Obrazowanie 3D włókien kolagenowych PDL podczas ortodontycznego ruchu zębów w mysim modelu żuchwy

Podstawowym procesem biologicznym leżącym u podstaw ortodontycznego ruchu zębów (OTM) jest przebudowa kości. Wyzwalacz tego procesu przebudowy przypisuje się zmianom w strukturze więzadła przyzębia (PDL), takim jak stres macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), martwica, a także niszczenie i tworzenie naczyń krwionośnych^1,2,3. Inne możliwe czynniki wywołujące przebudowę kości wyrostka zębodołowego są związane z wyczuwaniem siły przez osteocyty w kości, a także z mechanicznym odkształceniem samej kości wyrostka zębodołowego; jednak ich rola w OTM nadal nie jest w pełni wyjaśniona^4,5.

Pomimo wielu badań mających na celu ujawnienie relacji struktura-funkcja PDL podczas OTM, jasny mechanizm funkcjonalny nie został jeszcze zdefiniowany^6,7. Głównym tego powodem jest wyzwanie związane z uzyskaniem danych dotyczących tkanki miękkiej (PDL) znajdującej się między dwiema tkankami twardymi (cementem i kością wyrostka zębodołowego). Przyjęte metody zbierania informacji strukturalnych zwykle wymagają utrwalenia i sekcji, które zakłócają i modyfikują strukturę PDL. Co więcej, większość z tych metod daje dane 2D, które nawet jeśli nie są zniekształcone, dają tylko częściowe i zlokalizowane informacje. Ponieważ PDL nie jest jednorodny pod względem struktury i funkcji, uzasadnione jest podejście, które odnosi się do nienaruszonej struktury 3D całego kompleksu ząb-PDL-kość.

Ten artykuł opisze metodę generowania OTM u myszy oraz dwie metody, które umożliwiają wizualizację 3D włókien kolagenowych w PDL bez żadnego podziału próbki.

Modele mysie są powszechnie używane do eksperymentów in vivo w medycynie, biologii rozwojowej, dostarczaniu leków i badaniach strukturalnych. Mogą być modyfikowane genetycznie w celu wyeliminowania lub wzmocnienia określonych białek i funkcji; zapewniają szybką, powtarzalną i przewidywalną kontrolę rozwoju; Są one również łatwe do zobrazowania ze względu na ich mały rozmiar⁸. Pomimo wielu zalet, modele mysie w badaniach stomatologicznych nie są często używane, zwłaszcza gdy uzasadnione są manipulacje kliniczne, głównie ze względu na małe rozmiary zębów. Modele zwierzęce, takie jak szczury^9,10,11, dogs^12,13, pigs^14,15,16 i monkeys¹⁷ są używane częściej niż myszy. Wraz z niedawnym rozwojem technik obrazowania o wysokiej rozdzielczości, korzyści płynące z wykorzystania modelu myszy do rozszyfrowania zawiłych procesów w OTM są liczne. W pracy przedstawiono metodę generowania ruchu mezjalnego zęba trzonowego w żuchwie przy stałych poziomach siły, które wyzwalają przebudowę kości. Większość eksperymentów OTM na gryzoniach przeprowadza się w szczęce, ponieważ ruchomość żuchwy i obecność języka dodają kolejny poziom złożoności. Jednak żuchwa ma wiele zalet, gdy pożądana jest integralność strukturalna 3D. Można go łatwo wypreparować jako całą kość; u niektórych gatunków można go rozdzielić na dwie półżuchwy przez spojenie włókniste; Jest zwarty, płaski i zawiera tylko zęby bez przestrzeni zatokowych. Natomiast szczęka jest częścią czaszki i jest ściśle związana z innymi narządami i strukturami, dlatego konieczne jest obszerne cięcie w celu wypreparowania kości wyrostka zębodołowego wraz z powiązanymi zębami.

Korzystając z własnej komory wilgotnościowej połączonej z systemem ładowania wewnątrz mikro-tomografu komputerowego o wysokiej rozdzielczości, który umożliwia wzmocnienie fazy, opracowaliśmy metodę wizualizacji świeżych tkanek włóknistych w 3D, jak wcześniej opisano9^{,18,19,20,21,22,23}. Świeże tkanki są skanowane natychmiast po uśmierceniu zwierzęcia bez żadnego barwienia czy utrwalania, co zmniejsza artefakty tkankowe, jak również zmiany właściwości biomechanicznych. Te dane 3D mogą być wykorzystane do analizy rozkładu i kierunku włókien, jak opisano w innym miejscu¹⁹.

Druga przedstawiona tutaj metoda obrazowania całych tkanek 3D opiera się na optycznym oczyszczaniu żuchwy, co umożliwia obrazowanie włókien PDL przez kość bez żadnego cięcia. Co ciekawe, umożliwia również wizualizację włókien kolagenowych samej kości, jednak nie będzie to tutaj omawiane. Ogólnie rzecz biorąc, istnieją dwie metody oczyszczania tkanek. Pierwszym z nich jest oczyszczanie wodne, w którym próbkę zanurza się w roztworze wodnym o współczynniku załamania światła większym niż 1,4 poprzez proste zanurzenie, hiperhydratację lub zatopienie hydrożelu. Jednak metoda ta jest ograniczona pod względem poziomu przezroczystości, a także zachowania strukturalnego tkanki, a zatem wymaga utrwalenia tkanki. Drugą metodą, która daje wysoce przezroczyste próbki i nie wymaga utrwalania, jest metoda czyszczenia oparta na rozpuszczalniku^24,25. Opracowaliśmy zmodyfikowaną metodę oczyszczania opartą na rozpuszczalniku opartą na etylo-3-fenyloprop-2-enonianu (cynamonian etylu, ECi) dla próbek żuchwy. Ta metoda ma zalety polegające na zastosowaniu nietoksycznego środka czyszczącego dopuszczonego do kontaktu z żywnością, minimalnym kurczeniu się tkanek i zachowaniu białek fluorescencyjnych.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi NIH dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz wytycznymi Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Harvarda (Protokół nr 01840).

1. Ortodontyczny ruch zębów

1. Aby wygenerować łóżko dla myszy, użyj płaskiej plastikowej platformy z zagłówkiem w kształcie klina, nachylonym pod kątem 45°. Zagłówek można wygenerować poprzez wycięcie plastikowego pudełka.
   1. Podnieś wezgłowie platformy, aby wytworzyć kąt około 30° między zagłówkiem a płaszczyzną stołu. Przymocuj wygięty gruby spinacz do papieru (o średnicy 0.036 cala) do końca po stronie głowy, aby przytrzymać górne siekacze.
   2. Na końcu ogona wygeneruj podwyższoną powierzchnię, do której można przymocować ortodontyczny łańcuch zasilający, aby utrzymać dolne siekacze. Zobacz Rysunek 1 dla przykładowej platformy.
2. Znieczulić mysz przez dootrzewnowe wstrzyknięcie ksylazyny w dawce 10 mg/kg i ketaminy 100 mg/kg za pomocą strzykawki 1 ml i igły 27G.
3. Umieść znieczuloną mysz na specjalnie przygotowanej platformie i unieruchamij górną szczękę, zaczepiając górne siekacze o pętlę spinacza. Otwórz dolną szczękę myszy za pomocą ortodontycznego łańcucha zasilającego zaczepionego o dolne siekacze. Utrzymuj policzki cofnięte za pomocą retraktora do ust mini-colibri.
4. Umieść platformę pod mikroskopem chirurgicznym lub innym stereoskopem, który może osiągnąć powiększenie do 5-6x.
5. Nałóż 50 μl soli fizjologicznej (około 1 kropla) na oczy myszy, aby zapobiec odwodnieniu rogówki. Uzupełniaj sól fizjologiczną co 20 minut.
6. Wytnij kawałek drutu aluminiowego (o średnicy 0,08 mm) o długości 1 cm. Przesuń drut od strony policzkowej językowo w okolicy międzyzębowej, poniżej punktu styku między pierwszymi i drugimi zębami trzonowymi za pomocą mikrochirurgicznego uchwytu na igłę. Pozostaw 2 mm wolnej krawędzi przed pierwszym zębem trzonowym, aby można ją było wkręcić w koniec sprężyny.
7. Wytnij kawałek cewki niklowo-tytanowej (NiTi) o długości około 7 do 9 gwintów.
   UWAGA: Elastyczne właściwości cewki zapewnią stałą siłę do ruchu ortodontycznego. Całkowita długość cewki bez naprężeń powinna być krótsza niż przerwa między siekaczem a zębem trzonowym. Należy pamiętać, że potrzebne są dodatkowe 2 gwinty na każdym końcu, aby zakotwiczyć cewkę do zęba. Drut aluminiowy jest wybierany w celu zmniejszenia artefaktów skanowania, takich jak twardnienie wiązki podczas skanowania mikro-CT.
8. Włożyć sprężynę śrubową NiTi (średnica drutu 0,15 mm, wewnętrzna średnica cewki 0,9 mm; zapewnia siłę 10 g) między dolny pierwszy trzonowiec a dolny siekacz. Użyj ligatury drutowej umieszczonej wokół pierwszego zęba trzonowego w kroku 1.6, mocno skręć drut wokół 2 gwintów sprężyny cewkowej, aby zamocować cewkę po stronie zębów trzonowych.
9. Aby zapewnić równomierny poziom siły, użyj dokładnie 3 aktywnych nici między pierwszym zębem trzonowym a siekaczem. Tymczasowo zdejmij łańcuch napędowy z siekacza i zapętl 2 do 3 nienapiętych nici na siekaczu, aby zakotwiczyć cewkę. Zsuń nici w dół do brzegu dziąsła wolnego od siekaczy.
10. Umieść warstwę płynnej żywicy kompozytowej na siecznej granicy cewki i utwardź ją światłem do utwardzania zębów. Wymień łańcuch zasilający po utwardzeniu żywicy.
11. Używając tego samego światła utwardzającego, podgrzej cewkę NiTi przez 20 s. Spowoduje to dokręcenie cewki NiTi. Gotowe rozmieszczenie jest pokazane Rysunek 1C.
12. Albo pozostaw nienaruszoną stronę przeciwległą, albo włóż pozorę, taką jak drut między pierwszym a drugim zębem trzonowym.
13. Umieść znieczuloną mysz pod gorącym światłem, aby utrzymać mysz w cieple aż do powrotu do zdrowia.
14. Umieść mysz z powrotem w osobnej klatce i monitoruj codziennie. Podczas ruchu ortodontycznego nie jest konieczna zmiana diety.
    UWAGA: Urządzenie OTM z jednej strony powoduje pewien dyskomfort, ale nie upośledza karmienia. Jednak wkładanie urządzeń po obu stronach nie jest zalecane ze względu na dodatkowy dyskomfort. Leki przeciwbólowe nie są konieczne, chyba że widoczne są zewnętrzne oznaki bólu.

2. Mikrotomografia komputerowa włókien PDL w świeżych półżuchwach

1. Montaż półżuchwy (Rysunek 2)
   1. Po pożądanym czasie trwania ruchu ortodontycznego poświęć mysz poprzez zwichnięcie szyjki macicy. Wyjmij żuchwę i rozdziel na półżuchwy.
      UWAGA: Ponieważ próbka nie zostanie zamocowana, bardzo ważne jest, aby przeprowadzić sekcję szczęki i montaż tak szybko, jak to możliwe, najlepiej w ciągu 30 minut.
   2. Delikatnie usuń otaczającą miękką tkankę czystą, niestrzępiącą się chusteczką.
   3. Zdejmij aparat ortodontyczny za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych i pęsety pod mikroskopem stereoskopowym o co najmniej 4-krotnym powiększeniu.
   4. Utrzymuj próbkę wilgotną w objętości 1,5 ml w probówce do mikrowirówek wraz z kawałkiem niestrzępiącej się chusteczki zwilżonej wodą.
   5. Umieść nadającą się do pakowania dentystyczną żywicę kompozytową w szczelinie próbki na stoliku, a następnie umieść świeżą półżuchwę w kompozycie. Przed montażem należy upewnić się, że powierzchnia kości stykająca się z kompozytem dentystycznym jest wolna od jakichkolwiek tkanek miękkich i sucha, w przeciwnym razie kompozyt dentystyczny nie utwardzi się prawidłowo.
   6. Dostosuj położenie półżuchwy, aż pierwszy ząb trzonowy zostanie wyśrodkowany w rowku linii środkowej stolika. Upewnij się, że powierzchnia zgryzowa jest pozioma. Utwardź kompozyt, gdy jest zadowolony z pozycjonowania.
      UWAGA: Dodatkowe niewielkie ilości kompozytów dentystycznych można umieścić po bokach półżuchwy i/lub w poprzek siekacza, aby pomóc w stabilizacji próbki.
   7. Umieść zwilżoną, niestrzępiącą się chusteczką w kałużach wilgoci na sample stage. Umieść kompozyt dentystyczny na powierzchni zgryzowej pierwszego zęba trzonowego. Przed zamknięciem komory należy upewnić się, że nic nie blokuje ścieżki promieniowania rentgenowskiego na poziomie próbki.
   8. Zamocuj komorę w mikro-CT. Przykręć komorę do stolika na próbkę mikro-CT, aby zminimalizować ruch podczas obrazowania.
   9. Włącz promienie rentgenowskie i rób zdjęcia 2D, opuszczając kowadło w pionie, aż końcówka kowadła zostanie otoczona kompozytem, ale nie zostanie wykryty wzrost siły.
   10. Po osadzeniu kowadła w kompozycie zamknij źródło promieniowania rentgenowskiego. Następnie otwórz komorę mikro-CT i utwardź kompozyt przez przezroczyste okienko z pleksi.
2. Ustawienia mikrotomografii komputerowej
   1. Ustaw napięcie źródła na 40 kV, a prąd na 200 μA. Za pomocą detektora z 10-krotnym powiększeniem umieść próbkę w ramce view. Użyj kategoryzacji 2 dla przechwyconych obrazów.
      UWAGA: Ponieważ PDL jest znacznie mniej gęsty niż kość i ząb, wizualizacja PDL wymaga większej mocy i czasu naświetlania. Ten protokół zapewni ustawienia do wizualizacji biblioteki PDL.
   2. Ustaw czas ekspozycji pojedynczego obrazu na 25 s. Ustaw obrót stolika próbki w zakresie 183 stopni lub większym. Ustaw skanowanie na 2500 projekcji. Nie używaj żadnego filtra źródła promieniowania rentgenowskiego, wynikowe skany mają rozmiar woksela 0,76 μm z każdej strony.
   3. Pobrać skan referencyjny w celu prawidłowej rekonstrukcji zgodnie z wytycznymi mikrotomografii komputerowej. Użyj 1/3 liczby obrazów referencyjnych jako całkowitych projekcji. Zrekonstruuj wolumin bez dodatkowego kategoryzacji, używając algorytmu filtrowania projekcji wstecznej.

3. Metoda czyszczenia (Rysunek 3)

1. Przygotuj pięć mikroprobówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml.
2. Przygotuj 1,4 ml następujących roztworów w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml: 4% paraformaldehydu (PFA) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), 50% etanolu (EtOH) w wodzie dejonizowanej (DI), 70% EtOH w wodzie DI i dwie probówki 100% EtOH.
   UWAGA: PFA służy do utrwalania próbki. Rozliczanie ECi będzie również działać na próbkach nieutrwalonych. Aby usunąć nieutrwalone próbki, po prostu pomiń etap PFA.
3. Umieść wypreparowaną półżuchwę w 4% PFA. Przykryj folią aluminiową i umieść na bujaku na delikatnym ustawieniu w temperaturze pokojowej na 6 godzin.
4. Przesuń półżuchwę do 50% EtOH. Umieść go na bujaku osłoniętym od światła na 16 godzin.
5. Przesuń półżuchwę do 70% EtOH. Umieść go na bujaku osłoniętym od światła na 16 godzin.
6. Przesuń półżuchwę do 100% EtOH. Umieść go na bujaku osłoniętym od światła na 16 godzin.
7. Powtórzyć czynności 3.6. w drugiej probówce ze 100% EtOH.
8. Przygotować 5 ml ECi w szklanej lub polipropylenowej probówce.
   UWAGA: ECi rozpuszcza polistyren, ale nie polipropylen. Ponadto, jeśli nie używa się tkanki z białkami fluorescencyjnymi, próbka może być wystawiona na działanie światła podczas procedury oczyszczania.
9. Przesuń półżuchwę do rurki ECi. Przykryj rurkę folią aluminiową i umieść na bujaku na delikatnym ustawieniu na minimum 12 godz.
   UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Odwodniona próbka może być przechowywana w ECi w temperaturze pokojowej. Temperatura zamarzania lub topnienia ECi wynosi od 6,5 do 8,0 °C. Nie przechowywać w temperaturze 4 °C.
10. Półżuchwa jest gotowa do obrazowania za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
    UWAGA: Podczas obrazowania próbka musi być zanurzona w ECi, aby pozostała optycznie przezroczysta.

Ten artykuł przedstawia metodę wytwarzania OTM, jak również dwie metody obrazowania 3D włókien kolagenowych wewnątrz PDL bez żadnego przekroju. Do celów badań na zwierzętach, gdy wyrównanie zębów nie jest konieczne, ruch zębów jest uważany za ortodontyczny, jeśli powoduje przebudowę kości wyrostka zębodołowego na wszystkich poziomach korzeni. Stały poziom siły wywieranej na zęby jest wymagany w celu wytworzenia niezawodnego OTM. W tym przypadku aktywowana cewka NiTi z pamięcią kształtu jest używana do generowania stałej siły 10 g przez cały czas eksperymentu wynoszący 7 dni i dłużej, jeśli jest to uzasadnione. Opisana tutaj aktywacja cewki (Rysunek 1) generuje naprężenie w cewce NiTi w fazie martenzytycznej i doprowadza cewkę do stanu histerezy, co powoduje stałe naprężenie zęba. Podgrzanie cewki za pomocą lampy utwardzającej po włożeniu cewki zapewni również, że stop przejdzie do swojej austenitycznej postaci i nastąpi efekt pamięci kształtu.

Tutaj pokazujemy reprezentatywne wyniki od 9-tygodniowych samców myszy. Uśredniona przestrzeń mezjodystalna między koronami pierwszego i drugiego zęba trzonowego po 7 dniach OTM wynosi 40 μm, mierzona między powierzchniami międzyzębowymi zębów trzonowych w mikrotomografii komputerowej przy powiększeniu 1X (n=12, st.dev.= 15 μm) (Rysunek 1E). Uśredniona przestrzeń PDL w kierunku mezjodystalnym wynosi 80 μm przed i po 7 dniach OTM (Rysunek 4B). Potwierdza to, że pierwszy ząb trzonowy uległ translacji mezjalnie i 7 dni to wystarczający czas do wygenerowania OTM w modelu mysim podczas generowania procesów resorpcji i apozycji kości w naturze (Rysunek 4). Myszy były karmione standardową dietą z twardych palet. Nie wprowadzono żadnych zmian w diecie po włożeniu urządzenia.

Pierwsza przedstawiona metoda wizualizacji zmian w kompleksie ząb-PDL-kość podczas OTM opiera się na wspomaganym fazowo obrazowaniu mikro-CT świeżych tkanek (Rysunek 4), który został szczegółowo opisany wcześniej9,18,19,20,22,23. Krótko mówiąc, pod warunkiem możliwości wzmocnienia fazy mikro-CT lub synchrotronu, mechanicznej stabilizacji tkanki włóknistej i nawilżonego środowiska, świeże włókna kolagenowe można uwidocznić bez żadnych środków utrwalających lub kontrastujących. W PDL widoczne są włókna, które są połączone zarówno z zębem, jak i kością, głównie typ I collagen19. Ta wyjątkowa możliwość wizualizacji w 3D nienaruszonego PDL umożliwia analizę gęstości włókien 3D, orientacji włókien, a także ruchu 3D zęba, jak opisano wcześniej9,19. W szczególności przedstawiamy tutaj wizualizację sieci włóknistej w PDL. W czasie 0 można zaobserwować fizjologiczną przebudowę zarówno w kości, jak i PDL. Przebudowa zachodzi również w cemencie komórkowym; Nie jest to jednak bezpośrednio związane z prezentowaną metodą i dlatego nie będzie rozwijane. Interfejs kość-PDL jest w większości gładki zarówno w płaszczyznach poprzecznych (Rysunek 4A), jak i strzałkowych (Rysunek 4B) przed przyłożeniem jakiejkolwiek siły. W płaszczyźnie koronalnej (Rysunek 4C), interfejs kość-PDL jest bardziej szorstki, szczególnie w kierunku obszaru wierzchołkowego, co może wskazywać na równowagę przebudowy, która ma tendencję do resorpcji. Po 3 dniach OTM (Rysunek 4D-F), po których pierwszy ząb trzonowy jest przesuwany mezjalicznie (kierunek jest reprezentowany przez przerywaną strzałkę), gęstość włókien w PDL ulega zmniejszeniu (białe groty strzałek). Granica kość-PDL jest bardziej szorstka niż po 0 dniach ze względu na rozwój kraterów na powierzchni kości, które wskazują na aktywność osteoklastyczną i procesy resorpcji kości związane głównie z siłami ściskania w klasie PDL26, jednak tutaj widoczne w obszarach napięcia po 3 dniach. Sugerowano niszczenie tkanek w obszarach naprężeń w PDL27,28 i można je wyraźnie zobaczyć przy użyciu tej metody. Szorstka granica jest widoczna na różnych poziomach korzeni (białe strzałki) i dlatego sugeruje, że ruch zęba ma charakter translacyjny, a nie tylko przechylenie korony. Po 7 dniach OTM (Ryc. 4G-I) objawy resorpcji kości, takie jak kratery w kości, szorstkie granice i rozszerzanie się przestrzeni PDL, są widoczne na wszystkich płaszczyznach, ale uśredniona przestrzeń PDL jest węższa niż w 3 dniach OTM (Rysunek 4D-F). Jednak w niektórych obszarach granica kość-PDL stała się gładsza po 7 dniach OTM obszary te znajdują się na dystalnych powierzchniach korzeni, co najprawdopodobniej jest wskazaniem do zrostu kostnego, zgodnie z oczekiwaniami w OTM w kierunku mezjalnym.

Ze względu na długi czas obrazowania mikro-tomografią (~19 h) i rotację stolika, montaż próbki jest niezbędny, aby utrzymać próbkę w bezruchu. Niestabilna próbka spowoduje rozmycie skanów. Rysunek 5 pokazuje, jak wygląda skan mikro-tomografu komputerowego, gdy próbka porusza się podczas skanowania. Ząb i kość są nieostre. Nie obserwuje się ani włókien PDL, ani osteocytów. W takich przypadkach sylwetka znajduje się wokół krawędzi obiektu. W Rysunek 5, można zaobserwować wiele konturów korony zęba (strzałki).

W zależności od celu badawczego, rozdzielczość i wizualizacja włókien PDL mogą być poświęcone w handlu na rzecz krótszego czasu skanowania, gdy pożądane są tylko informacje o twardych tkankach.

Uzupełniającą metodą wizualizacji 3D włókien PDL bez żadnego przekroju jest mikroskopia optyczna na optycznie oczyszczonych próbkach przy użyciu ECi (Rysunek 3). Metoda ta może być stosowana na próbce bez utrwalania i zachowuje sygnały fluorescencyjne, które istnieją w tkance przed usunięciem. Półżuchwy przed i po oczyszczeniu ECi są pokazane w Rysunek 3B i 3C. Odpowiednie oczyszczenie próbki z PDL można potwierdzić, gdy papier siatkowy jest widoczny przez ramus żuchwy. Ilość oczyszczania można regulować poprzez wydłużenie procesu odwadniania. Rysunek 6 pokazuje sygnał drugiej harmonicznej generacji (SHG) z włókien kolagenowych zarówno w kości wyrostka zębodołowego, jak i PDL w oczyszczonej żuchwie. Obrazowanie włókien kolagenowych kości w 3D to skomplikowany proces, w którym często wykorzystuje się metody mikroskopii elektronowej, takie jak FIB/SEM. Jednak przy użyciu metody oczyszczania opartej na ECi i SHG, włókna kostne wyrostka zębodołowego są wyraźnie widoczne, szczególnie w kierunku poziomym. Podczas translacji przez próbkę w głąb PDL z powierzchni kości, przejście do poziomu włókien PDL jest bardzo wyraźne, ponieważ włókna nagle zmieniają swoją orientację na pionową.

Mikroskopia Lightsheet może być również wykorzystana do obrazowania białek fluorescencyjnych przez kość. W tym przypadku oczyszczonej próbki z transgenicznego Flk1-cre; Tdtomato mouse19,29,30, fluorescencyjne komórki śródbłonka wyściełające naczynia krwionośne są wyraźnie widoczne (Rysunek 7A, B, C, E). Prawidłowe oczyszczanie jest kluczem do generowania zrozumiałych obrazów za pomocą mikroskopii lightsheet. Gdy kość nie jest całkowicie oczyszczona, nie obserwowano naczyń krwionośnych w PDL (Ryc. 7D, F).

Rysunek 1: Konfiguracja zakładania aparatu ortodontycznego. A. Legowisko dla myszy wykonane z materiałów laboratoryjnych, aby podtrzymać zwierzę i utrzymać otwarte usta. Platforma z tworzywa sztucznego (PP) do nadwozia jest nachylona pod kątem 30°, a zagłówek (HR) znajduje się pod kątem 45° od powierzchni PP. 2-poziomowy stojak na rurki (TS) służy do podnoszenia głowicy końcowej PP. Pętla spinacza do papieru (strzałka) zakotwicza górne siekacze, a dolny ortodontyczny łańcuch zasilający (biała strzałka) zaczepia się o dolne siekacze. Lusterko inspekcyjne o średnicy 5 mm służyło do oględzin zębów trzonowych. Ur. Widok z boku na łóżko myszy. Kąty między powierzchniami są oznaczone (zielony i karmazynowy). C. Reprezentatywny obraz prawidłowo umieszczonego urządzenia. D. Zęby trzonowe widziane przez lusterko inspekcyjne przed implantacją urządzenia. E. Reprezentatywny obraz zębów trzonowych po zabiegu ortodontycznym. Linie przerywane wyznaczają kontur pierwszego i drugiego zęba trzonowego. Fot. Schemat urządzenia i jego umiejscowienie. Czerwona linia reprezentuje ligaturę drutu wokół pierwszego zęba trzonowego. Pomarańczowa linia reprezentuje płynną żywicę kompozytową używaną do zakotwiczenia cewki. Cewka NiTi jest pokazana na niebiesko i oznaczona. G. Wypreparowana półżuchwa z założonym urządzeniem po 7-dniowym ruchu ortodontycznym. Zwróć uwagę, że 3 gwinty cewki są nadal otwarte, co oznacza, że cewka jest nadal aktywna po 7 dniach. Podziałka = 1 mm w E i G. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Półżuchwa zamontowana w specjalnie zaprojektowanej komorze do obrazowania mikro-CT. A. Pełna konfiguracja komory na próbki w maszynie mikro-CT. Źródło promieniowania rentgenowskiego jest widoczne po lewej stronie, a detektor po prawej. Czerwony prostokąt obrysowuje półżuchwę zamontowaną w komorze na stoliku na próbkę (SS). Pokazana tutaj przykładowa komora jest częścią zestawu do testów mechanicznych, obejmującego silnik (M), kowadło (A, obrysowane białymi przerywanymi liniami) i wałek kowadełka (AS) na szczycie komory. Pełny zestaw jest przykręcony do stolika CT. Obraz we wstawce pokazuje zbliżenie obszaru obrysowanego na czerwono, zawierającego komorę wilgotności z próbką w środku. Ur. Widok z góry próbki zamontowanej na stoliku na próbkę. Baseny wilgotności (szara strzałka) są wbudowane na obwodzie, aby utrzymać wilgotność podczas obrazowania. Na okrągłym stoliku pośrodku półżuchwa może być zamontowana w skośnym głębokim rowku (strzałka). Cienki rowek (biała strzałka) wyznacza linię środkową stolika, aby pomóc w orientacji próbki. C. Schemat stolika kołowego z rowkiem na próbkę. Nachylenie rowka podtrzymuje żuchwę i umożliwia montaż zębów trzonowych wzdłuż osi pionowej korzeni. D. Reprezentatywny wycinek 2D mikro-CT w połączeniu z obrazem objętości 3D próbki półżuchwy. Przerwa międzyzębowa wynosi tutaj 52 μm. Próbka jest montowana na stoliku na próbkę poniżej (nie pokazano), a kowadło (A) na górze za pomocą kompozytu dentystycznego (DC). Podziałka = 500 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Metoda oczyszczania oparta na ECi dla wypreparowanych półżuchw myszy. ZA. Wypreparowaną półżuchwę zanurza się kolejno w 4% PFA, 50% EtOH, 70% EtOH i 100% EtOH. Po odwodnieniu półżuchwa jest przechowywana w ECi przez co najmniej 12 godzin do momentu wykonania badania obrazowego. Ur. Półżuchwa natychmiast po rozwarstwieniu. C. Półżuchwa po zakończeniu oczyszczania. Podziałka = 5 mm Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Reprezentatywne skany in-situ mikro-CT PDL świeżej próbki na różnych etapach ruchu ortodontycznego. A-C, Brak ruchu ortodontycznego. ZA. Obraz Micro-CT 2D w płaszczyźnie poprzecznej półżuchwy pokazujący korzenie mezjalne (M) i dystalne (D) wewnątrz kości wyrostka zębodołowego, B-policzkowe, L-językowe strony kości wyrostka zębodołowego. Pomiędzy korzeniami zębów a kością wyrostka zębodołowego wyraźnie obserwuje się przestrzeń PDL i znajdujące się w niej włókna. B. Obraz 2D w płaszczyźnie strzałkowej. C. Obraz 2D w płaszczyźnie koronalnej. D-E, obrazy 2D po 3 dniach OTM, groty strzał wskazują obszary w PDL ze zmniejszeniem gęstości włókien kolagenowych, białe strzałki wskazują obszary resorpcji kości. G-I, obrazy 2D po 7 dniach OTM, czarne strzałki wskazują obszary przylegania kości. Podziałka liniowa = 150 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Obraz 2D mikro-CT w płaszczyźnie strzałkowej, pokazujący rozmyte struktury zarówno zęba, jak i kości spowodowane ruchem zęba podczas skanowania. Strzałki wskazują wiele linii deski zęba, wskazując jego ruch. Podziałka 150 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: ECi oczyszczona żuchwa pokazuje pierwszy ząb trzonowy zobrazowany z generacją drugiej harmonicznej (SHG). Biała strzałka wskazuje obszar, w którym widoczne są włókna kolagenowe PDL, zwróć uwagę na orientację pionową, czarne strzałki wskazują obszar, w którym widoczne są zarówno pionowe włókna PDL, jak i poziome włókna kości wyrostka zębodołowego. T-ząb, F-furkacja, AB-kość wyrostka zębodołowego, MR-korzeń mezjalny, DR-Korzeń dystalny, podziałka 150 μm. Obrazy uzyskano przy użyciu 20-krotnego obiektywu z wieloma zanurzeniami dla roztworów o RI 1,33-1,56. Laser wzbudzający został ustawiony na 860nm przy 10% mocy. Czas przebywania pikseli: 0,51 μs; Tryb skanowania: ramka; Średnia: 16; Typ detektora: niedeskanowany detektor lampy fotopowielacza; Wzmocnienie detektora 800V. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7. Obrazy mikroskopowe Lightsheet Flk1-Cre z certyfikatem ECi; Mysz tdTomato. ZA. Optymalnie oczyszczona kontrola półżuchwy. Widoczna jest sieć naczyń krwionośnych w obrębie kości (grot strzały) i przestrzeni PDL (strzałka). Ur. wstawka obszaru mezjojęzykowego pierwszego zęba trzonowego (czerwona obwódka w A) pokazuje naczynia krwionośne. C. optymalnie oczyszczona 7-dniowa półżuchwa OTM i D. nieoptymalnie oczyszczona półżuchwa. E. Obraz 2D panelu C w płaszczyźnie strzałkowej, obraz pokazuje dobrze zdefiniowane naczynia krwionośne w kości (szara strzałka) i przestrzeni PDL (białe strzałki). Fot. Dwuwymiarowy obraz przekroju panelu D, ten sam obszar co obrazy w E, co powoduje rozmycie obrazu. Podziałki A, C, D = 500 μm, B, E, F = 100 μm Zdjęcia wykonano obiektywem planistycznym 5X, przy użyciu kamery jako detektora. Wzbudzenie lasera miało długość fali 561 nm przy 4% mocy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.