. Bowyer, J. F., et al. Interactions of MK-801 with glutamate-, glutamine- and methamphetamine-evoked release of [3H]dopamine from striatal slices. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 257 (1), 262-270 (1991).
  69. Perszyk, R. E., et al. GluN2D-containing N-methyl-D-aspartate receptors mediate synaptic transmission in hippocampal interneurons and regulate interneuron activity. Molecular Pharmacology. 90 (6), 689-702 (2016).
  70. Jones, S. R., et al. Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 4029-4034 (1998).
  71. Jedema, H. P., Narendran, R., Bradberry, C. W. Amphetamine-induced release of dopamine in primate prefrontal cortex and striatum: striking differences in magnitude and timecourse. Journal of Neurochemistry. 130, 490-497 (2014).
  72. Buchmayer, F., et al. Amphetamine actions at the serotonin transporter rely on the availability of phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11642-11647 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wysokosprawna chromatografia cieczowadetekcja elektrochemicznatransporter monoaminuwalnianie p cherzykowewarunki farmakologicznepomiar dopaminy

Powiązane artykuły