Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Syngeneiczny ortotopowy kostniakomięsak Sprague Dawley Rat Model z amputacją w celu kontrolowania częstości przerzutów

3.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62139

⸱

3 maja 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Comparative Pathobiology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 2Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University, 3Department of Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Coloproctological Surgery, Juntendo University Faculty of Medicine, 5Program for Comparative Medicine, Gene Therapy Program, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 6Tuskegee College of Veterinary Medicine, 7Department of Human Pathology, Juntendo University Faculty of Medicine, 8Department of Surgery, Juntendo University Shizuoka Hospital, Juntendo University School of Medicine, 9Department of Urology, The Johns Hopkins School of Medicine, 10Department of Gastroenterology and Minimally Invasive Surgery, Juntendo University Faculty of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisana jest syngeniczna implantacja ortotopowa, po której następuje procedura amputacji kostniakomięsaka ze spontanicznymi przerzutami do płuc, która może być wykorzystana do badań przedklinicznych biologii przerzutów i rozwoju nowych terapii.

Streszczenie

Ostatni postęp w leczeniu kostniakomięsaka (OS) nastąpił w latach 80., kiedy wykazano, że wielolekowa chemioterapia poprawia całkowite przeżycie w porównaniu z samą operacją. Aby rozwiązać ten problem, celem badania jest udoskonalenie mniej znanego modelu OS u szczurów za pomocą kompleksowego podejścia chirurgicznego histologicznego, obrazowego, biologicznego, implantacji i amputacji, które przedłuża przeżycie. Użyliśmy immunokompetentnego, niekrewniaczego Sprague-Dawleya (SD), syngenicznego modelu szczura z wszczepioną linią komórkową UMR106 OS (pochodzącą od szczura SD) z ortotopowymi implantami guza piszczelowego u 3-tygodniowych samców i samic szczurów w celu modelowania pediatrycznego systemu operacyjnego. Odkryliśmy, że u szczurów rozwijają się powtarzalne pierwotne i przerzutowe guzy płuc, a amputacje kończyn po 3 tygodniach od implantacji znacznie zmniejszają częstość występowania przerzutów do płuc i zapobiegają nieoczekiwanym zgonom. Histologicznie pierwotne i przerzutowe OS u szczurów były bardzo podobne do ludzkich OS. Stosując metody immunohistochemiczne, badanie pokazuje, że OS szczurów jest infiltrowany przez makrofagi i limfocyty T. Badanie ekspresji białek w komórkach OS ujawnia, że guzy te wykazują ekspresję kinaz z rodziny ErbB. Ponieważ kinazy te są również silnie eksprymowane w większości ludzkich systemów operacyjnych, ten model szczurzy może być wykorzystany do testowania inhibitorów szlaku ErbB do terapii.

Wprowadzenie

Kostniakomięsak (OS) jest najczęstszym pierwotnym nowotworem kości u dzieci, młodzieży i młodych dorosłych. Ostatni postęp w leczeniu OS nastąpił w latach 80., kiedy wykazano, że chemioterapia wielolekowa poprawia całkowite przeżycie w porównaniu z samą operacją1. OS rozwija się podczas szybkiego wzrostu kości, zwykle występującego w długich kościach rurkowych, takich jak kość udowa, piszczelowa i ramienna. Charakteryzują się wyglądem osteolitycznym, osteoblastycznym lub mieszanym z zauważalną reakcją okostną2. Chemioterapia i resekcja chirurgiczna mogą poprawić wyniki leczenia u pacjentów z 5-letnim przeżyciem u 65% pacjentów2,3. Niestety, pacjenci z OSP wysokiego stopnia z przerzutami mają 20% przeżycia. OS atakuje regionalnie i daje przerzuty głównie do płuc lub innych kości i jest bardziej rozpowszechniony u mężczyzn. Najbardziej przekonującą potrzebą tych młodych pacjentów jest nowatorska terapia, która zapobiega i eliminuje żywotność odległych przerzutów.

OS modele przedkliniczne zostały przejrzane4,5,6,7 i opracowano kilka dostępnych modeli immunokompetentnych wykorzystujących amputację ortotopowego OS. W 2000 roku opracowano ważny model z wykorzystaniem myszy BALB/c z ortotopowym syngenicznym systemem operacyjnym i amputacją8. W porównaniu z tym modelem myszy, model szczura opiera się na genetycznie niekrewniaczych i 10 razy większych zwierzętach, co prowadzi do pewnych korzyści. Model szczura UMR106 został opracowany z systemu operacyjnego indukowanego przez 32P u szczura Sprague Dawley (SD), który został uzyskany do linii komórkowej9. W 2001 roku ortotopowa implantacja UMR106-01 została po raz pierwszy opisana w wszczepionych piszczelach myszy atymicznych z szybkim, konsekwentnym rozwojem guza pierwotnego i radiologicznymi, histologicznymi cechami wspólnymi dla OS u ludzi. Przerzuty do płuc rozwijały się i były zależne od ortotopowego umieszczenia UMR106 w mikrośrodowisku kostnym10. W 2009 roku Yu i wsp.11 stworzyli powtarzalny ortotopowy model OS kości udowej u szczurów przy użyciu komórek UMR106 u większych samców szczurów SD. Udane implantacje guza i wskaźnik przerzutów do płuc u szczurów bez amputacji były podobne do przedstawionych tutaj danych. W tym badaniu przeprowadzono dodatkową amputację do modelu przy użyciu młodych szczurów, co sugerowało, że czas usunięcia guza pierwotnego ma kluczowe znaczenie w modelowaniu OS, szczególnie w odniesieniu do progresji przerzutów. Dzięki temu udoskonaleniu, amputacja i obrazowanie in vivo ulepszają ten model do badań przedklinicznych w celu oceny nowego leku w OS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury i eksperymenty z udziałem szczurów zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Johns Hopkins.

1. Protokół hodowli komórkowej UMR-106 linii komórkowej szczura SD

  1. Hoduj komórki w DMEM, uzupełnione 10% (v/v) FBS, penicyliną (10 U/mL)-streptomycyną (10 U/mL) w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 . Wykonuj eksperymenty, używając komórek z pasażami 2-812.

2. Protokół dopiszczelowej iniekcji komórek OS

UWAGA: Ciężarne szczury SD kryte w czasie rodzą w obiekcie dla zwierząt i w wieku 3 tygodni stosuje się mioty (ponieważ linia komórkowa UMR 106 jest syngeniczna ze szczurami SD, nie jest potrzebne napromienianie).

  1. indukcja
    1. Umieść szczura w średniej wielkości komorze indukcyjnej i wywołaj znieczulenie 2%-3% izofluranem. Stale monitoruj zwierzę pod kątem głębokości znieczulenia poprzez odruch szczypania palców u stóp, częstość oddechów i charakter.
    2. Włóż nos do nosa. W razie potrzeby zabezpiecz taśmą.
    3. Usuń włosy z prawej nogi aż do brzusznej i grzbietowej dolnej części brzucha za pomocą maszynki do strzyżenia lub użyj środka do depilacji. Ułóż szczura w pozycji leżącej.
    4. Wyszoruj obszar operacyjny w aseptyce przy użyciu 70% etanolu i rozcieńczyć octan chlorheksydyny lub rozcieńczyć betadynę. Zacznij wokół kolana i szoruj okrężnymi ruchami zarówno proksymalnie, jak i dystalnie. Powtórz ten krok trzy razy. Do implantacji guza nie używa się serwety.
    5. Nałóż lubrykant do oczu w obu oczach szczura, aby zapobiec wysuszeniu rogówki spowodowanemu znieczuleniem. Umieść szczura na poduszce grzewczej o niskiej temperaturze. Upewnij się, że szczur ma normalną temperaturę ciała (37 °C) i normalną częstość oddechów.
  2. chirurgia
    1. Włącz izofluran na poziomie ~1,5%-2% (dla konserwacji). Upewnij się, że zwierzę znajduje się w odpowiedniej płaszczyźnie znieczulenia poprzez brak odruchu szczypania palców u stóp. Jeśli nie, należy zwiększyć zawartość izofluranu do 2,5%.
    2. Zaznacz sterylną igłę (około 22 G) w odległości 10 mm od końcówki, aby wskazać głębokość wkłucia.
    3. Wbij igłę 10 mm w dół do trzonu kości piszczelowej, wchodząc w zgięte kolano w środku płaskowyżu piszczelowego, przedłużając igłę przez przynasadę do trzonu za pomocą lekkiego ruchu przypominającego wiertło, aby zrobić otwór. Wyjąć igłę.
    4. Zawiesinę komórek należy załadować do strzykawki Hamiltona bezpośrednio przed wstrzyknięciem do kości piszczelowej. Aby to zrobić, delikatnie wymieszaj komórki przed wciągnięciem do strzykawki, ponieważ grawitacja sprawia, że komórki osiadają na dnie probówki.
      UWAGA: Komórki można przechowywać w probówce o pojemności od 1,5 do 2 ml (w temperaturze pokojowej) przed pobraniem do strzykawki Hamilton (100 μL) po dokładnym wymieszaniu. Komórki mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej przez 2-3 godziny podczas zabiegu implantacji. Zawsze sprawdzaj żywotność komórek w probówce przed i po sesji implantacji. Wykluczenie błękitu trypanowego jest najłatwiejszą metodą oceny żywotności komórek.
    5. Po przecięciu kości pierwszą igłą należy wprowadzić drugą igłę (o mniejszej średnicy, również oznaczoną na 10 mm) igłę dołączoną do 100 μl strzykawki Hamiltona wypełnionej komórkami. Upewnij się, że igła do oznaczenia 10 mm została włożona w ten sam otwór sięgający do trzonu.
    6. Delikatnie wypuścić 20 μl zawiesiny 75 000 komórek OS w PBS do trzonu i jamy szpiku.
      UWAGA: Igła nie powinna chwiać się w kości i powinna być bezpieczna. Jeśli igła łatwo się porusza, kora mogła zostać przecięta w trzonie. Powtórz indukcję ponownie, aby uzyskać mocniejsze umieszczenie przed wstrzyknięciem komórek.
    7. Usunąć igłę Hamiltona z kości.
      UWAGA: Jeśli utworzy się mała kropla krwi, lekko dociśnij. Jeśli w miejscu nakłucia utworzy się przezroczysta kropla płynu, igła mogła nie zostać wystarczająco głęboko wciągnięta w kość, a zawiesina komórek nowotworowych mogła przeciekać z powrotem przez otwór. Zapisz to w notatkach, ale ogólnie rzecz biorąc, implantacja guza zakończy się sukcesem. Z doświadczeniem zabieg implantacji guza powinien trwać 5 minut na szczura. Wraz z doświadczeniem implantacja komórek nowotworowych w kości stanie się łatwiejsza. Przypadkowe wstrzyknięcie komórek do mięśnia wokół kości może nie prowadzić do mikrośrodowiska guza potrzebnego do przerzutów do płuc.
  3. Odzyskiwania
    1. Upewnij się, że szczur jest normotermiczny. Umieść szczura w klatce z poduszką grzewczą umieszczoną pod klatką w celu odzyskania zdrowia.
    2. Po pełnym przebudzeniu, sprawności ruchowej i prawidłowym oddychaniu, wstrzyknąć szczurom buprenorfinę (1,0-1,2 mg/kg s.c.).
      UWAGA: Aby uzyskać dostęp do buprenorfiny, skontaktuj się z instytucją, aby zapoznać się z opcjami zatwierdzenia przez personel weterynaryjny w celu złożenia zamówienia.
    3. Przenieś szczury z powrotem do czystych klatek i monitoruj raz dziennie, każdego tygodnia.

3. Pomiar i monitorowanie

  1. Zmierz rozmiar guza 9-10 dni po implantacji, a następnie co 2 dni do 3 tygodni po implantacji, aby ustalić tempo wzrostu. Zmierz maksymalną średnicę kości piszczelowej za pomocą suwmiarki elektronicznej lub ręcznej. Przechowuj dane w arkuszu kalkulacyjnym z formułą do obliczania objętości guza. Zmierz przeciwległą (nie wszczepioną piszczel) jako linię bazową.
    UWAGA: Wszczepione średnice kończyn tylnych są używane jako substytut wielkości guza. Kończyny tylne są mierzone prostopadle do osi długiej kości piszczelowej o największej średnicy dla dwóch pomiarów, brzusznej/grzbietowej i środkowej/bocznej kończyny. Szacowaną objętość guza oblicza się według wzoru11: Objętość guza (mm3) = największa średnica (mm) x najmniejsza średnica (mm)2/2.
  2. Rozważ przeżycie szczurów pod kątem amputacji lub chemioterapii, gdy guzy zbliżają się do 15 mm w największym wymiarze lub 3 tygodnie po implantacji guza. Kończyna przeciwległa mierzy około 7-9 mm u większości szczurów w tym wieku.

4. Doxorubicin podawanie dożylne

  1. Znieczulij szczury 2% izofluranem. Przygotuj skórę nad żyłą szyjną za pomocą trzech zabiegów chirurgicznego płukania przy użyciu betadyny i alkoholu, zgodnie z opisem13.
  2. Podczas starannej sekcji uwidocznij prawą lub lewą żyłę szyjną. Włóż igłę do leżącego mięśnia, a następnie skieruj ją w stronę głowy szczura do światła żyły szyjnej, tak jak jest to uwidocznione w żyle szyjnej przed mięśniem piersiowym.
    1. Po wprowadzeniu igły do żyły szyjnej należy delikatnie pobrać krew do strzykawki, aby zapewnić prawidłowe wprowadzenie. Można sądzić, że igła przechodzi przez żyłę, ale igła znajduje się pod żyłą, a nie w świetle. Jeśli żyła szyjna stanie się zbyt mała do wstrzyknięć podczas rozwarstwienia w celu odsłonięcia żyły szyjnej, należy użyć drugiej żyły szyjnej do wstrzyknięcia.
  3. Doksorubicynę (2 mg/kg) wstrzykiwać powoli przez 1 minutę w objętości 100-150 μl. Roztwór można uwidocznić dożylnie w żyle szyjnej podczas porodu.
  4. Wstrzyknąć podobne objętości normalnej soli fizjologicznej szczurom kontrolnym.
  5. Wyjąć igłę i delikatnie uciskać żyłę sterylną gazą.
  6. Zamknij nacięcie skóry za pomocą 3-4 klipsów do ran. Usuń klipsy po 7-10 dniach od wstrzyknięcia.
    UWAGA: Szczury zwykle nie próbują usuwać metalowych klipsów, ale gryzą i usuwają szwy. Metoda iniekcji szyjnej jest lepsza niż iniekcja doksorubicyny do żyły ogonowej, ponieważ każdy lek, który wycieka na zewnątrz naczynia, powoduje martwicę ogona, która może wymagać amputacji ogona.

5. Protokół amputacji kończyn tylnych

  1. indukcja
    1. Umieść szczura w średniej wielkości komorze indukcyjnej i wywołaj znieczulenie 2%-4% izofluranem. Stale monitoruj szczura pod kątem głębokości znieczulenia.
      UWAGA: Komora indukcyjna jest przesysana do kanistra z węglem drzewnym, a wszelkie inne gazy są usuwane przez stół z ciągiem w dół używany do operacji.
    2. Włóż nos do nosa. W razie potrzeby zabezpiecz taśmą.
      UWAGA: Ta procedura jest wykonywana na stole z ciągiem w dół w celu usunięcia nadmiaru lotnych gazów (tj. izofluranu).
    3. Usuń włosy z prawej nogi aż do brzusznej i grzbietowej dolnej części brzucha za pomocą maszynki do strzyżenia lub użyj środka do depilacji. Ułóż szczura w pozycji leżącej.
    4. Wyszoruj obszar operacyjny w aseptyce przy użyciu 70% etanolu i rozcieńczyć octan chlorheksydyny lub rozcieńczyć betadynę. Przygotuj skórę do operacji od środka łydki do obszaru skóry tuż nad stawem biodrowym prawej dolnej części brzucha. Wyszoruj nogę proksymalnie i dystalną okolicę obwodowo. Powtórz ten krok trzy razy.
    5. Nałóż smar do oczu w obu oczach szczura. Upewnij się, że szczur ma normalną temperaturę ciała (37 °C) i normalne parametry życiowe. Monitoruj i reguluj temperaturę ciała za pomocą poduszki grzewczej, która jest podłączona do monitora sondy temperatury doodbytnicy.
  2. chirurgia
    1. Włącz izofluran na poziomie 1,5%-3% (konserwacja). Monitoruj głębokość znieczulenia, w tym reakcję na uszczypnięcie palca, częstość oddechów i charakter. W razie potrzeby należy dostosować dawkę izofluranu, aby utrzymać odpowiednią płaszczyznę znieczulenia.
      UWAGA: Częstość oddechów w znieczuleniu powinna wynosić od 50 do 100 oddechów na minutę. Głębokie, rzadkie oddechy wskazują, że szczur jest zbyt głęboko znieczulony.
    2. Otwórz sterylne opakowania narzędzi i obłożenia oraz załóż sterylne rękawiczki. Zadbaj o zachowanie sterylności przez cały czas trwania zabiegu. Potrzebne są podstawowe sterylne narzędzia chirurgiczne, uchwyt na ostrze skalpela, kleszcze, hemostatyki, uchwyt na igłę, nożyczki i aplikator do spinania ran.
    3. Przeciągnij nogę szczura przez otwór wentylacyjny sterylnej obłożenia chirurgicznego. Upewnij się, że zwierzę znajduje się w odpowiedniej płaszczyźnie znieczulenia za pomocą odruchu szczypania palców u stóp.
    4. Za pomocą ostrza skalpela lub nożyczek chirurgicznych wykonaj obwodowe, skórne nacięcie tuż proksymalnie do kolana (stawu kolanowego).
    5. Odepić tylną kończynę za pomocą gazy lub rozwarstwienia, aby odsłonić tętnicę i żyłę udową na brzuszno-przyśrodkowej powierzchni kończyny tylnej.
    6. Podwiązywać naczynia za pomocą szwów wchłanialnych 4-0 na poziomie dystalnie środkowej części kości udowej i transektu.
    7. Zacisnąć żyłę dystalnie, aby zmniejszyć wyciek podczas rozwarstwiania mięśni.
      UWAGA: Mięśnie obwodowe będą transektowane dystalnie do poziomu podwiązania naczynia tętnicy udowej i mięśni uniesionych od kości udowej do poziomu stawu biodrowo-udowego.
    8. Za pomocą rozwarstwienia odwodzić staw biodrowy z boczną rotacją na zewnątrz.
    9. Znajdź głowę kości udowej i odłącz ją od panewki. Wytnij pozostałą tkankę, utrzymując nogę przymocowaną do ciała.
    10. Podać blok rozpryskujący się na panewkę i nerw kulszowy za pomocą około 6 mg/kg ropiwakainy.
    11. Zamknij mięśnie nad panewką za pomocą prostego szwu przerywanego (4-0, szew wchłanialny).
      UWAGA: Dodatkowe 0,5% bupiwakainy lub lidokainy (łącznie 0,15-0,2 mg) można wstrzyknąć w kilka miejsc wzdłuż zamkniętej warstwy mięśniowej (miejscowy naciek/blok rozpryskowy).
    12. Oprzyj i zamknij krawędzie skóry za pomocą klipsów do ran rozmieszczonych co 5-10 mm.
  3. Odzyskiwania
    1. Umieść szczura w czystej klatce regeneracyjnej ze wspomaganiem ciepła za pomocą poduszki grzewczej umieszczonej pod klatką.
      UWAGA: Aby zapobiec hipertermii, poduszka grzewcza nie powinna mieć bezpośredniego kontaktu ze zwierzęciem i nie powinna przekraczać 40 °C.
    2. Monitorować zwierzę, aż w pełni wyzdrowieje i osiągnie normotermię (37,5-39 °C).
      UWAGA: Zwierzę nie powinno być pozostawiane bez opieki, dopóki nie będzie w pełni przytomne i nie znajdzie się w pozycji leżącej oraz nie będzie się swobodnie poruszać po klatce.
    3. Po pełnym przebudzeniu, sprawności ruchowej i prawidłowym oddychaniu, wstrzyknąć szczurom buprenorfinę (1,0-1,2 mg/kg s.c.).
      UWAGA: Podanie buprenorfiny znieczulonemu szczurowi może zaburzyć powrót do zdrowia.
    4. Podawać 10 ml ciepłego roztworu Ringera z mleczanami podskórnie między łopatki.
    5. Przenieś szczury z powrotem do czystej klatki i połącz się z przedstawicielami tego samego gatunku.
    6. Monitoruj wszystkie zwierzęta dwa razy dziennie przez następny miesiąc pod kątem oznak bólu i niepokoju, w tym piloerekcji, zgarbionej postawy, braku apetytu lub objawów infekcji miejsca nacięcia, w tym rumienia, ropnej wydzieliny lub rozejścia się rany.
      UWAGA: Do tej pory nie zaobserwowaliśmy objawów klinicznych (takich jak infekcje) po powrocie do zdrowia po operacji u żadnego ze zwierząt. Tylko jeden szczur miał rozejście się ze szwami, po czym do zamykania ran bez dalszych problemów używano klipsów do zamykania ran.
    7. Zwierzętom wykazującym kliniczne objawy bólu należy podawać buprenorfinę lub meloksykam w opublikowanych dawkach w porozumieniu z lekarzem weterynarii zajmującym się zwierzętami laboratoryjnymi.
    8. Podawać antybiotyki (tj. cefalosporynę) zwierzętom wykazującym kliniczne objawy bólu w opublikowanych dawkach w porozumieniu z lekarzem weterynarii zwierząt laboratoryjnych.
      UWAGA: Wszystkie zwierzęta wykazujące przedłużające się objawy bólu lub niepokoju, które nie ustępują po zastosowaniu leków przeciwbólowych lub zwierzęta wykazujące objawy infekcji, które nie reagują na antybiotyki, muszą zostać humanitarnie poddane eutanazji.

6. Obrazowanie za pomocą promieniowania rentgenowskiego

  1. Po implantacji guza nieinwazyjnie zobrazuj piszczele i płuca, aby wykryć wzrost guza za pomocą promieniowania rentgenowskiego za pomocą urządzenia przeznaczonego dla gryzoni.
  2. Znieczulij szczury, tak jak poprzednio.
  3. Rób zdjęcia w 3-krotnym powiększeniu przez 6 s przy napięciu 25 kV.
  4. Przetwórz film za pomocą procesora rentgenowskiego. Zdjęcia rentgenowskie mogą być również skanowane cyfrowo.

7. Procedura sekcji

zwłok
  1. Poddać szczury eutanazji za pomocą CO2 . Potwierdź zgon z powodu braku bicia serca i natychmiast pobierz 3 ml krwi z serca do próbek surowicy lub osocza.
  2. Otwórz klatkę piersiową i brzuch do badania.
  3. Odizolować tchawicę i kanulować cewnikiem (18 G). Aby zabezpieczyć cewnik w tchawicy, zawiąż jedwabny szew wokół obu tchawic z cewnikiem.
  4. Podłączyć cewnik infuzyjny do strzykawki o pojemności 3 lub 5 ml. Wlej formalinę lub sól fizjologiczną, aby delikatnie napompować płaty płuc, aby uzyskać lepsze próbki histologiczne. Po infuzji płuca nadęją się i umożliwią lepszą wizualizację przerzutów do płuc.
  5. Zbadaj, rozbioruj i zważ wszystkie wybrane narządy klatki piersiowej i jamy brzusznej (takie jak wątroba, nerki).
  6. Umocuj narządy w formalinie do histopatologii lub zamroź na suchym lodzie, 2-metylobutanie lub ciekłym azocie.
  7. W celu oceny ekspresji białka za pomocą western blot należy wykonać lizaty zamrożonych tkanek. Przeciwciała, które reagują z tkankami szczurów, są szczegółowo oznaczone13.

8. Immunohistochemia

  1. Przetwórz pierwotną tkankę OS, zanurz ją w parafinie i przetnij w celu barwienia immunohistochemicznego.
  2. Pobrać antygen po odparafinowaniu za pomocą buforu cytrynianowego (pH 6,0). Inkubować w 0,3% H2O2 w metanolu przez 30 minut w celu wygaszenia endogennej peroksydazy.
  3. Zablokuj skrawki parafiny o grubości 5 μm za pomocą zwykłej surowicy.
  4. Inkubować z pierwszorzędowymi przeciwciałami anty-CD68 i CD3 (patrz tabela) przez noc w temperaturze 4 °C.
  5. Przepłukać skrawki w PBS i inkubować je w polimerze HRP za pomocą zestawu do wykrywania.
    UWAGA: Barwienie immunologiczne zostało opracowane z diaminobenzydyną jako chromogenem.

9. Western blotting

  1. Poddaj ogniwa UMR-106 lizie w 200-300 μl buforu do lizy14, aby wykonać standardową elektroforezę żelową i western blotting.
  2. Używaj od 4% do 12% żeli Bis-Tris.
  3. Inkubować w przeciwciałie pierwszorzędowym anty-ErbB2, anty-ErbB4, anty-EGFR, anty-ERK, β-aktynie lub anty-myszym β2-AR (patrz tabela) i przeciwciałie drugorzędowym związanym z peroksydazą chrzanową.
  4. Dodaj podłoże chemiluminescencyjne. Wystaw membrany na działanie kliszy rentgenowskiej.
    UWAGA: Poziomy β-aktyny są używane jako kontrola obciążenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Do badań nad OS wykorzystuje się immunokompetentne szczury SD outbred, co zapewnia model zwierzęcy z nienaruszonym układem odpornościowym. Użyliśmy linii komórkowej UMR106 z ATCC, opracowanej z komórek pierwotnie wyizolowanych z OS szczura SD. Komórki te zaimplantowano szczurom SD, tworząc w ten sposób syngeniczny model OS. Komórki UMR106 implantuje się do kości piszczelowej 3-tygodniowych samców i samic szczurów SD, co symuluje pediatryczny model OS. Ponadto ortotopowa implantacja komórek UMR106 bezpośrednio do rozwlekk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Szczury z implantami piszczelowymi OS rozwijają mierzalne guzy w ciągu 3 tygodni po implantacji. Jeśli kończyny z guzami zostaną amputowane 3 tygodnie po implantacji, częstość występowania przerzutów do płuc jest znacznie zmniejszona. Systemy operacyjne są zarówno osteolityczne, jak i osteoblastyczne. U szczurów bez amputacji rozwijają się przerzuty do płuc, które są liczne i różnej wielkości, obserwowane za pomocą radiografii lub sekcji zwłok przez 7 tygodni po implantacji. EGFR, ErbB2 i ErbB4 ulegają ekspresji w szczur...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Brak obowiązku ujawniania informacji.

Podziękowania

Finansowanie NIH przez National Cancer Institute, grant # CA228582. Shun Ishiyama otrzymuje obecnie grant od Toray Medical Co., Ltd.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AKTCell Signaling TECHNOLOGY4685S
wchłanialny szewEthiconJ214H
β-aktynaSANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-47778
β Przeciwciało 2-ARSANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-569zastąpione przez β 2-AR (E-3): sc-271322
Bis– Tris żeleThermo FisherNP0321PK2
Buprenorphine SR LabZooPharmIZ-70000-201908
Przeciwciało CD3Przeciwciało Dako#A0452
CD68eBioscience#14-0688-82
Podłoże chemiluminescencyjnecytivaRPN2232
folia CL-XposureThermo Fisher34089
Kompletny system anestezjologicznyEVETEQUIP922120
diaminobenzydynaVECTOR LABORATORIESSK-4100
DoksorubicynaActavisNDC 45963-733-60
PrzeciwciałoEGFR SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-03zastąpione przez EGFR (A-10): sc-373746
Przeciwciało ERBB2SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-284zastąpiony przez Neu (3B5): sc-33684
Przeciwciało ERBB4SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-283zastąpione przez ErbB4 (C-7): sc-8050
PrzeciwciałoERK SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-514302
lubrykant do oczuPHARMADERMNDC 0462-0211-38
Strzykawka Hamilton (100 &mikro; L)HamiltonModel 1710 SN SYR
wtórne sprzężone z peroksydazą chrzanowącytivaNA934
Zestaw do wykrywania polimerów HRPVECTOR LABORATORIESMP-7401
Zestaw do wykrywania polimerówHRP VECTOR LABORATORIESMP-7402
izofluranBUTLER SCHEINNDC 11695-6776-2
izofluran waporyzatorEVETEQUIP911103
UMR-106 komórka ATCCCRL-1661
X-rayFaxitronUltraFocus
Procesor rentgenowskiHope X-Ray Peoducts IncMicroMax X-rayProcessors Hope Processors nie są już dostępne w USA
klipsydo ran BECTON DICKINSON427631
przeciwciało

Bibliografia

  1. Link, M. P., et al. The effect of adjuvant chemotherapy on relapse-free survival in patients with osteosarcoma of the extremity. New England Journal of Medicine. 314 (25), 1600-1606 (1986).
  2. Bielack, S. S., et al. Prognostic factors in high-grade osteosarcoma of the extremities or trunk: an analysis of 1,702 patients treated on neoadjuvant cooperative osteosarcoma study group protocols. Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 776-790 (2002).
  3. Botter, S. M., Neri, D., Fuchs, B. Recent advances in osteosarcoma. Current Opinion in Pharmacology. 16, 15-23 (2014).
  4. Ek, E. T. H., Dass, C. R., Choong, P. F. M. Commonly used mouse models of osteosarcoma. Critical Reviews in Oncology Hematology. 60 (1), 1-8 (2006).
  5. Guijarro, M. V., Ghivizzani, S. C., Gibbs, C. P. Animal models in osteosarcoma. Frontiers Oncology. 4, 189(2014).
  6. Janeway, K. A., Walkley, C. R. Modeling human osteosarcoma in the mouse: From bedside to bench. Bone. 47 (5), 859-865 (2010).
  7. Mohseny, A. B., Hogendoorn, P. C., Cleton-Jansen, A. M. Osteosarcoma models: from cell lines to zebrafish. Sarcoma. 2012, 417271(2012).
  8. Khanna, C., et al. An orthotopic model of murine osteosarcoma with clonally related variants differing in pulmonary metastatic potential. Clinical & Experimental Metastasis. 18 (3), 261-271 (2000).
  9. Martin, T. J., et al. Parathyroid hormone-responsive adenylate cyclase in induced transplantable osteogenic rat sarcoma. Nature. 260 (5550), 436-438 (1976).
  10. Fisher, J. L., Mackie, P. S., Howard, M. L., Zhou, H., Choong, P. F. The expression of the urokinase plasminogen activator system in metastatic murine osteosarcoma: an in vivo mouse model. Clinical Cancer Research. 7 (6), 1654-1660 (2001).
  11. Yu, Z., et al. Establishment of reproducible osteosarcoma rat model using orthotopic implantation technique. Oncology Reports. 21 (5), 1175-1180 (2009).
  12. Zhang, P., et al. Homologous mesenchymal stem cells promote the emergence and growth of pulmonary metastases of the rat osteosarcoma cell line UMR-106. Oncology Letters. 8 (1), 127-132 (2014).
  13. Gabrielson, K., et al. Heat shock protein 90 and ErbB2 in the cardiac response to doxorubicin injury. Cancer Research. 67 (4), 1436-1441 (2007).
  14. Sysa-Shah, P., et al. Bidirectional cross-regulation between ErbB2 and β-adrenergic signalling pathways. Cardiovascular Research. 109 (3), 358-373 (2016).
  15. Wachtman, L. M., Browning, M. D., Bedja, D., Pin, S., Gabrielson, K. L. Validation of the use of long-term indwelling jugular catheters in a rat model of cardiotoxicity. Journal of American Association Laboratory Animal Science. 45, 55-64 (2006).
  16. Abdou, A. G., et al. The Prognostic role of Ezrin and HER2/neu expression in osteosarcoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 24 (5), 355-363 (2016).
  17. Hughes, D. P., Thomas, D. G., Giordano, T. J., McDonagh, K. T., Baker, L. H. Essential erbB family phosphorylation in osteosarcoma as a target for CI-1033 inhibition. Pediatric Blood & Cancer. 46 (5), 614-623 (2006).
  18. Wen, Y. H., et al. Epidermal growth factor receptor in osteosarcoma: expression and mutational analysis. Human Pathology. 38 (8), 1184-1191 (2007).
  19. Khanna, C., et al. Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4200-4209 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Szczurzy model osteosarkomaortotopowe wszczepienie nowotworuamputacja kończynyprzerzuty do płucszczury Sprague Dawleywstrzyknięcie do żyły szyjnejobrazowanie rentgenowskieimmunohistochemiaekspresja kinaz białkowychinfiltracja komórek nowotworowych
Syngeneiczny ortotopowy kostniakomięsak Sprague Dawley Rat Model z amputacją w celu kontrolowania częstości przerzutów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.