Artykuł metodologiczny

Cytometria przepływowa i obrazowanie konfokalne Analiza niskiej ekspresji Wnt w tymocytach reporterowych Axin2-mTurquoise2

DOI:

10.3791/62141

⸱

24 września 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology, Leiden University Medical Center, 2Department of Cell and Chemical Biology, Leiden University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiadomo, że poziomy sygnalizacji regulują los komórki, co wskazuje, że regulacja sygnalizacji Wnt stanowi interesujący cel terapeutyczny. W tym miejscu opisujemy metody analizy cytometrii przepływowej i mikroskopii konfokalnej dla solidnego mysiego kanonicznego modelu reporterowego sygnalizacji Wnt, który mierzy różne poziomy sygnalizacji Wnt.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomiar poziomu ekspresji Wnt jest niezbędny, gdy próbujesz zidentyfikować lub przetestować nowe cele terapeutyczne Wnt. Wcześniejsze badania wykazały, że kanoniczna sygnalizacja Wnt działa poprzez mechanizm zależny od dawki, co motywuje potrzebę badania i mierzenia sygnalizacji Wnt w różnych typach komórek. Chociaż zaproponowano kilka modeli reporterowych reprezentujących fizjologiczną ekspresję Wnt, zarówno kontekst genetyczny, jak i białko reporterowe miały duży wpływ na trafność, dokładność i elastyczność tych narzędzi. W artykule opisano metody pozyskiwania i analizowania danych uzyskanych za pomocą mysiego modelu reporterowego Wnt Axin2-mTurquoise2, który zawiera zmutowany allel Axin2em1Fstl. Model ten ułatwia badanie endogennej kanonicznej sygnalizacji Wnt w poszczególnych komórkach w szerokim zakresie aktywności Wnt.

Ten protokół opisuje, jak w pełni docenić aktywność reporterową Axin2-mTurquoise2 za pomocą analizy populacji komórek układu krwiotwórczego, w połączeniu ze znacznikami powierzchni komórki lub β-katenina barwienie wewnątrzkomórkowe. Procedury te służą jako podstawa do implementacji i rozmnażania w innych tkankach lub komórkach będących przedmiotem zainteresowania. Łącząc aktywowane fluorescencją sortowanie komórek i obrazowanie konfokalne, można wizualizować różne kanoniczne poziomy ekspresji Wnt. Zalecane strategie pomiaru i analizy dostarczają danych ilościowych na temat poziomów ekspresji fluorescencji w celu precyzyjnej oceny kanonicznej sygnalizacji Wnt. Metody te będą przydatne dla badaczy, którzy chcą wykorzystać model Axin2-mTurquise2 do kanonicznych wzorców ekspresji Wnt.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kanoniczne sygnalizacja Wnt to zachowana ścieżka sygnałowa związana zarówno z homeostazą zdrowych tkanek, jak i z chorobą. Wykazano, że precyzyjna regulacja poziomów sygnalizacji Wnt jest ważna w rozwoju embrionalnym, ale ma również ogromne znaczenie w tkankach dorosłych. Stwierdzono, że kanoniczna sygnalizacja Wnt odgrywa ważną rolę w regeneracji tkanek kilku narządów, takich jak jelita, skóra i układ krwiotwórczy. W związku z tym, gdy sygnalizacja Wnt jest rozregulowana, pojawiają się poważne patologie. Rak jelita grubego, wątroby i skóry, choroby neurologiczne, a także niektóre nowotwory hematologiczne są przykładowymi patologiami, w których rozregulowana sygnaliza....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie procedury na myszach zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu Etycznego ds. Eksperymentów na Zwierzętach Centrum Medycznego Uniwersytetu w Lejdzie (LUMC). Samiec i samica, 6-12-tygodniowy, typu dzikiego (wt), który nie ma insercji konstruktu reporterowego Axin2-mTurquoise2, heterozygotyczny (Tg/0) z jedną insercją konstruktu reporterowego Axin2-murquoise2, a zatem jednym zaburzonym genem Axin2 i homozygotyczny (Tg/Tg) z insercją konstruktu reporterowego Axin2-mTurquoise2 w obu allelach, a zatem dwa zakłócone geny Axin2; Myszy Axin2-mTurquoise2 (B6; W eksperymentach użyto myszy CBA-Axin2em1Fstl/J)....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zbadać rolę kanonicznej sygnalizacji Wnt, przetestowano kanoniczny model reportera Wnt Axin2-mTurquoise2 w połączeniu z ekspresją białka β-kateniny. Wiadomo, że tymocyty są kruche, wykazują niską kanoniczną sygnalizację Wnt na kilku etapach procesu dojrzewania tymocytów i mają niski stosunek cytoplazmatyczny do jądrowego; wszystkie te czynniki utrudniają wykrycie cytoplazmatycznego mTurquoise2 lub β-kateniny. Postępując zgodnie z protokołem, mysie tymocyty Axin2-mTurquoise2 zostały zebrane z grasicy i przetworzone na.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostępnych jest kilka kanonicznych reporterów Wnt o różnej czułości reporterowej i rzeczywistych białkach reporterowych. Modele reporterowe wykorzystujące syntetycznie wprowadzone multimeryzowane miejsca wiązania TCF/LEF są dostępne z fluorescencyjnymi białkami reporterowymi; jednak takie powtórzenia transgenów mogą zostać utracone podczas hodowli lub długich eksperymentów in vivo i mogą być wrażliwe na sygnały inne niż Wnt z otaczających sekwencji genomowych, które wpływają na ekspresję reporterową. Dlatego naj.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez grant z Uniwersytetu w Lejdzie na profilowanie obszaru medycyny regeneracyjnej w celu opracowania nowych modeli myszy.

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cytometr przepływowy BD FACScantoIIBD Biosciencesnie ma zastosowaniaNumer seryjny V96300710. Konfiguracja cytometru przepływowego w tym protokole zawiera linię laserową 405 nm z filtrem długoprzepustowym 505 i filtrem pasmowoprzepustowym 530/30 nm oraz filtrem pasmowoprzepustowym 470/20 nm; Laser 488 nm z filtrem długoprzepustowym 735 nm i filtrem pasmowoprzepustowym 780/60 nm, filtrem długoprzepustowym 670 nm i filtrem długoprzepustowym 655 nm, filtrem długoprzepustowym 610 nm, filtrem długoprzepustowym 550 nm i filtrem pasmowoprzepustowym 575/26 nm, filtrem długoprzepustowym 505 nm i filtrem pasmowoprzepustowym 530/30 nm oraz filtrem pasmowoprzepustowym 488/10 nm; oraz linia laserowa 633 nm z filtrem długoprzepustowym 735 nm i filtrem pasmowoprzepustowym 780/60 nm, filtrem długoprzepustowym 685 nm i filtrem pasmowoprzepustowym 660/20 nm.
BSA Sigma A9647
Corning 70 μ Filtr siatkowy M Sokół/Corning 352350
Cytospin 4 Typ A78300101Thermo Scientificniedostępny 
DMSOSigma Aldrich D5879-1L
DNAse ISigma A9647
Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 50 mlGreiner bio-one227261
Falcon okrągłodenne probówki polistyrenowe z zatrzaskiem sitko do komórekFisher Scientific 
Surowica dla cieląt płodowych (FCS)Greiner Bio-One B.V. Nie można się dostosować Zależy od pochodzenia
Oprogramowanie Fidżi ObrazJnie jest aplikowalny Wersja 1.53
Karta filtra biała (do cytospinu)Oprogramowanie VWRSHAN5991022
FlowJo 10Treestarnie jest dostępne Wersja 10.5.3
Zjeżdżalnie mrozowe Klinipath
Gibco IMDM średni Fisher Naukowy 
Obiektyw HCX PL APLO 40x 1.4 OILLeica microsystems Nie można się dostosować 
Długopis hydrofobowy: Długopis Omm Edge Wektornie jest możliwy do zastosowania 
Leica TCS SP5 DMI6000Mikrosystemy Leica Nie można się dostosować Konfiguracja mikroskopu w tym protokole składała się z obiektywu olejowego HCX PL APO 40x/1,2 o rozdzielczości 8 bitów, 1024 pikselach x 1024 pikselach, prędkości 400 Hz, otworku 68 i mikro; m i współczynnik powiększenia 1,5 w temperaturze pokojowej. System ten składa się z lasera diodowego 405, lasera argonowego, lasera DPSS 561, lasera HeNe 594 i lasera HeNe 633 z 4 detektorami hybrydowymi (HyD) i 5 lampami fotopowielacza (PMT).
Metanol VWR1060091000
NaN3/azydek soduFarmacja szpitalnaniezgodna 
Normalna surowica myszyWłasne myszynie są podatne 
PBS LonzaBE17-517Q
ProLong Diamond Antiblade MountantFisher Scientific P36965
Oczyszczona mysia anty-β-katenina (CTNNB1)BD Biosciences610154
TO-PRO-3 JodekThermofisherT3605
Przezroczysty lakier do paznokciw każdej apteceniedostępny 
Tween-20Sigma Aldrich P1379-500ml 
Zenon Alexa Fluor 568 Zestaw do etykietowania myszy IgG1ThermofisherZ25006
35223512440053

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kahn, M. Can we safely target the WNT pathway. Nature Reviews. Drug Discovery. 13 (7), 513-532 (2014).
  2. Jung, Y. S., Park, J. I. Wnt signaling in cancer: therapeutic targeting of Wnt signaling beyond beta-catenin and the destruc....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sygnalizacja WntKanoniczna Ekspresja WntAnaliza Tymocyt wMarkery Powierzchniowe Kom rekBarwienie Beta KateninyUk ad HematopoetycznyIlo ciowa Analiza Fluorescencji
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły