Szczegółowe instrukcje są dostarczone do budowy otwartego, modułowego fluorymetru, który jest kompatybilny z wieloma tanimi grzejnikami, aby przeprowadzać w czasie rzeczywistym, ilościowe izotermiczne amplifikacje kwasów nukleinowych.
Artykuł metodologiczny
Miniaturowy fluorymetr typu open source do monitorowania reakcji amplifikacji izotermicznych kwasów nukleinowych w czasie rzeczywistym w warunkach ograniczonych zasobów
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Tradycyjne metody wykrywania i ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych opierają się na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i wymagają użycia drogich termocyklerów ze zintegrowaną detekcją fluorescencji amplikonów. Technologie izotermicznej amplifikacji kwasów nukleinowych eliminują potrzebę cykli termicznych; Jednak wykrywanie produktów na podstawie fluorescencji jest nadal wymagane w celu uzyskania wyników ilościowych w czasie rzeczywistym. Obecnie dostępnych na rynku jest kilka przenośnych grzejników izotermicznych ze zintegrowaną detekcją fluorescencji; Jednak koszt tych urządzeń pozostaje istotną barierą dla powszechnego przyjęcia w warunkach ograniczonych zasobów. Poniżej opisano protokół projektowania i montażu modułowego, taniego fluorymetru zbudowanego z gotowych komponentów. Zamknięty w kompaktowej obudowie wydrukowanej w 3D, fluorymetr jest przeznaczony do umieszczenia na dostępnym w handlu bloku grzewczym zawierającym probówkę do PCR. Opisany tutaj fluorymetr został zoptymalizowany do wykrywania barwnika izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC), ale system można zmodyfikować do stosowania z barwnikami powszechnie stosowanymi jako reportery w reakcjach amplifikacji kwasów nukleinowych w czasie rzeczywistym. Kliniczne zastosowanie systemu zostało wykazane poprzez detekcję kwasów nukleinowych w czasie rzeczywistym za pomocą dwóch technologii amplifikacji izotermicznej: amplifikacji polimerazy rekombinazy (RPA) do wykrywania DNA kontroli pozytywnej dostarczonego w komercyjnym zestawie oraz amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP) do wykrywania klinicznie istotnych poziomów RNA SARS-CoV-2.
Wprowadzenie
Technologie amplifikacji izotermicznej są szeroko stosowane do wykrywania kwasów nukleinowych. W porównaniu z tradycyjnymi metodami PCR, które wymagają termocyklingu, amplifikacja izotermiczna umożliwia amplifikację kwasu nukleinowego w jednej temperaturze, umożliwiając w ten sposób szybszy czas uzyskania wyników i lepszą tolerancję inhibitorów1,2. Kolejną kluczową zaletą wzmocnienia izotermicznego jest zmniejszona złożoność oprzyrządowania. Większość reakcji amplifikacji izotermicznej wymaga jedynie bloku ciepła i metody detekcji - albo detekcji w czasie rzeczywistym poprzez monitorowanie fluorescencji, albo detekcji punktu końcowego, na przykład za pomocą przepływu bocznego lub elektroforezy żelowej3,4. Wykrywanie fluorescencji w czasie rzeczywistym odbywa się poprzez wykrywanie fluorescencji wytwarzanej przez barwniki interkalacyjne, które aktywują się w obecności dwuniciowego DNA lub wygaszonych sond fluorescencyjnych, które aktywują się w obecności określonych dwuniciowych sekwencji DNA.
Chociaż istnieją komercyjnie dostępne stacjonarne fluorymetry izotermiczne, wiele z nich nie ma możliwości dostosowania do implementacji testów. Na przykład wiele urządzeń wymaga specjalnych lub dostarczonych przez firmę materiałów eksploatacyjnych, poleca preferowanych dostawców lub korzysta z zastrzeżonego oprogramowania w celu uzyskania reklamowanych wyników. Większość z tych systemów kosztuje ponad 5 000 USD, co stanowi istotną barierę dla powszechnego stosowania w warunkach ograniczonych zasobów. Ponadto, użytkownicy w środowiskach o niskich zasobach stoją przed wyzwaniami związanymi z konserwacją sprzętu zaprojektowanego do warunków o wysokich zasobach ze względu na trudne warunki środowiskowe, słabe łańcuchy dostaw części zamiennych i specjalistyczne narzędzia wymagane do konserwacji i napraw5. Aby sprostać tej potrzebie, opisano tutaj projekt i montaż modułowego i taniego fluorymetru zbudowanego z gotowych komponentów zamkniętych w kompaktowej obudowie wydrukowanej w 3D (rysunki 1A-C) z dwiema opcjonalnymi konfiguracjami. Pierwsza konfiguracja tego urządzenia wykorzystuje dostępne na rynku szklane filtry i dichroiczne lustro do blokowania nadmiaru światła tła, a całkowity koszt montażu wynosi 830 USD. Podczas gdy filtry te są powszechnie stosowane w systemach obrazowania opartych na fluorescencji, wcześniej wykazano, że zastąpienie drogich, wysokiej jakości folii filtrów optycznych pozwala na wykrywanie kwasów nukleinowych6. Druga konfiguracja fluorymetru zawiera te niedrogie filtry i zastępuje lustra dichroiczne rozdzielaczami wiązki φ1/2", zmniejszając całkowity koszt systemu z 830 USD do 450 USD.
Reprezentatywne obrazy zespołu są pokazane dla pierwszej konfiguracji w Rysunek 1 i Rysunek 2, ale analogiczne obrazy dla drugiej konfiguracji można znaleźć w Pliku uzupełniającym 6. Aby uniknąć konieczności specjalistycznego wyrównania optycznego, układ optyczny ma wyznaczone obszary do umieszczenia każdego elementu optycznego i może być wykonany za pomocą stosunkowo niskiej klasy drukarki 3D, co pozwala na szerokie zastosowanie projektu. Jedynymi różnicami w budowie i montażu dla obu konfiguracji są pliki używane do druku 3D oraz elementy optyczne umieszczone w obudowie. Wymiary zewnętrzne obudowy wydrukowanej w 3D dla obu systemów są takie same. Porównanie kosztów obu systemów przedstawiono w tabeli 1.
Jak pokazano w Rysunek 1A, aby zachować mały rozmiar, fluorymetr składa się z optyki Φ1/2" (~12,5 mm), połączonej z kompaktowym oświetleniem i detekcją, które są umieszczone w celu pomiaru sygnału przez górną część probówki do PCR. System w klasie Rysunek 1 jest przeznaczony do wykrywania barwników o szczytowych długościach fal wzbudzenia i emisji bliskich odpowiednio 490 nm i 525 nm, w tym FITC i blisko spokrewnionych barwników, takich jak SYBR i SYTO-9, które są powszechnie używane jako reportery w reakcjach amplifikacji kwasów nukleinowych w czasie rzeczywistym7,8. Źródło wzbudzenia, filtry optyczne i detektor można łatwo zastąpić komponentami kompatybilnymi z różnymi barwnikami fluorescencyjnymi w zależności od potrzeb. Reakcje amplifikacji kwasów nukleinowych są zwykle przeprowadzane w probówkach PCR, a fluorymetr jest zaprojektowany tak, aby można go było umieścić na dowolnym dostępnym na rynku bloku grzewczym, który zawiera probówki do PCR (Rysunek 1D), co pozwala na monitorowanie reakcji izotermicznych w czasie rzeczywistym. Odpowiednie bloki grzewcze są dostępne w większości laboratoriów biomedycznych i można je kupić za mniej niż 500 USD.
Wcześniej zademonstrowano wykorzystanie komputerów jednopłytkowych do zapewnienia taniej, przyłóżkowej alternatywy dla technologii obrazowania9. Opierając się na tych pracach, w tym protokole zastosowano jednopłytkowy, komputerowy graficzny interfejs użytkownika (rysunek 1D) w celu ułatwienia rejestrowania danych w czasie rzeczywistym i wyświetlania wyników w miejscu opieki, eliminując potrzebę korzystania z laptopa do przetwarzania lub wizualizacji danych. Pomiary fluorescencji zostały przeniesione za pomocą protokołu I2C z czujników światła do mikrokontrolera, a następnie udostępnione komputerowi jednopłytkowemu poprzez komunikację szeregową. Połączenia elektryczne do oświetlenia i przesyłania danych zostały zapewnione poprzez uproszczone okablowanie i na zminiaturyzowanych płytkach stykowych, eliminując potrzebę stosowania specjalistycznych płytek obwodów drukowanych (PCB). Oprogramowanie wymagane do uruchomienia fluorymetru jest dostępne za pośrednictwem platform oprogramowania typu open source, a kod wymagany do uruchomienia urządzenia znajduje się w dodatkowych plikach kodowania. Kompletny fluorymetr można zmontować za 450 do 830 USD, a wyniki pokazują, że zapewnia dokładne i wiarygodne pomiary fluorescencji w celu monitorowania izotermicznej amplifikacji kwasów nukleinowych w czasie rzeczywistym.
Protokół
1. Etapy przygotowania: druk 3D i
UWAGA: Układ optyczny opisany w tym protokole jest przeznaczony do standardowego suchego grzejnika blokowego.
- Aby utworzyć pierwszą konfigurację, wydrukuj w 3D pliki CAD dostarczone odpowiednio jako pliki uzupełniające 1, 2 i 3:
- Aby utworzyć drugą konfigurację, wydrukuj w 3D pliki CAD dostarczone jako pliki uzupełniające 3, 4 i 5, odpowiednio:
UWAGA: Te części są przeznaczone do drukowania z podporami. W tym przewodniku zastosowano filament poliwęglanowy, który może zachować swoją formę po poddaniu działaniu temperatur do 110 °C. Ogólnie rzecz biorąc, można zastosować dowolny materiał, który można podgrzać do temperatury pożądanej reakcji izotermicznej bez znacznego odkształcenia. Aby zminimalizować efekt wewnętrznych odbić i zakłóceń światła otoczenia, zaleca się użycie materiału w kolorze czarnym lub innym ciemnym kolorze. - Przygotuj dwa moduły oceny czujnika światło-cyfrowy do równoległego monitorowania dwóch próbek. Na jednej z płytek testowych czujników wyjmij rezystor R4 i przewód połączeniowy z prawej płyty lutowniczej obszaru R4 na płytce drukowanej do górnego padu w obszarze R1 na płytce drukowanej. Spowoduje to zmianę adresu I2C czujnika, umożliwiając w ten sposób jednoczesny pomiar obu czujników.
UWAGA: Zastosowany czujnik składa się z dwóch płytek drukowanych: płytki adaptera USB i płytki testowej czujnika zawierającej czujnik światła; Do tego urządzenia potrzebna jest tylko płytka testowa czujnika. - przewody do każdej z dwóch diod elektroluminescencyjnych (LED). Podłącz czerwony przewód (dodatni) do podkładki oznaczonej "1" na diodzie LED i przewód (ujemny) na podkładce oznaczonej "2" na diodzie LED. Nałóż cienką warstwę kleju termicznego na tył diody LED, umieść diodę LED na górze zaślepki i poczekaj, aż klej termiczny utwardzi się. Po drugiej stronie zaślepki końcowej dodaj radiator.
UWAGA: Podczas testowania diod LED przed ich zamknięciem w obudowie, upewnij się, że nosisz odpowiednią ochronę oczu blokującą niebieskie światło. - Aby utworzyć drugą konfigurację, wytnij dwa koła o średnicy 1/4 cala z niebieskiego arkusza folii wzbudzającej i cztery koła o średnicy 1/4 cala z żółtego arkusza folii emisyjnej za pomocą nożyczek lub żyletki.
- Wciśnij wkładkę sześciokątną M2.5 w każdy z czterech otworów w pochyłej części "LCD_Screen_Holder.stl".
2. Montaż optyczny
- Umieść wkładkę z gwintem 4-40 o długości 3/16 cala w otworze na górze części "Optics_Enclosure_Bottom.stl". Umieść wkładkę z gwintem 4-40 o długości 1/4 cala we wszystkich innych otworach części drukowanej w 3D, jak pokazano na Rysunek 2A.
- Włóż płytkę testową czujnika do górnej wnęki obudowy, tak aby pięć kołków było skierowanych do góry i najbliżej środkowej osi urządzenia. Zabezpiecz śrubą 4-40 o długości 3/16 cala przez otwór na płytce testowej czujnika ( Rysunek 2B).
- Umieść jeden z obiektywów o ogniskowej 20 mm w sekcji poniżej płytki testowej czujnika wypukłą stroną skierowaną w stronę dolnej części urządzenia i z dala od płytki testowej (Rysunek 2C).
- Aby utworzyć pierwszą konfigurację, umieść filtr długoprzepustowy w następnej sekcji poniżej obiektywu o ogniskowej 20 mm (Rysunek 2D) umieszczonego w poprzednim kroku. Aby utworzyć drugą konfigurację, umieść dwie żółte folie z filtrem emisyjnym w sekcji pod obiektywem.
- Aby utworzyć pierwszą konfigurację, umieść lustro dichroiczne w sekcji dichroicznej w pobliżu środka obudowy, obserwując orientację filtra określoną przez producenta (Rysunek 2E). Aby utworzyć drugą konfigurację, umieść rozdzielacz belki w przekroju ukośnym. Rozdzielacz wiązki nie wymaga określonej orientacji.
- Umieść drugi obiektyw o ogniskowej 20 mm w sekcji poniżej zwierciadła dichroicznego (lub rozdzielacza wiązki, w zależności od konfiguracji) z wypukłą stroną skierowaną w stronę górnej części urządzenia (Rysunek 2F).
- Aby utworzyć pierwszą konfigurację, umieść filtr wzbudzenia w sekcji po prawej stronie lustra dichroicznego, upewniając się, że strzałka jest skierowana w stronę lustra dichroicznego (Rysunek 2G). Aby utworzyć drugą konfigurację, umieść jedną niebieską folię filtra wzbudzenia w sekcji po prawej stronie rozdzielacza wiązki.
- Umieść soczewkę o ogniskowej 15 mm po prawej stronie filtra wzbudzenia, wypukłą stroną skierowaną w stronę zwierciadła dichroicznego (Rysunek 2H).
- Umieść diodę LED w pozostałej części wydruku, tak aby dioda LED była skierowana w stronę lustra dichroicznego (lub rozdzielacza wiązki, w zależności od konfiguracji). Upewnij się, że dwa przewody prowadzące od diody LED są włożone do zagłębionych kanałów, aby wydruk szczelnie się zamknął.
- Powtórz kroki 2.3-2.9 dla drugiej strony części drukowanej w 3D (Rysunek 2I).
- Zamknij pustą stronę wydruku na wierzchu wydruku za pomocą elementów optycznych, umieszczając wytłaczane części górnej połowy obudowy w zagłębionych rowkach w dolnej połowie obudowy. Zabezpiecz dwie drukowane części razem za pomocą 4-40 o długości 3/8 cala (Rysunek 2J).
UWAGA: Jeśli dwie części drukowane nie są całkowicie zamknięte, z obudowy optycznej może wydostać się rozproszone światło wzbudzenia. Upewnij się, że noszona jest odpowiednia ochrona oczu blokująca niebieskie światło, aż do uzyskania odpowiedniego uszczelnienia. Ponownie uszczelnij obudowę, aż nadmiar światła nie ucieknie.
3. Elektronika i montaż ekranu dotykowego
- Połącz ze sobą dwie mini płytki stykowe, a następnie umieść mikrokontroler na jednej z płytek stykowych. Upewnij się, że port microUSB mikrokontrolera jest skierowany na zewnątrz.
- Aby podłączyć modulację LED, należy podłączyć pin CTL sterownika LED (+) do pinu cyfrowego mikrokontrolera, a pin LED (-) sterownika LED do pinu GND mikrokontrolera.
- Zdejmij plastikowe osłony z tyłu płytek stykowych. Dociśnij samoprzylepny spód płytek stykowych do części drukowanej w 3D, aby przymocować połączone płytki stykowe do wewnętrznej strony tylnej części drukowanej części "LCD_Screen_Holder.stl".
- Przymocuj uchwyt ekranu wyświetlacza ciekłokrystalicznego (LCD) ze zmontowanymi płytkami stykowymi wewnątrz do obudowy optycznej zmontowanej w sekcji 2 za pomocą 4-40 o długości jednego cala.
- Aby podłączyć zasilacz LED, podłącz pin LED (+) sterownika LED do przewodu dodatniego pierwszej diody LED. Podłącz ujemny przewód pierwszej diody LED do dodatniego przewodu drugiej diody LED na płytce stykowej. Podłącz przewód ujemny drugiej diody LED do styku diody LED (-) sterownika LED.
UWAGA: Kolejność pierwszej lub drugiej diody LED jest dowolna. - Aby podłączyć zasilacz sterownika LED, podłącz dodatni i ujemny przewód zasilacza 10 V odpowiednio do pinów VIN+ i VIN sterownika LED. (Użyto adaptera z podnośnika lufowego na dwupinowy.)
- Podłącz płytkę testową czujnika, zasilanie i transfer danych. Na płytce testowej czujnika używane są tylko cztery piny: SCK, SDA, VDUT i GND. Weź 4-pinowy przewód połączeniowy żeński na męski i podłącz te piny na płytkach testowych czujnika światło-cyfrowy do mini płytki stykowej przez szczelinę w prawym górnym rogu wydruku uchwytu LCD.
- Na płytce stykowej upewnij się, że są zainstalowane połączenia między następującymi elementami: pinem 3,3 V mikrokontrolera i pinem VDUT obu płytek testowych; pinem GND mikrokontrolera i pinem GND obu płytek testowych; pinem analogowym 4 (A4) mikrokontrolera i pinem SDA obu płytek testowych; oraz pinem analogowym 5 (A5) mikrokontrolera i pinem SCK obu płytek testowych.
UWAGA: Ponieważ komunikacja I2C jest używana dla czujników światła, piny SCK i SDA obu czujników mogą być kierowane do tych samych pinów mikrokontrolera. - Przymocuj komputer jednopłytkowy do uchwytu ekranu LCD za pomocą czterech M2.5. Upewnij się, że porty HDMI i zasilacza komputera jednopłytkowego są skierowane do góry, a komputer jednopłytkowy jest wyśrodkowany na części wydrukowanej w 3D.
- Podłącz wyświetlacz ekranu dotykowego do komputera jednopłytkowego zgodnie z instrukcjami na ekranie dotykowym, a następnie podłącz port HDMI komputera jednopłytkowego do portu HDMI ekranu dotykowego.
4. Instalacja oprogramowania
- Zainstaluj i użyj edytora internetowego, aby przesłać do mikrokontrolera niestandardowy szkic "MiniFluorimeter_2Diode.ino" dostarczony w uzupełniającym pliku kodowania 1. Upewnij się, że biblioteka "ClosedCube OPT3002" jest zainstalowana za pomocą Menedżera bibliotek.
- Zmień led_A_pin zmiennej na numer pinu cyfrowego użytego w kroku 3.3 (sekcja Montaż elektroniki i ekranu dotykowego).
- Dostosuj liczbę milisekund, przez którą dioda LED jest włączona podczas wykonywania pomiarów fluorescencji, zmieniając wartość zmiennej ExposureTime. Dostosuj liczbę milisekund między ekspozycjami diod LED, zmieniając wartość zmiennej led_A_Interval.
- Zmień led_Power zmiennej na liczbę z zakresu od zera do jednego, aby dostosować jasność diod LED podczas ekspozycji. Zero oznacza maksymalną jasność, a jeden oznacza najniższą jasność.
- Włącz możliwość sterowania wyświetlaczem za pomocą ekranu dotykowego, postępując zgodnie z instrukcjami producenta dołączonymi do 3.5-calowego wyświetlacza.
UWAGA: W razie potrzeby 3,5-calowy ekran może być używany jako monitor bez możliwości ekranu dotykowego, a klawiaturę i mysz można podłączyć do portów USB komputera jednopłytkowego w celu sterowania komputerem jednopłytkowym. - Pobierz plik "MiniFluorimeter_2Diode_GUI.py" z Supplemental Coding File 2 do żądanej lokalizacji na komputerze jednopłytkowym.
- Upewnij się, że na komputerze jednopłytkowym jest zainstalowana działająca wersja Pythona. Język Python 3.7 został użyty w dostarczonym module języka Python, ale można było użyć dowolnej stabilnej wersji języka Python z odpowiednimi zmianami w dostarczonym skrypcie. Zainstaluj biblioteki potrzebne do programu w języku Python na komputerze jednopłytkowym.
- Zmień measurement_time zmiennej na żądany czas wykonywania pomiarów. Program kończy pobieranie i zamyka się po upływie żądanego czasu. Graficzny interfejs użytkownika umożliwia również zakończenie akwizycji za pomocą przycisku w interfejsie użytkownika.
- Zmień zmienną serialPort na adres szeregowy podłączonego mikrokontrolera.
5. Rejestrowanie danych fluorescencyjnych w czasie rzeczywistym
- Włącz komercyjny blok grzewczy i pozwól mu osiągnąć żądaną temperaturę.
- Komputer jednopłytkowy należy zasilać standardowym zasilaczem 5 V dostarczanym z większością zakupionych komputerów jednopłytkowych. Podłącz komputer jednopłytkowy do mikrokontrolera za pomocą microUSB do USB.
- Korzystając z ekranu dotykowego, otwórz dostarczony skrypt języka Python. Zmień zmienne measurement_time i serialPort na żądane wartości. Zmień zmienną outputFilepath na nazwę pliku danych generowanego przez program. Upewnij się, że nazwa pliku kończy się na ".xlsx".
- Umieścić dwie probówki PCR zawierające reakcje, które mają być monitorowane, w bloku grzewczym. Upewnij się, że umieszczenie probówek PCR jest wyrównane z kanałami optycznymi fluorymetru po umieszczeniu go na bloku grzewczym.
- Umieść fluorymetr na bloku grzewczym z probówkami PCR wyśrodkowanymi między czterema kołkami wystającymi z każdego kanału optycznego fluorymetru. Aby uzyskać optymalne pomiary, upewnij się, że wydrukowany w 3D fluorymetr jest bezpiecznie przymocowany do studzienek bloku grzewczego.
- Bezpiecznie podłącz fluorymetr, podłącz zasilacz do diod LED.
- Użyj ekranu dotykowego, aby uruchomić program w języku Python. Na ekranie LCD pojawia się graficzny interfejs użytkownika (GUI), który mierzy fluorescencję w czasie rzeczywistym.
- Obserwuj pomiary fluorescencji w czasie rzeczywistym dla obu probówek PCR, które są wyświetlane użytkownikowi w graficznym interfejsie użytkownika.
- Po upływie czasu eksperymentu określonego przez użytkownika pobieranie zostaje wstrzymane. Wyświetlanie pomiarów w pliku danych wyjściowych zapisanym w lokalizacji zdefiniowanej przez użytkownika. Aby zakończyć pomiary wcześniej, kliknij przycisk "Zatrzymaj akwizycję" w interfejsie użytkownika.
Wyniki
Po złożeniu urządzenia sprawność fluorymetru można zweryfikować, mierząc fluorescencję serii rozcieńczeń barwnika FITC. Na Rysunku 3A przedstawiono pomiary barwnika FITC w stężeniach 0, 20, 40, 60 i 80 pg/µL przygotowanych w 1x PBS na obu kanałach pierwszej konfiguracji fluorymetru. Każda próbka była mierzona trzykrotnie przy czasie ekspozycji LED wynoszącym 1,5 s w odstępach 20 s. Oba kanały fluorymetru wykazują liniową odpowiedź w pożądanym zakresie.
Zastosowanie kliniczne fluorymetru zostało dodatkowo zademonstrowane poprzez wykorzystanie systemu wraz z dostępnym komercyjnie suchym blokiem grzejnym do przeprowadzenia amplifikacji z wykorzystaniem dwóch technologii amplifikacji izotermicznej: RPA oraz RT-LAMP.
Rysunek 3B przedstawia przebieg czasowy fluorescencji z odjętą wartością bazową, mierzonej podczas amplifikacji w 39 °C dla 50 µL reakcji kontroli pozytywnej i negatywnej RPA w czasie rzeczywistym, z wykorzystaniem DNA kontroli pozytywnej zestawu dostarczonego w standardowym zestawie komercyjnym i przygotowanego zgodnie z instrukcjami producenta. Reakcje RPA, które generują stosunkowo niski poziom fluorescencji, były mierzone przy użyciu pierwszej konfiguracji fluorymetru, która zapewnia lepszą supresję światła wzbudzenia.
Rysunek 3C przedstawia pomiar przebiegu czasowego niestandardowego testu RT-LAMP w temperaturze 65 °C z wykorzystaniem zestawów starterów N2, E1 i As1e opisanych przez Zhang i wsp.10 oraz Rabe i Cepko11. Reakcje RT-LAMP generują większą ilość fluorescencji i były mierzone przy użyciu drugiej, tańszej konfiguracji fluorymetru. Oligonukleotydy zakupiono i zawieszono ponownie w buforze 2x TE w stężeniu 1 mM. Oligonukleotydy starterów wewnętrznych przednich (FIP) i tylnych (BIP) zamówiono z oczyszczaniem metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Każdy zestaw starterów (N2, E1 i As1e) połączono w celu przygotowania 1000 µL mieszaniny 25x w następujący sposób: 40 µL FIP, 40 µL BIP, 5 µL F3, 5 µL B3, 10 µL LF, 10 µL LB oraz 890 µL buforu 1x TE. Aby przygotować każdą reakcję RT-LAMP, do 0,5 µL barwnika fluorescencyjnego 50x i 12,5 µL master mix 2x dodano 1 µL każdego zestawu starterów, a objętość reakcji uzupełniono do 20 µL wodą wolną od nukleaz zgodnie z instrukcjami producenta. Kontrolne RNA SARS-CoV-2 rozcieńczano seryjnie w wodzie wolnej od nukleaz do stężeń 10, 100 lub 1000 kopii na µL, a następnie dodano 5 µL, aby uzyskać całkowitą objętość reakcji 25 µL. Jako kontrolę bez matrycy (NTC) we wszystkich eksperymentach zastosowano wodę wolną od nukleaz. Reakcje RT-LAMP przykryto 25 µL oleju mineralnego klasy biologii molekularnej.
Reakcje RPA oraz RT-LAMP przygotowano w dwóch studzienkach niskoprofilowej paskowej płytki PCR z 8 probówkami o pojemności 0,2 mL i zamknięto ultraprzezroczystymi płaskimi zakrętkami. Każdą reakcję RPA i RT-LAMP przeprowadzono w trzech powtórzeniach. We wszystkich testach mini-fluorymetr skutecznie ilościowo oznaczył wzrost poziomu fluorescencji w czasie, związany z amplifikacją DNA.
Rysunek 1: Obudowa optyczna i zmontowany miniaturowy fluorymetr na bloku grzejnym. (A) Schemat obudowy optycznej przedstawiający komponenty optyczne umieszczone w jednym kanale detekcji. (B) Schemat pierwszej konfiguracji miniaturowego fluorymetru po montażu. (C) Zdjęcie obudowy optycznej z komponentami optycznymi umieszczonymi w jednym kanale detekcji. (D) Zdjęcie zmontowanego miniaturowego fluorymetru umieszczonego na komercyjnie dostępnym bloku grzejnym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2: Schemat montażu i sterowania elektrycznego miniaturowego fluorymetru. A-J) Krok po kroku rozmieszczenie komponentów optycznych w wydrukowanej w technologii 3D obudowie optycznej dla pierwszej konfiguracji systemu. (K) Schemat elektryczny miniaturowego fluorymetru dla obu konfiguracji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Reprezentatywne pomiary uzyskane za pomocą miniaturowego fluorymetru. (A) Zależność zmierzonej fluorescencji od stężenia barwnika FITC w obu kanałach wykazuje liniową odpowiedź w żądanym zakresie dynamicznym. (B) Fluorescencja w czasie rzeczywistym w funkcji czasu dla izotermicznej amplifikacji kontroli pozytywnej i negatywnej z komercyjnie dostępnego zestawu. Amplifikacja przebiega zgodnie z oczekiwaniami dla kontroli pozytywnej. (C) Fluorescencja w czasie rzeczywistym w funkcji czasu dla izotermicznej amplifikacji 50, 500 i 5000 kopii RNA SARS-CoV-2 oraz próbki NTC z autorskiego testu RT-LAMP. Amplifikacja przebiega zgodnie z oczekiwaniami w pobliżu granicy wykrywalności testu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| System 1 | System 2 | |||
| Element | Ilość | Cena całkowita (USD) | Ilość | Cena całkowita (USD) |
| Komponenty optyczne | ||||
| Soczewki | 6 | 158.14 | 6 | 158.14 |
| Lustra | 2 | 244.56 | 2 | 60 |
| Filtry optyczne | 4 | 200 | 6 | 5 |
| Suma częściowa | 602.7 | Suma częściowa | 223.14 | |
| Oświetlenie i detekcja | ||||
| diody LED | 2 | 72.62 | 2 | 72.62 |
| Sterownik LED | 1 | 11.49 | 1 | 11.49 |
| Fotodioda | 2 | 50 | 2 | 50 |
| Suma częściowa | 134.11 | Suma częściowa | 134.11 | |
| Elektronika i wyświetlacze | ||||
| Arduino Nano | 1 | 20.7 | 1 | 20.7 |
| Raspberry Pi | 1 | 35 | 1 | 35 |
| Ekran LCD | 1 | 25 | 1 | 25 |
| Mini płytka stykowa | 1 | 4 | 1 | 4 |
| zasilacz 10V | 1 | 8.6 | 1 | 8.6 |
| Suma częściowa | 93.3 | Suma częściowa | 93.3 | |
| Całkowity koszt (USD) | 830.11 | 450.55 | ||
Tabela 1: Porównanie kosztów dwóch konfiguracji miniaturowego fluorymetru.
Plik uzupełniający 1: System1_Optics_Enclosure_Top.stl Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Plik uzupełniający 2: System1_Optics_Enclosure_Bottom.stl, oraz Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Plik uzupełniający 3: LCD_Screen_Holder.stl Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Plik uzupełniający 4: System2_Optics_Enclosure_Top.stl Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Plik uzupełniający 5: System2_Optics_Enclosure_Bottom.stl, oraz Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Plik uzupełniający 6: System2_BuildInstructions.pdf Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.
Plik uzupełniający z kodem 1: MiniFluorimeter_2Diode.ino Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik z kodem.
Dodatkowy plik z kodem 2: MiniFluorimeter_2Diode_GUI.py Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik z kodem.
Dyskusja
Opisany tutaj jest niedrogi, modułowy, przenośny fluorymetr o otwartym kodzie źródłowym do ilościowego wykrywania fluorescencji w izotermicznych reakcjach amplifikacji. Projekty typu open source ułatwiają szybką i niedrogą konserwację dzięki łatwo dostępnym częściom zamiennym i pozwalają użytkownikom na elastyczność w dostosowywaniu systemu do ich potrzeb w oparciu o modułową konstrukcję. Protokół ten opisuje proces montażu komponentów mechanicznych, optycznych i elektrycznych oraz walidacji wydajności optycznej. Ponadto wykazano elastyczność fluorymetru w monitorowaniu dwóch różnych typów testów amplifikacji izotermicznej o znacząco różnych wymaganiach dotyczących temperatury, objętości i fluorescencji, RPA exo i RT-LAMP. RPA przeprowadza się w temperaturze 39 °C w reakcjach o objętości 50 μl, w których do generowania fluorescencji wykorzystuje się sondę znakowaną FAM specyficzną dla sekwencji, podczas gdy RT-LAMP przeprowadza się w temperaturze 65 °C w objętości reakcyjnej 25 μl i wykorzystuje barwnik interkalacyjny do zgłaszania obecności amplifikowanego DNA. Ponieważ pomiary fluorescencji są wykonywane przez górną część probówek PCR z płaskimi nasadkami, fluorymetr jest w stanie wykryć fluorescencję z obu objętości testu, a wymagania dotyczące ciepła są ograniczone tylko przez wybrany komercyjny blok cieplny. Co więcej, intensywność fluorescencji wytwarzanej w RT-LAMP jest prawie o rząd wielkości większa niż w RPA, ze względu na metody generowania sygnału fluorescencji oparte na barwniku i sondzie. Jednak zakres dynamiczny wybranego czujnika optycznego może wykrywać i określać ilościowo zarówno sygnały, jak i algorytmy odejmowania linii bazowej uwzględniają te różnice, aby uzyskać wiarygodne odczyty fluorescencji.
Aby ułatwić rozpowszechnianie technologii i zminimalizować potencjalne koszty konserwacji, zastosowano modułową konstrukcję, która jest kompatybilna z grzejnikami, które są powszechnie dostępne w różnych ustawieniach. W obecnym protokole zastosowano wspólny suchy blok grzewczy; Ta sama konstrukcja optyczna i elektryczna może być łatwo dostosowana do innych dostępnych na rynku grzejników. Jeśli ma być zastosowany inny suchy blok grzewczy, wymagane będą minimalne zmiany w konstrukcji obudowy 3D. W szczególności dolne kołki plików STL obudowy optycznej muszą zostać zmodyfikowane, aby zapewnić prawidłowe wyrównanie z dołkami innych komercyjnych bloków grzewczych. Chociaż obudowy pokazane w przykładach zostały wydrukowane na stosunkowo niskiej klasie drukarce 3D (patrz Tabela materiałów), należy zadbać o to, aby rozdzielczość drukarki i/lub tolerancje druku były odpowiednie, aby pomieścić elementy optyczne i wkładki gwintowane. W dostarczonych plikach STL dodano tolerancję 0,01-0,02 cala po obu stronach elementów optycznych w kierunku promieniowym i osiowym w oparciu o wymiary określone przez producenta. Dzięki temu wszystkie elementy optyczne są bezpiecznie dopasowane do wydruku, a obudowa całkowicie blokuje przedostawanie się lub ucieczkę nadmiaru światła. Aby zapewnić prawidłowe pasowanie wtłaczane wkładek gwintowanych, podobna tolerancja 0,01-0,02 cala została odjęta od średnicy podanej przez producenta w pliku CAD.
Reakcje RPA były z powodzeniem monitorowane przy użyciu pierwszej konfiguracji fluorymetru, podczas gdy reakcje RT-LAMP można było monitorować przy użyciu dowolnej konfiguracji. Ulepszone tłumienie światła rozproszonego w pierwszej konfiguracji było niezbędne do monitorowania niskich poziomów fluorescencji wytwarzanej przez sondę fluorogenną w reakcjach RPA. W przeciwieństwie do tego, RT-LAMP wykorzystuje barwnik interkalacyjny do generowania sygnału, co skutkuje wyższą intensywnością fluorescencji, która jest kompatybilna z niższym zakresem dynamiki drugiej konfiguracji przy użyciu fotograficznych folii filtracyjnych. Użytkownicy powinni wybrać konfigurację fluorymetru, która pasuje do barwnika interkalującego element generujący sygnał fluorescencyjny lub sondy fluorogenicznej ich testu.
Jednym z ograniczeń tego systemu jest to, że ogrzewanie jest zapewniane przez dostępny na rynku blok grzewczy zasilany ze standardowego gniazdka ściennego. System ten mógłby być dalej rozwijany do użytku na obszarach bez niezawodnego dostępu do energii elektrycznej poprzez włączenie przenośnych i ładowalnych zestawów akumulatorów, jak pokazano w innych grupach12. Kolejnym ograniczeniem jest stosunkowo niska przepustowość systemu, która pozwala na jednoczesny pomiar fluorescencji tylko dwóch próbek jednocześnie. Wiele wydruków obudowy można umieścić na tym samym bloku grzewczym w celu zwiększenia przepustowości; jednak zastosowany czujnik światła ma tylko cztery unikalne adresy I2C. Ogranicza to maksymalną liczbę próbek, które można jednocześnie mierzyć, do czterech. Aby jeszcze bardziej zwiększyć przepustowość, potrzebny jest inny czujnik światła z większą liczbą unikalnych adresówI2C.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Specjalne podziękowania dla Chelsey Smith, Megan Chang, Emilie Newsham, Sai Paula i Christophera Goha za pomoc w przygotowaniu próbki. Autorzy dziękują Caroline Noxon za korektę manuskryptu. Fundusze na te prace zostały zapewnione przez naród amerykański przez USAID poprzez grant badawczy IAVI CCID 9204 w ramach nagrody AID-OAA-A16-00032 między IAVI i USAID.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Wkładka gwintowana 1/4 cala 4-40 | McMaster-Carr | 90742A116 | Służy do zabezpieczenia dwóch stron wydrukowanej w 3D obudowy optycznej razem. |
| Zasilacz 10v | GlobTek, Inc. | WR9HU1800CCP-F(R6B) | AC/DC Obiektyw o ogniskowej 10V 18W |
| 15 mm | Thorlabs | LA 1074 | Do fluorymetru używane są łącznie dwa. Ten obiektyw służy do ustawiania ostrości oświetlenia LED. |
| o długości 1 cala 4-40 Obiektyw | McMaster-Carr | ||
| 20 mm | Thorlabs | LA 1540 | Do fluorymetru używane są łącznie cztery. |
| 2x WarmStart LAMP Master Mix | New England Biolabs, Inc | E1700 | Master mix został użyty do stworzenia reakcji LAMP pokazanych na rysunku 3C |
| 3.5" Ekran dotykowy | Uctronics | BO10601 | |
| śruba 4-40 o długości 3/16 cala | McMaster-Carr | 90128A105 | |
| wkładka gwintowana 4-40 o długości 3/16 cala | McMaster-Carr | 90742A115 | Służy do mocowania płytki testowej OPT3002 na obudowie wydrukowanej w 3D |
| 4-40 o długości 3/8 cala | McMaster-Carr | 90128A108 | Służy do zabezpieczenia dwóch stron obudowy optycznej wydrukowanej w 3D razem. |
| Filament do drukarki 3D | 3D Universe | UMNFC-PC285- | lub inny ciemny kolor |
| Używana drukarka 3D | Ultimaker | Ultimaker 2 + | |
| 8 probówek Paski PCR | BioRad | #TLS0801 | |
| Advanced Mini Dry Block Heater | VWR International | 10153-320 | Następujące bloki grzewcze są dopuszczalnymi substytutami bez konieczności przeprojektowywania zespołu optycznego: 949VWMNLUS, 949VWMHLUS i 949VWMHLEU |
| przejściówka baryłkowa na dwupinową | SparkFun Electronics | 1568-1238-ND | |
| Niebieska folia filtracyjna wzbudzająca | LEE | LE071S | Wybrana do użytku z FITC - inne barwniki fluorescencyjne mogą wymagać innych filtrów. |
| Niebieska dioda LED - 460 nm | Mouser | LZ1-30DB00-0100 | Wybrany do użytku z FITC - inne barwniki fluorescencyjne mogą wymagać różnych części |
| Dichroic Mirror | Thorlabs | DMLP505T | Wybrany do użytku z FITC - inne barwniki fluorescencyjne mogą wymagać innych części |
| Filtr emisyjny | Edmunds Optics | OG-515 | Wybrany do użytku z FITC - inne barwniki fluorescencyjne mogą wymagać różnych części. Strzałka na części jest skierowana w stronę przeciwną do źródła oświetlenia. |
| Filtr wzbudzenia | Omega Filters | 490AESP | Wybrany do użytku z FITC - inne barwniki fluorescencyjne mogą wymagać różnych części |
| Sterownik LED | LEDdynamics | 3021-D-I-700 | |
| M2.5 Wkładka w kształcie sześciokąta | McMaster-Carr | 91292A009 | Służy do mocowania Raspberry Pi do wydrukowanego w 3D uchwytu ekranu LCD |
| Mikrokontroler | Arduino | Nano | |
| Mini Płytka do krojenia chleba | Adafruit | 65 | |
| Olej mineralny klasy biologii molekularnej | Sigma Aldrich | 69794 | |
| OPT3002EVM - Czujnik światło-cyfrowy | Texas Instruments | OPT3002EVM: | Używany czujnik Light-to-digital. Składa się z dwóch płytek drukowanych: płytki SM-USB_DIG i płytki testowej OPT3002; Do tego urządzenia potrzebna jest tylko OPT3002 płytka testowa. |
| Zakupione oligonukleotydy | Zintegrowane technologie DNA Zestaw | ||
| RPA kontrola pozytywna DNA | TwistDx Limited | CONTROL01DNAE | |
| SARS-CoV-2 RNA Control | Twist Biosciences | MN908947.3 | |
| Komputer jednopłytkowy | Raspberry Pi | Raspberry Pi 3 | |
| TwistAmp RPA exo kit | TwistDx Limited | TAEXO02KIT | |
| Ultraprzezroczyste płaskie nakrętki | BioRad | #TCS0803 | |
| Żółta folia filtracyjna z emmisją | LEE LE767S | Wybrana do stosowania z FITC - inne barwniki fluorescencyjne mogą wymagać różnych części |
Bibliografia
- Daher, R. K., Stewart, G., Boissinot, M., Bergeron, M. G. Recombinase polymerase amplification for diagnostic applications. Clinical Chemistry. 62 (7), 947-958 (2016).
- Yan, L., et al. Isothermal Amplified Detection of DNA and RNA. Molecular BioSystems. 10 (5), 970-1003 (2014).
- Giuffrida, M. C., Spoto, G. Integration of Isothermal Amplification Methods in Microfluidic Devices: Recent Advances. Biosensors and Bioelectronics. 90, 174-186 (2017).
- Gill, P., Ghaemi, A. Nucleic Acid Isothermal Amplification Technologies-A Review. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. 27 (3), 224-243 (2008).
- Richards-Kortum, R., Oden, M. Devices for Low-Resource Health Care. Science. 342 (6162), 1055-1057 (2013).
- Katzmeier, F., et al. A Low-Cost Fluorescence Reader for in vitro Transcription and Nucleic Acid Detection with Cas13a. PLOS One. 14 (12), e0220091(2019).
- Safavieh, M., et al. Emerging Loop-Mediated Isothermal Amplification-Based Microchip and Microdevice Technologies for Nucleic Acid Detection. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (3), 278-294 (2016).
- Monis, P. T., Giglio, S., Saint, C. P. Comparison of SYTO9 and SYBR Green I for Real-Time Polymerase Chain Reaction and Investigation of the Effect of Dye concentration on Amplifcation and DNA Melting Curve Analysis. Analytical Biochemistry. 340 (1), 24-34 (2005).
- Parra, S., et al. Development of Low-Cost Point-of-Care Technologies for Cervical Cancer Prevention Based on a Single-Board Computer. IEEE Journal of Translational Engineering in Health and Medicine. 8 (4300210), (2020).
- Zhang, Y., et al. Enhancing Colorimetric Loop-Mediated Isothermal Amplification Speed and Sensitivity with Guanidine Chloride. Biotechniques. 69 (3), 178-185 (2020).
- Rabe, B. A., Cepko, C. SARS-CoV-2 Detection Using an Isothermal Amplification Reaction and a Rapid, Inexpensive Protocol for Sample Inactivation and Purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (39), 24450-24458 (2020).
- Snodgrass, R., et al. A Portable Device for Nucleic Acid Quantification Powered by Sunlight, a Flame or Electricity. Nature Biomedical Engineering. 2 (9), 657-665 (2018).
Przedruki i uprawnienia
