Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja, hodowla i inżynieria genetyczna pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego ssaków do niewirusowej terapii genowej

2.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62145

⸱

26 lutego 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 2Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 3Department of Ophthalmology, University Hospital RWTH Aachen, 4Max Delbrück Center for Molecular Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj przedstawiono protokół izolacji i transfekcji pierwotnych komórek nabłonka tęczówki i barwnika siatkówki od różnych ssaków (myszy, szczury, króliki, świnie i bydło). Metoda ta idealnie nadaje się do badania podejść do ocznej terapii genowej w różnych konfiguracjach do analiz ex vivo i badań in vivo, które można przenieść na ludzi.

Streszczenie

Zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD) jest najczęstszą przyczyną ślepoty u pacjentów w wieku >60 lat, dotykając ~30 milionów ludzi na całym świecie. AMD jest chorobą wieloczynnikową, na którą wpływają czynniki środowiskowe i genetyczne, które prowadzą do upośledzenia funkcji siatkówki z powodu zwyrodnienia komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE), a następnie degradacji fotoreceptorów. Idealne leczenie obejmowałoby przeszczepienie zdrowych komórek RPE wydzielających czynniki neuroprotekcyjne, aby zapobiec śmierci komórek RPE i zwyrodnieniu fotoreceptorów. Ze względu na podobieństwa funkcjonalne i genetyczne oraz możliwość mniej inwazyjnej biopsji, zaproponowano przeszczepienie komórek nabłonka barwnikowego tęczówki (IPE) jako substytut zdegenerowanego RPE. Wydzielanie czynników neuroprotekcyjnych przez małą liczbę komórek przeszczepionych podsiatkówkowo można osiągnąć za pomocą transfekcji >za pośrednictwem transpozonów Sleeping Beauty (SB100X) z genami kodującymi czynnik pochodzenia nabłonka barwnikowego (PEDF) i/lub czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów granulocytów (GM-CSF). Ustaliliśmy izolację, hodowlę i transfekcję za pośrednictwem SB100X komórek RPE i IPE różnych gatunków, w tym gryzoni, świń i bydła. Kule są eksplantowane, a rogówka i soczewka są usuwane, aby uzyskać dostęp do tęczówki i siatkówki. Za pomocą specjalnie wykonanej szpatułki komórki IPE są usuwane z izolowanej tęczówki. Aby zebrać komórki RPE, może być wymagana inkubacja trypsyny, w zależności od gatunku. Następnie, za pomocą szpatułki dostosowanej do RPE, komórki są zawieszane w podłożu. Po wysianiu komórki są monitorowane dwa razy w tygodniu, a po osiągnięciu konfluencji transfekowane za pomocą elektroporacji. Integracja, ekspresja, wydzielanie i funkcja genów zostały potwierdzone za pomocą qPCR, WB, ELISA, immunofluorescencji i testów funkcjonalnych. W zależności od gatunku można wyizolować 30 000-5 milionów (RPE) i 10 000-1,5 miliona (IPE) komórek na oko. Genetycznie zmodyfikowane komórki wykazują znaczną nadekspresję PEDF/GM-CSF ze zdolnością do zmniejszania stresu oksydacyjnego i oferują elastyczny system do analiz ex vivo i badań in vivo, który można przenieść na ludzi w celu opracowania metod terapii genowej oczu.

Wprowadzenie

Nasza grupa skupia się na rozwoju metod regeneracyjnych do leczenia zwyrodnień neurosiatkówkowych, tj. AMD, za pomocą niewirusowej terapii genowej opartej na RPE i IPE. Przedkliniczne opracowanie takich terapii wymaga modeli in vitro, które można przenieść na ludzi. W związku z tym celem przedstawionego tutaj badania jest dostarczenie protokołów izolacji, hodowli i inżynierii genetycznej pierwotnych komórek RPE i IPE. Uzasadnieniem dla ustanowienia izolacji komórek PE od wielu gatunków jest solidne potwierdzenie bezpieczeństwa i skuteczności tego podejścia oraz zwiększenie jego odtwarzalności i możliwości przenoszenia. Dostępna ludzka linia komórkowa RPE ARPE-19 różni się od komórek pierwotnych (np. są mniej pigmentowane) i dlatego ma ograniczoną wartość dla analiz przedklinicznych1. Dodatkowo komórki ssaków innych niż ludzkie można kupić za niższą cenę i w większych ilościach; Tkanki ludzkiego dawcy można pozyskać z różnych banków oczu, ale ich dostępność jest ograniczona i kosztowna. Wreszcie, nowe produkty lecznicze terapii zaawansowanej (ATMP, tj. produkt leczniczy terapii komórkowej, tkankowej lub genowej) muszą być stosowane u co najmniej dwóch różnych gatunków przed przetestowaniem na pacjentach, a te badania in vivo wymagają przygotowania allogenicznych przeszczepów komórek.

Choroby neurodegeneracyjne siatkówki są główną przyczyną ślepoty w krajach uprzemysłowionych, obejmując powszechne choroby, takie jak AMD, a także rzadkie choroby, takie jak barwnikowe zwyrodnienie siatkówki, w którym śmierć komórek siatkówki ostatecznie prowadzi do ślepoty. Uszkodzenia komórek RPE, fotoreceptorów i komórek zwojowych siatkówki (RGC) mogą być w niektórych przypadkach spowolnione, ale obecnie nie ma dostępnych terapii leczniczych. Produkty lecznicze terapii zaawansowanych (ATMPs) oferują potencjał do korygowania wad genów, integracji genów terapeutycznych lub zastępowania zdegenerowanych komórek, umożliwiając w ten sposób rozwój terapii regeneracyjnych i leczniczych chorób takich jak AMD; 13 terapii genowych zostało już dopuszczonych do obrotu, w tym terapia w leczeniu zwyrodnienia siatkówki związanego z mutacją RPE652,3. Wśród osób starszych (>60 lat) ~30 milionów ludzi na całym świecie jest dotkniętych neowaskularnym (nvAMD) lub jałowym (aAMD) AMD4. Obie formy są indukowane przez czynniki związane z wiekiem, w tym uszkodzenia oksydacyjne, upośledzenie funkcji i utratę komórek RPE, a następnie degradację fotoreceptorów, między innymi (np. allele ryzyka genetycznego, palenie tytoniu, nadciśnienie)5,6. W nvAMD patogeneza jest pogarszana przez brak równowagi czynników angiogennych i antyangiogennych na korzyść angiogennego czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), który indukuje neowaskularyzację naczyniówki (CNV). Do tej pory tylko nvAMD można leczyć poprzez comiesięczne wstrzyknięcia doszklistkowe inhibitorów białka VEGF w celu zahamowania CNV; Nie jest jeszcze dostępna skuteczna metoda leczenia aAMD6,7.

Kilka badań oceniało terapie komórkowe zastępujące terapię anty-VEGF: badania przeprowadzone przez Binder et al., w których świeżo pobrane autologiczne komórki RPE zostały przeszczepione pacjentom z nAMD8,9,10, wykazały umiarkowaną poprawę widzenia, ale tylko niewielka grupa pacjentów osiągnęła końcową ostrość widzenia wystarczająco wysoką, aby umożliwić czytanie. Niedawno, w badaniu klinicznym fazy I, w którym wykorzystano plaster RPE pochodzący z embrionalnych komórek macierzystych w leczeniu AMD, uzyskując obiecujące wyniki; tj. skuteczność, stabilność i bezpieczeństwo plastra RPE przez okres do 12 miesięcy u 2 z 10 leczonych pacjentów11. Ponadto kilka grup opublikowało badania, w których autologiczne plamy błonowo-naczyniówkowe RPE-Brucha zostały pobrane z siatkówki obwodowej i przeszczepione do plamki żółtej12,13,14; oraz wygenerowano plastry RPE pochodzące z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) do przeszczepu15. W przypadku aAMD przeciwciała skierowane na szlak dopełniacza zostały przetestowane w badaniach klinicznych6,16 i zakończono badanie fazy I z zastosowaniem pojedynczego wstrzyknięcia do ciała szklistego wektora wirusowego związanego z adenowirusem (AAV) kodującego gen czynnika CD59 (AAVCAGsCD59) u pacjentów z atrofią geograficzną (GA)17; Niedawno rozpoczęło się badanie fazy II, którego celem jest rekrutacja 132 pacjentów z zaawansowanym AMD i ocena wyników po 2 latach od interwencji18. Wreszcie, grupa badawcza FocuS rozpoczęła wieloośrodkowe badanie kliniczne fazy I/II oceniające bezpieczeństwo, odpowiedź na dawkę i skuteczność rekombinowanego, niereplikującego wektora AAV kodującego ludzki czynnik dopełniacza19.

Przede wszystkim, celem regeneracyjnej terapii AMD jest przeszczepienie funkcjonalnych komórek RPE, które zostały uszkodzone lub utracone. Jednak komórki IPE i RPE mają wiele podobieństw funkcjonalnych i genetycznych (np. fagocytoza i metabolizm retinolu), a ponieważ komórki IPE są bardziej wykonalne, zaproponowano je jako substytut RPE20. Mimo że wcześniej wykazano, że przeszczep komórek IPE opóźnia degenerację fotoreceptorów w modelach zwierzęcych21,22 i stabilizuje funkcje wzrokowe u pacjentów ze schyłkowym stadium nvAMD, nie zaobserwowano znaczącej poprawy u tych pacjentów23. Brak skuteczności może być spowodowany małą liczbą przeszczepionych komórek i (lub) brakiem równowagi neuroprotekcyjnych czynników siatkówki. Alternatywnym podejściem byłoby przeszczepienie transfekowanych komórek nabłonka barwnikowego, które nadmiernie eksprymują czynniki neuroprotekcyjne w celu przywrócenia homeostazy siatkówki, utrzymania pozostałych komórek RPE oraz ochrony fotoreceptorów i RGC przed degeneracją. W związku z tym proponujemy nową terapię, która polega na przeszczepieniu funkcjonalnych komórek RPE lub IPE, które zostały poddane inżynierii genetycznej w celu wydzielania białek neuroprotekcyjnych i antyangiogennych, takich jak PEDF, GM-CSF lub insulinopodobne czynniki wzrostu (IGF). Zaletą opracowania i przeanalizowania tego podejścia na kilku gatunkach zamiast przy użyciu linii komórkowej, tylko jednego gatunku lub tkanki ludzkiej jest: 1) zwiększona odtwarzalność i przenośność wyników, jak wykazano w licznych badaniach przeprowadzonych w niezależnych laboratoriach i różnych gatunkach1,24,25; 2) komórki świńskie lub bydlęce są praktycznie do utylizacji bez poświęcania dodatkowych zwierząt; 3) Dostępność komórek pochodzących w szczególności od świń i bydła pozwala na uzyskanie wiarygodnych wyników w dużych seriach testowych; 4) wiedza na temat izolacji, hodowli i modyfikacji genetycznej komórek z najczęściej używanych modeli umożliwia analizy in vivo u wielu gatunków24,25,26, a tym samym oferuje lepszy stosunek ryzyka do korzyści dla pierwszych leczonych pacjentów; 5) Elastyczność przedstawionego protokołu pozwala na jego zastosowanie w różnych modelach i układach eksperymentalnych oraz we wszystkich terapiach opartych na komórkach oka z inżynierią genetyczną i bez niej. Natomiast techniki alternatywne, takie jak linie komórkowe lub tkanki ludzkie, mają jedynie ograniczoną zdolność przenoszenia i/lub ograniczoną jednorazowość. Linie komórkowe, takie jak ARPE-19, są idealne do wstępnych eksperymentów; Jednak niska pigmentacja i wysoka proliferacja różnią się znacznie od komórek pierwotnych1. Komórki RPE i IPE, które są izolowane z ludzkich tkanek dawcy, stanowią cenne źródło dla przenośnych eksperymentów in vitro; jednak pozyskujemy ludzką tkankę z amerykańsko-amerykańskiego banku oczu, co oznacza, że tkanka ma co najmniej dwa dni (po enukleacji) i wymaga długiego i kosztownego transportu, ale lokalna tkanka dawcy nie jest dostępna w wystarczających ilościach do produktywnych badań. Zaleta zastosowania komórek pierwotnych jest potwierdzona wieloma badaniami z innych grup27,28.

Za opracowanie komórkowej niewirusowej terapii genowej z wykorzystaniem systemu transpozonów SB100X do transfekcji pierwotnych komórek RPE i IPE z genami kodującymi dla PEDF i/lub GM-CSF w celu leczenia odpowiednio nvAMD i aAMD29,30,31,32, najpierw ustaliliśmy transfekcję komórek ARPE-191. Następnie ustalono protokoły izolacji i transfekcji w łatwo dostępnych komórkach pierwotnych bydła i świń. Teraz ustalono izolację i transfekcję pierwotnych komórek RPE i IPE od pięciu różnych gatunków, od małych (jak myszy) do dużych ssaków (jako bydło). Zostało to potwierdzone w pierwotnych komórkach RPE i IPE pochodzących z ludzkich oczu dawcy30. Produkcja ATMP zgodna z Dobrymi Praktykami Wytwarzania (GMP) została również zwalidowana przy użyciu ludzkiej tkanki dawcy33. Na koniec oceniono zarówno bezpieczeństwo, jak i skuteczność tego podejścia in vivo na trzech różnych gatunkach, do których dostosowano protokół: myszy, szczura i królika. W warunkach klinicznych od pacjenta zostanie pobrana biopsja tęczówki, a komórki IPE zostaną wyizolowane i przetransfekowane w pomieszczeniu czystym, zanim komórki zostaną przeszczepione podsiatkówkowo z powrotem do tego samego pacjenta. Cały proces odbędzie się podczas jednej sesji chirurgicznej, która trwa około 60 minut. Opracowanie podejścia do leczenia i ocena jego skuteczności wymagały doskonałych modeli in vitro i ex vivo w celu wdrożenia solidnych i skutecznych metod dostarczania genów, analizy efektywności dostarczania genów, produkcji białek terapeutycznych i efektów neuroprotekcyjnych oraz produkcji przeszczepów komórek w celu przetestowania podejścia in vivo1,24,25,29,30. Warto wspomnieć, że terapia posiada etyczną zgodę na badanie kliniczne fazy Ib/IIa wydaną przez komisję etyczną ds. badań kantonu Genewa (nr 2019-00250) i obecnie ostatnie dane przedkliniczne wymagane do autoryzacji przez szwajcarskie organy regulacyjne są zbierane przy użyciu przedstawionego protokołu. W związku z tym dane przedkliniczne in vivo wykazały znaczne zmniejszenie CNV i doskonałe bezpieczeństwo24,25,31.

Tutaj opisana jest izolacja i hodowla komórek RPE/IPE od bydła, świni, królika, szczura i myszy oraz zastosowanie integracyjnego systemu transpozonów SB100X w połączeniu z elektroporacją jako efektywną metodą dostarczania genów. W szczególności pierwotne komórki PE zostały transfekowane w celu nadekspresji PEDF i GM-CSF. Zbiór tych protokołów umożliwia prowadzenie badań in vitro i in vivo we wszystkich fazach przedklinicznych rozwoju ATMP. Co więcej, układ ten ma potencjał do adaptacji do innych genów i chorób, które są przedmiotem zainteresowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokoły, w których zwierzęta były zaangażowane, zostały przeprowadzone przez certyfikowany personel i po autoryzacji kantonalnego Département de la sécurité, de l'emploi et de la santé (DSES), Domaine de l'expérimentation animale z Genewy, Szwajcarii, oraz zgodnie z oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych (zatwierdzenie nr. GE/94/17). Dorosłe, zdrowe szczury rasy brunatnej norweskiej, myszy C57BL/6 i białe króliki nowozelandzkie zostały poddane eutanazji przez przedawkowanie pentobarbitalu (150 mg / kg) rozcieńczonego w 0,9% NaCl wstrzykniętym dootrzewnowo, a oczy wyłuszczono natychmiast po uśmierceniu. Oczy świń i bydła pozyskiwano z lokalnej rzeźni w ciągu 6 godzin od złożenia ofiary i transportowano do laboratorium na lodzie.

1. Przed przygotowaniem

  1. Przygotować kompletną pożywkę (DMEM/Ham's F12 uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 80 U/ml penicyliny / 80 μg/ml streptomycyny i 2,5 μg/ml amfoterycyny B). Podgrzej pożywkę, 1x PBS i 0,25% trypsyny (jeśli to konieczne) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  2. Włóż sterylną serwetę do okapu, aby przygotować aseptyczne miejsce pracy. Wprowadź wszystkie potrzebne sterylne narzędzia i materiały do wnętrza okapu.
    UWAGA: Tylko wyłuszczenie oczu i oczyszczenie pozostałej tkanki mięśniowej i skóry to zabiegi wykonywane na zewnątrz okapu, pozostałe czynności należy wykonać wewnątrz kaptura.

2. Izolacja komórek PE szczura/myszy

  1. Użyj zakrzywionych nożyczek i kleszczy Colibri, aby wyłuszczyć oczy po eutanazji zwierzęcia. Oczyść pozostałą tkankę mięśniową i skórę z oczu za pomocą nożyczek i kleszczy (niesterylnych).
    UWAGA: Rozmiar nożyczek i kleszczy używanych do wyłuszczenia i czyszczenia oczu zależy od gatunku (np. w przypadku szczurów i myszy narzędzia będą mniejsze niż te używane u świń i bydła) (patrz rysunek S1).
    1. Zebrać oczy w probówce o pojemności 50 ml wypełnionej niesterylnym PBS i przenieść probówkę do okapu z przepływem laminarnym. Zdezynfekuj oczy, zanurzając je na 2 minuty w roztworze na bazie jodu, a następnie przenieś je na szalkę Petriego wypełnioną sterylnym PBS.
  2. Otwarcie żarówki
    1. Po przeniesieniu oczu na sterylną szalkę Petriego, przytrzymaj je mocno blisko nerwu wzrokowego za pomocą Colibri lub spiczastych kleszczy. Przebić otwór w pobliżu granicy tęczówki (między pars plana a ora serrata) za pomocą igły 18 G. Włóż małe nożyczki do otworu i przetnij wokół tęczówki. Usuń przedni odcinek (rogówkę, soczewkę i tęczówkę) i umieść go na szalce Petriego. Pozostaw bańkę z ciałem szklistym, aż komórki RPE zostaną odizolowane.
  3. Izolacja komórek IPE
    1. Zdejmij soczewkę i za pomocą cienkich kleszczyków delikatnie wyciągnij tęczówkę zawierającą komórki IPE. Umieść tęczówkę na szalce Petriego, umyj sterylnym PBS i pozostaw w PBS, aż przygotuje się więcej tęczówki.
    2. Powtórz kroki od 2.2.1 do 2.3.1, aby przygotować wszystkie oczy tego dnia.
    3. Dodać 50 μl 0,25% trypsyny na tęczówkę i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Usunąć trypsynę, dodać 150 μl kompletnej pożywki na tęczówkę i delikatnie zeskrobać IPE płaską, polerowaną ogniowo pipetą Pasteura; użyć cienkich kleszczyków do unieruchomienia tkanki. Zebrać zawiesinę komórek i umieścić w probówce o pojemności 1,5 ml. Użyć 10 μl zawiesiny komórek rozcieńczonej w stosunku 1:3 błękitem trypanowym, aby policzyć komórki w komorze Neubauera34,35.
    4. Jeśli nie zostanie natychmiast transfekowany, wysiewaj 200 000 komórek/basenik na 24-dołkowej płytce (100 000 komórek/cm2) w 1 ml kompletnego podłoża (10% FBS) (do wysiewu patrz Tabela 1). Umieścić płytkę w inkubatorze i hodować ją w temperaturze 37 °C, 5% CO2,
      UWAGA: Może być konieczne połączenie kilku oczu razem, aby mieć wystarczającą liczbę komórek do wysiewu.
  4. Izolacja komórek RPE
    1. Usuń ciało szkliste i siatkówkę z tylnego segmentu za pomocą cienkich kleszczy. Unikaj uszkodzenia nabłonka barwnikowego siatkówki.
    2. Przetnij segment na pół skalpelem #10, aby kula ziemska była całkowicie otwarta i umyj sterylnym PBS.
    3. Dodać 50 μl 0,25% trypsyny na oko i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Usunąć trypsynę i dodać 150 μl kompletnej pożywki na kulę i delikatnie zeskrobać komórki RPE okrągłym skalpelem; użyć cienkich kleszczy do unieruchomienia tkanki. Zebrać zawiesinę komórek i umieścić ją w probówce o pojemności 1,5 ml. Pobrać 10 μl zawiesiny komórek; rozcieńczyć w stosunku 1:4 błękitem trypanowym, aby policzyć komórki w komorze Neubauera.
    4. Patrz krok 2.3.4.
      UWAGA: Może być konieczne połączenie kilku oczu razem, aby mieć wystarczającą liczbę komórek do wysiewu.

3. Izolacja komórek PE królika

  1. Przeprowadzić czyszczenie i dezynfekcję zgodnie z opisem w krokach od 2.1 do 2.1.1.
  2. Połóż jedno oko na sterylnym kompresie z gazy i trzymaj je mocno blisko nerwu wzrokowego. Otwórz oko skalpelem #11 i nożyczkami około 2 mm pod rąbkiem. Usuń przedni odcinek (rogówkę, soczewkę i tęczówkę) i umieść go na szalce Petriego. Pozostaw bańkę z ciałem szklistym, aż komórki RPE zostaną odizolowane.
  3. Izolacja komórek IPE
    1. Wykonaj krok 2.3.1. Usuń ciało rzęskowe z tęczówki, przecinając skalpelem #10.
    2. Po przygotowaniu 2 tęczówek inkubować z 1 ml 0,25 % trypsyny w temperaturze 37 °C przez 10 minut; w tym czasie można wyizolować komórki RPE (patrz krok 3.4). Usuń trypsynę i dodaj 1 ml kompletnej pożywki do tęczówki i odizoluj komórki, ostrożnie drapiąc płaską, polerowaną ogniowo pipetą Pasteura. Ostrożnie zawiesić komórki przez pipetowanie i przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 1,5 ml. Pobrać 10 μl zawiesiny komórek i rozcieńczyć w stosunku 1:3 błękitem trypanowym, aby policzyć komórki w komorze Neubauera.
    3. Patrz krok 2.3.4.
  4. Izolacja komórek RPE
    1. Wykonaj krok 2.4.1.
    2. Umieść sterylną gazę na płytce 12-dołkowej i umieść bańkę na gazie.
    3. Umyć PBS i wykonać krok 2.4.3.
      UWAGA: Użyj zakrzywionej, polerowanej ogniowo pipety Pasteura.
    4. Odwirować komórki 10 minut przy 120 x g.
    5. Patrz krok 2.3.4.

4. Izolacja komórek PE świni

  1. Wykonaj czyszczenie zgodnie z opisem w kroku 2.1. Przemyć PBS i zdezynfekować oczy, zanurzając na 2 minuty w roztworze na bazie jodu, spłukać PBS. Przejdź do kroku 3.2.
  2. Izolacja komórek IPE
    1. Wykonaj krok 3.3.1. Po przygotowaniu 2 tęczówek dodaj 1 ml kompletnej pożywki i wyizoluj komórki, ostrożnie drapiąc płaską, wypolerowaną ogniowo pipetą Pasteura. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 1,5 ml. Pobrać 10 μl zawiesiny komórek i rozcieńczyć w stosunku 1:4 błękitem trypanowym, aby policzyć komórki w komorze Neubauera.
    2. Patrz krok 2.3.4.
  3. Izolacja komórek RPE
    1. Wykonaj krok 2.4.1. Umieść bańkę na szalce Petriego i umyj PBS. Napełnij bańkę 1 ml kompletnego podłoża.
    2. Za pomocą zakrzywionej, polerowanej ogniowo pipety Pasteura ostrożnie usuń komórki RPE. Upewnij się, że zeskrobywasz od dołu do góry, aby uniknąć ześlizgiwania się kompleksu błonowego naczyniówki-Brucha. Zebrać zawiesinę komórek w bańce za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl i przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml w celu ponownego zamieszania. Pobrać 10 μl zawiesiny komórek i rozcieńczyć w stosunku 1:8 błękitem trypanowym, aby policzyć komórki w komorze Neubauera.
    3. Patrz krok 2.3.4.

5. Izolacja bydlęcych komórek PE

  1. Wykonaj czyszczenie zgodnie z opisem w kroku 2.1. Przemyć PBS i zdezynfekować oczy, zanurzając na 2 minuty w roztworze na bazie jodu, spłukać PBS. Przejdź do kroku 3.2.
  2. Izolacja komórek IPE
    1. Wykonaj krok 3.3.1. Po przygotowaniu dwóch tęczówek inkubować z 2 ml 0,25% trypsyny w temperaturze 37 °C przez 10 minut. W tym czasie można wyizolować komórki RPE (patrz krok 5.3).
    2. Usuń trypsynę i dodaj 2 ml kompletnej pożywki do tęczówki i wyizoluj komórki, ostrożnie drapiąc płaską, polerowaną ogniowo pipetą Pasteura. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml. Odwirować komórki 10 minut przy 120 x g. Pobrać 10 μl zawiesiny komórek i rozcieńczyć w stosunku 1:4 błękitem trypanowym, aby policzyć komórki w komorze Neubauera.
    3. Jeśli nie zostanie natychmiast przetransfekowany, wysiew 320 000 komórek/basenik na płytce 6-dołkowej w 3 ml kompletnego podłoża (10% FBS) (do wysiewu patrz Tabela 1). Umieścić płytkę w inkubatorze i hodować ją w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  3. Izolacja komórek RPE
    1. Wykonaj krok 2.4.1. Umieść bańkę na szalce Petriego i umyj PBS. Po przygotowaniu 2 oczek napełnić bańkę w około 3/4 trypsyną i inkubować przez 25 minut w temperaturze 37 °C z pokrywką szalki Petriego na wierzchu bańki.
    2. Usuń trypsynę i dodaj 1 ml kompletnej pożywki. Wykonaj krok 4.3.2. Odwirować komórki 10 minut przy 120 x g.
    3. Patrz krok 5.2.3.

6. Uprawa - średnia zmiana

  1. Hodować komórki w F12 DMEM/Ham, uzupełnionym 10% FBS, 80 U/ml penicyliny / 80 μg/ml streptomycyny i 2,5 μg/ml amfoterycyny B, w temperaturze 37°C i 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze. Po 3-4 dniach pipetuj w górę iw dół, aby zebrać nieprzylegające komórki i umieść połowę objętości w innym dołku. Napełnij do 1 ml kompletnym podłożem.
    UWAGA: Pozwala to na uzyskanie wystarczająco dużej powierzchni, aby wszystkie odizolowane komórki mogły się przyłączyć i zmaksymalizować moc wyjściową.
  2. Po kolejnych 3-4 dniach powtórz pobieranie komórek, ale tym razem łącząc nieprzylegające komórki z dwóch studzienek do jednego dołka (np. A1 + B1 w C1). Dodaj pożywkę do wszystkich studzienek. Obserwuj komórki i zmieniaj pożywkę 2 razy w tygodniu (w przypadku płytek 6- i 24-dołkowych należy użyć odpowiednio 3 i 1 ml / dołek). Gdy komórki osiągną konfluencję, przełącz się na kompletną pożywkę z 1% FBS lub użyj komórek do eksperymentów (np. transfekcji).
    UWAGA: Komórki RPE i IPE zlewają się odpowiednio po 3-4 i 4-5 tygodniach od izolacji. Czystość hodowli komórkowej została potwierdzona, sprawdzając morfologię komórek (komórki pigmentowane) i specyficzne markery, jak opisali Johnen i współpracownicy36.

7. Elektroporacja pierwotnych ogniw PE

  1. Wykonaj elektroporację zgodnie z wcześniejszym opisem1,37.
  2. W zależności od liczby transfekowanych komórek należy użyć płytek 6-, 24- lub 48-dołkowych (patrz Tabela 2) do wysiewu komórek w pożywce bez antybiotyków lub środków przeciwgrzybiczych. Przez następne 2 tygodnie dodawaj krople z pożywką zawierającą penicylinę (80 j./ml), streptomycynę (80 μg/ml) i amfoterycynę B (2,5 μg/ml) dwa razy w tygodniu. Całkowicie wymień pożywkę 2 tygodnie po transfekcji.
  3. Aby określić wzrost komórek, wydajność transfekcji i wydzielanie białka, monitoruj komórki co tydzień za pomocą mikroskopii i analizuj supernatant kultury komórkowej za pomocą western blot. Przed zakończeniem hodowli należy pobrać 24-godzinny supernatant z hodowli komórkowej w celu ilościowego określenia wydzielania białka metodą ELISA, policzyć komórki, zmierzyć fluorescencję za pomocą cytometrii obrazowej (w przypadku komórek transfekowanych przez Wenus) zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów) i zebrać osad komórkowy do analizy ekspresji genów opartej na RT-qPCR.
    UWAGA: Metody te nie zostały uwzględnione w niniejszej pracy, ponieważ nie jest celem szczegółowego wyjaśnienia analizy komórek, ale raczej ich izolacji. Gęstość wysiewu komórek jest taka sama dla wszystkich gatunków (100 000 komórek/cm2), ale ponieważ liczba izolowanych komórek jest różna, użyto różnych płytek. Ponadto w przypadku myszy, szczurów i królików może być konieczne zebranie 2-3 oczu, aby mieć wystarczającą liczbę komórek do wysiewu.
osób
gatunekLeczenie trypsynąLiczba ogniw IPELiczba ogniw RPETalerz do wysiewu (100 000 komórek/cm2)
Mysz/szczurtak~50,000~150 000Płytki 24-dołkowe
króliktak~350 000~2 500 000Płytki 24-dołkowe
świniaNie~1 000 000~3 000 000Płytki 24-dołkowe
wołowytak~1 700 000~5 000 000Płytki 6-dołkowe

Tabela 1: Liczba pierwotnych komórek PE wyizolowanych z oczu różnych gatunków.

szt.
nazwaobszarNośnik objętościowytrypsynaObjętość medium do zatrzymania działania trypsynyGęstość wysiewu
Płytka 6-dołkowa9,6 cm²3,0 ml0,5 ml1,0 mlWymiary: 3x105
Płytka 24-dołkowa2,0 cm²1,0 ml0,2 ml0,8 mlDawka 5x104
Płytka 48-dołkowa1,1 cm²0,5 ml0,1 ml0,4 ml0,5-1x104

Tabela 2: Objętości kultur komórkowych i gęstości wysiewu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Izolacja PE z różnych gatunków ssaków
Z zastosowaniem wyżej opisanych protokołów pomyślnie wyizolowano i hodowano komórki IPE i RPE z pięciu różnych gatunków. Liczba komórek uzyskanych w każdej procedurze zależy od gatunku i wielkości oka (Tabela 1). Jak pokazano na Rysunku 1, komórki wykazują typową morfologię i pigmentację komórek PE (z wyjątkiem przedstawionych komórek królika, pochodzących od albinotycznych królików nowozelandzkich białych (NZW)). W ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Posiadanie ustandaryzowanych metod izolacji i hodowli komórek PE ma zasadnicze znaczenie dla opracowania nowych podejść do leczenia chorób zwyrodnieniowych siatkówki. Dzięki przedstawionym tutaj protokołom komórki PE mogą być z powodzeniem izolowane od różnych gatunków i hodowane przez długie okresy (do tej pory najdłuższa hodowla była utrzymywana przez 2 lata 1,38); Zaobserwowano typową morfologię, pigmentację i funkcję komórek PE (ryc. 1

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Podziękowania należą się Greggowi Sealy'emu i Alainowi Conti za ich doskonałą pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez Komisję Europejską w ramach siódmego programu ramowego, Szwajcarską Narodową Fundację Nauk oraz Fundację Schmieder-Bohrisch. Z.I. otrzymał finansowanie od Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742], a B.M.W. z grantu badawczego Fulbrighta i stypendium rządu szwajcarskiego za doskonałość.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytki 12-dołkoweCorning353043
Płytki 24-dołkowe Płytki 48-dołkoweCorning353047
6-dołkoweThermoFisher Scientific
Mikrokleszczyki
BetadineMundipharma
Kleszcze Colibri (sterylne)
Test cytotoksyczności CytoTox-GloPromegaG9291
DMEM/Ham's F12Sigma-AldrichD8062
Serweta (sterylna)Mö lnlycke Health Care800530
Bufor do elektroporacji 3P.143P Pharmaceutical
FBSBrunschwigP40-37500
Kleszcze (różne rozmiary) (sterylne)
Kompres z gazyPROMEDICAL AG25403
NaCl (0,9%)Laboratorium Dr. Bichsel AG1000090
Igła (18G) TerumoTER-NN1838R
Zestaw do transfekcji neonowej 10 i mikro; LThermoFisher ScientificMPK1096
System transfekcji neonowejThermoFisher ScientificMPK5000S
Komora NeubaueraMarienfeld-superior640010
Pipeta Pasteura (fire-polish)Witeg4100150
PBS 1XSigma-AldrichD8537
Penicylina/StreptomycynaSigma-AldrichP0781-100
Pentobarbital (Thiopental Inresa)Ospedalia AG31408025
szalka PetriegoThermoFisher Scientific150288
pFAR4-PEDF
pFAR4-SB100X
pFAR4-VenusPastor i wsp., 2018. Dzięki uprzejmości prof. Schermana i prof. Marie
pSB100X (250 ng/µ L)Má t&eaostry; S i wsp., 2009. Dostarczone przez prof. Izsvak
pT2-CAGGS-VenusJohnen et al., 2012
pT2-CMV-GMCSF-His plazmidowe DNA (250 ng/&mikro; L)Sklonowany w naszym laboratorium
pT2-CMV-PEDF-His plazmidowe DNA (250 ng /&mikro; L)Pastor i wsp., 2018
scarpel nr 10Swann-Morton501
scarpel nr 11Swann-Morton503
Ostro-ostra końcówka zakrzywione Extra Fine Bonn Nożyczki (sterylne) 
Ostra-ostra końcówka prosta Bardzo cienkie nożyczki Bonn (sterylne)
Cytometr obrazowy TaliThermoFisher ScientificT10796
Trypsyna 0,25% ThermoFisher Scientific25050014
Trypsin 5%/EDTA 2%Sigma-AldrichT4174
Nożyczki sprężynowe Vannas zakrzywione (sterylne)
Płytki 150687 płaskie Greiner 7657160 Bonn

Bibliografia

  1. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  2. Prado, D. A., Acosta-Acero, M., Maldonado, R. S. Gene therapy beyond luxturna: A new horizon of the treatment for inherited retinal disease. Current Opinion in Ophthalmology. 31 (3), 147-154 (2020).
  3. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. The Lancet. 390, 849-860 (2017).
  4. Age Related Macular Degeneration and Data and Statistics. NIH. , Available from: https://nei.nih.gov/learn-about-eye-health/resources-for-health-educators/eye-health-data-and-statistics/age-related-macular-degeneration-amd-data-and-statistics (2020).
  5. Al-Zamil, W. M., Yassin, S. A. Recent developments in age-related macular degeneration: A review. Clinical Interventions in Aging. 12, 1313-1330 (2017).
  6. Stahl, A. The diagnosis and treatment of age-related macular degeneration. Deutsches Arzteblatt International. 117, 513-520 (2020).
  7. Mitchell, P., Liew, G., Gopinath, B., Wong, T. Y. Age-related macular degeneration. The Lancet. 392, 1147-1159 (2018).
  8. Binder, S., et al. Transplantation of autologous retinal pigment epithelium in eyes with foveal neovascularization resulting from age-related macular degeneration: a pilot study. American Journal of Ophthalmology. 133 (2), 215-225 (2002).
  9. Binder, S., et al. Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: a prospective trial. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 45 (11), 4151-4160 (2004).
  10. Binder, S. The Macula. Diagnosis, treatment and future trends. , Springer-VerlaglWien. New York. 7985-7987 (2004).
  11. da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 1-10 (2018).
  12. Stanga, P. E., et al. Retinal pigment epithelium translocation after choroidal neovascular membrane removal in age-related macular degeneration. Ophthalmology. 109 (8), 1492-1498 (2002).
  13. Van Zeeburg, E. J. T., Maaijwee, K. J. M., Missotten, T. O. A. R., Heimann, H., Van Meurs, J. C. A free retinal pigment epitheliumchoroid graft in patients with exudative age-related macular degeneration: Results up to 7 years. American Journal of Ophthalmology. 153 (1), 120-127 (2012).
  14. Chen, F. K., et al. Long-term visual and microperimetry outcomes following autologous retinal pigment epithelium choroid graft for neovascular age-related macular degeneration. Clinical and Experimental Ophthalmology. 37 (3), 275-285 (2009).
  15. Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
  16. Akyol, E., Lotery, A. Gene, cell and antibody-based therapies for the treatment of age-related macular degeneration. Biologics: Targets and Therapy. 14, 83-94 (2020).
  17. Hemera Biosciences. Treatment of advanced dry age related macular degeneration with AAVCAGsCD59. ClinicalTrialsgov. , NCT03144999 (2019).
  18. , Hemera Biosciences. Intravitreal AAVCAGsCD59 for advanced dry age-related macular degeneration (AMD) with geographic atrophy (GA). ClinicalTrialsgov. , NCT04358471 (2020).
  19. Gyroscope Therapeutics. First in human study to evaluate the safety and efficacy of GT005 administered in subjects with dry AMD. ClinicalTrialsgov. , NCT03846193 (2019).
  20. Thumann, G., et al. Transplantation of autologous iris pigment epithelium after removal of choroidal neovascular membranes. Archives of Ophthalmology. 118 (10), 1350-1355 (2000).
  21. Thumann, G., Salz, A. K., Walter, P., Johnen, S. Preservation of photoreceptors in dystrophic RCS rats following allo- and xenotransplantation of IPE cells. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (3), 363-369 (2009).
  22. Crafoord, S., Geng, L., Seregard, S., Algvere, P. V. Photoreceptor survival in transplantation of autologous iris pigment epithelial cells to the subretinal space. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 80 (4), 387-394 (2002).
  23. Aisenbrey, S., et al. Iris pigment epithelial translocation in the treatment of exudative macular degeneration: A 3-year follow-up. Archives of Ophthalmology. 124 (2), 183-188 (2006).
  24. Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after sleeping beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
  25. Kropp, M., et al. Results of a biodistribution study of Venus transfected pigment epithelial cells transplanted subretinally in rabbits. Association for Research in Vision and Ophthalmology. , (2016).
  26. Kropp, M., et al. Improved transferability of a disease model for avascular age-related macular degeneration (AMD) to evaluate cell-based gene therapies using aged mice. ISSCR Annual Meeting. , Boston, USA. Meeting Abstract: MDD228. Poster (2020).
  27. Uebersax, E. D., Grindstaff, R. D., Defoe, D. M. Survival of the retinal pigment epithelium in vitro: Comparison of freshly isolated and subcultured cells. Experimental Eye Research. 70 (3), 381-390 (2000).
  28. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  29. Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the sb transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
  30. Pastor, M., et al. The antibiotic-free pFAR4 vector paired with the sleeping beauty transposon system mediates efficient transgene delivery in human cells. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 11, 57-67 (2018).
  31. Hernández-Pinto, A., et al. PEDF peptides promote photoreceptor survival in rd10 retina models. Experimental Eye Research. 184, 24-29 (2019).
  32. Bascuas, T., et al. Non-virally transfected primary human pigment epithelium cells overexpressing the oxidative stress reduction factors PEDF and GM-CSF to treat retinal neurodegeneration neurodegenerationl. Human Gene Therapy. 30 (11), (2019).
  33. Kropp, M., et al. Development of GMP-compliant production of freshly isolated and transfected iris pigment epithelial (IPE) cells to treat age-related macular degeneration (AMD). Human Gene Therapy. Meeting abstract: P371 Poster. , (2017).
  34. Marienfeld. Marienfeld Technical information Neubauer-improved. , Available from: https://www.marienfeld-superior.com/information-about-our-counting-chambers.html (2020).
  35. Electron Microscopy Sciences. Neubauer Haemocytometry. , Available from: https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/68052-14.aspx (2020).
  36. Johnen, S., Wickert, L., Meier, M., Salz, A. K., Walter, P., Thumann, G. Presence of xenogenic mouse RNA in RPE and IPE cells cultured on mitotically inhibited 3T3 fibroblasts. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (5), 2817-2824 (2011).
  37. Bascuas, T., et al. Induction and analysis of oxidative stress in sleeping beauty transposon-transfected human retinal pigment epithelial cells. Journal of Visualized Experiments. , e61957(2020).
  38. Thumann, G., et al. High efficiency non-viral transfection of retinal and iris pigment epithelial cells with pigment epithelium-derived factor. Gene Therapy. 17, 181-189 (2010).
  39. Thumann, G., et al. Transplantation of autologous iris pigment epithelium to the subretinal space in rabbits. Transplantation. 68, 195-201 (1999).
  40. Bilak, M. M., et al. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) protects motor neurons from chronic glutamate-mediated neurodegeneration. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 58, 719-728 (1999).
  41. Duh, E. J., et al. Pigment epithelium-derived factor suppresses ischemia-induced retinal neovascularization and VEGF-induced migration and growth. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 43, 821-829 (2002).
  42. Chichagova, V., et al. Cellular regeneration strategies for macular degeneration: Past, present and future. Eye. 32 (5), 946-971 (2018).
  43. Veckeneer, M., et al. angiography documented reperfusion of translocated autologous full thickness RPE-choroid graft for complicated neovascular age-related macular degeneration. Eye. 31, 1274-1283 (2017).
  44. Afshari, F. T., et al. Integrin activation or alpha9 expression allows retinal pigmented epithelial cell adhesion on Bruch's membrane in wet age-related macular degeneration. Brain. 133, 448-464 (2010).
  45. Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (2), 467-476 (1999).
  46. Tezel, T. H., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. Reengineering of aged Bruch's membrane to enhance retinal pigment epithelium repopulation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 45 (9), 3337-3348 (2004).
  47. Tezel, T. H., Del Priore, L. V. Repopulation of different layers of host human Bruch's membrane by retinal pigment epithelial cell grafts. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (3), 767-774 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja komórek RPEizolacja komórek IPEtranspozon Sleeping Beautytransfekcja poprzez elektroporacjęokularna terapia genowatest wydzielania białekanaliza immunofluorescencyjnamodel stresu oksydacyjnego
Izolacja, hodowla i inżynieria genetyczna pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego ssaków do niewirusowej terapii genowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.