Cytometria przepływowa i obrazowanie konfokalne Analiza niskiej ekspresji Wnt w tymocytach reporterowych Axin2-mTurquoise2

Podsumowanie

Wiadomo, że poziomy sygnalizacji regulują los komórki, co wskazuje, że regulacja sygnalizacji Wnt stanowi interesujący cel terapeutyczny. W tym miejscu opisujemy metody analizy cytometrii przepływowej i mikroskopii konfokalnej dla solidnego mysiego kanonicznego modelu reporterowego sygnalizacji Wnt, który mierzy różne poziomy sygnalizacji Wnt.

Streszczenie

Pomiar poziomu ekspresji Wnt jest niezbędny, gdy próbujesz zidentyfikować lub przetestować nowe cele terapeutyczne Wnt. Wcześniejsze badania wykazały, że kanoniczna sygnalizacja Wnt działa poprzez mechanizm zależny od dawki, co motywuje potrzebę badania i mierzenia sygnalizacji Wnt w różnych typach komórek. Chociaż zaproponowano kilka modeli reporterowych reprezentujących fizjologiczną ekspresję Wnt, zarówno kontekst genetyczny, jak i białko reporterowe miały duży wpływ na trafność, dokładność i elastyczność tych narzędzi. W artykule opisano metody pozyskiwania i analizowania danych uzyskanych za pomocą mysiego modelu reporterowego Wnt Axin2-mTurquoise2, który zawiera zmutowany allel Axin2^em1Fstl. Model ten ułatwia badanie endogennej kanonicznej sygnalizacji Wnt w poszczególnych komórkach w szerokim zakresie aktywności Wnt.

Ten protokół opisuje, jak w pełni docenić aktywność reporterową Axin2-mTurquoise2 za pomocą analizy populacji komórek układu krwiotwórczego, w połączeniu ze znacznikami powierzchni komórki lub β-katenina barwienie wewnątrzkomórkowe. Procedury te służą jako podstawa do implementacji i rozmnażania w innych tkankach lub komórkach będących przedmiotem zainteresowania. Łącząc aktywowane fluorescencją sortowanie komórek i obrazowanie konfokalne, można wizualizować różne kanoniczne poziomy ekspresji Wnt. Zalecane strategie pomiaru i analizy dostarczają danych ilościowych na temat poziomów ekspresji fluorescencji w celu precyzyjnej oceny kanonicznej sygnalizacji Wnt. Metody te będą przydatne dla badaczy, którzy chcą wykorzystać model Axin2-mTurquise2 do kanonicznych wzorców ekspresji Wnt.

Wprowadzenie

Kanoniczne sygnalizacja Wnt to zachowana ścieżka sygnałowa związana zarówno z homeostazą zdrowych tkanek, jak i z chorobą. Wykazano, że precyzyjna regulacja poziomów sygnalizacji Wnt jest ważna w rozwoju embrionalnym, ale ma również ogromne znaczenie w tkankach dorosłych. Stwierdzono, że kanoniczna sygnalizacja Wnt odgrywa ważną rolę w regeneracji tkanek kilku narządów, takich jak jelita, skóra i układ krwiotwórczy. W związku z tym, gdy sygnalizacja Wnt jest rozregulowana, pojawiają się poważne patologie. Rak jelita grubego, wątroby i skóry, choroby neurologiczne, a także niektóre nowotwory hematologiczne są przykładowymi patologiami, w których rozregulowana sygnalizacja Wnt jest czynnikiem sprawczym lub czynnikiem przyczyniającym się¹. W związku z tym kilka inhibitorów dla różnych celów Wnt jest obecnie testowanych w badaniach klinicznych jako terapie przeciwnowotworowe związane z Wnt².

Dodatkowo, interesujące postępy mają miejsce w zakresie potencjału terapeutycznego Wnt w zakresie odzyskiwania neurologicznego, zaburzeń neurologicznych związanych z wiekiem i wrodzonych zaburzeń ze spektrum autyzmu^3,4,5. Sygnały Wnt zostały zbadane pod kątem ekspansji ex vivo komórek macierzystych w celu późniejszej transplantacji⁶. Jednak terapeutyczne ukierunkowanie kanonicznej sygnalizacji Wnt jest trudnym przedsięwzięciem ze względu na jej znaczenie w wielu podstawowych funkcjach komórek i wzajemne oddziaływanie z innymi szlakami^7,8,9, co skutkuje potrzebą precyzyjnego pomiaru efektów tych środków terapeutycznych Wnt w łatwym do interpretacji modelu. Sygnalizacja kanoniczna Wnt jest napędzana przez rozpuszczalne ligandy Wnt krótkiego zasięgu, które są wydzielane przez sąsiednie komórki lub jako wydalanie autokrynne, jak zgłaszano w różnych typach komórek macierzystych reagujących na Wnt.

Receptory Wnt Frizzled i białko związane z receptorem lipoprotein (LRP) reagują na te ligandy, co uruchamia wewnątrzkomórkową kaskadę sygnalizacyjną. Gdy sygnalizacja Wnt jest wyłączona, kompleks destrukcyjny składający się z inhibitora osi (Axin), produktu genu supresorowego nowotworu, polipowatości gruczolakowatej Coli (APC), kinazy kazeinowej1 (CK1α) i kinazy syntazy glikogenu (GSK-3β), zapobiega gromadzeniu się β-kateniny (CTNNB1) przez degradację proteasomalną. Po związaniu ligandu Wnt kompleks destrukcyjny jest inaktywowany, co prowadzi do akumulacji i stabilizacji β-kateniny w cytoplazmie. Aktywna β-katenina może migrować do jądra, gdzie wiąże się z czynnikami transkrypcyjnymi czynnika transkrypcyjnego / czynnika wiążącego wzmacniacz limfoidalny (TCF / LEF), aby zainicjować transkrypcję docelowych genów Wnt. Axin2 jest uważany za gen docelowy, ponieważ jest bezpośrednim celem szlaku Wnt¹⁰. Dodatkowo Axin2 służy jako ujemny regulator, a także gen reporterowy dla aktywnej kanonicznej sygnalizacji Wnt^11,12.

Kilka kanonicznych reporterów sygnalizacji Wnt zostało opisanych w literaturze i było bardzo przydatnych w zrozumieniu roli sygnalizacji Wnt w rozwoju embrionalnym. Większość z tych reporterów korzysta z syntetycznie wstawionych miejsc wiązania TCF/LEF, które nie wykorzystują endogennego genu docelowego^{13,14,15,16,17,18,19}. Dodatkowo zastosowano strategie knock-in Axin2, które uwzględniają naturalną lokalizację genu ^{11,20,21,22,23}, z czego Axin2-LacZ jest ogólnie akceptowany jako najbardziej niezawodny kanoniczny reporter Wnt¹¹. Jednak białko reporterowe LacZ, choć łatwe w użyciu w większości tkanek, wymaga substratu β-galaktozydazy, który jest uznawany za agresywny dla żywych komórek²⁴. Szczególnie w przypadku komórek macierzystych i tymocytów, trudne warunki wykrywania LacZ zwiększają śmierć komórkową (własne nieraportowane dane) podczas pracy z zawiesinami komórek.

Chociaż wzmocnienie sygnału spowodowane barwieniem LacZ jest wygodne do wykrywania słabych sygnałów, sprawia, że kwantyfikacja jest mniej bezpośrednia, a tym samym prawdopodobnie mniej wiarygodna. W związku z tym zaprojektowano mysi model reporterowy, aby naśladować strategię genetyczną Axin2-LacZ, ale z białkiem reporterowym mTurquoise2²¹, aby zapewnić odczyt, który jest bardziej bezpośredni i bliższy fizjologicznym poziomom ekspresji. Białko fluorescencyjne mTurquoise2 jest doskonałym substytutem LacZ ze względu na wysoką jasność (wydajność kwantowa (QY) = 0,93), elastyczność w połączeniu z innymi białkami fluorescencyjnymi w celu rozległej charakterystyki powierzchni komórki oraz brak potrzeby stosowania substratu egzogennego. Co więcej, jego bliskie pokrewieństwo genetyczne z białkiem zielonej fluorescencji (GFP) daje możliwość wykorzystania większości przeciwciał fluorescencyjnych rozpoznających GFP do silniejszego wykrywania sygnału, jeśli to konieczne, w komórkach wyjątkowo wrażliwych na Wnt²⁵.

Model Axin2-mTurquoise2 jest nie tylko kanonicznym raportem Wnt, ale oferuje również możliwość badania fenotypów heterozygoty i homozygoty Axin2 (nokaut Axin2). Ukierunkowana insercja mTurquoise2 w miejscu startowym Axin2 powoduje zakłócenie białka Axin2²¹. Ponieważ Axin2, znany również jako Conductin, jest częścią kompleksu destrukcyjnego Wnt, a kompleks destrukcyjny ściśle reguluje transkrypcję za pośrednictwem β-kateniny, jego częściowy lub całkowity brak może być interesujący do badania różnych patologii. Na przykład w raku jelita grubego poziomy Axin2 są stosunkowo wysokie z powodu hiperaktywacji Wnt¹¹; Jednak jego rola w innych patologiach jest nadal w dużej mierze nieznana. Mimo że uważa się, że Axin2 odgrywa ograniczoną rolę w degradacji β-kateniny, jej rola w regulacji Wnt może być zwiększona przez dodanie małego peptydu, który blokuje wzrost raka jelita grubego za pośrednictwem Wnt²⁶.

Ogólnie rzecz biorąc, ostrożna regulacja Wnt za pomocą celów terapeutycznych Wnt może otworzyć możliwości zmiany początku lub rozwoju poważnych patologii i powinna być dalej badana w modelach o zdolności reporterskiej. W tym raporcie wyjaśniamy naszą metodę analizy najlepszych praktyk mysiego modelu Axin2-mTurquoise2 do cytometrii przepływowej i obrazowania konfokalnego. W kontekście poziomów dawkowania Wnt, bardzo niskie kanoniczne poziomy sygnalizacji Wnt są trudne do wykrycia, dla których zaawansowane możliwości wykrywania i analizy zapewniają przewagę, aby w pełni czerpać korzyści z tego modelu. Tymocyty są używane jako system modelowy ze względu na ich delikatną żywotność komórek, niską kanoniczną ekspresję sygnalizacji Wnt i skondensowany obszar cytoplazmy, aby reprezentować czułość wykrywania modelu Axin2-mTurquoise2. Dodatkowo wyjaśniono histologiczną procedurę barwienia całkowitą β-kateniną dla zawiesin komórek tymocytowych w celu pomiaru cytoplazmatycznych poziomów β-kateniny i weryfikacji aktywnej jądrowej sygnalizacji kanonicznej Wnt w połączeniu z reporterem.

Protokół

UWAGA: Wszystkie procedury na myszach zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu Etycznego ds. Eksperymentów na Zwierzętach Centrum Medycznego Uniwersytetu w Lejdzie (LUMC). Samiec i samica, 6-12-tygodniowy, typu dzikiego (wt), który nie ma insercji konstruktu reporterowego Axin2-mTurquoise2, heterozygotyczny (Tg/0) z jedną insercją konstruktu reporterowego Axin2-murquoise2, a zatem jednym zaburzonym genem Axin2 i homozygotyczny (Tg/Tg) z insercją konstruktu reporterowego Axin2-mTurquoise2 w obu allelach, a zatem dwa zakłócone geny Axin2; Myszy Axin2-mTurquoise2 (B6; W eksperymentach użyto myszy CBA-Axin2^em1Fstl/J). Zwierzęta zostały uśmiercone przez eutanazję CO₂ przed izolacją narządów. Przez cały czas trwania procedury należy zminimalizować narażenie próbek na działanie światła i przez cały czas utrzymywać je na lodzie lub w temperaturze 4 °C, chyba że wskazano inaczej. Przykryj próbki folią aluminiową. Wszystkie kroki powinny być wykonywane w standardowym laboratorium z komorą bezpieczeństwa biologicznego.

1. Przygotowanie zawiesiny komórek tymocytu

1. Zbieraj grasicę od myszy ostrożnie, bez zanieczyszczenia krwi, rozcinając brzuch myszy i ekstrahując grasicę za pomocą kleszczy. Przechowywać/transportować tymczasowo w lodowatym zmodyfikowanym podłożu Dulbecco's Sulbecco firmy Iscove (IMDM) zawierającym 2,5% płodowej surowicy cielęcej (FCS).
   UWAGA: Aby uniknąć rozlania krwi i możliwego uszkodzenia grasicy, nie należy składać myszy w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy.
2. Przygotuj probówkę o pojemności 50 ml z sitkiem o pojemności 70 μm i zwilż filtr 1 ml zimnego podłoża IMDM/2,5% FCS.
3. Rozgnieć narząd tylną końcówką tłoka strzykawki o pojemności 1 ml, jednocześnie dwukrotnie przemywając zimną pożywką IMDM/2,5% FCS (Rysunek 1A). W razie potrzeby dodać końcowe stężenie 50 U/ml DNAzy I do pożywki IMDM/2,5% FCS, aby zapobiec zlepianiu się martwych komórek. Przepłukać filtr 2x zimnym medium IMDM/2,5% FCS i delikatnie zawiesić w probówce 50 ml.
   UWAGA: Nie przekraczaj całkowitej objętości końcowej 10 ml. Trzymaj komórki na lodzie i w ciemności przez kolejne kroki i gdy nie są obsługiwane.
4. Wirować przy 330 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i delikatnie zassać supernatant z osadu komórkowego. Delikatnie zawiesić osad komórek w zimnym, niekompletnym podłożu IMDM/2,5% FCS i przygotować do liczenia komórek.
   UWAGA: W razie potrzeby zamrozić i przechowywać tymocyty w ciekłym azocie w FCS-10% dimetylosulfotlenku do późniejszych eksperymentów. Prawidłowe zamrażanie i rozmrażanie komórek zmniejszy nadmierną śmierć komórek. Średnio połowa tymocytów może ulegać apoptozie po rozmrożeniu ze względu na naturalną selekcję limfocytów T w grasicy, którą należy wziąć pod uwagę przy podejmowaniu decyzji, ile tymocytów zamrozić w jednej kriofiolce. Nie mniej niż 2,5 × 10⁶ tymocytów należy zamrozić w jednej fiolce.

2. Przygotowanie cytometrii przepływowej tymocytów

1. Przygotuj tymocyty do procedury barwienia powierzchni komórek, przygotowując 2,5 × 10⁶ tymocytów na próbkę barwienia w lodowato zimnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS, pH 7,4) (Rysunek 1B). Przelicz liczbę żywych komórek po rozmrożeniu, jeśli tymocyty zostały wcześniej zamrożone. W razie potrzeby dodać końcowe stężenie 50 U/ml DNAzy I, aby zapobiec zlepianiu się martwych komórek.
2. Użyj paneli do barwienia przeciwciał do scharakteryzowania powierzchni komórek pełnego podzbioru tymocytów.
   UWAGA: Można wybrać inne kombinacje fluorochromów. Wybierz rzadkie markery populacji dla jasnych fluorescencyjnych fluorochromów i, jeśli to możliwe, dodaj marker żywej śmierci. Ani fluorochromy V450, ani V500 nie powinny być stosowane w połączeniu z reporterem fluorescencyjnym mTurquoise2 ze względu na nakładanie się widma. Zawsze sprawdzaj widma fluorescencji mTurquoise2 w połączeniu z niebieskimi i zielonymi fluorochromami (rysunek uzupełniający 1A).
   1. Wymieszać przeciwciała w wcześniej zdefiniowanych proporcjach paneli ujemnych pod względem linii (Lin-) oddzielnie w buforze PBS/0,2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA)/0,1% NaN₃ (azydek sodu).
      UWAGA: Wszystkie niechciane komórki (nie-tymocyty obecne w grasicy) są barwione w 2-etapowym procesie za pomocą drugorzędowego przeciwciała streptawidyny (w tym przykładzie fikoerytryny (Pe)-Cy7 i allofikocyjaniny (APC)-Cy7) i można je wykluczyć za pomocą "bramki zrzutu" w analizie cytometrii przepływowej.
   2. Wymieszać przeciwciała w wcześniej zdefiniowanych proporcjach panelu barwienia podwójnie ujemnego (DN) z przeciwciałem drugorzędowym streptawidyny Pe-Cy7 w buforze PBS/0,2% BSA/0,1% NaN₃. Wyklucz panel Lin- z tej mieszanki (Tabela 1).
   3. Wymieszać przeciwciała we wcześniej zdefiniowanych proporcjach panelu barwienia niedojrzałego pojedynczego dodatniego (ISP), podwójnie dodatniego (DP) i pojedynczego dodatniego (SP) z drugorzędowym przeciwciałem streptawidyny APC-Cy7 w buforze PBS/0,2% BSA/0,1% NaN₃. Wyklucz panel Lin- z tej mieszanki (Tabela 1).
   4. Po pierwsze, wybarwić tymocyty niechcianymi populacjami komórek innych niż T, używając mieszanin przeciwciał pierwotnych biotyny z paneli Lin- przez 30 minut na lodzie w ciemności.
      UWAGA: Każdy panel Lin-panel to inny zestaw komórek i dlatego nie powinien być barwiony razem w jednej próbce.
   5. Wirować w temperaturze 300 × g, 4 °C przez 5 minut i usunąć supernatant. Przemyć tymocyty 150 μl lodowatego buforu PBS/0,2% BSA/ 0,1% NaN₃ i odwirowywać w temperaturze 300 × g, 4 °C przez 5 minut.
   6. Barwienie za pomocą panelu DN i panelu ISP/DP/SP odpowiedniego barwienia Lin- przez 30 minut na lodzie w ciemności. Wirować w temperaturze 300 × g, w temperaturze 4 °C przez 5 minut i usunąć supernatant. Przemyć tymocyty 150 μl lodowatego buforu PBS/0,2% BSA/0,1% NaN₃ i odwirowywać w temperaturze 300 × g, 4 °C przez 5 minut.
3. Przygotować komórki do pomiaru cytometrii przepływowej poprzez homogenizację z rurką sitową o wielkości 35 μm i umieszczenie komórek w buforze PBS/0,2% BSA/0,1% NaN₃. Chroń komórki przed światłem i trzymaj na lodzie do czasu i podczas pomiaru cytometrem przepływowym.
   UWAGA: NaN₃ (azydek sodu) jest wysoce toksyczny i śmiertelny. Należy zachować szczególną ostrożność podczas pracy z tą substancją. Po użyciu należy dokładnie umyć ręce i natychmiast skontaktować się z centrum kontroli zatruć lub lekarzem w przypadku połknięcia NaN₃.

3. Pomiar cytometrem przepływowym

UWAGA: Niedoświadczeni użytkownicy powinni najpierw przejść szkolenie z cytometru przepływowego, ponieważ pomiar sygnału mTurquoise2 w połączeniu z kilkoma innymi fluorochromami wymaga doświadczenia i wiedzy na temat planowania eksperymentu. Zobacz tabelę materiałów, aby uzyskać informacje na temat cytometru przepływowego.

1. Uruchom cytometr przepływowy zgodnie z instrukcją obsługi lub innym ustalonym protokołem. Sprawdzić i w razie potrzeby wyregulować, filtr pasmowoprzepustowy ustawia się w cytometrze przepływowym, aby uzyskać optymalną strategię wykrywania fluorescencji.
   UWAGA: Zalecany filtr dla mTurquoise2 to 470/20 nm na linii lasera ultrafioletowego 405 nm, 407 nm lub rzadziej spotykanej linii laserowej 440 nm.
2. Skalibruj cytometr przepływowy, ustalając ustawienia kompensacji za pomocą dostępnych na rynku kulek kompensacyjnych i stabilnie transfekowanych komórek 293T z ekspresją mTurkusu.
   UWAGA: Zamiast koralików kompensacyjnych można stosować pojedynczo barwione tymocyty wt. W tym przypadku kompensacja za pomocą kulek była równie wydajna i wygodniejsza niż przy użyciu ogniw.
   1. Oznacz koraliki każdym pojedynczym fluorochromem użytym w eksperymencie i dołącz niebarwione koraliki. Zmierz koraliki, aby skonfigurować panel ustawień kompensacji i zmierz komórki 293T z ekspresją mTurkusu2, ponieważ nie ma pasującego fluorochromu do mTurquoise2, który można użyć na koralikach. Zapisz ustawienia kompensacji do użycia w rzeczywistym eksperymencie.
      UWAGA: Komórki wyrażające mTurquoise2 użyte do ustawienia kompensacji muszą być tak samo jasne lub jaśniejsze niż tymocyty eksprymujące mTurquoise2 w rzeczywistym eksperymencie. Upewnij się, że obecne są również mTurkusowe2-ujemne komórki 293T.
   2. Do eksperymentu należy dołączyć fluorescencję minus jeden (FMO) tymocyty barwione Tg/Tg, w tym próbkę wagową dla mTurquoise2 FMO i niebarwioną próbkę tymocytów każdego genotypu myszy jako kontrole pozytywne dla części analizy.
      UWAGA: Te elementy sterujące są ważne, aby prawidłowo ustawić bramki dla komórek dodatnich. Pozostałe próbki doświadczalne barwi się kompletnym panelem barwiącym (Tabela 1).
      1. Utwórz eksperyment, dodaj i nazwij liczbę probówek w oprogramowaniu cytometru przepływowego i utwórz wykresy punktowe, aby zwizualizować barwione komórki dla pełnego zestawu fluorochromów.
      2. Zastosuj wcześniej ustalone ustawienia wynagrodzenia do eksperymentu. Dostosuj rozproszenie do przodu (FSC) i rozproszenie boczne (SSC) za pomocą niebarwionych wt tymocytów, aż cała populacja komórek będzie widoczna na wykresie rozrzutu. Najpierw zmierz niebarwione tymocyty wykazujące ekspresję mTurkusu2, aby upewnić się, że populacja dodatnia jest widoczna.
      3. Zmierz w pełni wybarwioną próbkę tymocytu Tg/Tg i sprawdź, czy nie ma wszystkich kombinacji fluorochromu. W razie potrzeby dostosuj wcześniej ustalone wartości kompensacji dla fluorochromów, które wykazują nieprawidłową kompensację. Zmierz pozostałe próbki eksperymentalne i nie zmieniaj żadnych ustawień podczas pomiaru próbek.
         UWAGA: Późniejszą korektę kompensacji można również przeprowadzić w pakiecie oprogramowania analitycznego. Chociaż liczba dostępnych komórek może być czynnikiem ograniczającym, zaleca się wykonanie tego kroku podczas pomiaru. Utrzymuj równe ustawienia między wszystkimi próbkami w celu porównania wartości intensywności mTurquoise2.

4. Analiza cytometryczna przepływowa

UWAGA: Analiza cytometryczna przepływowa została przeprowadzona przy użyciu specjalnego oprogramowania wymienionego w Tabeli Materiałów; jednak dostępne są również inne programy do analizy cytometrii przepływowej.

1. Bramki żywych komórek i podzbiorów tymocytów zgodnie z wartościami FSC i SSC.
2. Sprawdź ustawienia kompensacji w oknie dialogowym matrycy kompensacji znajdującym się po lewej stronie próbki, aby upewnić się, że nie ma zakłóceń fluorochromowych i że nastąpiła prawidłowa kompensacja, aby uniknąć rozlania lub przesączenia.
   1. Jeśli matryca zdefiniowana przez akwizycję musi zostać dostosowana, zmień wartości w macierzy kompensacji, po prostu zwiększając lub zmniejszając wartość kompensacji każdej kombinacji fluorochromu, tak aby populacja nie wykazywała prawie idealnej linii poziomej lub pionowej (rysunek uzupełniający 1B).
3. Aby wizualnie rozłożyć intensywność mTurquoise2 w celu uzyskania prawidłowego bramkowania dodatniego, zmień wyświetlanie osi X mTurquoise2 na liniowe (rysunek uzupełniający 2).
   1. Użyj kontroli FMO mTurquoise2 jako kontroli negatywnej dla bramkowania sygnału dodatniego mTurquoise2. Poprawiono prawidłowy próg bramkowania na populację komórek (Rysunek 2).
      UWAGA: (wt) komórki kontrolne mTurquoise2 FMO nie mają markera mTurquoise2 i dlatego mogą być używane jako próg tła dla aktywności reporterowej Axin2.
4. Bramka mTurquoise2-dodatnie komórki z odpowiednim kanałem detekcji, aby określić, ile komórek jest Wnt-dodatnich.
5. Oblicz średnią geometryczną i medianę, aby określić natężenie fluorescencji w interesujących komórkach.
   1. Kliknij Statystyki | Dodaj statystykę w panelu pokazującym komórki mTurquoise2-dodatnie.
   2. Zdefiniuj metodę statystyczną, populację będącą przedmiotem zainteresowania i kanał wykrywania mTurquoise2, a następnie kliknij Dodaj. Przedstaw średnią geometryczną i medianę intensywności fluorescencji w dowolnych jednostkach (AU), aby wykreślić wykresy.
      UWAGA: Mediana reprezentuje środkową wartość intensywności fluorescencji, a zatem dostarcza informacji o przesunięciu populacji o intensywności fluorescencji. W razie potrzeby korekcja tła może pomóc w uzyskaniu wyraźniejszej wizualizacji zakresu dynamicznego aktywności reportera mTurquoise2. Można to zrobić, odejmując częstotliwości barwienia tła wt od całkowitej częstotliwości komórek mTurkusowych2-dodatnich określonego typu komórek, które są bramkowane.

5. Przygotowanie cytospinów tymocytowych do obrazowania konfokalnego

UWAGA: Cytospiny tymocytowe są zalecane podczas pracy z zawiesinami komórek nieprzylegających. Ponieważ ekspresja Axin2-mTurquoise2 w tymocytach jest niższa niż w komórkach nabłonka grasicy, do obrazowania użyto przefiltrowanych zawiesin komórek tymocytów.

1. Zacznij od zawiesiny komórkowej świeżo zebranych lub zamrożonych tymocytów. Zawiesić ~20 000 tymocytów w 100 μL zimnego PBS/0,5% BSA/10% FCS na genotyp tegocytu.
   UWAGA: W razie potrzeby delikatnie rozmrozić komórki, aby zachować maksymalną żywotność komórek podczas pracy z wcześniej zamrożonymi tymocytami. Pomoże to w zmniejszeniu autofluorescencji podczas obrazowania komórek. Sprawdzić żywotność komórek, aby zapewnić jakość próbki. Procedura cytospinowa wykorzystuje siłę mechaniczną, która została dostosowana do delikatnego tymocytu; Niemniej jednak wymaga to wysoce żywotnej populacji wyjściowej. Aby zapewnić wyższą żywotność, zaleca się rozpoczęcie od świeżo zebranych, a nie mrożonych tymocytów.
2. Wstępnie zwilż obszar wokół otworu kart filtracyjnych PBS. Zamontuj uchwyt komory na próbkę cytospinową zgodnie z instrukcją ( Rysunek 1C).
   1. Umieść kartę filtracyjną na szkiełku szronowym (gładką stroną przylegającą do szkiełka). Umieść oba elementy na uchwycie komory na próbkę. Zachowaj ostrożność, umieszczając kartę filtracyjną dokładnie w otworze uchwytu komory na próbkę i umieszczając cały uchwyt komory na próbkę w wirniku.
3. Ostrożnie zawiesić tymocyty i dodać 100 μl zawiesiny komórek do komór na próbki. Wirować zawiesinę tymocytów przez 4 minuty pod ciśnieniem ~350 × g na szkiełkach mrozowych. Ostrożnie wyjmij kartę filtracyjną ze szkiełka szronu, nie dotykając komórek. Suszyć cytospiny na powietrzu przez okres od 1 godziny do nocy w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Podczas pracy z innymi typami komórek przetestuj różne gęstości komórek, aby uzyskać optymalne wyniki. Cytospiny można zamrozić w temperaturze -20 °C w szczelnie zamkniętym pudełku w celu późniejszych eksperymentów. Rozmrażać cytospiny do dalszej obróbki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.

6. Barwienie immunologiczne cytospiny z całkowitą β-kateniną

1. Utrwal cytospiny na 15 minut w temperaturze pokojowej w 100% metanolu. Suszyć szkiełka na powietrzu przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Narysuj okrąg wokół populacji tymocytów na szkiełku za pomocą hydrofobowego pisaka.
   UWAGA: Ten etap utrwalania jest zoptymalizowany specjalnie pod kątem barwienia β-kateniną.
2. Umieść szkiełka w PBS/0,05% Tween-20 na 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przenieś je do ciemnego, wilgotnego pudełka podczas etapów blokowania i inkubacji. Dodaj 100 μl PBS/10% normalnej surowicy myszy (NMS) na szkiełko i pozostaw w wilgotnym pudełku na 10 minut w temperaturze pokojowej. Dotknij szkiełka, aby usunąć 10% NMS, dodaj 100 μl PBS/10% normalnej koziej surowicy (NGS) na szkiełko i pozostaw w wilgotnym pudełku na 30 minut w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Inkubacja z PBS/10% NMS blokuje niespecyficzne wiązanie przeciwciał pierwszorzędowych (Figura 1D), podczas gdy PBS / 10% NGS blokuje wiązanie przeciwciał niespecyficznych drugorzędowych.
3. Przygotuj dodatkowe przeciwciała do barwienia komórek. Wymieszać 0,5 μg całkowitego przeciwciała β-kateniny z fragmentami znakowanymi AF568.
   UWAGA: W tym ustawieniu użyto dostępnego na rynku zestawu do znakowania do wstępnego znakowania pierwotnej całkowitej β-kateniny anty-mysiej wtórnymi fragmentami IgG1 Fab koziej anty-myszy za pomocą znacznika fluorochromowego Alexa Fluor 568 (AF568) przed dodaniem go do tymocytów. Oznakowanie należy wykonać zgodnie z protokołem producenta, ponieważ może być konieczne przetestowanie kilku stężeń. Całkowite przeciwciało znakowane β-kateniną-AF568 należy zużyć w ciągu 30 minut.
4. Dodać 50 μl (0,5 μg) całkowitego przeciwciała znakowanego β-kateniną-AF568 na szkiełko cytospinowe przez noc w temperaturze 4 °C w wilgotnym pudełku. Uwzględnić kontrolę barwienia ujemnego zgodnie z protokołem producenta lub kontrolę izotypu w przypadku protokołu etykietowania bezpośredniego.
5. Prać przez 20 minut z PBS/0,05% Tween-20 w temperaturze pokojowej. Następnie myć przez 20 minut PBS w temperaturze pokojowej w słoiku z mieszaniem. Wykonaj drugi etap utrwalania, aby zapewnić wiązanie przeciwciała z antygenem: 10 minut w temperaturze pokojowej ze 100 μl 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS w wilgotnym pudełku.
   UWAGA: Slajdy należy trzymać w ciemności. Ani metanol, ani utrwalanie PFA nie wpłyną znacząco na wyrażenie mTurquoise2²⁷.
6. Zanurz slajdy w PBS. Barwienie jądrowe należy przeprowadzić za pomocą 50 μl TO-PRO-3 (1:1500) przez 10 minut w temperaturze pokojowej w wilgotnym pojemniku. Myć szkiełka przez 20 minut PBS w temperaturze pokojowej w słoiku z mieszaniem.
   UWAGA: Stężenie TO-PRO3 można miareczkować w zależności od zastosowania innych fluorochromów o pobliskich widmach fluorescencyjnych.
7. Zanurzyć próbki w odczynniku zapobiegającym blaknięciu zgodnie z protokołem producenta i przykryć szkiełkiem nakrywkowym. Suszyć na powietrzu przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Szkiełka można oglądać bezpośrednio pod mikroskopem fluorescencyjnym lub konfokalnym lub przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego obrazowania.

7. Konfokalny pomiar mikroskopowy

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać informacje na temat mikroskopu konfokalnego.

1. Włączyć mikroskop konfokalny zgodnie z instrukcją lub ustalonym protokołem. Użyj ujemnych i dodatnich, stabilnie transfekowanych kontrolek linii komórkowej mTurquoise2 293T do podstawowej regulacji ustawień konfokalnych. Następnie użyj tymocytów wt Axin2-mTurquoise2 i Tg/Tg (knock-out) Axin2-mTurquoise2 jako kontroli negatywnej i pozytywnej, odpowiednio, aby zapewnić brak niedoświetlenia sygnału mTurquoise2.
2. Przygotuj oprogramowanie do skanowania sekwencyjnego, programując lasery i szerokości filtrów. Zacznij od linii laserowej o najwyższej długości fali i pracuj w kierunku najniższej długości fali. Po zainstalowaniu wszystkich etapów skanowania sekwencyjnego załaduj próbkę na stolik mikroskopu, ustaw ostrość próbki i naciśnij na żywo, aby zoptymalizować moc lasera i Smart Gain za pomocą odpowiednich przycisków w oprogramowaniu konfokalnym lub opcjonalnym panelu ręcznym.
   UWAGA: Sekcja próbki szkiełka nie powinna być obrazowana w celu ilościowego określenia sygnału, ponieważ może potencjalnie wystąpić fotowybielanie. Jednak mTurquoise2 ma wysoką fotostabilność²⁵.
3. W przypadku bardzo niskiej ekspresji mTurquoise2 należy zwiększać moc lasera i Smart Gain aż do zaobserwowania sygnału fluorescencyjnego i sprawdzić z ujemną próbką kontrolną, aby upewnić się, że sygnał jest naprawdę dodatni. Wizualizuj tymocyty za pomocą soczewki olejowej 1,4 x 40x, soczewki olejowej 1,4 63x lub soczewki olejowej 100x 1,4.
   UWAGA: Do tego badania użyto mikroskopu Leica SP5.
4. Użyj tych ustawień obrazowania konfokalnego w mikroskopie przed pomiarem próbki.
   1. Dostosuj zakres wartości intensywności do obrazu 12-bitowego, klikając Konfiguracja | Ustawienia | zmień na 12-bitowy w opcji Głębia bitowa, aby utworzyć szerszą skalę intensywności, a tym samym większe rozróżnienie między sygnałami o niskiej i wysokiej fluorescencji.
   2. Dostosuj rozdzielczość obrazowania, klikając XY, i zwiększ format do 1024 x 1024, co również podwoi czas skanowania. Dostosuj prędkość skanowania do 400-600 Hz, klikając Prędkość | Więcej, aby ręcznie zmienić ustawienia. Dodatkowo aktywuj opcję Skanowanie dwukierunkowe.
   3. Dostosuj suwak czułości, aby zredukować sygnał tła. Zoptymalizuj odpowiednią moc lasera i inteligentne wzmocnienie dzięki opcji szybkiej tablicy LUT (Look-Up Table).
      UWAGA: W obrazie 12-bitowym suwak ma wartość intensywności skali szarości od 0 do 4095. Można to również zrobić później za pomocą bezpłatnego oprogramowania Las X w trybie offline. Kolor zielony pokaże czarne tło, a kolor niebieski pokaże nasycone piksele próbki.
5. Po zoptymalizowaniu wszystkich ustawień obrazowania zmierz próbkę, klikając przycisk Start, który rozpocznie sekwencyjne obrazowanie wszystkich trzech kanałów.
   1. Zmierz sygnał fluorescencji jądrowej TO-PRO-3. Wykrywanie TO-PRO-3 za pomocą lasera 633 nm i HyD 640-750 nm.
      UWAGA: W tej konfiguracji użyto 6% mocy lasera przy 15% inteligentnym wzmocnieniu. To ustawienie może się zmieniać w zależności od intensywności barwienia TO-PRO-3. Jeśli jest bardzo jasny, może wpływać na fluorochromy o niższej intensywności, gdy jest nadmiernie wzbudzony. W takim przypadku należy zmniejszyć stężenie barwienia.
   2. Zmierz jądrowe i cytoplazmatyczne sygnały fluorescencyjne β-kateniny. Wykrywanie β-kateniny za pomocą lasera 561 nm i HyD 580-605 nm. Zgromadź do 2 skanów dla jednego obrazu, dostosowując ustawienie w skrzynce XY w oprogramowaniu ze średnią liniową 2 w przypadku słabego sygnału AF568.
      UWAGA: W tej konfiguracji wykorzystano 85% mocy lasera przy 87% inteligentnym wzmocnieniu.
   3. Zmierz cytoplazmatyczny sygnał fluorescencyjny mTurquoise2. Wykrywanie mTurquoise2 za pomocą lasera 458 nm i HyD 490-600 nm. Zgromadź do 4 skanów dla jednego obrazu, dostosowując ustawienie w skrzynce XY w oprogramowaniu ze średnią liniową 4 w przypadku niskiego sygnału mTurquoise2.
      UWAGA: Ze względu na stare lasery w mikroskopie konfokalnym używanym do tego protokołu i niski sygnał mTurquoise2, zastosowano 405 nm przy 90% mocy lasera, wraz z laserami 458 nm i 476 nm przy 100% mocy lasera z HyD 490-550 nm przy 100% inteligentnym wzmocnieniu. Najbardziej optymalny jest laser o długości fali 440 nm, choć rzadziej spotykany w mikroskopie konfokalnym. Z dużą mocą lasera należy obchodzić się ostrożnie i wykonywać go tylko w przypadku obrazowania sekwencyjnego. Upewnij się, że są ustawione ustawienia awaryjne, aby uniknąć prześwietlenia detektora. Moc lasera w innych mikroskopach konfokalnych może być mniejsza niż ta proponowana w tym protokole ze względu na mocniejsze lub nowsze lasery. Można przeprowadzić test wybielania, aby upewnić się, że sygnał fluorescencyjny nie zostanie utracony przed obrazowaniem. W proponowanej konfiguracji fotowybielanie mTurquoise2 było dopuszczalne.
   4. Wykonaj obrazowanie w jasnym polu w celu wizualizacji całkowitej komórki. Wykrywaj tymocyty za pomocą lasera 488 nm i PMT Scan-DIC. Eksportuj pliki Lif do analizy obrazu.
      UWAGA: W tej konfiguracji użyto 59% mocy lasera ze wzmocnieniem 212 V i przesunięciem danych -4,3%. Pliki Lif można odczytywać w oprogramowaniu LAS x w trybie offline w celu korekcji obrazu.

8. Analiza mikroskopii konfokalnej

1. Przeanalizuj obrazy za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów²⁸ (Rysunek uzupełniający 3). Załaduj obrazy do oprogramowania.
   UWAGA: Akceptowanych jest wiele formatów, ale zalecane są pliki TIFF z tabelą LUT lub bezpośredni import plików Lif do oprogramowania do przetwarzania obrazu.
2. Zmierz aktywny sygnał β-kateniny w jądrach tymocytów.
   1. Wybierz jądra tymocytów barwionych TO-PRO-3 na czerwono-szarym obrazie wartości do analizy aktywnej β-kateniny. Zrób to ręcznie lub użyj automatycznego wyboru komórek w oprogramowaniu.
      UWAGA: Automatyczny wybór komórek może wymagać przetwarzania obrazu w celu prawidłowego progowania i analizy cząstek. Ręczny wybór komórek może być pracochłonny, ale generalnie nie wymaga żadnego przetwarzania obrazu i jest zalecany w tym protokole.
   2. Aktywuj zaznaczanie ręczne za pomocą dowolnego narzędzia zaznaczania na pasku roboczym.
      1. Wybierz kontur jądra i dodaj go do menedżera obszaru zainteresowania (ROI). Aktywuj menedżera ROI, klikając Analizuj | Narzędzia | Menedżer ROI, a gdy otworzy się nowe okno menedżera ROI, kliknij pierwszą opcję Dodaj (t) lub użyj skrótu klawiaturowego t. Powtarzaj poprzedni krok, aż wszystkie jądra zostaną zdefiniowane i dodane do menedżera ROI. Użyj opcji Pokaż wszystko w menedżerze ROI, aby zwizualizować wybrane komórki.
   3. Zaznacz >3 obszary tła, w których nie ma żadnych komórek, i dodaj je do menedżera ROI.
      UWAGA: Rozmiar i kształt nie mają w tym przypadku znaczenia. Obszary te posłużą jako pomiary szumu tła do końcowych obliczeń. >
      1. Zdefiniuj pomiar na obrazie, klikając Analizuj | Ustaw wymiary. W nowym oknie, które otworzy się z różnymi opcjami pomiaru, aktywuj Obszar, Zintegrowana gęstość i Średnia wartość szarości | kliknij OK.
      2. Aktywuj obraz wartości szarości β-kateniny, klikając na niego, a następnie zwizualizuj wybrane jądra i obszary tła, klikając Pokaż wszystko w menedżerze ROI. Obserwuj wszystkie zaznaczone obszary, które są teraz widoczne na obrazie β-kateniny.
      3. Kliknij Mierz w Menedżerze ROI lub kliknij Analizuj | Miara. Obserwuj nowe okno Wyniki, które się otworzy, pokazujące wyniki sygnału β-kateniny w ROI.
      4. Przenieś wyniki do programu kalkulacyjnego do obliczeń w arkuszu kalkulacyjnym, klikając Edytuj | Zaznacz wszystko; i skopiuj/wklej listę do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszych obliczeń. Zapisz menedżera ROI do wykorzystania w przyszłości bez konieczności powtarzania wyboru jąder, klikając Więcej | Zapisać....
   4. W celu automatycznego wyboru komórek utwórz duplikaty (Klawiatura Ctrl D) obrazu, który ma zostać przetworzony, ponieważ wielu ustawień przetwarzania obrazu nie można cofnąć.
      UWAGA: Automatyczne znakowanie jądrowe wymaga przetwarzania obrazu, w większości przypadków, w celu automatycznego i dokładnego zdefiniowania jąder. Przetwarzanie obrazu powinno odbywać się wyłącznie w celu wyboru obszaru. Przetworzone obrazy nie są przydatne do pomiaru intensywności fluorescencji, ponieważ wartości pikseli są zmieniane.
      1. Wykonaj filtr Gaussa, klikając pozycję Proces | Filtry | Rozmycie gaussowskie, aby wygładzić obraz. Przetestuj wiele wartości Sigma (Promień) i aktywuj opcję Podgląd, aby zwizualizować efekt przed kliknięciem OK.
      2. Odwróć obraz, klikając Edytuj | Odwrócić. Sprawdź jasność i kontrast, klikając Obraz | Dostosuj | Jasność/Kontrast. Użyj opcji Auto lub najlepiej ręcznie zmień wartości.
         UWAGA: Nie stosuj zmian, ponieważ zmieniłoby to właściwości obrazu. Po prostu zamknij okno B&C po uzyskaniu żądanego obrazu.
      3. Utwórz próg, klikając Obraz | Dostosuj | Próg i zdefiniuj najlepsze ustawienia progu, w których wszystkie komórki są w większości widoczne. Kliknij Zastosuj, aby zastosować ustawienia progu.
         UWAGA: Jeśli próg nie został zastosowany do komórek, które pokazują, kliknij Procesuj | Binarny | Wypełnij otwory, aby wypełnić luki w komórkach. Jeśli komórki są połączone ze sobą z ustawieniami progowymi, kliknij Proces | Binarny | Zlewnia, aby oddzielić te komórki. Drobna 1-pikselowa linia oddzieli każdą komórkę, którą program zinterpretuje jako połączoną.
      4. Zdefiniuj najmniejsze i największe jądro na obrazie, ręcznie wybierając jądro za pomocą narzędzia do zaznaczania odręcznego, dodaj je do menedżera ROI i zmierz obszar.
      5. Analizuj cząstki (jądra), klikając Analizuj | Przeanalizuj cząstki i wstaw najmniejszy obszar i największy obszar w polu Rozmiar (^2) z łącznikiem (-) pomiędzy. Aktywuj pola Wyświetl wyniki, Dodaj do menedżera i Wyklucz na krawędziach przed kliknięciem OK. Przejdź do kroku 8.2.3, aby zakończyć protokół.
3. Zmierz cytoplazmatyczne sygnały mTurquoise2 i β-kateniny w tymocytach.
   1. Wybierz kontur całych tymocytów na obrazie w jasnym polu, wykonując te same czynności, co powyżej.
   2. Zaznacz >3 obszary tła, w których nie ma żadnych komórek, i dodaj je do menedżera ROI.
      UWAGA: Rozmiar i kształt nie mają w tym przypadku znaczenia. Obszary te posłużą jako pomiary szumu tła do końcowych obliczeń. >
      1. Aktywuj obraz wartości szarości mTurquoise2, klikając go, i wizualizuj wybrane całkowite ROI komórek i obszary tła, klikając Pokaż wszystko w menedżerze ROI. Obserwuj wszystkie zaznaczone obszary, które są widoczne na obrazie mTurquoise2.
      2. Kliknij Mierz w Menedżerze ROI lub kliknij Analizuj | Miara. Obserwuj nowe okno Wyniki, które otwiera się z wynikami pomiarów sygnału mTurquoise2.
      3. Przenieś wyniki do programu kalkulacyjnego do obliczeń w arkuszu kalkulacyjnym, klikając Edytuj | Zaznacz wszystko i skopiuj/wklej listę do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszych obliczeń.
      4. Aktywuj obraz o wartości szarości β-kateniny, klikając go, i wizualizuj wybrane całkowite ROI komórek i obszary tła, klikając Pokaż wszystko w menedżerze ROI. Obserwuj wszystkie zaznaczone obszary, które są widoczne na obrazie β-kateniny.
      5. Kliknij Mierz w Menedżerze ROI lub kliknij Analizuj | Miara. Zwróć uwagę na nowe okno Wyniki, które otwiera się z wynikami pomiarów całkowitego sygnału komórkowego β-kateniny.
      6. Przenieś wyniki do programu kalkulacyjnego do obliczeń w arkuszu kalkulacyjnym, klikając Edytuj | Zaznacz wszystko i skopiuj/wklej listę do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszych obliczeń. Zapisz menedżera ROI do wykorzystania w przyszłości bez konieczności powtarzania wyboru komórek, klikając Więcej | Zapisać....
4. Obliczyć skorygowaną całkowitą fluorescencję jądrową (CTNF) dla aktywnej β-kateniny, korzystając z równania 1.
   CTNF = Gęstość zintegrowana - (Powierzchnia × średnia średnich obszarów tła) (1)
5. Obliczyć skorygowaną całkowitą fluorescencję komórek (CTCF) dla mTurkusu2 za pomocą równania 2.
   CTCF = gęstość zintegrowana - (Średnia × powierzchni średniego tła) (2)
6. Rozróżnić aktywną jądrową β-kateninę i cytoplazmatyczną β-kateninę, odejmując wartości jądrowej β-kateniny uzyskane w kroku 8.2.3.3. od całkowitych wartości β-kateniny komórek uzyskanych w kroku 8.3.2.5 w celu uzyskania cytoplazmatycznej nieaktywnej β-kateniny.
   UWAGA: Upewnij się, że pomiary są wykonywane w tej samej komórce.
   1. Oblicz średnią intensywności obszarów tła. Oblicz CTNF i CTCF za pomocą równań 1 i 2. Traktuj IntDen (sumę wszystkich pikseli w wybranym obszarze) jako gęstość całkowitą, a nie RawIntDen.
   2. W razie potrzeby oblicz odchylenie standardowe wartości IntDen do wykreślania wykresów. Rozważ do 200 oddzielnych komórek do analizy statystycznej za pomocą testu U-Manna-Whitneya.
7. Wykreśl wyniki na wykresie z pojedynczym punktem danych i oznacz oś y wartościami CTNF lub CTCF jako względne jednostki fluorescencyjne (RFU).

Wyniki

Aby zbadać rolę kanonicznej sygnalizacji Wnt, przetestowano kanoniczny model reportera Wnt Axin2-mTurquoise2 w połączeniu z ekspresją białka β-kateniny. Wiadomo, że tymocyty są kruche, wykazują niską kanoniczną sygnalizację Wnt na kilku etapach procesu dojrzewania tymocytów i mają niski stosunek cytoplazmatyczny do jądrowego; wszystkie te czynniki utrudniają wykrycie cytoplazmatycznego mTurquoise2 lub β-kateniny. Postępując zgodnie z protokołem, mysie tymocyty Axin2-mTurquoise2 zostały zebrane z grasicy i przetworzone na...

Dyskusja

Dostępnych jest kilka kanonicznych reporterów Wnt o różnej czułości reporterowej i rzeczywistych białkach reporterowych. Modele reporterowe wykorzystujące syntetycznie wprowadzone multimeryzowane miejsca wiązania TCF/LEF są dostępne z fluorescencyjnymi białkami reporterowymi; jednak takie powtórzenia transgenów mogą zostać utracone podczas hodowli lub długich eksperymentów in vivo i mogą być wrażliwe na sygnały inne niż Wnt z otaczających sekwencji genomowych, które wpływają na ekspresję reporterową. Dlatego naj...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Cytometr przepływowy BD FACScantoII	BD Biosciences	nie ma zastosowania	Numer seryjny V96300710. Konfiguracja cytometru przepływowego w tym protokole zawiera linię laserową 405 nm z filtrem długoprzepustowym 505 i filtrem pasmowoprzepustowym 530/30 nm oraz filtrem pasmowoprzepustowym 470/20 nm; Laser 488 nm z filtrem długoprzepustowym 735 nm i filtrem pasmowoprzepustowym 780/60 nm, filtrem długoprzepustowym 670 nm i filtrem długoprzepustowym 655 nm, filtrem długoprzepustowym 610 nm, filtrem długoprzepustowym 550 nm i filtrem pasmowoprzepustowym 575/26 nm, filtrem długoprzepustowym 505 nm i filtrem pasmowoprzepustowym 530/30 nm oraz filtrem pasmowoprzepustowym 488/10 nm; oraz linia laserowa 633 nm z filtrem długoprzepustowym 735 nm i filtrem pasmowoprzepustowym 780/60 nm, filtrem długoprzepustowym 685 nm i filtrem pasmowoprzepustowym 660/20 nm.
BSA	Sigma	A9647
Corning 70 μ Filtr siatkowy M	Sokół/Corning	352350
Cytospin 4 Typ A78300101	Thermo Scientific	niedostępny
DMSO	Sigma Aldrich	D5879-1L
DNAse I	Sigma	A9647
Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 50 ml	Greiner bio-one	227261
Falcon okrągłodenne probówki polistyrenowe z zatrzaskiem sitko do komórek	Fisher Scientific
Surowica dla cieląt płodowych (FCS)	Greiner Bio-One B.V.	Nie można się dostosować	Zależy od pochodzenia
Oprogramowanie Fidżi	ObrazJ	nie jest aplikowalny	Wersja 1.53
Karta filtra biała (do cytospinu)	Oprogramowanie VWR	SHAN5991022
FlowJo 10	Treestar	nie jest dostępne	Wersja 10.5.3
Zjeżdżalnie mrozowe	Klinipath
Gibco IMDM średni	Fisher Naukowy
Obiektyw HCX PL APLO 40x 1.4 OIL	Leica microsystems	Nie można się dostosować
Długopis hydrofobowy: Długopis Omm Edge	Wektor	nie jest możliwy do zastosowania
Leica TCS SP5 DMI6000	Mikrosystemy Leica	Nie można się dostosować	Konfiguracja mikroskopu w tym protokole składała się z obiektywu olejowego HCX PL APO 40x/1,2 o rozdzielczości 8 bitów, 1024 pikselach x 1024 pikselach, prędkości 400 Hz, otworku 68 i mikro; m i współczynnik powiększenia 1,5 w temperaturze pokojowej. System ten składa się z lasera diodowego 405, lasera argonowego, lasera DPSS 561, lasera HeNe 594 i lasera HeNe 633 z 4 detektorami hybrydowymi (HyD) i 5 lampami fotopowielacza (PMT).
Metanol	VWR	1060091000
NaN3/azydek sodu	Farmacja szpitalna	niezgodna
Normalna surowica myszy	Własne myszy	nie są podatne
PBS	Lonza	BE17-517Q
ProLong Diamond Antiblade Mountant	Fisher Scientific	P36965
Oczyszczona mysia anty-β-katenina (CTNNB1)	BD Biosciences	610154
TO-PRO-3 Jodek	Thermofisher	T3605
Przezroczysty lakier do paznokci	w każdej aptece	niedostępny
Tween-20	Sigma Aldrich	P1379-500ml
Zenon Alexa Fluor 568 Zestaw do etykietowania myszy IgG1	Thermofisher	Z25006