Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

System in vitro do oceny skuteczności trombolitycznej hestotrypsji i leku litycznego

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62133

⸱

4 czerwca 2021

 ,  , 
1Department of Radiology, University of Chicago, 2Graduate Program in Medical Physics, University of Chicago

W tym artykule

Podsumowanie

Wspomagane przez Histotripsy'ego dostarczanie lityczne lub lizotrypsja są w trakcie opracowywania do leczenia zakrzepicy żył głębokich. Przedstawiono procedurę in vitro mającą na celu ocenę skuteczności tej terapii skojarzonej. Omówiono kluczowe protokoły dotyczące modelu skrzepu, wskazówek obrazowych i oceny skuteczności leczenia.

Streszczenie

Zakrzepica żył głębokich (DVT) jest globalnym problemem zdrowotnym. Podstawowym podejściem do osiągnięcia rekanalizacji naczyń w przypadku krytycznych przeszkód jest trombolityka kierowana przez cewnik (CDT). Aby złagodzić skutki uboczne i długi czas leczenia związany z CDT, opracowywane są metody adiuwantowe i alternatywne. Jednym z takich podejść jest histotrypsja, skoncentrowana terapia ultradźwiękowa mająca na celu ablację tkanki poprzez zarodkowanie chmury pęcherzykowej. Badania przedkliniczne wykazały silną synergię między histotrypsją a lekami trombolitycznymi w degradacji skrzepów. W niniejszym raporcie przedstawiono metodę laboratoryjną służącą do oceny skuteczności terapii trombolitycznej wspomaganej histotrypsją lub lizotrypsją.

Skrzepy wykonane ze świeżej ludzkiej krwi żylnej zostały wprowadzone do kanału przepływowego, którego wymiary i właściwości akustyczno-mechaniczne naśladują żyłę biodrowo-udową. Kanał był perfundowany osoczem i litycznym rekombinowanym tkankowym aktywatorem plazminogenu. Chmury pęcherzykowe zostały wygenerowane w skrzepie za pomocą zogniskowanego źródła ultradźwięków przeznaczonego do leczenia zakrzepów żył udowych. Zmotoryzowane pozycjonery zostały użyte do przesunięcia ogniska źródłowego na całej długości skrzepu. W każdym miejscu insonacji emisje akustyczne z chmury bąbelkowej były pasywnie rejestrowane i formowane wiązką w celu wygenerowania pasywnych obrazów kawitacyjnych. Wskaźniki mierzące skuteczność leczenia obejmowały utratę masy skrzepu (ogólna skuteczność leczenia) oraz stężenia D-dimerów (fibrynolizacja) i hemoglobiny (hemoliza) w perfuzacie. Istnieją ograniczenia w tym projekcie in vitro, w tym brak środków do oceny skutków ubocznych in vivo lub dynamiczne zmiany szybkości przepływu w miarę lizy skrzepu. Ogólnie rzecz biorąc, konfiguracja zapewnia skuteczną metodę oceny skuteczności strategii opartych na histotrypsji w leczeniu zakrzepicy żył głębokich.

Wprowadzenie

Zakrzepica to stan tworzenia się skrzepów w zdrowym naczyniu krwionośnym, które utrudniają krążenie1,2. Żylna choroba zakrzepowo-zatorowa wiąże się z rocznym kosztem opieki zdrowotnej w wysokości 7-10 miliardów dolarów, z 375 000-425 000 przypadków w Stanach Zjednoczonych3. Zatorowość płucna jest niedrożnością tętnicy płucnej i jest najpoważniejszą konsekwencją żylnej choroby zakrzepowo-zatorowej. Głównym źródłem niedrożności płuc jest skrzepliny żył głębokich, głównie z odcinków żył biodrowo-udowych4,5,6. Zakrzepica żył głębokich (DVT) ma nieodłączne następstwa oprócz niedrożności płuc, z długotrwałymi powikłaniami, które skutkują bólem, obrzękiem, owrzodzeniami nóg i amputacjami kończyn7,8,9. W przypadku krytycznych niedrożności, trombolityki kierowane cewnikiem (CDT) są pierwszym podejściem do rekanalizacji naczyń10. Wynik CDT zależy od wielu czynników, w tym wieku skrzepliny, lokalizacji, wielkości, składu, etiologii i kategorii ryzyka pacjenta11. Co więcej, CDT wiąże się z uszkodzeniem naczyń krwionośnych, infekcjami, powikłaniami krwotocznymi i długim czasem leczenia10. Urządzenia nowej generacji mają na celu połączenie trombektomii mechanicznej z trombolitykami (tj. trombektomią farmakomechaniczną)12,13. Stosowanie tych urządzeń obniża dawkę lityczną, co prowadzi do zmniejszenia powikłań krwotocznych i skrócenia czasu leczenia12,13,14 w porównaniu do CDT. Urządzenia te nadal borykają się z problemami związanymi z krwotocznymi skutkami ubocznymi i niepełnym usuwaniem przewlekłych zakrzepów15. W związku z tym potrzebna jest strategia adiuwantowa, która może całkowicie usunąć skrzeplinę przy mniejszych powikłaniach krwotocznych.

Jednym z możliwych podejść jest leczenie trombolityczne wspomagane histotrypsją, określane jako lizotrypsja. Histotripsy to nieinwazyjna metoda leczenia, która wykorzystuje skoncentrowane ultradźwięki do zarodkowania chmur bąbelkowych w tkankach16. Aktywność pęcherzyków jest generowana nie przez jądra egzogenne, ale przez zastosowanie impulsów ultradźwiękowych o napięciu wystarczającym do aktywacji jąder nieodłącznie związanych z tkankami, w tym skrzepu17,18. Mechaniczna oscylacja chmury bąbelkowej nadaje skrzepowi napięcie, rozkładając strukturę na bezkomórkowe szczątki19. Aktywność pęcherzyków hestotrypsji zapewnia skuteczną degradację cofniętych i niecofniętych skrzepów krwi zarówno in vivo, jak i in vitro20,21,22. Wcześniejsze badania wykazały23,24 wykazały, że połączenie histotrypsji i litycznego rekombinowanego tkankowego aktywatora plazminogenu (rt-PA) znacznie zwiększa skuteczność leczenia w porównaniu z samym litykiem lub samą histotrypsją. Przypuszcza się, że dwa podstawowe mechanizmy związane z aktywnością pęcherzyków histotrypsji są odpowiedzialne za poprawę skuteczności leczenia: 1) zwiększona fibrynoliza spowodowana zwiększonym dostarczaniem litów oraz 2) hemoliza czerwonych krwinek w skrzepie. Większość masy skrzepu składa się z czerwonych krwinek24, a zatem śledzenie degradacji erytrocytów jest dobrym substytutem ablacji próbki. Inne utworzone elementy skrzepu są również prawdopodobnie rozpadane pod wpływem aktywności pęcherzyków histotrypsji, ale nie są uwzględniane w tym protokole.

Tutaj przedstawiono podejście laboratoryjne do leczenia zakrzepicy żył głębokich in vitro za pomocą lizotrypsji. Protokół opisuje krytyczne parametry operacyjne źródła histotrypsji, ocenę skuteczności leczenia oraz wskazówki dotyczące obrazu. Protokół obejmuje zaprojektowanie kanału przepływowego naśladującego odcinek żyły biodrowo-udowej i wytwarzanie ludzkich skrzepów krwi pełnej. Procedura eksperymentalna określa umiejscowienie źródła histotrypsji i matrycy obrazowania w celu uzyskania ekspozycji histotrypsji wzdłuż skrzepu umieszczonego w kanale przepływowym. Zdefiniowano odpowiednie parametry insonacji w celu osiągnięcia zakłócenia skrzepu i zminimalizowania aktywności pęcherzyków poza celem. Zilustrowano zastosowanie obrazowania ultrasonograficznego do prowadzenia i oceny aktywności pęcherzyków24. Wskaźniki określające skuteczność leczenia, takie jak utrata masy skrzepu, D-dimer (fibrynoliza) i hemoglobina (hemoliza), są przedstawione23,24,25,26,27. Ogólnie rzecz biorąc, badanie dostarcza skutecznych środków do wykonywania i oceny skuteczności lizotrypsji w leczeniu zakrzepicy żył głębokich.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Dla przedstawionych tutaj wyników, żylna krew ludzka została pobrana w celu utworzenia skrzepów po zatwierdzeniu przez lokalną wewnętrzną komisję rewizyjną (IRB #19-1300) i pisemnej świadomej zgodzie dostarczonej przez ochotniczych dawców24. W tej sekcji przedstawiono protokół projektowy służący do oceny skuteczności lizotrypsji. Protokół jest oparty na wcześniejszej pracy Bollena i wsp.24.

1. Modelowanie skrzepów

UWAGA: Przygotuj skrzepy w ciągu 2 tygodni, ale więcej niż 3 dni przed dniem eksperymentu, aby zapewnić stabilność skrzepu i zmaksymalizować jego retrakcję28. Przygotuj skrzep po uzyskaniu zgody lokalnej instytucjonalnej komisji rewizyjnej.

  1. Przygotować pipetę borokrzemianową Pasteura do przechowywania krwi (specyfikacja pipety znajduje się w Tabeli materiałów). Rurki borokrzemianowe są używane ze względu na hydrofilowy charakter materiału, który sprzyja aktywacji płytek krwi i retrakcji skrzepów29. Uszczelnij końcówkę pipety poprzez podgrzanie nad palnikiem Bunsena.
  2. Pobierz świeżą ludzką krew żylną. Podwielokrotność całkowitej krwi pobranej w odstępach co 2 ml na pożądany skrzep. Przenieść każdą 2 ml porcji do jednej pipety Pasteura.
    UWAGA: Krok 1.2 należy wykonać w ciągu około 3 minut od pobrania krwi, aby krew nie krzepła przed przeniesieniem do pipet. Upewnij się również, że dawca ochotnik nie przyjmuje żadnych leków, które mogą zmienić kaskadę krzepnięcia (np. leki rozrzedzające krew lub inhibitory płytek krwi).
  3. Inkubować porcje krwi w pipetach (równe wymaganej liczbie skrzepów) w łaźni wodnej przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.
  4. Pipety należy przechowywać przez co najmniej 3 dni w temperaturze 4 °C, aby umożliwić wycofanie się skrzepów28. W miarę cofania się skrzepów obserwuje się, że surowica gromadzi się w górnej części skrzepu w pipecie. Odpowiedź rt-PA skrzepów pozostaje stabilna przez 2 tygodnie po wycofaniu28.

2. Przygotowanie zbiornika na wodę

  1. Napełnij zbiornik na wodę wodą z odwróconej osmozy. Wyłóż dolną powierzchnię zbiornika materiałem pochłaniającym dźwięk, aby zmniejszyć odbicie impulsów ultradźwiękowych terapii lub obrazowania. Użyj systemu uzdatniania wody, aby odgazować i przefiltrować wodę, aby zminimalizować jądra pęcherzyków.
    UWAGA: Jednym ze sposobów filtrowania wody jest użycie wbudowanego filtra. Specyfikacja worka wykorzystywanego do generowania reprezentatywnych wyników jest podana w Tabeli Materiałów.
  2. Umieść dwa elementy grzejne na dolnej powierzchni zbiornika. Podgrzej wodę do 37,3 °C, aby osiągnąć maksymalną aktywność enzymatyczną lityczną30.
  3. Ustaw kanał przepływu, jak pokazano na Rysunek 1A. Kanał przepływowy składa się z rurki, modelowego naczynia o właściwościach materiałowych i geometrycznych reprezentatywnych dla żyły biodrowo-udowej, zbiornika na osocze i strzykawki na dalszym końcu zbiornika (tabela materiałów). Strzykawka jest podłączona do pompy w celu regulacji przepływu przez kanał podczas eksperymentu.
  4. Ręcznie zanurz kanał przepływowy w zbiorniku na wodę, aby doprowadzić kanał do temperatury fizjologicznej podczas etapu odgazowywania/filtrowania/ogrzewania (kroki 2.1 i 2.2).

3. Przygotowanie mieszaniny plazmy i rt-PA

  1. Przed dniem eksperymentu
    UWAGA: Przy przechowywaniu w temperaturze -80 °C plazma jest stabilna przez co najmniej 2,5 roku31, a rt-PA jest stabilna przez co najmniej 7 lat32. Dlatego wykonaj krok 3.1 w dowolnym momencie w tych okresach, aby zapewnić stabilność obu komponentów.
    1. Rozcieńczyć rt-PA otrzymany od producenta w postaci sproszkowanej do 1 mg/ml w sterylnej wodzie.
    2. Podać 100 μl rozcieńczonego rt-PA do probówek wirówkowych o pojemności 0,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    3. Podwielokrotność 35 ml świeżo mrożonego osocza ludzkiego typu O w probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml. Przechowywać probówki w temperaturze -80 °C.
  2. W dniu eksperymentu
    1. Pobrać porcje osocza z zamrażarki. Pobrać tyle podwielokrotności, ile skrzepów ma być badanych tego dnia. Zanurzyć zamrożone porcje w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do rozmrożenia (~10 min).
    2. Po rozmrożeniu plazmy wlej ją do zlewki, którą trzykrotnie spłukuje się ultraczystą wodą. Lekko przykryj ujście zlewki folią aluminiową, aby zapobiec zanieczyszczeniu, i umieść zlewkę w łaźni wodnej. Pozwól, aby folia była wystarczająco luźna, aby powietrze mogło zetknąć się z plazmą.
    3. Pozwól, aby plazma zrównoważyła się w temperaturze 37 °C z ciśnieniem atmosferycznym przez co najmniej 2 godziny.
    4. Wyjąć zamrożone fiolki rt-PA i umieścić na lodzie do czasu, aż będą potrzebne, z jedną fiolką na każdy przebieg eksperymentu.
    5. Przygotować agarozę o niskiej żelowości (2%) w kolbie o pojemności 50 ml, rozpuszczając agarozę w ultraczystej wodzie. Wybrać całkowitą ilość roztworu agarozy tak, aby na każdą próbkę, która ma być analizowana, przypadało około 2 ml. Podgrzej roztwór w kolbie w kuchence mikrofalowej, aż zacznie musować. Zabezpiecz kolbę wodoodporną zakrętką. Zanurz kolbę w łaźni wodnej razem z plazmą.
      UWAGA: Ten krok zapewnia, że agaroza jest dostępna w celu zabezpieczenia odsłoniętych segmentów skrzepu do analizy histologicznej po insonacji histotrypsji.

4. Konfiguracja źródła histotrypsji i matrycy obrazowania

  1. Upewnij się, że zmotoryzowane pozycjonery mogą być sterowane ze środowiska uruchomieniowego platformy programistycznej, korzystając ze wskazówek i poleceń dostarczonych przez producenta. Sprawdź, czy silniki systemu są podłączone do odpowiedniego portu komputera ze środowiskiem wykonawczym.
  2. Zamontuj źródło histotrypsji w zmotoryzowanym systemie pozycjonowania, jak pokazano na Rysunek 1B.
  3. Podłącz źródło histotrypsji do jego elektroniki sterującej (np. wzmacniacza mocy i generatora funkcyjnego) za pomocą odpowiednich złączy (np. BNC) zgodnie ze specyfikacją producenta.
    UWAGA: Upewnij się, że elektronika sterująca źródłem histotrypsji może być sterowana za pomocą środowiska wykonawczego użytego w kroku 4.1.
  4. Przykryj matrycę obrazowania osłoną sondy i przymocuj matrycę współosiowo w otworze źródła histotrypsji, jak pokazano na Rysunek 2. Upewnij się, że rozumiesz orientację płaszczyzny obrazowania względem orientacji źródła histotrypsji.
  5. Podłącz matrycę obrazowania do systemu skanowania ultrasonograficznego. Upewnij się, że ten system może sterować działaniem i wyzwalaniem macierzy obrazowania oraz zbierać dane obrazowania, zgodnie z poleceniami dostarczonymi przez producenta skanera.
  6. Zanurz źródło histotrypsji/matrycę obrazowania w zbiorniku podczas odgazowywania, jak pokazano na Rysunek 1A. Delikatnie usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza za pomocą strzykawki z powierzchni źródła histotrypsji lub matrycy obrazowej.
    UWAGA: Przed rozpoczęciem pracy zanurz źródło histotrypsji i matrycę obrazowania całkowicie w wodzie. Unikaj dotykania powierzchni źródła histotrypsji.
  7. Rejestruj obrazy w trybie B z szybkością 20 klatek na sekundę za pomocą matrycy obrazowania i wbudowanych poleceń skanera. Dostosuj okno obrazowania, aby zapewnić wizualizację ostrości źródła histotrypsji na tych obrazach w czasie rzeczywistym.
    UWAGA: Zakłada się, że znane są wymiary obszaru ogniskowego źródła terapeutycznego.
  8. Ustaw parametry pracy źródła histotrypsji, w tym częstotliwość podstawową (np. 1,5 MHz), częstotliwość powtarzania impulsów (np. 20-100 Hz), czas trwania impulsu (np. 1-20 cykli na impuls) i całkowitą liczbę impulsów na lokalizację (np. 100-2,000)18,23,24,33. Zmodyfikować te parametry, jeśli nie zostanie osiągnięta wystarczająca liza skrzepu lub jeśli aktywność pęcherzyków wykracza poza światło naczynia modelowego. Aby ustawić te parametry, należy skorzystać z protokołu dostarczonego przez producenta źródła lub skorzystać z platformy programistycznej, która może komunikować się ze źródłem (Krok 4.3).
  9. Korzystając z protokołu producenta lub platformy programistycznej użytej w kroku 4.8, uruchom źródło histotrypsji z ustawionymi parametrami tylko w odgazowanej wodzie, bez żadnych przeszkód w otaczającym środowisku. Zwiększ napięcie przyłożone do źródła histotrypsji, aż utworzy się chmura bąbelkowa.
  10. Korzystając z obrazowania w czasie rzeczywistym opisanego w kroku 4.7, dostosuj położenie matrycy obrazowania wewnątrz otworu przetwornika konfokalnego, aż chmura bąbelkowa znajdzie się mniej więcej w środku okna obrazu. Chmura bąbelkowa to obszar hiperechogenicznych pikseli w płaszczyźnie obrazowania (Rysunek 3). Dokręć, aby mocno przytrzymać matrycę obrazowania w otworze przetwornika.
    UWAGA: Jeśli matryca jest prawidłowo wyrównana, azymutalne położenie chmury bąbelkowej powinno znajdować się w przybliżeniu na 0 mm w płaszczyźnie obrazowania. Matryca obrazowania może nieznacznie wystawać z wewnętrznej powierzchni źródła terapii, a zatem położenie zasięgu chmury pęcherzyków może różnić się od ogniskowej źródła.
  11. Zidentyfikuj lokalizację chmury bąbelkowej na płaszczyźnie obrazowania. Przypisz ognisko źródła histotrypsji jako środek chmury bąbelkowej (Rysunek 3).
  12. Zapisz wykrytą ogniskową lokalizację (krok 4.11) w oknie obrazowania (Rysunek 3). Możliwym sposobem oznaczenia pozycji ogniskowej jest umieszczenie kursora w celu zapisania lokalizacji w oknie obrazowania, jeśli jest dostępne w platformie obrazowania.
  13. Przerwij insonację i ustaw napięcie przyłożone do źródła histotrypsji na 0 V.

5. Przygotowanie skrzepu

  1. Usuń skrzep z pipety, odcinając uszczelniony koniec szczypcami. Pozwól, aby skrzep wsunął się na szalkę Petriego wraz z surowicą. Jeśli skrzep nie usunie się, delikatnie dociśnij z drugiego końca pipety przez spłukiwanie solą fizjologiczną, aby usunąć skrzep.
  2. Przyciąć skrzep do długości 1 cm za pomocą skalpela, dążąc do uzyskania jednolitego kawałka od środka (tj. z dala od odcinków skrzepu utworzonych na górze lub na dole pipety).
  3. Użyj chusteczki czyszczącej, aby delikatnie osuszyć przeciętą część skrzepu, aby usunąć nadmiar płynu.
  4. Za pomocą pęsety delikatnie umieść skrzep na wadze i zapisz wagę.
  5. Ręcznie podnieś kanał przepływowy ze zbiornika na wodę i wyjmij model naczynia z kanału przepływowego.
  6. Umieść skrzep w naczyniu modelowym za pomocą pęsety i ponownie przymocuj model naczynia do kanału przepływowego.
    UWAGA: W naczyniu modelowym można umieścić nylonowy pręt, aby zapobiec przemieszczaniu się skrzepu w dół z powodu przepływu.
  7. Opuścić kanał przepływowy do zbiornika w taki sposób, aby bliższy koniec stopnia w stosunku do zbiornika był niski w porównaniu ze stroną dystalną. Ustawienie stolika pod takim kątem zapobiega uwięzieniu pęcherzyków w naczyniu modelu, gdy plazma jest wciągana przez kanał przepływowy w kroku 6.1.
  8. Dodać 30 ml osocza do zbiornika za pomocą pipety i monitorować temperaturę, aż osiągnie co najmniej 36 °C.
  9. Za pomocą pipety dozować rt-PA (80,4 μg w 30 ml osocza, 2,68 μg/ml) do zbiornika osocza. Wymieszaj osocze za pomocą pipety, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie rt-PA w zbiorniku.

6. Zalewanie kanału przepływowego

  1. Pobieraj osocze do kanału przepływowego ze zbiornika za pomocą pompy strzykawkowej, aż plazma wypełni naczynie modelowe.
    UWAGA: Jeśli skrzep nie jest równo z nylonowym prętem, użyj krótkich zaciągów pompy z prędkością 60 ml/min, aby spróbować wepchnąć osocze za skrzep lub ręcznie przeciągnąć przez strzykawkę. Ogranicz ilość osocza pobieranego w tym procesie lub napełnij zbiornik za pomocą dodatkowego osocza/rt-PA, aby zapewnić 30 ml roztworu w kanale przepływowym.
  2. Korzystając z pozycjonerów z napędem, ustaw matrycę obrazowania równolegle do długości skrzepu za pomocą skryptu obrazowania (krok 4.7). Równoległe wyrównanie umożliwia użytkownikowi wizualne zapewnienie prawidłowego umieszczenia skrzepu i braku pęcherzyków wewnątrz modelu naczynia.
  3. Wypoziomuj model naczynia ręcznie i wizualnie upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza za pomocą okienka obrazowania (krok 4.7).

7. Procedura eksperymentu

  1. Obróbka wstępna
    UWAGA: Ten krok ma na celu zaplanowanie ścieżki dla źródła histotrypsji/matrycy obrazowania w celu uzyskania jednolitej ekspozycji histotrypsji na całej długości skrzepu.
    1. Ustawić matrycę obrazowania za pomocą zmotoryzowanych pozycjonerów w taki sposób, aby płaszczyzna obrazowania była równoległa do przekroju skrzepu (tj. prostopadła do orientacji opisanej w kroku 6.2).
    2. Pod kierunkiem okna obrazowania (krok 4.7) przesunąć źródło histotrypsji do bliższego końca skrzepu względem zbiornika za pomocą zmotoryzowanych pozycjonerów. W tym momencie dostosuj położenie źródła histotrypsji tak, aby zaznaczony punkt ogniskowy w kroku 4.12 wyrównał się ze środkiem skrzepu.
    3. Określ ścieżkę insonacji wzdłuż długości skrzepu. Aby zdefiniować tę ścieżkę, ustaw trzy punkty trasy wzdłuż długości skrzepu (tj. pozycje silników, w których aktywność pęcherzyków histotrypsji jest zawarta w skrzepie) w odstępach co 5 mm. Wyrównaj punkty trasy w taki sposób, aby ogólny ruch źródła histotrypsji wzdłuż ścieżki był wsteczny w stosunku do przepływu w systemie (tj. pierwszy punkt trasy znajduje się na najbardziej proksymalnym końcu skrzepu względem zbiornika, a trzeci punkt trasy znajduje się w pozycji dystalnej względem zbiornika).
    4. Przed sfinalizowaniem każdego punktu trasy, test ogniowy impulsów ze źródła histotrypsji o tych samych parametrach insonacji co krok 4.8, ale zmniejsz ogólną ekspozycję do 10 całkowitych impulsów. W razie potrzeby wyreguluj położenie źródła histotrypsji za pomocą zmotoryzowanych pozycjonerów, aby powstrzymać aktywność pęcherzyków w skrzepie.
    5. W każdym punkcie trasy zapisz pozycje silnika, korzystając z poleceń dostarczonych przez producenta, podobnie jak w kroku 4.1.
  2. Leczenie
    UWAGA: Ten krok określa procedurę leczenia skrzepu wzdłuż jego długości zgodnie ze ścieżką zdefiniowaną na etapie obróbki wstępnej.
    1. Uruchomić pompę strzykawkową z prędkością 0,65 ml/min i poczekać, aż łąkotka osocza zacznie się poruszać. To natężenie przepływu naśladuje prawie całkowitą niedrożność układu biodrowo-udowego24,34.
    2. Przeplataj ścieżkę utworzoną w kroku 7.1.3 stopniami pośrednimi między ustalonymi punktami trasy o stałym rozmiarze kroku (np. 0,5 mm). Rozmiar kroku jest tak dobrany, aby był mniejszy niż połowa szerokości obszaru ogniskowego mierzonej wzdłuż długości skrzepu (kierunek elewacji matrycy obrazowania). Przesuń źródło histotrypsji za pomocą zmotoryzowanych pozycjonerów w każdym miejscu ścieżki z parametrami insonacji zdefiniowanymi w kroku 4.8.
    3. Monitoruj/obrazuj aktywność pęcherzyków podczas aplikacji impulsu histotrypsji w każdym miejscu ścieżki za pomocą okienka obrazowania (krok 4.7). Wyśrodkuj obraz na histotrypsji, aby ustawić ostrość obrazu tak, aby wymiary obrazu obejmowały 15 mm w azymucie i zakresie. Przed zastosowaniem impulsu histotrypsji w każdej lokalizacji, należy uzyskać obraz w trybie B, aby zapewnić wizualizację skrzepu i modelu naczynia, tworząc skrypt na platformie programistycznej. Upewnij się, że skrypt nawiązuje komunikację ze skanerem przy użyciu poleceń producenta.
    4. Podczas stosowania impulsu histotrypsji zaimplementuj akwizycję emisji akustycznych w skrypcie w kroku 7.2.3, aby utworzyć obrazy kawitacji pasywnej post hoc35. Uzyskaj jeden obraz kawitacji biernej po każdych 10 impulsach zabiegowych. Zastosuj płaską kompensację wzmocnienia w czasie wynoszącą 50 na 8 stopniowych głębokościach do końca głębokości obrazowania. Wybierz odpowiedni rozmiar okna akwizycji, tak aby cały sygnał z skrzepu był przechwytywany przy minimalnej utracie energii z powodu okienowania35.
    5. Jeśli obecne są chmury bąbelkowe poza celem, wyreguluj pozycję przetwornika na miejscu za pomocą pozycjonerów z napędem.
      UWAGA: Monitoruj, czy nie pominięto wyzwalaczy matrycy obrazowania. Dostosuj liczbę pozyskanych zestawów danych obrazowania, aby upewnić się, że przechowywanie danych zostanie zakończone przed kolejnym wyzwoleniem.

8. Procedura po eksperymencie

  1. Ręcznie podnieś model naczynia ze zbiornika na wodę, aby spuścić perfuzat grawitacyjnie. Upewnij się, że kanał przepływowy jest wypoziomowany, aby zapobiec przemieszczaniu się skrzepu w dół i na zewnątrz modelu naczynia podczas opróżniania.
  2. Zebrać cały perfuzat do dalszej analizy w małej zlewce (Rysunek 4A), pobierając roztwór osocza z kanału przepływowego przez pompę strzykawkową przy bardzo niskim natężeniu przepływu.
  3. Odłącz model naczynia i usuń skrzep. W razie potrzeby wstrzyknąć niewielką ilość soli fizjologicznej do naczynia modelowego, aby delikatnie usunąć skrzep.
  4. Wytrzyj skrzep podobnie jak w kroku 1.2.3. Zważyć skrzep na wadze w celu oceny ubytku masy skrzepu.
  5. Aby przeanalizować zawartość D-dimerów, dodaj 100 mg kwasu aminokapronowego do probówki mikrowirówkowej, a następnie 1 ml perfuzatu i dobrze wymieszaj za pomocą pipety. Wykonaj test immunologiczno-turbidymetryczny lateksu, aby określić ilościowo D-dimer w próbce36.
  6. Aby ocenić hemolizę, dodaj 1 ml perfuzatu do probówek wirówkowych i wiruj z prędkością 610 x g (3500 obr./min) przez 10 min. Połącz 0,5 ml supernatantu (koncentratu) z 0,5 ml roztworu Drabkinsa i pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej na 15 minut. Przenieś 200 μl na płytki dołkowe, jak pokazano na Rysunek 4B. Użyj czytnika płytek, aby odczytać absorbancję przy 540 nm, Rysunek 4C (test Drabkinsa37).
  7. Ocena histologiczna
    1. Wytnij skalpelem odcinek od środka skrzepu o długości około 2-3 mm.
    2. Dodaj sekcję do kasety. Utrzymuj orientację przekroju względem kierunku propagacji impulsu histotrypsji.
    3. Dodać 2 ml roztworu agarozy o niskiej zawartości żelu, przygotowanego w kroku 3.2.5, do kasety, aby utrwalić skrzep na miejscu.
    4. Utrwal próbkę w 10% formalinie na 24 godziny. Po 24 godzinach umieść próbkę w 70% alkoholu i wykonaj standardowe barwienie hemotoksyliną-eozyną38.

9. Pasywna analiza obrazu kawitacji

  1. Przetwarzaj sygnały uzyskane z matrycy obrazowania podczas wzbudzenia histotrypsji (krok 7.2.4) za pomocą algorytmu opartego na solidnym Capon beamformer39, aby stworzyć obraz emisji akustycznych generowanych przez chmurę pęcherzyków w każdym miejscu zabiegu.
    UWAGA: Aby wygenerować obrazy ilościowe, wykonaj czynności opisane w Haworth et al.35. W przeciwnym razie każda wartość piksela na obrazie powinna reprezentować względną energię akustyczną chmury bąbelkowej (jednostkiV2) w każdym odpowiednim miejscu.
  2. Podziel obraz w trybie B uzyskany w krokach 7.2.3, aby rozróżnić piksele reprezentujące skrzep i model naczynia.
  3. Zarejestruj obraz kawitacji pasywnej z obrazem trybu B, jak pokazano na rysunku Rysunek 5B. Zsumuj energię akustyczną w skrzepie w okresie ekspozycji35.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Protokół opisany w niniejszym badaniu przedstawia szczegóły modelowania zakrzepu żylnego, lizotripsji w celu rozbicia zakrzepu oraz obrazowania ultradźwiękowego w układzie in vitro symulującym zakrzepicę żył głębokich (DVT). Przyjęta procedura demonstruje kroki niezbędne do oceny rozbicia zakrzepu pod wpływem połączonego działania rt-PA oraz aktywności chmury pęcherzyków histotripsji. Układ laboratoryjny został zaprojektowany tak, aby naśladować charakterystykę żyły biodrowo-udowej. Rysunek 1A

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W proponowanym protokole przedstawiono model ilościowego określenia skuteczności leczenia lizotrypsją. Chociaż kluczowe szczegóły zostały omówione, istnieją pewne krytyczne aspekty, które należy wziąć pod uwagę dla powodzenia tego protokołu. Aktywność enzymatyczna rt-PA ma zależność od temperatury Arrheniusa30. Temperatura jest również czynnikiem wpływającym na prędkość dźwięku w wodzie i tkankach, a zmiany temperatury mogą powodować niewielkie zmiany w geometrii strefy ogniskowej. Dlatego tempera...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez National Institutes of Health, Grant R01HL13334. Autorzy chcieliby podziękować dr Kevinowi Haworthowi za pomoc w teście Drabkina oraz dr Viktorowi Bollenowi za wsparcie w opracowaniu protokołu. Autorzy są również wdzięczni dr Adamowi Maxwellowi za jego wskazówki dotyczące projektowania źródła histotrypsji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Arkusze absorpcyjnePrecyzyjna akustykaF28-SMALL-M300mm x 300 mm x 10 mm
Borokrzemianowe pipety PasteuraFisher Scientific1367820A14,6 cm długości, pojemność 2 ml
Probówki wirówkoweEppendorf22364111pojemność 1,5 ml
Test DrabkinaSigma AldrichD5941-6VL
Strzykawkado pobieraniaCole-ParmerEW-07945-43Pojemność 60 ml
Worki filtracyjneMcMaster-Carr5162K111Usuń cząstki o wielkości do 1 mikrona
Rurka kanału przepływowegoMcMaster-Carr5154K25Rurka z tworzywa sztucznego EVA wyłożona polietylenem (średnica zewnętrzna: 3/8", średnica wewnętrzna: 1/4"
Elementy grzejneWon BrothersHT 300 TytanTytanowe pręty umieszczone na dnie zbiornika
Matryca obrazowaniaElement VerasonicsL11-5v128 o czułości od -55 do -49 dB
Agaroza o niskim żelowaniuMillipore SigmaA9414
Model naczyniaMcMaster-Carr5234K98Długość 6,6 cm, średnica wewnętrzna 0,6 cm, grubość 1 mm
Nanoczysta wodaBarnsteadNanopure DiamondASTM typ I, rezystywność 18 Mohm-cm
PlazmaVitalant4PF000Osocze zamrożone w ciągu 24 godzin
Czytnik płytekBiotekSynergy Neo HST Czytnik płytekDo oznaczania ilościowego hemoglobiny
Osłona sondyCivco610-362
Platforma programistycznaMATLAB (the Mathworks, Natick, MA, USA)
Rekombinowany tkankowy aktywator plazminogenu (rt-PA)AktywazaGenentech
ZbiornikCole-ParmerEW-07945-43Pojemność 60 ml
Pompa strzykawkowaCole-ParmerEW-74900-20dołączona do strzykawki do pobierania przepływu w kanale przepływowym z wcześniej ustaloną szybkością
Przetwornik Ośmioelementowydostosowany do potrzeb(oś główna 9 cm, oś mniejsza 7 cm i ogniskowa 6 cm), zasilany przez specjalnie zaprojektowaną i zbudowaną klasę D wzmacniacz i sieć dopasowująca
System skanowania ultradźwiękowegoVerasonicsVantage Research System ultrasonograficzny
Zbiornik na wodęZaawansowane akryleC13314 x 14 x 12, 1/2"
, eliptyczny przetwornik klienta

Bibliografia

  1. Oklu, R. Thrombosis. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 7, Suppl 3 131-133 (2017).
  2. Satoh, K., Satoh, T., Yaoita, N., Shimokawa, H. Recent advances in the understanding of thrombosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (6), 159-165 (2019).
  3. Grosse, S. D., Nelson, R. E., Nyarko, K. A., Richardson, L. C., Raskob, G. E. The economic burden of incident venous thromboembolism in the United States: A review of estimated attributable healthcare costs. Thrombosis Research. 137, 3-10 (2016).
  4. Hirsh, J., Hoak, J. Management of deep vein thrombosis and pulmonary embolism. Circulation. 93 (12), 2212-2245 (1996).
  5. Browse, N. L., Clemenson, G., Croft, D. N. Fibrinogen-detectable thrombosis in the legs and pulmonary embolism. British Medical Journal. 1 (5908), 603-604 (1974).
  6. Plate, G., Ohlin, P., Eklöf, B. Pulmonary embolism in acute iliofemoral venous thrombosis. British Journal of Surgery. 72 (11), 912-915 (1985).
  7. Chen, J. X., Sudheendra, D., Stavropoulos, S. W., Nadolski, G. J. Role of catheter-directed thrombolysis in management of iliofemoral deep venous thrombosis. Radiographics. 36 (5), 1565-1575 (2016).
  8. Kahn, S. R., Solymoss, S., Lamping, D. L., Abenhaim, L. Long-term outcomes after deep vein thrombosis: postphlebitic syndrome and quality of life. Journal of General Internal Medicine. 15 (6), 425-429 (2000).
  9. Oğuzkurt, L., Ozkan, U., Gülcan, O., Koca, N., Gür, S. Endovascular treatment of acute and subacute iliofemoral deep venous thrombosis by using manual aspiration thrombectomy: long-term results of 139 patients in a single center. Diagnostic and Interventional Radiology. 18 (4), 410-416 (2012).
  10. Lauw, M. N., Büller, H. R. Current Approaches to Deep Vein Thrombosis. , 136-160 (2014).
  11. Kearon, C., et al. Antithrombotic therapy for VTE disease: antithrombotic therapy and prevention of thrombosis: American college of chest physicians evidence-based clinical practice guidelines. Chest. 141 (2), 419-496 (2012).
  12. Pouncey, A. L., et al. AngioJet Pharmacomechanical Thrombectomy and Catheter Directed Thrombolysis vs. Catheter Directed Thrombolysis Alone for the Treatment of Iliofemoral Deep Vein Thrombosis: A Single Centre Retrospective Cohort Study. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. , (2020).
  13. Tang, T., Chen, L., Chen, J., Mei, T., Lu, Y. Pharmacomechanical thrombectomy versus catheter-directed thrombolysis for iliofemoral deep vein thrombosis: a meta-analysis of clinical trials. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 25, (2019).
  14. Kuo, T. -T., Huang, C. -Y., Hsu, C. -P., Lee, C. -Y. Catheter-directed thrombolysis and pharmacomechanical thrombectomy improve midterm outcome in acute iliofemoral deep vein thrombosis. Journal of the Chinese Medical Association. 80 (2), 72-79 (2017).
  15. Donaldson, C. W., et al. Thrombectomy using suction filtration and veno-venous bypass: single center experience with a novel device. Catheterization and Cardiovascular Interventions. 86 (2), 81-87 (2015).
  16. Khokhlova, V. A., et al. Histotripsy methods in mechanical disintegration of tissue: Towards clinical applications. International Journal of Hyperthermia. 31 (2), 145-162 (2015).
  17. Bader, K. B., Vlaisavljevich, E., Maxwell, A. D. For whom the bubble grows: Physical principles of bubble nucleation and dynamics in histotripsy ultrasound therapy. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (5), 1056-1080 (2019).
  18. Maxwell, A. D., et al. Noninvasive thrombolysis using pulsed ultrasound cavitation therapy-histotripsy. Ultrasound in Medicine & Biology. 35 (12), 1982-1994 (2009).
  19. Xu, Z., et al. Size measurement of tissue debris particles generated from pulsed ultrasound cavitational therapy-histotripsy. Ultrasound in Medicine & Biology. 35 (2), 245-255 (2009).
  20. Vlaisavljevich, E., et al. Effects of tissue stiffness, ultrasound frequency, and pressure on histotripsy-induced cavitation bubble behavior. Physics in Medicine and Biology. 60 (6), 2271-2292 (2015).
  21. Zhang, X., et al. Histotripsy thrombolysis on retracted clots. Ultrasound in Medicine & Biology. 42 (8), 1903-1918 (2016).
  22. Maxwell, A. D., et al. Noninvasive treatment of deep venous thrombosis using pulsed ultrasound cavitation therapy (histotripsy) in a porcine model. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 22 (3), 369-377 (2011).
  23. Bader, K. B., et al. Efficacy of histotripsy combined with rt-PA in vitro. Physics in Medicine and Biology. 61 (14), 5253-5274 (2016).
  24. Bollen, V., et al. In vitro thrombolytic efficacy of single- and five-cycle histotripsy pulses and rt-PA. Ultrasound in Medicine & Biology. 46 (2), 336-349 (2020).
  25. Wang, Y. N., Khokhlova, T., Bailey, M., Hwang, J. H., Khokhlova, V. Histological and biochemical analysis of mechanical and thermal bioeffects in boiling histotripsy lesions induced by high intensity focused ultrasound. Ultrasound in Medicine & Biology. 39 (3), 424-438 (2013).
  26. Weisel, J. W., Litvinov, R. I. Fibrin formation, structure and properties. Sub-Cellular Biochemistry. 82, 405-456 (2017).
  27. Devanagondi, R., et al. Hemodynamic and hematologic effects of histotripsy of free-flowing blood: implications for ultrasound-mediated thrombolysis. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 26 (10), 1559-1565 (2015).
  28. Holland, C. K., Vaidya, S. S., Datta, S., Coussios, C. -C., Shaw, G. J. Ultrasound-enhanced tissue plasminogen activator thrombolysis in an in vitro porcine clot model. Thrombosis Research. 121 (5), 663-673 (2008).
  29. Sutton, J. T., Ivancevich, N. M., Perrin, S. R., Vela, D. C., Holland, C. K. Clot retraction affects the extent of ultrasound-enhanced thrombolysis in an ex vivo porcine thrombosis model. Ultrasound in Medicine & Biology. 39 (5), 813-824 (2013).
  30. Shaw, G. J., Dhamija, A., Bavani, N., Wagner, K. R., Holland, C. K. Arrhenius temperature dependence of in vitro tissue plasminogen activator thrombolysis. Physics in Medicine & Biology. 52 (11), 2953(2007).
  31. Pinto, J., et al. Human plasma stability during handling and storage: impact on NMR metabolomics. Analyst. 139 (5), 1168-1177 (2014).
  32. Shaw, G. J., Sperling, M., Meunier, J. M. Long-term stability of recombinant tissue plasminogen activator at -80 C. BMC Research Notes. 2 (1), 117(2009).
  33. Maxwell, A. D., et al. Cavitation clouds created by shock scattering from bubbles during histotripsy. The Journal of the Acoustical Society of America. 130 (4), 1888-1898 (2011).
  34. Jensen, C. T., et al. Qualitative slow blood flow in lower extremity deep veins on doppler sonography: quantitative assessment and preliminary evaluation of correlation with subsequent deep venous thrombosis development in a tertiary care oncology center. Journal of Ultrasound in Medicine. 36 (9), 1867-1874 (2017).
  35. Haworth, K. J., Bader, K. B., Rich, K. T., Holland, C. K., Mast, T. D. Quantitative frequency-domain passive cavitation imaging. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 177-191 (2017).
  36. Hamano, A., et al. Latex immunoturbidimetric assay for soluble fibrin complex. Clinical Chemistry. 51 (1), 183-188 (2005).
  37. Drabkin, D. L., Austin, J. H. Spectrophotometric studies II. Preparations from washed blood cells; nitric oxide hemoglobin and sulfhemoglobin. Journal of Biological Chemistry. 112 (1), 51-65 (1935).
  38. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protocols. 2008, (2008).
  39. Coviello, C., et al. Passive acoustic mapping utilizing optimal beamforming in ultrasound therapy monitoring. The Journal of the Acoustical Society of America. 137 (5), 2573-2585 (2015).
  40. Mori, K., Dwek, R. A., Downing, A. K., Opdenakker, G., Rudd, P. M. The activation of type 1 and type 2 plasminogen by type I and type II tissue plasminogen activator. Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 3261-3267 (1995).
  41. Righini, M., Perrier, A., De Moerloose, P., Bounameaux, H. D-Dimer for venous thromboembolism diagnosis: 20 years later. Journal of Thrombosis and Haemostasis: JTH. 6 (7), 1059-1071 (2008).
  42. Hilleman, D. E., Razavi, M. K. Clinical and economic evaluation of the Trellis-8 infusion catheter for deep vein thrombosis. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 19 (3), 377-383 (2008).
  43. De Sensi, F., et al. Predictors of successful ultrasound guided femoral vein cannulation in electrophysiological procedures. Journal of Atrial Fibrillation. 11 (3), 2083(2018).
  44. Vlaisavljevich, E., et al. Effects of ultrasound frequency and tissue stiffness on the histotripsy intrinsic threshold for cavitation. Ultrasound in Medicine & Biology. 41 (6), 1651-1667 (2015).
  45. Vlaisavljevich, E., et al. Histotripsy-induced cavitation cloud initiation thresholds in tissues of different mechanical properties. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 61 (2), 341-352 (2014).
  46. Hendley, S. A., Paul, J. D., Bader, K. B. Mechanistic investigation of clot degradation via the action of histotripsy and thrombolytic. Joint AAPM | COMP Virtual Meeting. The American Association of Physics in Medicine. , (2020).
  47. Goss, S. A., Johnston, R. L., Dunn, F. Comprehensive compilation of empirical ultrasonic properties of mammalian tissues. The Journal of the Acoustical Society of America. 64 (2), 423-457 (1978).
  48. Duck, F. A. Physical Properties of Tissues. Duck, F. A. , Academic Press. 137-165 (1990).
  49. Bader, K. B., Haworth, K. J., Maxwell, A. D., Holland, C. K. Post hoc analysis of passive cavitation imaging for classification of histotripsy-induced liquefaction in vitro. IEEE Transactions on Medical Imaging. 37 (1), 106-115 (2018).
  50. Crake, C., et al. Enhancement and passive acoustic mapping of cavitation from fluorescently tagged magnetic resonance-visible magnetic microbubbles in vivo. Ultrasound in Medicine & Biology. 42 (12), 3022-3036 (2016).
  51. Gyongy, M., Coussios, C. Passive spatial mapping of inertial cavitation during HIFU exposure. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 57 (1), 48-56 (2010).
  52. Canney, M. S., Bailey, M. R., Crum, L. A., Khokhlova, V. A., Sapozhnikov, O. A. Acoustic characterization of high intensity focused ultrasound fields: A combined measurement and modeling approach. The Journal of the Acoustical Society of America. 124 (4), 2406-2420 (2008).
  53. Czaplicki, C., et al. Can thrombus age guide thrombolytic therapy. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 7, Suppl 3 186-196 (2017).
  54. Bajd, F., Vidmar, J., Blinc, A., Sersa, I. Microscopic clot fragment evidence of biochemo-mechanical degradation effects in thrombolysis. Thrombosis Research. 126 (2), 137-143 (2010).
  55. Wang, C., et al. Efficacy and safety of low dose recombinant tissue-type plasminogen activator for the treatment of acute pulmonary thromboembolism: a randomized, multicenter, controlled trial. Chest. 137 (2), 254-262 (2010).
  56. Arvanitis, C. D., Crake, C., McDannold, N., Clement, G. T. Passive acoustic mapping with the angular spectrum method. IEEE Transactions on Medical Imaging. 36 (4), 983-993 (2017).
  57. Khokhlova, V. A., et al. Histotripsy methods in mechanical disintegration of tissue: towards clinical applications. International Journal of Hyperthermia: The Official Journal of European Society for Hyperthermic Oncology, North American Hyperthermia Group. 31 (2), 145-162 (2015).
  58. Roberts, W. W. Development and translation of histotripsy: current status and future directions. Current Opinion in Urology. 24 (1), 104-110 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Terapia histotripsjązakrzepica żył głębokichskupiona wiązka ultradźwiękówgenerowanie chmury pęcherzykówpasywne obrazowanie kawitacjiubytek masy skrzepurekombinowany aktywator plazminogenu tkankowegotromboliza in vitrodostarczanie leków litycznych
System in vitro do oceny skuteczności trombolitycznej hestotrypsji i leku litycznego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.