Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie systemu GAL4-UAS do genetyki funkcjonalnej u Anopheles gambiae

6.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62131

⸱

15 kwietnia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Vector Biology, Liverpool School of Tropical Medicine, 2IMBB FORTH, 3Department of Biology, University of Crete

W tym artykule

Podsumowanie

Dwuczęściowy system GAL4-UAS jest wszechstronnym narzędziem do modyfikacji ekspresji genów w kontrolowany sposób czasoprzestrzenny, co pozwala na funkcjonalną analizę genetyczną w Anopheles gambiae. Opisane procedury korzystania z tego systemu to częściowo ustandaryzowana strategia klonowania, określanie płci i badanie przesiewowe poczwarek pod kątem fluorescencyjnych markerów białkowych i utrwalanie zarodków.

Streszczenie

Dwuczęściowy system GAL4-UAS jest wszechstronnym i potężnym narzędziem do funkcjonalnej analizy genetycznej. Istotą systemu jest krzyżowanie transgenicznych linii "sterowników", które wyrażają czynnik transkrypcyjny GAL4 drożdży w sposób specyficzny dla tkanki, z transgenicznymi liniami "odpowiadającymi" przenoszącymi konstrukt interferencyjny genu kandydującego / RNA, którego ekspresja jest kontrolowana przez sekwencje aktywacyjne (UAS), które wiążą GAL4. W powstałym potomstwie gen lub konstrukt wyciszający ulega zatem ekspresji w określony sposób czasoprzestrzenny, co umożliwia oznaczenie wynikowych fenotypów i wywnioskowanie funkcji genu. System binarny umożliwia elastyczność w eksperymentalnych podejściach do badań przesiewowych fenotypów generowanych przez ekspresję transgenu w wielu wzorcach specyficznych dla tkanki, nawet jeśli wiąże się to z poważnymi kosztami przystosowania. Dostosowaliśmy ten system do Anopheles gambiae, głównego wektora malarii w Afryce.

W tym artykule przedstawiamy niektóre z typowych procedur używanych podczas analizy GAL4-UAS. Opisujemy już wygenerowane linie GAL4-UAS An. gambiae, a także klonowanie nowych konstruktów reagujących w celu regulacji w górę i knockdownu RNAi. Określamy przewodnik krok po kroku dotyczący określania płci poczwarek komarów w celu ustalenia krzyżówek genetycznych, który obejmuje również badanie przesiewowe potomstwa w celu śledzenia dziedziczenia fluorescencyjnych markerów genowych, które oznaczają insercje sterownika i osoby reagującej. Przedstawiamy również protokół oczyszczania zarodków An. gambiae w celu zbadania rozwoju embrionalnego. Na koniec wprowadzamy potencjalne adaptacje metody do generowania linii sterujących poprzez insercję CRISPR / Cas9 GAL4 za genami docelowymi.

Wprowadzenie

Bipartyjny system GAL4-UAS jest podstawowym narzędziem funkcjonalnej charakterystyki genów w organizmie modelowym owadów Drosophila melanogaster1,2,3. Aby wykorzystać system GAL4-UAS, transgeniczne linie sterujące (driver lines), wykazujące ekspresję drożdżowego czynnika transkrypcyjnego GAL4 pod kontrolą sekwencji regulacyjnej, krzyżuje się z liniami odpowiadającymi (responder lines) niosącymi interesujący gen lub konstrukt interferencji RNA (RNAi) kontrolowany przez sekwencję aktywacyjną Upstream Activation Sequence (UAS) rozpoznawaną przez GAL4. Potomstwo tego krzyżowania wykazuje ekspresję interesującego transgenu w wzorcu czasoprzestrzennym dyktowanym przez promotor kontrolujący ekspresję GAL4 (Rycina 1). Fenotypy wykazane przez potomstwo krzyżówek linii sterujących i odpowiadających mogą być oceniane w celu wyjaśnienia funkcji genów kandydackich. Chociaż D. melanogaster była wykorzystywana do badania genów z innych organizmów4,5,6,7, system GAL4-UAS został obecnie dostosowany do zastosowania u owadów o znaczeniu medycznym i rolniczym, aby umożliwić bezpośrednią analizę w gatunkach będących przedmiotem zainteresowania 8,9,10,11,12,13,14.

W przypadku afrykańskiego komara przenoszącego malarię, Anopheles gambiae, system GAL4-UAS został po raz pierwszy przetestowany poprzez kotransfekcję linii komórkowych9. Przebadano wydajność wielu konstruktów w różnych kombinacjach parzystych, ustalając, że 14 tandemowo powtórzonych sekwencji UAS uzupełnionych o mały sztuczny intron (UAS-14i) wykazywało najszerszy zakres potencjału aktywacji przy zastosowaniu panelu driverów GAL4. Aby wykazać funkcjonalność in vivo, konstrukty te wykorzystano następnie do stworzenia dwóch osobnych transgenicznych linii An. gambiae za pomocą transformacji PiggyBac8: linii drivera niosącej GAL4 sterowany przez promotor specyficzny dla jelita środkowego oraz linii respondera zawierającej geny lucyferazy i wzmocnionego żółtego białka fluorescencyjnego (eYFP) pod regulacją sekwencji UAS. Aktywność lucyferazy specyficzna dla jelita oraz fluorescencja w potomstwie wykazały, że system ten jest wydajny u Anopheles. Od tego czasu stworzono linie drivera wykazujące ekspresję transgenów w innych tkankach istotnych dla potencjału wektorowego i oporności na insektycydy, w tym w oenocytach15 i hemocytach16, a także w wzorcu bliskim powszechnemu10. Wygenerowano również liczne linie UAS w celu zbadania genów uważanych za zaangażowane w metabolizm i oporność na insektycydy zapośredniczoną przez sekwestrację, syntezę węglowodorów kutykularnych oraz w celu fluorescencyjnego znakowania różnych typów komórek i tkanek (Tabela 1). W przypadku linii respondera celowana integracja transgenu jest obecnie przeprowadzana za pomocą wymiany kasety rekombinacyjnej katalizowanej przez ΦC3117,18, aby ustalić kontekst genomowy genów regulowanych przez UAS. W ten sposób ekspresja transgenu jest normalizowana pod kątem miejsca insercji w genomie, co pozwala na dokładniejsze porównanie efektów fenotypowych różnych genów kandydackich.

Linie responderów stworzone do tej pory zostały zaprojektowane w celu ekspresji transgenu na podwyższonym poziomie lub w celu redukcji ekspresji genu poprzez interferencję RNA (RNAi). Zazwyczaj klony cDNA są łączone z sekwencją UAS w celu wytworzenia odpowiednich plazmidów ekspresyjnych, jednak możliwe jest również wykorzystanie pełnych sekwencji genomicznych, pod warunkiem, że nie są one zbyt duże do klonowania. W celu wytworzenia konstruktów wyciszających zastosowaliśmy trzy różne metody uzyskania odpowiednich tandemowych sekwencji odwróconych, które tworzą dwuniciowe RNA (dsRNA) w formie spinki stymulujące RNAi. Metody te obejmowały PCR fuzyjny, asymetryczny PCR oraz komercyjną syntezę konstruktów typu spinka. Wspólną cechą każdej z tych metod jest wprowadzenie sekwencji intronu pomiędzy sekwencje odwrócone w celu zapewnienia stabilności klonowania. Opracowano plazmidy responderów, do których można wstawić gen zainteresowania lub konstrukt RNAi15. Plazmidy te zawierają również wymagane miejsca ΦC31 attB dla RMCE (opisane w towarzyszącym artykule JoVE autorstwa Adolfiego, który szczegółowo opisuje technikę RCME). W niniejszym manuskrypcie zawarto protokoły obejmujące kluczowe kroki niezbędne przy wyborze sekwencji do wstawienia do jednego z tych plazmidów w celu nadekspresji. Dodatkowo opisano i zilustrowano dwa protokoły tworzenia konstruktów RNAi w formie spinki.

Podczas tworzenia nowych linii kluczowa jest identyfikacja rzadkich osobników transgenicznych, które posłużą do rozrodu w celu ustanowienia i utrzymania kolonii transgenicznych. Co najważniejsze dla systemu GAL4-UAS, konieczne jest rozróżnienie linii responderów i driverów, aby móc przeprowadzać krzyżówki i identyfikować poszczególne potomstwo niosące oba transgeny. Osiąga się to poprzez zastosowanie różnych dominujących genów markerów selekcyjnych powiązanych z kasetami drivera i respondera. Najczęściej są to fluorescencyjne geny markerowe, które można wyraźnie odróżnić za pomocą filtrów optycznych (np. eYFP, eCFP, dsRed). Ważne jest, aby markery były ekspresjonowane w znanym i wiarygodnym wzorcu czasowo-przestrzennym, co ułatwia identyfikację anomalii oraz kontaminacji. Ekspresja fluorescencyjnych genów markerowych jest rutynowo regulowana przez syntetyczny promotor 3xP3, który powoduje specyficzną ekspresję w oczach i zwojach brzusznych na wszystkich etapach rozwoju An. gambiae19. Markery fluorescencyjne kontrolowane przez 3xP3 są zawarte we wszystkich plazmidach transformacyjnych opisanych w niniejszym artykule. Poniżej zamieszczono protokół szczegółowo opisujący powszechne metody stosowane do przesiewania fluorescencyjnych linii GAL4-UAS u poczwarek An. gambiae.

Jednym z kluczowych elementów systemu GAL4-UAS jest konieczność krzyżowania różnie oznakowanych linii sterujących (driver) i odpowiadających (responder). Aby to osiągnąć, samce i samice z każdej linii muszą zostać rozdzielone przed kopulacją. Osobniki dorosłe są łatwo rozróżnialne wizualnie, jednak w celu ustanowienia krzyżówek genetycznych zasadne jest rozdzielenie płci przed wyjściem imago, aby mieć pewność, że kopulacja nie miała miejsca. Ogólna różnica w wielkości między poczwarkami samców i samic An. gambiae jest zbyt zmienna, aby stanowiła wydajną i niezawodną metodę określania płci20. Zamiast tego, wyraźne różnice morfologiczne w budowie zewnętrznych narządów płciowych stanowią wiarygodną podstawę do określania płci u An. gambiae. W niniejszym artykule opisujemy niezawodną metodę określania płci poczwarek An. gambiae w celu przygotowania odpowiednich krzyżówek.

Schemat procesu edycji genów z wykorzystaniem spinek RNAi, klonowania, krzyżowania oraz analizy fenotypowej w modelu owadziego.
Rycina 1 - Schematyczny przedstawienie procesu wykorzystania dwuczęściowego systemu GAL4-UAS u Anopheles gambiae. (A) Przedstawiono główne komponenty przykładowego wektora (pSL-attB-UAS14-gyp[3xp3-eYFP]), szczegółowo opisując dostępne miejsca restrykcyjne (EcoRI, NheI, XhoI oraz NcoI) w obrębie wielomiejscowych stron klonowania, które nadają się do wstawienia konstruktu spinki lub sekwencji kodującej interesujący gen. Przedstawiono również strukturę linii dokującej. (B) Zilustrowano etap krzyżowania, wskazując na użycie samców z linii sterującej (niosących sterownik GAL4 pod kontrolą promotora interesującego genu oraz eCFP sterowanego przez promotor 3xP3) i samic z linii odpowiadającej (niosących interesujący gen lub konstrukt spinki pod kontrolą promotora UAS oraz marker eYFP sterowany przez promotor 3xP3). (C) Schematyczne przedstawienie sterowania ekspresją interesującego genu przez GAL4 w potomstwie z krzyżowania opisanego w punkcie B oraz lista niektórych typowych fenotypów poddawanych ocenie. Skróty: Multiple Cloning Site (MCS) – wielomiejscowa strona klonowania, Recombinase mediated cassette exchange (RMCE) – wymiana kasety oparta na rekombinazie, Upstream Activator Sequence (UAS) – sekwencja aktywatora upstream, enhanced yellow fluorescent protein (eYFP) – ulepszone żółte białko fluorescencyjne, enhanced cyan fluorescent protein (eCFP) – ulepszone cyjanowe białko fluorescencyjne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

To właśnie wykorzystanie krzyżówek nadaje systemowi GAL4-UAS jego dwuczęściowy charakter, co zapewnia wyraźne zalety w porównaniu do podejść bardziej liniowych. Przykładowo, można ocenić znacznie więcej kombinacji linii driver i responder, niż byłoby to możliwe, gdyby dla każdej kombinacji promotora i genu należało wygenerować i utrzymywać nową linię transgeniczną. Co ważniejsze, pozwala to na analizę genów, których zaburzona ekspresja prowadzi do fenotypów letalnych lub sterylnych, co jest trudne do osiągnięcia i utrzymania w systemie liniowym. Takie fenotypy letalne mogą objawiać się na wszystkich etapach rozwoju, w zależności od funkcji genu i ekspresji spatiotemporalnej, lecz najczęściej obserwuje się je podczas rozwoju embrionalnego. Wizualizacja rozwoju embrionów komara wymaga usunięcia nieprzezroczystego chorionu pokrywającego jaja. Opierając się na metodach opisanych przez Trpiša (1970)21 oraz Kaisera i wsp. (2014)22, opisujemy stosowane przez nas protokoły utrwalania embrionów z zachowaniem ich integralności strukturalnej oraz wybielania w celu usunięcia endochorionu, co umożliwia wizualizację mikroskopową i obrazowanie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Projektowanie i konstrukcja konstruktów UAS

  1. Projektowanie i składanie wektorów do ekspresji genów kandydackich
    1. Wyznaczyć sekwencję, która zostanie wykorzystana do nadekspresji kandydującego genu.
      1. Przeprowadź sekwencjonowanie cDNA/gDNA z interesującego szczepu i porównaj je z opublikowaną sekwencją, aby zweryfikować jego tożsamość oraz zidentyfikować potencjalne polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (SNP) i miejsca restrykcyjne dla trawienia diagnostycznego.
      2. Należy upewnić się, że starter forward użyty do amplifikacji genu obejmuje natywną sekwencję Kozaka oraz kodon startowy, jeśli jest to odpowiednie. Starter z wiązaniem na ok. 10 bp powyżej kodonu startowego obejmie sekwencję Kozaka.
      3. W większości przypadków należy uwzględnić kodon stop w fragmencie amplifikowanym za pomocą primera odwrotnego. Należy zastosować sekwencje terminacyjne 3' zawarte w opisanych wektorach plazmidowych lub przeprowadzić amplifikację z genomicznych sekwencji genów kandydackich.
      4. W razie potrzeby zamów komercyjne sekwencje o specyficznym skrzywieniu kodonowym.
    2. Należy zastosować standardowe procedury subklonowania w celu wprowadzenia kaset genowych do wektorów plazmidowych UAS, np. pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP]15 (Rysunek 1) zarówno dla konstruktów nadekspresyjnych, jak i RNAi.
    3. Wytwarzanie transgenicznych komarów przy użyciu wymiany kasety pośredniczonej przez rekombinację ΦC3110,17,18,23.
  2. Tworzenie konstruktów spinki RNAi: amplifikacja jednowymiarowa z wykorzystaniem asymetrycznej PCR15,24
    1. Izolacja genomowego DNA (gDNA) od dorosłej samicy An. gambiae zawierającym pożądany gen kandydujący z zastosowaniem metody Livaka25.
      1. Zaprojektuj starter forward tak, aby wiązał się z egzonem docelowym na końcu 5' pożądanego fragmentu, w kierunku sąsiedniego intronu. Zaprojektuj koniec 3' startera mostkowego tak, aby wiązał się z końcem poprzedzającego egzonu w celu amplifikacji intronu. Koniec 5' powinien być komplementarny do krótkiego fragmentu egzonu docelowego znajdującego się bezpośrednio za intronem.
    2. Przeprowadzić asymetryczną reakcję PCR zgodnie z opisem w pracy Xiao (2006)24 (Rycina 2).
    3. Klonuj oczyszczony produkt PCR do odpowiedniego wektora zawierającego promotor UAS (np. pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP]15).
      UWAGA: Enzymy w obrębie wielokrotnej strony klonowania, które są odpowiednie do pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP] klonowanie15 a kolejne wymagane kroki są wskazane w Rycina 1. Trawienie pojedynczym enzymem jest niezbędne, ponieważ dodano tylko jedną miejsce restrykcyjne. Defosforylacja plazmidu zwiększy wydajność klonowania.
  3. Konstrukcja konstruktów spinek RNAi: PCR fuzji cDNA i gDNA15
    1. Izolacja genomowego DNA (gDNA) od dorosłej samicy An. gambiae niosący pożądany gen kandydujący z zastosowaniem metody Livaka25.
      1. Dodaj gDNA do reakcji PCR w celu amplifikacji obszaru docelowego zawierającego sekwencje eksonów i intronów razem (Rysunek 2).
      2. Zaprojektuj koniec 3' startera forward tak, aby wiązał się z sekwencją odwrotnego eksonu docelowego w celu amplifikacji w kierunku sekwencji intronu docelowego, a koniec 5' tak, aby zawierał miejsce restrykcyjne ułatwiające klonowanie.
      3. Zaprojektuj starter odwrotny (1) tak, aby wiązał się z końcem 5' intronu, przy czym nawis końcówki 5' powinien zawierać pierwsze zasady sekwencji bezpośredniej sąsiedniego eksonu. Nawis ten jest wykorzystywany w reakcji fusion PCR.
      4. Oczyścić pożądany produkt reakcji.
    2. Ekstrakcja RNA, usuwanie DNA za pomocą DNazy i przygotowanie cDNA z dorosłej samicy An. gambiae zawierającego pożądany gen kandyducyjny, zgodnie z protokołami producenta.
    3. Użyj cDNA w reakcji PCR, aby przeprowadzić amplifikację wyłącznie docinkowego obszaru eksonu (Rysunek 2).
      1. Zaprojektuj starter forward (2) w taki sposób, aby jego koniec 3' wiązał się z końcem 3' komplementarnej sekwencji docelowego eksonu, a koniec 5' startera zawierał miejsce restrykcyjne do wykorzystania w klonowaniu.
        UWAGA: Starter forward z etapu 1.3.1.2 może zostać ponownie wykorzystany w tej drugiej reakcji. Oznacza to jednak, że niezbędne będzie przeprowadzenie trawienia pojedynczym enzymem. Zastosowanie drugiego startera forward z innym miejscem restrykcyjnym umożliwi trawienie podwójne, co może zwiększyć wydajność klonowania.
      2. Zaprojektuj primer odwrotny (2) – jego koniec 3' wiąże się z końcem 5' sąsiedniego eksonu, amplifikując ekson docelowy. Koniec 5' wiąże się z końcem 3' pasma prowadzącego intronu. Ten nawis jest wykorzystywany w reakcji fusion PCR.
      3. Oczyścić pożądany produkt reakcji.
    4. Produkty z kroków 1.3.1 i 1.3.2 należy wykorzystać jako matryce w reakcji fusion PCR, stosując standardowe stężenia primerów Forward 1 i 2. Następnie należy oczyścić pożądany produkt.
    5. Trawić oczyszczony produkt, aby wygenerować nadwieszenia do klonowania. Klonować do odpowiedniego wektora w miejscu downstream od promotora UAS. Odpowiednie enzymy do klonowania pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP]15 a kolejne wymagane kroki zostały wskazane w Rysunek 1.

Schemat asymetrycznego PCR i PCR fuzji; celowanie w eksony i introny; trawienie enzymatyczne; technika edycji genów.
Rysunek 2 - Schematyczne przedstawienie tworzenia konstruktów RNAi do insercji do pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP] za pomocą dwóch metod: (A) jednoczynnikowy asymetryczny PCR (zaadaptowany z Xiao. Y H et al (2006) oraz (B) wielostopniowy PCR fuzji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. An. gambiae przesiewowe badanie poczwarek

  1. Zbieranie poczwarek do charakterystyki mikroskopowej
    UWAGA: W poniższych protokołach termin „woda” odnosi się do wody destylowanej uzupełnionej o 0,01% soli stawowej.
    1. Hodować komary An. gambiae zgodnie ze standardowymi protokołami (np. MR426) do stadium poczwarki.
      OSTRZEŻENIE: Należy uważać, aby nie uszkodzić poczwarek podczas tego procesu.
    2. Zebrać poczwarki na przezroczystą płaską płytkę odpowiednią do użycia ze stereomikroskopem (np. plastikową płytkę Petriego 100 x 15 mm, unikając krawędzi).
      UWAGA: Do zbierania poczwarek używamy plastikowej pipety Pasteura o pojemności 3 mL, z odciętym końcem o długości ok. 10 mm, aby poszerzyć wylot i zapobiec uszkodzeniu komarów. Przesiewanie i wyznaczanie płci można przeprowadzać indywidualnie, jednak jest to proces bardzo powolny. Zaleca się przeprowadzanie przesiewania i wyznaczania płci w grupach od 50 do 200 poczwarek (maksymalna wielkość grupy jest ograniczona rozmiarem użytej płytki i zależy od preferencji operatora). Przy przesiewaniu dużej liczby osobników wydajność można zwiększyć, układając najpierw poczwarki w liniach o głębokości około 4 do 5 osobników i przesuwając wybrane poczwarki poza tę linię.
    3. Za pomocą pipety Pasteura ostrożnie usunąć prawie całą wodę z okolic poczwarek. Pozostawić tylko tyle wody, aby poczwarki były praktycznie nieruchome, ale można je było łatwo przesuwać za pomocą cienkiego pędzla. Jeśli przesuwanie stanie się trudne, należy dodać więcej wody.
      UWAGA: Po usunięciu odpowiedniej ilości wody poczwarki położą się na boku, co umożliwi wizualizację oczu w celu detekcji fluorescencji oraz identyfikację dimorficznych genitaliów (Rycina 4DE).
      OSTRZEŻENIE: Należy upewnić się, że poczwarki nie wyschną. Jeśli pozostanie bardzo mała objętość wody, może ona dodatkowo odparować pod wpływem ciepła z lampy mikroskopu oraz w wyniku podziału na kilka grup poczwarek. W trakcie procesu może być konieczne dodanie dodatkowej wody do wybranych grup za pomocą pipety Pasteura 3 mL.
  2. Identyfikacja markerów fluorescencyjnych w poczwarkach
    UWAGA: Użycie stereoskopu o niskim powiększeniu pozwala na przesiewanie szerokiego pola; sortowanie można przeprowadzić na odwróconym mikroskopie złożonym, ale musi ono odbywać się indywidualnie.
    1. Podczas przesiewania w poszukiwaniu markera fluorescencyjnego kluczowe jest uprzednie poznanie oczekiwanych wzorców ekspresji i dziedziczenia. Należy wziąć pod uwagę następujące kwestie:
      1. Kolor(y): określenie, który(-e) filtr(-y) zastosować w celu wizualizacji ekspresji.
      2. Spacjoczasowy wzorzec ekspresji: zrozumienie, gdzie i na jakim etapie życia oczekiwana jest ekspresja.
      3. Stosunek różnych fenotypów: ustalenie, jaki procent populacji powinien posiadać interesujące nas markery.
    2. Przesiewanie fluorescencyjne należy przeprowadzać w ciemności, ponieważ nawet słabe światło może zakłócać rozdzielczość fluorescencji. Należy jednak używać lampy obok stereoskopu, gdy światło jest wymagane do innych czynności.
      OSTRZEŻENIE: Przed wyłączeniem świateł należy upewnić się, że przestrzeń robocza wokół fluorescencyjnego stereoskopu jest wolna od przeszkód.
    3. Włączyć żarówkę fluorescencyjną i pozostawić ją do rozgrzania przez czas zalecany przez producenta (zazwyczaj 10-15 min). Wybrać wymagany filtr w stereoskopie fluorescencyjnym i sprawdzić, czy widoczna jest kolorowa wiązka światła skierowana w centrum stolika. Jeśli nie jest ona widoczna lub jest bardzo słaba, żarówka fluorescencyjna mogła nie rozgrzać się całkowicie, przysłona jest zamknięta lub optyka mikroskopu nie jest dobrze skalibrowana.
    4. Używając światła białego, wycentrować poczwarki w polu widzenia i ustawić ostrość. Powiększenie może wymagać zmiany podczas przełączania między różnymi filtrami, w zależności od intensywności fluorescencji.
    5. Używając cienkiego pędzla do detali, upewnić się, że badane poczwarki na siebie nie nachodzą.
    6. Wyłączyć białe światło stereoskopu i za pomocą pokrętła mikroometru ustawić ostrość na obszar poczwarek wykazujących interesujący nas fenotyp. Wzorzec fluorescencyjny powinien być widoczny. Przykłady fluorescencji kontrolowanej przez promotor 3xP3 przedstawiono na Rycini 3.
      1. Stosować najniższe powiększenie, przy którym oczekiwany fenotyp fluorescencyjny można niezawodnie odróżnić od osobników niewykazujących fluorescencji.
      2. W przypadku szczepów o silnej fluorescencji podczas przesiewania można jednocześnie używać światła w jasnym polu o niskiej intensywności, jeśli sygnał fluorescencyjny jest nadal wyraźnie identyfikowalny.
      3. Po zakończeniu przesiewania wstępnego szybko przeskanować populacje pod innymi filtrami, aby wykryć potencjalne zanieczyszczenia.
        OSTRZEŻENIE: Należy zachować wyraźny odstęp między grupami posortowanych poczwarek, aby zapobiec zanieczyszczeniom wynikającym z ruchu poczwarek. Należy pamiętać, że wielkość grup będzie się zmieniać w miarę wyznaczania płci poczwarek, a odległości mogą wydawać się większe podczas obserwacji pod powiększeniem. Należy zachować szczególną ostrożność, gdy grupy nie znajdują się w polu widzenia.

Analiza ekspresji białek fluorescencyjnych; YFP, dsRed, CFP; obraz mikroskopowy, ekspresja genów.
Rysunek 3 - Poczwarki Anopheles gambiae wykazujące ekspresję markerów fluorescencyjnych pod kontrolą promotora 3xP3: (A) eYFP, (B) dsRed oraz (C) eCFP. Powiększenie: A=16X, B,C=20X. 

  1. Określanie płci pociwarek
    1. Zebrać poczwarki. Usunąć nadmiar wody, pozostawiając jednak taką jej ilość, aby pławiki analne lekko oddaliły się od genitaliów, co ułatwi wizualizację i charakterystykę morfologiczną (Rycina 4D,E).
    2. Jeśli któraś z poczwarek nie znajduje się na boku, należy użyć cienkiego pędzla modelarskiego, aby delikatnie ją obrócić i przesunąć płytki analne w taki sposób, by można było zidentyfikować genitalia zewnętrzne.
    3. Oddziel poczwarki na podstawie charakterystycznych narządów kopulacyjnych; samce posiadają długą rurkę wysuwającą się z ostatniego segmentu grzbietowego, której długość wynosi w przybliżeniu połowę długości płatków analnych (Rycina 4B). Narządy płciowe zewnętrzne poczek polek są znacznie krótsze i rozwidlone (Rycina 4A).
      UWAGA: W niektórych przypadkach, jeśli 4th pozostałości egzoszkieletu larwy z tego stadium pozostają przytwierdzone lub genitalia zewnętrzne są uszkodzone (Rysunek 4C), pewna identyfikacja płci jest trudniejsza. W przypadku, gdy płeć poczwarki nie jest jednoznaczna, najlepszą praktyką jest jej odrzucenie. Jeśli osobnik ma zostać zachowany, należy pozwolić poczwarce na przejście przeobrażenia w izolacji, a następnie określić płeć na podstawie cech morfologicznych osobnika dorosłego. Istnieje prawdopodobieństwo, że w przypadku uszkodzenia narządów kopulacyjnych osobnik ten nie będzie w stanie skutecznie kopulować.
    4. Utwórz osobną grupę dla każdej płci na przeciwległym końcu szalki względem grupy nieoznaczonej, przenosząc zidentyfikowane poczwarki przez szalkę za pomocą cienkiego pędzla detalingowego. Oznacz spód szalki w miejscach, w których zostaną zgromadzone obie grupy, aby móc je później zidentyfikować.
    5. W przypadku konieczności przeprowadzenia zarówno oznaczenia płci, jak i przesiewu fluorescencyjnego, w pierwszej kolejności należy wykonać przesiew fluorescencyjny, ponieważ jest on procesem szybszym.

Schemat mikroskopowy poczwarek komarów wykazujący różnice morfologiczne między samcami a samicami.
Rysunek 4 - Określanie płci poczwarek Anopheles gambiae. Poszczególne poczwarki wykazujące narządy płciowe zewnętrzne (A) samicy, (B) samca oraz (C) osobnika, którego nie można było łatwo zidentyfikować z powodu niepełnego odrzucenia egzoszkieletu larwalnego. Poniżej powiększone obrazy uwidaczniające narządy płciowe zewnętrzne. Poczwarki z oznaczeniami ♀ (samica) i ♂ (samiec) wykazujące narządy płciowe zewnętrzne poczwarek w warunkach, gdy (D) ok. 50% poczwarki jest zanurzone w wodzie oraz (E) po całkowitym usunięciu wody, co uwidacznia różnicę w łatwości wizualizacji narządów płciowych zewnętrznych. Powiększenie: A, B, C=40x, D, E=30x. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

  1. Potwierdzenie płci osobników dorosłych
    1. Do czasu wykazania bardzo niskiego poziomu błędów, należy potwierdzać płeć poczwarek na podstawie morfologii osobników dorosłych po ich wyjściu z poczwarek. Rozdzielone według płci poczwarki należy umieścić w grupach po maksymalnie 10 osobników w przezroczystej probówce o pojemności 20 mL z kilkoma mL wody, zamknąć kulką waty, opisać oczekiwaną płcią i pozostawić do wyklucia na noc.
      UWAGA: Ponieważ osobniki dorosłe są przenoszone następnego ranka, nie jest konieczne dostarczanie im pokarmu podczas wykluwania.
    2. Następnego dnia należy potwierdzić płeć wyklutych osobników dorosłych, wykorzystując cechy morfologiczne.
    3. Jeśli w kolekcjach samic znajdą się jakiekolwiek samce, należy odrzucić te samice, aby wykluczyć możliwość wcześniejszego kopulowania.
    4. Jeśli w kolekcji samców znajdą się samice, należy je usunąć, a samce zachować do krzyżowania.
  2. Zakładanie krzyżówek systemu GAL4-UAS
    1. Odessać pożądaną liczbę dorosłych samców i samic z probówek z kroku 2.4 do klatki lub małego pojemnika przygotowanego w standardowy sposób do hodowli An. gambiae.
      UWAGA: Należy uważać, aby nie uszkodzić osobników dorosłych podczas tego przenoszenia.
    2. W przypadku zapotrzebowania na około 2000 osobników z potomstwa, należy użyć około 50 samic i odpowiadającej im liczby samców.
      UWAGA: W przypadku krzyżówek, które mają być karmione wielokrotnie w celu uzyskania wielu partii potomstwa, w klatkach o wymiarach 30 cm x 30 cm x 30 cm można ustawić do 200 osobników każdej płci. Gdy do krzyżówki dostępna jest tylko niewielka liczba samic (<20), dodajemy około 4x więcej samców, aby zwiększyć prawdopodobieństwo udanego kopulowania.
    3. Karmić skrzyżowane samice krwią i hodować potomstwo do odpowiedniego stadium, zgodnie ze standardowymi protokołami26, w celu przeprowadzenia oceny fenotypowej (np. testy odporności na insektycydy, pojemności wektora i kosztów dostosowawczych).
    4. W przypadku prawdopodobnego wystąpienia efektu macierzyńskiego w ekspresji transgenu, należy przeprowadzić krzyżówki odwrotne linii sterującej (driver) i respondera oraz ocenić oczekiwany fenotyp.
      UWAGA: Krzyżówki z wykorzystaniem populacji „heterozygotycznych” lub mieszanych linii sterujących i responderów dają potomstwo o każdym z 4 możliwych genotypów. Zapewnia to kontrole typu dzikiego, tylko UAS i tylko GAL4, a także transheterozygoty GAL4-UAS, na których można analizować fenotyp. Jeśli krzyżowane są populacje homozygotyczne, należy ustawić dodatkowe krzyżówki w celu zapewnienia odpowiednich kontroli do porównania fenotypów. Potomstwo powinno zostać przesiewane jak opisano powyżej, oddzielając osobniki posiadające oba markery lub tylko jeden z nich, a także osobniki negatywne, w celu oceny fenotypowej.
  3. Tworzenie populacji homozygotycznych z linii generowanych metodą RCME z alternatywnymi markerami fluorescencyjnymi
    UWAGA: Niezbędne jest, aby marker fluorescencyjny obu linii znajdował się w tym samym miejscu genomowym i był całkowicie rozróżnialny.
    1. Przeprowadzić krzyżówkę rodzicielską około 200 osobników dorosłych z równą liczbą różnie oznakowanych samców jednej linii i samic drugiej linii, po przesiewaniu w celu wyboru osobników wykazujących prawidłową fluorescencję i płeć, jak opisano powyżej. Około tydzień później karmić krzyżówkę krwią zgodnie z ustalonymi protokołami26.
      1. Hodować potomstwo F1 do stadium poczwarki zgodnie ze standardowymi protokołami i zbierać poczwarki w opisany wcześniej sposób.
    2. Przesiewać pod kątem fluorescencji, wybierając osobniki posiadające oba markery rodzicielskie (transheterozygoty). Z tych poczwarek przeprowadzić krzyżówkę wewnątrzpokoleniową F1.
    3. Tydzień później karmić samice F1 krwią i hodować potomstwo do stadium poczwarki zgodnie ze standardowymi protokołami.
    4. Przesiewać poczwarki F2, wybierając te, które wykazują TYLKO jeden z markerów. Będą one homozygotyczne pod względem insercji. Tylko 25% potomstwa będzie homozygotyczne dla każdej insercji, dlatego należy zapewnić wyhodowanie wystarczającej liczby potomstwa, aby uzyskać klatkę z populacją zapasową (400-500).
      UWAGA: Seleksja potomstwa transheterozygotycznego musi być całkowicie rygorystyczna, w przeciwnym razie proces zostanie zanieczyszczony i może nie zostać osiągnięta pełna homozygotyczność. Należy dwukrotnie sprawdzić wszystkie osobniki wybrane do krzyżówki wewnątrzpokoleniowej F1.

3. An. gambiae protokół klarowania zarodków

  1. Karmienie krwią i utrzymanie
    1. Hodować komary An. gambiae  do stadium dorosłego zgodnie ze standardowymi protokołami (np. MR4).
    2. Podać krew samicom w wieku 5-7 dni, upewniając się, że większość z nich jest w pełni nasycona.
      UWAGA: W trakcie realizacji tego protokołu kluczowe jest szybkie tempo pracy, aby zapobiec wysychaniu jaj.
  2. Indukowane składanie jaj
    1. 3 dni po karmieniu krwią zebrać jaja poprzez indukowane składanie.
    2. Zmontować komorę do składania jaj.
      1. Napełnić pojemnik do składania jaj wodą do głębokości około 5 mm. Przymocować pojemnik do jednego końca probówki z polipropylenu o objętości 50 mL, wcześniej przeciętej piłką do metalu tak, aby oba końce były otwarte. (Używamy plastikowego dysku jako pojemnika (Rysunek 5); można jednak użyć oryginalnej zakrętki probówki).
      2. Przykryć drugi koniec przeciętej probówki polipropylenowej materiałem (wężykiem/rajstopami) lub fragmentami rękawiczki lateksowej zabezpieczonymi gumką recepturką, aby dorosłe osobniki mogły zostać wprowadzone, ale nie mogły uciec (Rysunek 5). Istnieją i mogą być stosowane inne alternatywne konstrukcje komór do składania jaj26.
    3. Ostrożnie wprowadzić 10-15 samic (nakarmionych krwią w kroku 3.1.2) do komory do składania jaj. Przykryć komorę, aby stworzyć ciemność, i pozostawić na 20 minut.
      UWAGA: Unikać przesuwania pojemnika do składania jaj po złożeniu jaj, aby zapobiec ich osadzeniu się na ściankach i wysychaniu.
    4. Ostrożnie odłączyć probówkę polipropylenową 50 mL od pojemnika do składania jaj, dbając o to, aby nie wypuścić komarów. Powinny być widoczne białe jaja. Sprawdzić, czy zostało złożone wystarczająca ich liczba do zamierzonego celu. W razie potrzeby powtórzyć czynność.
    5. Przykryć pojemnik (w celu ochrony przed kurzem) i pozwolić jajom dojrzeć do interesującego etapu rozwoju.
    6. Użyć cienkiego pędzla modelarskiego, aby zebrać jaja z pojemnika i umieścić je na wodzie w wyżłobionym bloku szklanym o rozmiarze 40 mm2.

Układ eksperymentalny dla równowagi statycznej z zakrętką probówki, gumkami; schemat przedstawia montaż krok po kroku.
Rycina 5 - Przykład komory do składania jaj (A) w rozkładzie w celu wyróżnienia poszczególnych elementów oraz (B) po złożeniu. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Fiksacja embrionów
    OSTRZEŻENIE: Wszystkie etapy fiksacji (krok 3.3) należy przeprowadzać w dygestorium ze względu na użycie formaldehydu.
    1. Przygotować roztwór FAA zgodnie z opisem w Kaiser et al. (2014)22. FAA składa się z 3,6 M formaldehydu, 0,87 M kwasu octowego i 8,5 M absolutnego etanolu, dopełnionych do objętości wodą destylowaną (dH2O).
      1. Aby otrzymać 10 mL FAA, połączyć 2,68 mL 13,42 M formaldehydu, 4,96 mL 17,14 M etanolu oraz 0,5 mL 17,4 M kwasu octowego z 1,86 mL destylowanej H2O. Fiksatyw można przechowywać przez co najmniej 3 miesiące w szczelnie zamkniętym szklanym pojemniku w wyznaczonej szafce na odczynniki chemiczne.
    2. Ostrożnie usunąć wodę z bloku szklanego za pomocą mikropipety, pokryć jaja 500 µL FAA i delikatnie mieszać (~25 RPM) na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Na tym etapie nie jest widoczna żadna zmiana barwy.
    3. Dokładnie wypłukać jaja wodą destylowaną. Płukanie należy powtórzyć 15 razy, aby usunąć wszelkie ślady formaldehydu. Używając mikropipety 1000 µL, należy dodawać i usuwać po 1 mL dH2O na raz, dbając o to, aby nie uszkodzić jaj.
    4. Wodę z płukania należy zbierać do wyznaczonego pojemnika na odpady zawierające formaldehyd i utylizować zgodnie z wytycznymi bezpieczeństwa.
    5. Na tym etapie ufiksowane jaja można przechowywać przez noc w wodzie w temperaturze 4 °C, aby zapobiec ich odwodnieniu.
  2. Wybielanie embrionów
    OSTRZEŻENIE: Wszystkie etapy wybielania (krok 4) należy przeprowadzać w dygestorium ze względu na możliwość wydzielenia chloru podczas łączenia podchlorynu sodu z kwasem octowym.
    1. Przygotować roztwór do wybielania (roztwór Trpiša – opisany w Trpiš (1970)21 i zmodyfikowany zgodnie z Kaiser et al. (2014)22). Roztwór Trpiša to 0,59 M podchloryn sodu i 0,35 M kwas octowy rozpuszczone w destylowanej H2O.
      1. Aby otrzymać 10 mL roztworu Trpiša, połączyć 2,68 mL 2,2 M podchlorynu sodu i 0,2 mL 17,4 M kwasu octowego z 7,12 mL destylowanej H2O.
        UWAGA: Roztwór Trpiša można przechowywać przez co najmniej 3 miesiące w szczelnie zamkniętym szklanym pojemniku w zabezpieczonej szafce chemicznej. Po przechowywaniu roztwór może wymagać wymieszania w wortexie i zawsze należy go otwierać w dygestorium z uwagi na możliwość wydzielenia chloru.
    2. Pokryć ufiksowane jaja 1 mL roztworu Trpiša i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po około 5 minutach inkubacji na jajach zaczną pojawiać się blade plamy, a po całkowitym przejaśnieniu nabiorą one mleczno-białego koloru.
    3. Wypłukać jaja w sposób opisany w kroku 3.3.3, aby usunąć roztwór Trpiša.
    4. Wodę z płukania należy zebrać do wyznaczonego pojemnika na odpady i utylizować wraz z nadmiarem wody w zlewie.
  3. Przechowywanie
    1. Przechowywać w 500 µL dH2O w temperaturze 2-8 °C przez kilka dni. Przed oglądaniem i obrazowaniem masowym ostrożnie usunąć większość wody, pozostawiając niewielką objętość w szkiełku zegarowym, aby zapobiec wysychaniu jaj. Nie wpłynie to negatywnie na fotografowanie jaj. Pojedyncze jaja można umieścić na szkiełku mikroskopowym w celu obrazowania przy większym powiększeniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

3xP3 ekspresja eYFP, dsRed i eCFP zapewnia niezawodną i łatwo rozróżnialną identyfikację osobników posiadających geny markerowe wykazujące ekspresję w oczach i zwojach brzusznych poczek An. gambiae (Rysunek 3). Różnice morfologiczne zaobserwowane w zewnętrznych narządach płciowych samców i samic wykorzystywane do określania płci oraz przykład poczwej nieidentyfikowalnej przedstawiono na Rysunku 4. Usunięcie całej wody z poczew utrudnia określan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zrozumienie funkcji genów komarów ma zasadnicze znaczenie dla opracowania nowych podejść do zwalczania Anopheles i wpływania na przenoszenie malarii. Opisany system GAL4-UAS jest wszechstronnym i wydajnym systemem do funkcjonalnej analizy genów kandydujących i do tej pory używaliśmy go do badania genetycznych podstaw odporności na insektycydy 17 i produkcji węglowodorów kutykularnych 15,23, a także do fluorescencyjnego znakowania różnych populacji komórek komarów 8...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Z wdzięcznością dziękujemy za finansowanie od LSTM i IVCC (Adriana Adolfi), BBSRC (New Investigator Award (AL), MRC (stypendium doktoranckie dla BCP:MR/P016197/1), Wellcome (stypendium podoktorskie Sir Henry Wellcome dla LG: 215894/Z/19/Z), które uwzględniły analizę Gal4UAS w swoich propozycjach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Plastikowa szalka Petriego 100 x 15 mmSLS2175546opakowanie 10 sztuk
1000 &mikro; L Pipeta GilsonProbówka uniwersalna GilsonF144059P
20/25 mlStarlabE1412-3020Zestaw 400
pipet Pasteura 3 mlSLSG612398Pipeta Pasteura 3 ml sterylna, pakowana pojedynczo
50 ml probówki FalconFisher Scientific11512303
Absolutny etanolFisher ScientificBP2818-500500 ml
Kwas octowySLS45726-1L-F1 L
KlatkiSLSE609930x30x30 z portem ekranu
Drobne pędzle malarskieAmazonUKDPB66KOLAMOON 9 sztuk Zestaw pędzli do malowania detali Miniture Pędzle do akwareli, malarstwa akrylowego, obrazu olejnego (czerwone wino)
Pokarm dla rybAmazonkaTetra Min Fish Food, Kompletny pokarm dla wszystkich ryb tropikalnych dla zdrowia, koloru i witalności, 10 l 
Roztwór formaldehyduSigma AldrichF8775
Aspirator do ustJohn Hock612
Sól stawowaAmazonBlagdon Guardian Pond Tonic Salt, dla zdrowia ryb, jakości wody, ogólnego toniku, buforu pH, 9,08 kg, smakołyki 9,092 l 
Doniczki z poczwarkamiCater4youSP8OZ250 doniczek z pokrywkami
Małe plastikowe wiadraAmazon2,5 l białe plastikowe wiadro w komplecie z białą pokrywką (opakowanie 10 sztuk) 
Podchloryn soduFisher ScientificS25552

Bibliografia

  1. Brand, A. H., Perimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  2. Duffy, J. B. GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife. Journal of Genetics and Development. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  3. Dow, J. A. ELS. , John WIley & Sons, Ltd. (2012).
  4. Edi, C. V., et al. CYP6 P450 Enzymes and ACE-1 Duplication Produce Extreme and Multiple Insecticide Resistance in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae. PLoS Genetics. 10 (3), 1004236(2014).
  5. Daborn, P. J., et al. Using Drosophila melanogaster to validate metabolism-based insecticide resistance from insect pests. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (12), 918-924 (2012).
  6. Riveron, J. M., et al. Genome-wide transcription and functional analyses reveal heterogeneous molecular mechanisms driving pyrethroids resistance in the major malaria vector Anopheles funestus across Africa. Genes Genomes Genetics. 7 (6), 1819-1832 (2017).
  7. Riveron, J. M., et al. A single mutation in the GSTe2 gene allows tracking of metabolically based insecticide resistance in a major malaria vector. Genome Biology. 15 (2), (2014).
  8. Lynd, A., Lycett, G. J. Development of the Bi-Partite Gal4-UAS System in the African Malaria Mosquito, Anopheles gambiae. PLoS ONE. 7 (2), 31552(2012).
  9. Lynd, A., Lycett, G. J. Optimization of the Gal4-UAS system in an Anopheles gambiae cell line. Insect Molecular Biology. 20 (5), 599-608 (2011).
  10. Adolfi, A., Pondeville, E., Lynd, A., Bourgouin, C., Lycett, G. J. Multi-tissue GAL4-mediated gene expression in all Anopheles gambiae life stages using an endogenous polyubiquitin promoter. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 96, 1-9 (2018).
  11. Kokoza, V. A., Raikhel, A. A. Targeted gene expression in the transgenic Aedes aegypti using the binary Gal4-UAS system. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 41, 637-644 (2011).
  12. O'Brochta, D. A., Pilitt, K. L., Harrell, R. A., Aluvihare, C., Alford, R. T. Gal4-based Enhancer-Trapping in the Malaria Mosquito Anopheles stephensi. Genes Genomes Genetics. 2, 21305-21315 (2012).
  13. Zhao, B., et al. Regulation of the Gut-Specific Carboxypeptidase: A Study Using the Binary Gal4/UAS System in the Mosquito Aedes Aegypti. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 54, 1-10 (2014).
  14. Imamura, M., et al. Targeted Gene Expression Using the GAL4/UAS System in the Silkworm Bombyx mori. Genetics. 165 (3), 1329-1340 (2003).
  15. Lynd, A., et al. Development of a functional genetic tool for Anopheles gambiae oenocyte characterisation: application to cuticular hydrocarbon synthesis. bioRxiv. , (2019).
  16. Pondeville, E., et al. Hemocyte-targeted gene expression in the female malaria mosquito using the hemolectin promoter from Drosophila. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 120, 103339(2020).
  17. Adolfi, A., et al. Functional genetic validation of key genes conferring insecticide resistance in the major African malaria vector, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (51), 25764-25772 (2019).
  18. Pondeville, E., et al. Efficient integrase-mediated site-specific germline transformation of Anopheles gambiae. Nature Protocols. 9 (7), 1698-1712 (2014).
  19. Horn, C., Schmid, B. G. M., Pogoda, F. S., Wimmer, E. A. Fluorescent transformation markers for insect transgenesis. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 32, 1221-1235 (2002).
  20. Clements, A. A. Biology of Mosquitoes, Volume 1: Development, Nutrition and Reproduction. 1, CABI Publishing. (1992).
  21. Trpiš, M. A new bleaching and decalcifying method for general use in zoology. Canadian Journal of Zoology. 48, 892-893 (1970).
  22. Kaiser, M. L., Duncan, F. D., Brooke, B. D. Embryonic Development and Rates of Metabolic Activity in Early and Late Hatching Eggs of the Major Malaria Vector Anopheles gambiae. PLoS ONE. 9 (12), 114381(2014).
  23. Grigoraki, L., Grau-Bové, X., Yates, H. C., Lycett, G. J., Ranson, H. Isolation and transcriptomic analysis of Anopheles gambiae oenocytes enables the delineation of hydrocarbon biosynthesis. eLife. 9, 58019(2020).
  24. Xiao, Y. -H., Yin, M. -H., Hou, L., Pei, Y. Direct amplification of intron-containing hairpin RNA construct from genomic DNA. BioTechniques. 41 (5), 548-552 (2006).
  25. Livak, K. J. Organization and Mapping of a Sequence on the Drosophila melanogaster X and Y Chromosomes That Is Transcribed during Spermatogenesis. Genetics. 107 (4), 611-634 (1984).
  26. MR4, CDC, NEI & beiResources. The MR4 Methods in Anopheles Research Laboratory Manual. 5th Edition. , (2015).
  27. Sik Lee, Y., Carthew, R. W. Making a better RNAi vector for Drosophila: use of intron spacers. Methods. 30 (4), 322-329 (2003).
  28. Cha-aim, K., Hoshida, H., Fukunaga, T., Akada, R. Gene Synthesis: Methods and Protocols. Peccoud, J. , Humana Press. 97-110 (2012).
  29. Cavener, D. R. Comparison of the consensus sequence flanking translational start sites in Drosophila and vertebrates. Nucleic Acids Research. 15 (4), 1353-1361 (1987).
  30. Wang, Y., Wang, F., Wang, R., Zhao, P., Xia, Q. 2A self-cleaving peptide-based multi-gene expression system in the silkworm Bombyx mori. Scientific Reports. 5, (2015).
  31. Galizi, R., et al. A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito. Nature Communications. 5, 3977(2014).
  32. Kondo, S., et al. Neurochemical organisation of the Drosophila Brain Visualised by Endogenously Tagged Neurotransmitter Receptors. Cell Reports. 30 (1), 284-297 (2020).
  33. Lee, P. -T., et al. A gene-specific T2A-GAL4 library for Drosophila. eLife. 7, 35574(2018).
  34. Marois, E., et al. High-throughput sorting of mosquito larvae for laboratory studies and for future vector control interventions. Malaria Journal. 11, 302(2012).
  35. Crawford, J. E., et al. Efficient production of male Wolbachia-infected Aedes aegypti mosquitoes enables large-scale suppression of wild populations. Nature Biotechnology. 38 (4), 482-492 (2020).
  36. Goltsev, Y., et al. Developmental and evolutionary basis for drought tolerance of the Anopheles gambiae embryo. Developmental Biology. 330 (2), 462-470 (2009).
  37. Rezende, G. L., et al. Embryonic desiccation resistance in Aedes aegypti: presumptive role of the chitinized Serosal Cuticle. BMC Developmental Biology. 8 (1), 82(2008).
  38. Vargas, H. C. M., Farnesi, L. C., Martins, A. J., Valle, D., Rezende, G. L. Serosal cuticle formation and distinct degrees of desiccation resistance in embryos of the mosquito vectors Aedes aegypti, Anopheles aquasalis and Culex quinquefasciatus. Journal of Insect Physiology. 62, 54-60 (2014).
  39. Chang, C. -H., et al. The non-canonical Notch signaling is essential for the control of fertility in Aedes aegypti. PLOS Neglected Tropical Diseases. 12 (3), 0006307(2018).
  40. Clemons, A., Flannery, E., Kast, K., Severson, D., Duman-Scheel, M. Immunohistochemical Analysis of Protein Expression during Aedes aegypti Development. Spring Harbor Protocols. 10, 1-4 (2010).
  41. Juhn, J., James, A. A. Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries and Embryos of Vector Mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. , e3709(2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Krzy wki genetycznewyciszanie RNAimarkery fluorescencyjneprze raczanie embrion wkontrola ekspresji gen wdeterminacja p ci poczwarek komarainsercja CRISPR
Wykorzystanie systemu GAL4-UAS do genetyki funkcjonalnej u Anopheles gambiae
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.