Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena dyspersji biofilmu w mysich ranach

4.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62136

⸱

7 sierpnia 2021

 ,  , 
1Department of Surgery, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Immunology and Molecular Microbiology, Texas Tech University Health Sciences Center, 3TTUHSC Surgery Burn Center of Research Excellence, Texas Tech University Health Sciences Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy metody oceny ex vivo i in vivo rozprzestrzeniania się bakterii po zakażeniu ran u myszy. Protokół ten może być wykorzystany do testowania skuteczności miejscowych terapii przeciwbakteryjnych i przeciw biofilmowi lub do oceny zdolności dyspersji różnych szczepów lub gatunków bakterii.

Streszczenie

Infekcje związane z biofilmem są związane z szerokim wachlarzem przewlekłych schorzeń, takich jak niegojące się owrzodzenia stopy cukrzycowej, przewlekłe zapalenie zatok, nawracające zapalenie ucha środkowego i wiele innych. Komórki drobnoustrojów w tych infekcjach są chronione przez zewnątrzkomórkową substancję polimerową (EPS), która może zapobiegać usuwaniu infekcji przez antybiotyki i komórki odpornościowe gospodarza. Aby pokonać tę przeszkodę, badacze zaczęli opracowywać środki dyspersyjne jako potencjalne środki terapeutyczne. Środki te są ukierunkowane na różne składniki biofilmu EPS, osłabiając strukturę i inicjując dyspersję bakterii, co teoretycznie może poprawić siłę działania antybiotyku i klirens immunologiczny. Aby określić skuteczność środków dyspersyjnych w przypadku zakażeń ran, opracowaliśmy protokoły, które mierzą dyspersję biofilmu zarówno ex vivo, jak i in vivo. Używamy mysiego modelu chirurgicznego wycinania, który został dobrze opisany, aby stworzyć przewlekłe infekcje ran związane z biofilmem. Aby monitorować rozprzestrzenianie się in vivo, zakażamy rany szczepami bakterii, które eksprymują lucyferazę. Po ustabilizowaniu się dojrzałych infekcji przepłukujemy rany roztworem zawierającym enzymy, które rozkładają składniki biofilmu EPS. Następnie monitorujemy lokalizację i intensywność sygnału luminescencyjnego w ranie i narządach filtrujących, aby dostarczyć informacji o osiągniętym poziomie dyspersji. W celu analizy ex vivo dyspersji biofilmu, zakażona tkanka rany jest zanurzana w roztworze enzymu rozkładającego biofilm, po czym ocenia się ładunek bakteryjny pozostający w tkance w porównaniu z ładunkiem bakteryjnym w roztworze. Oba protokoły mają mocne i słabe strony i można je zoptymalizować, aby pomóc w dokładnym określeniu skuteczności zabiegów dyspersyjnych.

Wprowadzenie

Wzrost odporności na antybiotyki na całym świecie prowadzi do braku opcji antybiotykowych do leczenia różnych infekcji bakteryjnych1. Oprócz oporności na antybiotyki, bakterie mogą uzyskać tolerancję na antybiotyki, przyjmując styl życia związany z biofilmem2. Biofilm to społeczność mikroorganizmów, które są chronione przez matrycę polisacharydów, zewnątrzkomórkowego DNA, lipidów i białek3, zbiorczo nazywane zewnątrzkomórkową substancją polimerową (EPS). W miarę trwania kryzysu związanego z opornością na antybiotyki pilnie potrzebne są nowe strategie, które przedłużą stosowanie antybiotyków lub zwiększą ich skuteczność. Środki przeciw biofilmowi są obiecującym rozwiązaniem4.

Wśród różnych strategii zwalczania biofilmu, które zostały zaproponowane, wykorzystanie środków dyspersyjnych, które celują w różne składniki EPS biofilmu, jest na czele rozwoju terapeutycznego5. Hydrolazy glikozydowe (GH) są jedną z takich klas środków dyspersyjnych. GH to duża klasa enzymów, które katalizują rozszczepianie różnych wiązań w polisacharydach, które zapewniają integralność strukturalną EPS. Nasza grupa, jak również inne, wykazały, że GH może skutecznie degradować biofilmy, indukować dyspersję i poprawiać skuteczność antybiotyków dla wielu różnych gatunków bakterii, zarówno in vitro, jak i in vivo6,7,8,9,10,11.

Wraz z rosnącym zainteresowaniem dyspersją biofilmu, ważne jest opracowanie skutecznych metod oceny skuteczności dyspersji. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół leczenia zakażeń ran związanych z biofilmem za pomocą środka dyspersyjnego u myszy oraz ocenę skuteczności dyspersji in vivo i ex vivo. Ogólnym celem jest zapewnienie skutecznych metod, które można wykorzystać w modelach przedklinicznych do skutecznego i wydajnego pomiaru dyspersji biofilmu.

W tych badaniach użyto mysiego modelu infekcji chirurgicznego wycięcia, aby ustalić infekcję związaną z biofilmem. Używamy tego modelu od ponad 15 lat i obszernie publikujemy nasze obserwacje7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Ogólnie rzecz biorąc, jest to nieśmiertelny model infekcji, w którym bakterie pozostają zlokalizowane w łożysku rany i są związane z biofilmem (bakterie widoczne w agregatach otoczonych EPS), tworząc przewlekłą infekcję, która trwa do 3 tygodni. Jeśli jednak myszy mają obniżoną odporność (na przykład z cukrzycą typu 1), mogą stać się bardziej podatne na rozwój śmiertelnej infekcji ogólnoustrojowej w tym modelu.

W tym raporcie udostępniamy protokoły oceny rozprzestrzeniania się bakterii z rany, zarówno in vivo, jak i ex vivo. Oba protokoły mogą być wykorzystywane do badania skuteczności środka dyspersyjnego i mają swoje mocne i słabe strony. Na przykład ocena rozprzestrzeniania się in vivo może dostarczyć ważnych informacji w czasie rzeczywistym na temat rozprzestrzeniania się bakterii na inne części ciała po rozproszeniu oraz reakcji gospodarza. Z drugiej strony, ocena dyspersji ex vivo może być bardziej pożądana w przypadku badań przesiewowych wielu czynników, dawek lub preparatów, ponieważ tkankę można podzielić na wiele sekcji, które można testować osobno, zmniejszając w ten sposób liczbę wymaganych myszy. Oceniając wiele czynników, zazwyczaj najpierw mierzymy rozproszenie in vitro, jak opisano wcześniej 6,9,22. Następnie testujemy najskuteczniejsze testy ex vivo i rezerwujemy testy in vivo dla ograniczonej liczby bardzo obiecujących środków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ten protokół dla zwierząt został sprawdzony i zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Texas Tech (numer protokołu 07044). Badanie to zostało przeprowadzone w ścisłej zgodności z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych National Institutes of Health.

1. Przygotowanie bakterii do infekcji myszy

UWAGA: Tutaj opisujemy zarażanie myszy tylko Pseudomonas aeruginosa. Jednak inne gatunki bakterii mogą być wykorzystywane do wywoływania infekcji. Szczepy i materiały bakteryjne są szczegółowo opisane w Tabeli Materiałów.

  1. Do tych eksperymentów należy użyć szczepu PAO1 typu dzikiego Pseudomonas aeruginosa przenoszącego plazmid luminescencyjny pQF50-lux23 zgodnie z wcześniejszym opisem7.
  2. Szczepy P. aeruginosa należy hodować w przegrodowych kolbach Erlenmeyera, wytrząsając z prędkością 200 obr./min, w bulionie Luria-Bertani (LB) w temperaturze 37 °C przez 16 do 20 godzin. Dodać końcowe stężenie 100 μg/ml ampicyliny do nocnej hodowli PAO1 (pQF50-lux) w celu utrzymania plazmidu.
  3. Subhodowla P. aeruginosa przez dodanie 100 μl nocnej kultury do kolby Erlenmeyera zawierającej 10 ml bulionu LB o końcowym stężeniu 100 μg/ml ampicyliny. Następnie hodować przez 2-2,5 godziny w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem, do średnicyzewnętrznej 600 nm 0,4, a następnie seryjnie rozcieńczać (1:10) trzykrotnie, aby uzyskać infekującą dawkę około10-4 komórek.

2. Przygotowanie enzymu dyspersyjnego biofilmu

UWAGA: Do tego badania używamy 10% roztworu równych części amylazy i celulazy (po 5% każdego), które będą określane jako "GH", do leczenia dyspersyjnego.

  1. Użyj 10% roztworu GH (w/v) amylazy (z Bacillus subtilis) i celulazy grzybowej (z Aspergillus niger) rozcieńczonej w 1x bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS). Użyj PBS jako zabiegu kontroli pojazdu.
  2. Podgrzej wszystkie zabiegi do 37 °C przez 30 minut w celu aktywacji enzymu.

3. Zwierzęta doświadczalne i przygotowanie przedoperacyjne

  1. Myszy domowe, 5 towarzyszy z miotu w klatce, w kontrolowanych warunkach środowiskowych, z 12-godzinnymi cyklami światła/ciemności i odpowiednim dostępem do pożywienia i wody.
  2. Najlepiej używać samic szwajcarskich myszy Webster w wieku od 8 do 10 tygodni.
  3. Zważ myszy, aby określić odpowiednią ilość znieczulenia do podania.
  4. Podać znieczulenie przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 100 mg/kg ketaminy 10 mg/kg ksylazyny.
  5. Krem pod oczy (np. Refresh P.M.) należy dokładnie nałożyć na oko za pomocą bawełnianego wacika, aby zmniejszyć suchość.
  6. Monitoruj parametry fizjologiczne, w tym częstość oddechów, zabarwienie skóry i temperaturę ciała przez cały czas trwania operacji.

4. Operacja wycięcia grzbietowej pełnej grubości

  1. Oceń chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia za pomocą uszczypnięcia palca u nogi i monitorowania częstości oddechów i wysiłku. Ogol powierzchnię grzbietową i nałóż krem do depilacji na 10 minut (lub zgodnie z instrukcją produktu), po czym delikatnie usuń, upewniając się, że skóra jest sucha.
  2. W celu leczenia bólu należy podać 0,05 ml lidokainy podskórnie w obszar, który ma zostać wycięty, a następnie wstrzyknąć 0,02 ml buprenorfiny podskórnie w kark szyi. Odczekaj 10 minut, aby upewnić się, że leczenie bólu zostało osiągnięte.
  3. Przed wycięciem zdezynfekuj powierzchnię grzbietową za pomocą wacika nasączonego alkoholem i narysuj okrąg o średnicy 1,5 cm w kierunku tylnej części pleców. Utrzymuj sterylne pole operacyjne przez cały zabieg i używaj autoklawowanych narzędzi i sterylnych rękawiczek. Aby ograniczyć zanieczyszczenie, przeprowadź operację przy zapalonym palniku Bunsena i używaj czystych narzędzi dla każdego zwierzęcia.
  4. Za pomocą nożyczek chirurgicznych należy wykonać pełnogrubą, wycinającą ranę skóry do poziomu mięśnia pachwinowego.
  5. Po wycięciu natychmiast przykryj rany półprzepuszczalnym opatrunkiem poliuretanowym.
  6. Wstrzyknąć około 104 jtk bakterii w 100 μl PBS pod opatrunek, na łożysko rany, w celu wywołania infekcji.
    UWAGA: Rany mogą być również zakażone wieloma gatunkami bakterii i/lub grzybów jednocześnie lub poprzez umieszczenie na łożysku rany wstępnie uformowanych biofilmów12, a nawet tkanki do oczyszczania pobranej od pacjentów19.
  7. Po zakażeniu umieść myszy w klatce z poduszkami grzewczymi i monitoruj, aż odzyskają odruch prostowania.
    UWAGA: Upewnij się, że myszy nie marzną, ponieważ może to prowadzić do śmierci.
  8. Ustalić infekcje ran przez 48 godzin.
  9. Codziennie sprawdzaj opatrunki samoprzylepne pod kątem rozdarć i obszarów nieprzylegających i wymień w razie potrzeby.

5. Leczenie dyspersji in vivo

UWAGA: Tutaj opisujemy podawanie środków dyspersyjnych poprzez zastosowanie serii 3 miejscowych roztworów do irygacji ran (Rysunek 1). Protokół można jednak dostosować do innych rodzajów porodu, takich jak stosowanie żeli, kremów lub opatrunków.

  1. Umieść myszy w znieczuleniu izofluranem (przy 3% i 1 l tlenu na minutę) podczas podawania leków.
  2. Przygotować trzy strzykawki o pojemności 1 ml z igłami 25 G, zawierające 200 μl leku dla każdej myszy.
  3. Wstrzyknąć 200 μl roztworu enzymatycznego lub środka kontrolnego PBS na ranę, ostrożnie podnosząc i ściskając skórę kleszczami, nieco powyżej rany w kierunku głowy zwierzęcia. Ostrożnie przekłuć strzykawkę przez uniesioną skórę i powoli wstrzyknąć roztwór między opatrunek a łożysko rany. Opatrunek zastosowany w tym badaniu często przylega zarówno do łożyska rany, jak i otaczającej tkanki.
    1. Aby upewnić się, że całe łożysko rany jest pokryte roztworem, delikatnie podnieś opatrunek kleszczami, odciągając go od łożyska rany, jednocześnie powoli wstrzykując roztwór.
  4. Po zabiegu umieść myszy z powrotem w klatkach na 30 minut.
  5. Po 30 minutach od ekspozycji na leczenie należy ponownie znieczulić myszy izofluranem i odessać roztwór strzykawką, upewniając się, że nakłucie nastąpiło w tym samym miejscu, co poprzednio.
    UWAGA: Ten odessany roztwór zawiera rozproszone komórki bakteryjne, które można zachować do różnych dalszych analiz.
  6. Drugi i trzeci zabieg irygacyjny należy wykonać jako pierwszy, za każdym razem używając nowej strzykawki.

6. Obrazowanie i analiza dyspersji in vivo

UWAGA: Jeśli luminescencyjny szczep bakterii jest używany do zainicjowania infekcji, system obrazowania in vivo (IVIS) może być użyty do wizualizacji rozproszenia z łożyska rany.

  1. Obrazowanie myszy bezpośrednio przed i po leczeniu oraz po 10 i 20 godzinach po leczeniu (Rysunek 2 i Rysunek uzupełniający 1).
  2. Wykonuj obrazowanie, gdy myszy są pod narkozą, umieszczając je pojedynczo w IVIS i obrazując każde z nich przez 5 s na długości fali 560 nm. Zapisz obrazy do dalszej analizy.
    UWAGA: Optymalna długość fali i czas ekspozycji będą zależeć od użytego reportera oraz instrumentu IVIS i oprogramowania do obrazowania.
  3. W celu analizy otwórz obrazy w oprogramowaniu IVIS i wybierz obszar do analizy w palecie narzędzi.
  4. Aby uwzględnić tło, umieść okrąg na tle zdjęcia, a następnie umieść okrąg o tym samym rozmiarze na wierzchu łożyska rany dla każdej myszy.
  5. Aby przesłać wartości pomiarów, wybierz opcję Wyświetl -> pomiary obszaru zainteresowania (ROI) i prześlij tabelę pomiarów do arkusza kalkulacyjnego. Odejmij odczyt okręgu tła od każdego z pomiarów złoża rany, aby obliczyć luminescencję dla każdej próbki. Obliczać Procent luminescencji zmieniony przez:
    ROI przed obróbką-ROI po obróbce / ROI przed obróbką) x 100,
    UWAGA: Myszy kontrolne i leczone powinny być analizowane jednocześnie, aby znormalizować zmienne, które mogą wpływać na akwizycję obrazu lub promieniowanie.

7. Ocena rozproszenia poprzez określenie CFU

  1. Humanitarna eutanazja myszy poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie 0,2 ml pentobarbitalu sodu (np. Fatal Plus) w znieczuleniu 100 mg/kg ketaminy 10 mg/kg ksylazyny.
  2. Zbierz tkankę łożyska rany, najpierw delikatnie usuwając opatrunek sterylnymi kleszkami, a następnie przeciąć obwód łożyska rany sterylnymi nożyczkami chirurgicznymi. Delikatnie podnieś jeden koniec łożyska rany za pomocą kleszczy, używając nożyczek do odcięcia/odcięcia próbki od warstwy mięśniowej.
  3. Umieść tkankę z łożyska rany we wstępnie znakowanej i zważonej probówce homogenizacyjnej o pojemności 2 ml zawierającej 1 ml PBS. Po włożeniu próbek ponownie zważyć probówki, a następnie delikatnie odwrócić 3-5 razy, aby spłukać wszelkie rozproszone lub luźno przylegające bakterie i usunąć PBS. Dodaj 1 ml świeżego PBS.
  4. Aby pobrać śledziony, umieść myszy w pozycji anatomicznej leżącej na plecach i zabezpiecz, przypinając ich kończyny do powierzchni rozwarstwienia. Namocz obszar, który ma być poddany sekcji, 70% etanolem, aby zdezynfekować obszar i zapobiec zanieczyszczeniu próbki przez futro.
  5. Ostrożnie wykonaj małe nacięcie prostopadłe do linii środkowej nożyczkami chirurgicznymi w skórze właściwej dolnej części brzucha, upewniając się, że skóra jest podciągnięta do góry i z dala od narządów wewnętrznych. Kontynuuj nacięcie wewnętrznie, wzdłuż linii środkowej, aż do osiągnięcia mostka. Po odsłonięciu jamy otrzewnej i uwidocznieniu narządów wewnętrznych należy delikatnie oddzielić śledzionę od tkanki łącznej i umieścić w osobnej probówce homogenizującej.
  6. Zważyć śledzionę i przepłukać PBS, zgodnie z opisem dla tkanki łożyska rany.
    UWAGA: Inne interesujące organy mogą być pobierane w podobny sposób.
    1. Wykonując pierwsze nacięcie, należy uważać, aby nie przebić jelit lub innych narządów.
  7. Dwukrotnie homogenizować próbki w wstępnie napełnionych probówkach do mielenia perełkowego o pojemności 2 ml za pomocą homogenizatora stołowego z prędkością 5 m/s przez 60 s.
  8. Aby oznaczyć jtk, należy seryjnie rozcieńczyć próbki i umieścić je na płytce punktowej na selektywnym agarze . W celu rozcieńczenia seryjnego należy odpipetować 100 μl próbki do 900 μl PBS w probówce o pojemności 1,5 ml, odwirować i powtórzyć 5 razy. Odpipetować 10 μl każdego rozcieńczenia na płytkę agarową, jak pokazano na Rysunek 3.
    UWAGA: Jeśli wymagane jest dokładniejsze oznaczanie ilościowe CFU, rozprowadzić 100 μl każdego rozcieńczenia próbki na oddzielnych płytkach agarowych.

8. Ocena dyspersji ex vivo (Rysunek 4)

  1. Zranić myszy i zarazić około 104 PAO1, jak opisano powyżej, a następnie poddać eutanazji 48 godzin po zakażeniu.
  2. Ostrożnie zdjąć opatrunek kleszczami, stosując sterylną technikę i nie naruszając łożyska rany.
  3. Użyj sterylnych nożyczek chirurgicznych, aby odciąć obwód łożyska rany od niezakażonej skóry, używając kleszczy do podniesienia jednego końca łożyska rany i nożyczek do wycięcia zakażonej tkanki rany z warstwy mięśniowej pod spodem i otaczającej niezakażonej tkanki. Podziel próbki złoża ran na równe części lub użyj całości.
  4. Umieść nawiniętą tkankę w pustych, wstępnie zważonych probówkach homogenizujących o pojemności 2 ml. Następnie ponownie zważyć probówki po dodaniu próbki. Obliczyć masę próbki według wzoru:
    waga po dodaniu próbki - waga przed dodaniem próbki.
  5. Dodaj 1 ml PBS i delikatnie odwróć probówkę 3-5 razy, aby przepłukać próbkę i usunąć wszelkie komórki planktonowe. Wyjmij i wyrzuć PBS.
  6. Dodać 1 ml roztworu GH (lub PBS jako kontrola ujemna) do próbki i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 80 obr./min.
  7. Usuń roztwór dyspersyjny do biofilmu i umieść go w osobnej probówce o pojemności 1,5 ml. Zawiera rozproszone komórki.
  8. Dodaj 1 ml PBS do pozostałej próbki tkanki i delikatnie odwróć 3-5 razy, aby spłukać pozostałe rozproszone komórki. Wyjmij i wyrzuć PBS.
  9. Dodać 1 ml PBS do pozostałej tkanki i homogenizować z prędkością 5 m/s przez 60 s za pomocą homogenizatora laboratoryjnego.
  10. Roztwór rozproszonych komórek i homogenizowanej próbki tkanki należy rozcieńczyć seryjnie, umieszczając 100 μl próbki w 900 μl PBS w probówce o pojemności 1,5 ml i powtarzając pięć razy, co daje łącznie 6 rozcieńczeń.
  11. Umieścić na płytce punktowej 10 μl każdego rozcieńczenia na selektywnym agarze podłoża (np. Agarze do izolacji Pseudomonas dla P. aeruginosa) i inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc.
  12. Policz jtk i oblicz "procent rozproszenia" jako (jtk w supernanku/ (jtk w supernatancie + jtk w tkance biofilmu)) x 100.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W tym eksperymencie samice myszy rasy Swiss Webster w wieku od 8 do 10 tygodni zostały zainfekowane 104 CFU szczepu PAO1 niosącego plazmid luminescencyjny pQF50-lux. Zgodnie z powyższym opisem, pozwolono na rozwój infekcji przez 48 h przed zastosowaniem 3 serii 30-minutowych zabiegów z użyciem PBS (kontrola nośnika) lub 10% GH (leczenie) w celu strawienia EPS biofilmu. Obrazowanie myszy wykonano przed leczeniem, bezpośrednio po leczeniu (0 h) oraz w 10. i 20. godzinie po leczeniu. Rycina 2...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy protokoły, które można wykorzystać do badania skuteczności środków dyspersyjnych biofilmu. Protokoły te można łatwo dostosować do stosowania z różnymi rodzajami środków dyspersyjnych, gatunkami bakterii lub próbkami ex vivo, w tym próbkami klinicznymi do oczyszczania. Protokół ten zapewnia również klinicznie istotny model do zbierania i badania rozproszonych komórek bakteryjnych. Wykazano, że fenotypy rozproszonych komórek bakteryjnych różnią się od fenotypów komórek planktonowych lub bio...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z National Institutes of Health (R21 AI137462-01A1), Ted Nash Long Life Foundation, Jasper L. and Jack Denton Wilson Foundation oraz Departamentu Obrony (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 ml probówka do mikrowirówkiFisher14823434Służy do wykonywania seryjnych rozcieńczeń próbek
25G 58 w igleFisher14823434Dołącza się do strzykawki o pojemności 1 ml
Ampicylina Sól sodowaFisherBP1760-5Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 50 mg/ml i dodać 100 &mikro; L do 10 ml bulionu LB zarówno na noc, jak i do subkultury
AmylazaMP Biomedicals2100447Przygotuj 5% roztwór w/v, wir - można użyć innych środków dyspersyjnych
Buprenorfina SR-LAB 5 ml (1 mg / ml)ZooPharmRX216118Stosować jako środek przeciwbólowy - można użyć innych opcji
CelulazaMP Biomedicals2150583Dodać 5% w/v do 5% w/v roztworu amylazy, wirować, aktywować w temperaturze 37 & stopni; C przez 30 min - można stosować inne środki dyspersyjne
Krem do depilacjiWalmart287746Użyj niewielkiej ilości do wmasowania w mieszki włosowe z tyłu zwierzęcia i przeznacz 10 minut na usunięcie włosów
Kleszcze opatrunkowe, końcówki ząbkowaneFisher12-460-536Może używać innych form kleszczy
Kolby Erlenmeyera z przegrodą 125 mlFisher101406Służy do uprawy przez noc i subkultur bakterii
Homogenizator stacjonarny FastPrep-24MP Biomedicals6VFV9Użyj 5 m/s przez 60 s dwa razy w celu homogenizacji tkanki
Fatal PlusVortech Pharmaceuticals0298-9373-68Wstrzyknąć 0,2 ml dootrzewnowej dla każdej myszy
Probówki homogenizujące (rurka koralikowa 2 ml 2,4 mm metalowa)Fisher15340151Służy do homogenizacji próbek do posiewu
IsofluranDiamond Back Drugs
Chlorowodorek ketaminy/roztwór chlorowodorku ksylazyny C-IIINSigma AldrichK4138Stosować jako anazethię - inne opcje mogą być również wykorzystane do uzyskania pola chirurgicznego bulionu anasethia
LB, MillerFisherBP1426-2Dodaj 25 g / L i autoklaw
Lidokaina 2% do wstrzykiwańDiamentowe leki na plecy2468Wstrzyknąć 0,05 ml przez bok zaznaczonego łożyska rany, tak aby osadzało się w środku znaku. Przeznaczyć 10 minut przed cięciem
MeropenemSigma AldrichPHR1772-500MGPrzygotować 5 mg/ml do dodania do roztworu GH do stosowania miejscowego i 15 mg/ml roztworu do wstrzykiwania domięśniowego 4 godziny przed i 6 godzin po zabiegu
Niesterylne bawełniane gąbki z gazyFisher13-761-52Służy do usuwania kremu do depilacji
Szczep bakteryjny PAO1 pQF50-luxNr ref. [13]N/APAO1 pgF50-lux został użyty jako szczep P. aeruginosa będący przedmiotem zainteresowania w reprezentatywnych wynikach tego artykułu Szalki
PetriegoFisherPHR1772-500MG
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna 10xFisherBP3991Rozcieńczyć 10x do 1x przed użyciem
Opatrunek poliuretanowyMckesson66024007Odetnij zaokrągloną krawędź i pokrój pozostały kwadrat na 4 równe części
Pseudomonas agar izolacyjnyVWR90004-394Dodać 20 ml/l glicerolu i 45 g/ml do wody, autoklawu i wlać 20 ml do szalek Petriego
Odświeżenie P.M.WalmartStosuj na oczy, aby zmniejszyć suchość podczas zabiegu.
Sterylne podkładki alkoholoweFisher22-363-750Służy do czyszczenia skóry bezpośrednio przed zranieniem w celu dezynfekcji obszaru
Proste delikatne nożyczkiFisher89515Można również używać zakrzywionych nożyczek
Szwajcarskie myszy WebsterCharles River551NCISWWEBMożna stosować inne szczepy myszy
Końcówka strzykawkowa 1 mlFisher14823434Służy do podawania narkotyków i Leczenie enzymatyczne

Bibliografia

  1. Rossolini, G. M., Arena, F., Pecile, P., Pollini, S. Update on the antibiotic resistance crisis. Current Opinion in Pharmacology. 18, 56-60 (2014).
  2. Stewart, P. S. Antimicrobial Tolerance in Biofilms. Microbiology Spectrum. 3 (3), (2015).
  3. Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).
  4. Rumbaugh, K. P. How well are we translating biofilm research from bench-side to bedside. Biofilm. 2 (100028), (2020).
  5. Rumbaugh, K. P., Sauer, K. Biofilm dispersion. Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 571-586 (2020).
  6. Fleming, D., Chahin, L., Rumbaugh, K. Glycoside Hydrolases Degrade Polymicrobial Bacterial Biofilms in Wounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (2), (2017).
  7. Fleming, D., Rumbaugh, K. The Consequences of Biofilm Dispersal on the Host. Scientific Reports. 8 (1), 10738(2018).
  8. Baker, P., et al. Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Science Advances. 2 (5), 1501632(2016).
  9. Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. Differential Efficacy of Glycoside Hydrolases to Disperse Biofilms. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 379(2020).
  10. Zhu, L., et al. Glycoside hydrolase DisH from Desulfovibrio vulgaris degrades the N-acetylgalactosamine component of diverse biofilms. Environmental Microbiology. 20 (6), 2026-2037 (2018).
  11. Fell, C. F., Rumbaugh, K. P. Antibacterial Drug Discovery to Combat MDR. , 527-546 (2019).
  12. Dalton, T., et al. An in vivo polymicrobial biofilm wound infection model to study interspecies interactions. PLoS One. 6 (11), 27317(2011).
  13. Wolcott, R. D., et al. Biofilm maturity studies indicate sharp debridement opens a time- dependent therapeutic window. Journal of Wound Care. 19 (8), 320-328 (2010).
  14. Korgaonkar, A., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Community surveillance enhances Pseudomonas aeruginosa virulence during polymicrobial infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (3), 1059-1064 (2013).
  15. Watters, C., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice. Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).
  16. Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infection and Immunity. 82 (1), 92-100 (2014).
  17. Turner, K. H., Everett, J., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Requirements for Pseudomonas aeruginosa acute burn and chronic surgical wound infection. PLOS Genetics. 10 (7), 1004518(2014).
  18. Harrison, F., et al. A 1,000-Year-Old Antimicrobial Remedy with Antistaphylococcal Activity. mBio. 6 (4), 01129(2015).
  19. Wolcott, R., et al. Microbiota is a primary cause of pathogenesis of chronic wounds. Journal of Wound Care. 25, Sup10 33-43 (2016).
  20. Ibberson, C. B., et al. Co-infecting microorganisms dramatically alter pathogen gene essentiality during polymicrobial infection. Nature Microbiology. 2, 17079(2017).
  21. Fleming, D., et al. Utilizing Glycoside Hydrolases to Improve the Quantification and Visualization of Biofilm Bacteria. Biofilm. 2, (2020).
  22. DeLeon, S., et al. Synergistic interactions of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an in vitro wound model. Infection and Immunity. 82 (11), 4718-4728 (2014).
  23. Darch, S. E., et al. Phage Inhibit Pathogen Dissemination by Targeting Bacterial Migrants in a Chronic Infection Model. mBio. 8 (2), (2017).
  24. Chua, S. L., et al. Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles. Nature Communications. 5, 4462(2014).
  25. Beitelshees, M., Hill, A., Jones, C. H., Pfeifer, B. A. Phenotypic Variation during Biofilm Formation: Implications for Anti-Biofilm Therapeutic Design. Materials (Basel). 11 (7), (2018).
  26. Sauer, K., et al. Characterization of nutrient-induced dispersion in Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm. J Bacteriol. 186 (21), 7312-7326 (2004).
  27. Kuklin, N. A., et al. Real-time monitoring of bacterial infection in vivo: development of bioluminescent staphylococcal foreign-body and deep-thigh-wound mouse infection models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 2740-2748 (2003).
  28. Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infection and Immunity. 69 (5), 3350-3358 (2001).
  29. Kadurugamuwa, J. L., et al. Noninvasive optical imaging method to evaluate postantibiotic effects on biofilm infection in vivo. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (6), 2283-2287 (2004).
  30. Wimpenny, J., Manz, W., Szewzyk, U. Heterogeneity in biofilms. FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 661-671 (2000).
  31. Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
  32. Tipton, C. D., et al. Chronic wound microbiome colonization on mouse model following cryogenic preservation. PLoS One. 14 (8), 0221656(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

mysi model ranyprzewlekła infekcja ranyśrodki dyspergującezewnątrzkomórkowa substancja polimerowaobrazowanie in vivooznaczanie ilości ładunku bakteryjnegoanaliza ex vivoinfekcja polimikrobowatraktowanie enzymatyczne
Ocena dyspersji biofilmu w mysich ranach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.