Artykuł metodologiczny

Izolacja i obrazowanie poklatkowe pierwotnych embrionalnych komórek mezenchymy podniebiennej myszy w celu analizy zbiorowych atrybutów ruchowych

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62151

⸱

13 lutego 2021

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Kansas Medical Center, 2Department of Biological Physics, Eotvos University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół izolacji i hodowli pierwotnych embrionalnych komórek mezenchymalnych podniebienia myszy do obrazowania poklatkowego dwuwymiarowego (2D) wzrostu i gojenia ran. Udostępniamy również metodologię analizy danych z obrazowania poklatkowego w celu określenia powstawania strumienia komórkowego i ruchliwości kierunkowej.

Streszczenie

Rozwój podniebienia to dynamiczny proces, który obejmuje pionowy wzrost obustronnych półek podniebiennych obok języka, a następnie wyniesienie i fuzję ponad językiem. Wady tego procesu prowadzą do rozszczepu podniebienia, powszechnej wady wrodzonej. Ostatnie badania wykazały, że uniesienie półki podniebiennej obejmuje proces przebudowy, który zmienia orientację półki z pionowej na poziomą. Rola komórek mezenchymalnych szelfu podniebiennego w tej dynamicznej przebudowie była trudna do zbadania. Analiza ilościowa oparta na obrazowaniu poklatkowym została ostatnio wykorzystana do wykazania, że pierwotne embrionalne komórki mezenchymalne podniebienia myszy (MEPM) mogą samoorganizować się w ruch zbiorowy. Analizy ilościowe pozwoliły zidentyfikować różnice w zmutowanych komórkach MEPM w porównaniu z modelem mysim z wadami uniesienia podniebienia. W artykule opisano metody izolacji i hodowli komórek MEPM z zarodków E13.5 - w szczególności do obrazowania poklatkowego - oraz określenia różnych atrybutów komórkowych ruchu zbiorowego, w tym pomiarów tworzenia strumieni, wyrównania kształtu i trwałości kierunku. Zakłada ona, że komórki MEPM mogą służyć jako model zastępczy do badania roli mezenchymy szelfu podniebiennego podczas dynamicznego procesu podnoszenia. Te metody ilościowe pozwolą badaczom zajmującym się twarzoczaszką ocenić i porównać zbiorowe atrybuty ruchowe w komórkach kontrolnych i zmutowanych, co poszerzy wiedzę na temat przebudowy mezenchymalnej podczas podnoszenia półki podniebiennej. Co więcej, komórki MEPM stanowią rzadki mezenchymalny model komórkowy do badania zbiorowych ruchów komórek w ogóle.

Wprowadzenie

Rozwój podniebienia był intensywnie badany, ponieważ defekty w palatogenezie prowadzą do rozszczepu podniebienia - powszechnej wady wrodzonej, która występuje w pojedynczych przypadkach lub jako część setek zespołów1,2. Rozwój podniebienia embrionalnego jest procesem dynamicznym, który obejmuje ruch i fuzję tkanki embrionalnej. Proces ten można podzielić na cztery główne etapy: 1) indukcja półek podniebiennych, 2) pionowy wzrost półek podniebiennych obok języka, 3) podniesienie półek podniebiennych powyżej języka oraz 4) fuzja półek podniebiennych w linii środkowej1,3,4. W ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat zidentyfikowano wiele mutantów myszy, które manifestują rozszczep podniebienia5,6,7,8. Charakterystyka tych modeli wykazała defekty w etapach indukcji, proliferacji i fuzji szelfu podniebiennego; Wady elewacji półki podniebiennej były jednak rzadkie. Tak więc zrozumienie dynamiki podnoszenia się szelfu podniebiennego jest intrygującym obszarem badań.

Dokładna analiza niektórych mutantów myszy z wadami wysokości półki podniebiennej doprowadziła do obecnego modelu pokazującego, że bardzo przedni obszar półki podniebiennej wydaje się przechylać do góry, podczas gdy ruch pionowy do poziomego lub "przebudowa" półek podniebiennych występuje w środkowych i tylnych obszarach podniebienia1, 3,4,9,10,11. Nabłonek krawędzi przyśrodkowej półki podniebiennej prawdopodobnie inicjuje sygnalizację wymaganą do tej przebudowy, która jest następnie napędzana przez mezenchymę szelfu podniebiennego. Ostatnio wielu badaczy zidentyfikowało opóźnienie uniesienia półki podniebiennej w modelach mysich, które wykazały przejściowe zrosty jamy ustnej obejmujące półki podniebienne12,13. Remodeling mezenchymalny polega na reorganizacji komórek w celu utworzenia wybrzuszenia w kierunku poziomym, przy jednoczesnym cofnięciu półki podniebiennej w kierunku pionowym9,10,14. Wśród kilku proponowanych mechanizmów wpływających na uniesienie półki podniebiennej i leżącą u podstaw przebudowę mezenchymalną są: proliferacja komórek15,16,17, gradienty chemotaktyczne18 i komponenty macierzy zewnątrzkomórkowej19,20. Pojawiło się ważne pytanie: czy opóźnienie podniesienia półki podniebiennej obserwowane u myszy z niedoborem Specc1l jest również częściowo spowodowane defektem w przebudowie półki podniebiennej i czy ten defekt przebudowy może przejawiać się w wewnętrznej defektywności w zachowaniu pierwotnych komórek MEPM21?

Pierwotne komórki MEPM były używane w polu twarzoczaszki do wielu badań związanych z ekspresją genów22,23,24,25,26,27,28,29, oraz kilka związanych z rozprzestrzenianiem30,31 i migration25,31,32, ale brak do zbiorczej analizy zachowania komórek. Obrazowanie poklatkowe komórek MEPM przeprowadzono w hodowli 2D i testach gojenia ran, aby pokazać, że komórki MEPM wykazywały ruch kierunkowy i tworzyły strumienie komórkowe zależne od gęstości - atrybuty ruchu zbiorowego21. Co więcej, zmutowane komórki Specc1l tworzyły węższe strumienie komórkowe i wykazywały bardzo zmienne trajektorie migracji komórek. Uważa się, że ten brak skoordynowanej ruchliwości przyczynia się do opóźnienia uniesienia podniebienia u zmutowanych zarodków Specc1l13,21. Tak więc te stosunkowo proste testy wykorzystujące pierwotne komórki MEPM mogą służyć jako proxy do badania przebudowy mezenchymalnej podczas podnoszenia półki podniebiennej. W artykule opisano izolację i hodowlę pierwotnych komórek MEPM, a także obrazowanie i analizę poklatkową w testach 2D i gojeniu ran

.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez KUMC Institutional Animal Care and Use Committee, zgodnie z ich wytycznymi i regulacjami (numer protokołu: 2018-2447).

1. Pobranie zarodków E13.5

  1. Uśmiercić ciężarne myszy samice za pomocą komory inhalacyjnej z CO2 lub zgodnie z procedurą zatwierdzoną przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt. Niezwłocznie przystąpić do sekcji.
  2. Odsłonić dolną połowę jamy brzusznej poprzez usunięcie skóry i otrzewnej. Wyciąć oba rogi macicy zawierające embriony w stadium E13.5.
  3. Umieścić macicę na krótko w podgrzanym do 37 °C sterylnym roztworze soli fosforanowej w buforze (PBS), aby wypłukać nadmiar krwi, włosów lub innych zanieczyszczeń. Umieścić macicę w sterylnej szalce 10 cm wypełnionej sterylnym PBS.
  4. Za pomocą małych nożyczek przeciąć ścianę macicy wzdłuż jej długości, aby odsłonić każdy embrion znajdujący się w pęcherzyku żółtkowym. Usunąć pęcherzyk żółtkowy otaczający embrion, zachowując go do ewentualnego genotypowania. Po wyjęciu embrionów umieścić każdy z nich w oddzielnym dołku płytki 12-dołkowej wypełnionej PBS.

2. Disekcja podniebiennych wyrostków z embrionów (Rysunek 1)

UWAGA: Sterylizuj stalowe narzędzia do sekcji (patrz Tabela materiałów) po obróbce każdego zarodka, umieszczając narzędzia najpierw w zlewce z 100% etanolem (EtOH), następnie w sterylizatorze do narzędzi w temperaturze 350 °C przez 10 s, a następnie chłodząc je w drugiej zlewce z 100% EtOH.

  1. Za pomocą wysterylizowanej łyżki perforowanej przenieś embrion do nowej szalki o średnicy 10 cm wypełnionej pożywką MEPM, składającą się z minimalnej pożywki podstawowej Dulbecco (DMEM) zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), L-glutaminę (4 mM L-Glu) oraz antybiotyki – penicylinę i streptomycynę (50 jednostek/ml).
  2. Odciąć głowę zarodka tuż poniżej linii żuchwy, używając sterylnych nożyczek (Rysunek 1A, czerwona przerywana linia). Usunąć żuchwę, wkładając jeden koniec wysterylizowanej precyzyjnej pęsety nr 5 do pyska, tak aby znajdował się tuż za policzkiem. Przesunąć końcówkę wprowadzonej pęsety do momentu, aż wyjdzie ona z tyłu czaszki.
  3. Ustaw pęsetę wzdłuż żółonej linii w Rycina 1Bw taki sposób, aby druga strona pęsety (która wciąż znajduje się poza embrionem) znajdowała się tuż nad kanałem słuchowym, a następnie zaciśnij pęsetę, aby przeciąć tkankę. W razie potrzeby przesuń inną pęsetą precyzyjną wzdłuż miejsca zamknięcia pierwszej pęsety, aby przeciąć wszelkie tkanki, które nie zostały całkowicie oddzielone podczas zaciskania.
  4. Powtórz poprzedni krok po drugiej stronie głowy zarodka. Kontynuuj procedurę nacinania i odrywania, aby całkowicie usunąć żuchwę, język oraz dolną część czaszki i odsłonić wyrostki podniebienne.
  5. Usuń sklepienie czaszki, wykonując cięcie tuż nad oczami, zgodnie z obrazem w Rysunek 1C (zielona linia). Należy to zrobić, kładąc głowę na lewym lub prawym boku i ustawiając końcówki małych nożyczek ze stali nierdzewnej przed czaszką i za nią, nieco powyżej poziomu oka zarodka. Odciąć górną część czaszki jednym szybkim cięciem nożyczek, tworząc płaską powierzchnię, która będzie istotna dla stabilności w późniejszych etapach i która powinna wyglądać jak Rysunek 1D widziane z boku.
  6. Umieść pozostałą część głowy odwróconą do góry dnem, tak aby górna część głowy (po usunięciu czaszki) spoczywała płasko na dnie naczynia, co zapewni stabilną powierzchnię do usunięcia półek podniebiennych. Zidentyfikuj półki podniebienne, które są teraz odsłonięte i skierowane do góry; będą one widoczne jako dwie wypukłe krawędzie po obu stronach centralnego wgłębienia w przedniej połowie głowy.Rycina 1E).
  7. Przytwierdź pozostałą część głowy do szalki, aby ją unieruchomić na czas usuwania półdzielców podniebiennych. W tym celu wprowadź jeden koniec cienkiej pęsety przez tkankę w pobliżu obszaru nosowego głowy, przedniostronnie względem półdzielców podniebiennych, a drugi koniec pęsety wprowadź przez podstawę czaszki, tyłostronnie względem półdzielców podniebiennych. Utrzymuj je w tej pozycji podczas wycinania półdzielców podniebiennych.
    1. Unieruchamiając głowę jedną ręką, wybrać jedną z dwóch półek do usunięcia w pierwszej kolejności, a następnie wprowadzić oba ramiona drugiej pary pęsety precyzyjnej w tkankę u podstawy powierzchni bocznej półki i ścisnąć, aby przeciąć tkankę (Rycina 1F). Powtórz tę czynność wzdłuż podstawy powierzchni przyśrodkowej półki, a następnie na obu końcach półki – przednim i tylnym – aby oddzielić ją od głowy.
  8. Ostrożnie unieś półkę, wykonując w razie potrzeby dodatkowe chwyty pęsetą, aby całkowicie oddzielić ją od otaczającej tkanki.
  9. Powtórz poprzednie dwa kroki, aby usunąć drugą półkę podniebienną.
  10. Po uwolnieniu półek podniebiennych z otaczającej tkanki i umieszczeniu ich w PBS (Rycina G), za pomocą sterylnej plastikowej pipety transferowej z gruszką pobrać z pipety półki i przenieść je do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml wraz z około 500 µL buforu PBS. Probówki zawierające półki podniebienne należy przechowywać w lodzie podczas przetwarzania pozostałych osobników z miotu w ten sam sposób.
    UWAGA: Alternatywnie, bezpośrednio po sekcji (zamiast umieszczania ich na lodzie), fragmenty tkanek można umieścić w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml zawierającej uprzednio ogrzaną trypsynę (0,25%). Próbki będą w takim przypadku świeższe, jednak należy zachować szczególną ostrożność i kontrolować czas wszystkich kolejnych etapów dla każdej próbki z osobna, zamiast traktować próbki zbiorczo.

3. Hodowla komórek MEPM

UWAGA: W opisanych tutaj warunkach komórki nabłonkowe podniebienia nie przeżywają pierwszego pasażu, co skutkuje uzyskaniem czystej hodowli komórek mezenchymalnych podniebienia. Wszystkie etapy należy przeprowadzić z zachowaniem technik sterylnych w komorze do hodowli tkanek.

  1. Odssać i usunąć PBS z probówki 1,5 mL, uważając, aby nie usunąć podniebień w tym procesie. Natychmiast dodać 200 µL podgrzanej (37 °C) trypsyny (0,25%) do każdej probówki zawierającej podniebienia. Krótko pipetować podniebienia w górę i w dół w trypsynie, używając końcówki do pipety 1000 µL, aby przyspieszyć trypsynizację.
  2. Inkubować probówki przez 5 min w 37 °C, a następnie ponownie pipetować każdą próbkę w górę i w dół, aby pomóc w rozbiciu tkanki. Inkubować probówki przez kolejne 5 min w 37 °C i raz jeszcze pipetować w górę i w dół, aby całkowicie dokończyć dysocjację tkanki.
    UWAGA: Podniebienia muszą zostać całkowicie lub niemal całkowicie zdysocjowane i zawieszone w trypsynie, bez widocznych pozostałości grudek tkanki.
  3. Dodać 800 µL pożywki hodowlanej MEPM (krok 2.1) do każdej probówki 1,5 mL. Wirować probówkę 1,5 mL przy 200 × g przez 5 min w celu osadzenia komórek. Usunąć nadsącz i resuspendować osad komórkowy w 1 mL pożywki hodowlanej MEPM.
  4. Przenieść komórki MEPM na 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej zawierającą pożywkę hodowlaną MEPM. Pozostawić komórki do przytwierdzenia do plastikowej powierzchni na 12 h w 37 °C w inkubatorze z 5% CO2.
    UWAGA: Po inkubacji nocnej przytwierdzi się zdecydowana większość (~90%) komórek. W tym punkcie przytwierdzone komórki będą wyglądać dość homogenicznie, z trójkątnym lub lekko wydłużonym kształtem.
  5. Wymieniać pożywkę codziennie, delikatnie odsysając starą pożywkę i natychmiast zastępując ją 1 mL ciepłego sterylnego PBS bez wapnia i magnezu przez ok. 1 min. Odssać PBS i zastąpić go 3 mL podgrzanej pożywki hodowlanej MEPM.
  6. Przesiać komórki, gdy osiągną 100% konfluencji.
    UWAGA: Komórki MEPM powinny proliferować, podwajając swoją liczbę niemal codziennie.
    1. Aby przesiać komórki, delikatnie odessać starą pożywkę i natychmiast zastąpić ją ciepłym PBS bez wapnia i magnezu przez ok. 1 min. Odssać PBS i zastąpić go 0,5 mL podgrzanej 0,25% trypsyny.
    2. Inkubować w 37 °C przez ok. 5 min lub do momentu, aż komórki oddzielą się od powierzchni naczynia po delikatnym potrząśnięciu ręcznym w przód i w tył. Po oddzieleniu się komórek natychmiast dodać 5 mL podgrzanej pożywki hodowlanej MEPM do trypsynizowanych komórek.
    3. Używając pipety serologicznej 10 mL, delikatnie zebrać komórki do probówki stożkowej 15 mL i wirować probówkę przy 200 × g przez 5 min w celu osadzenia komórek. Odssać trypsynę i pożywkę, a następnie resuspendować komórki w 3 mL podgrzanej pożywki hodowlanej MEPM. Delikatnie nanieść 1 mL zawiesiny komórek do pojedynczego dołka płytki 6-dołkowej i dodać 2 mL pożywki hodowlanej MEPM, aby uzyskać całkowitą objętość 3 mL.
      UWAGA: Stanowi to podział komórek w stosunku 1:3. Komórki MEPM można przesiać do trzech razy. Gęstość siewu MEPM jest w pewnym stopniu elastyczna, a liczba obecnych komórek zmienia się w zależności od naczynia hodowlanego. Jednakże MEPM nie proliferują prawidłowo, gdy zostaną rozdzielone zbyt rzadko i powinny osiągnąć co najmniej 20-25% konfluencji w nowym naczyniu po przytwierdzeniu.

4. Kriokonserwacja komórek MEPM

  1. Po zgranulowaniu trypsynizowanych komórek MEPM, resuspenduj je w pożywce hodowlanej MEPM, aby uzyskać stężenie ~ 1 × 106 komórek/mL. Przenieś komórki pipetą do kriotubek i dodaj dimetylosulfotlenek do stężenia końcowego 5% w zawiesinie komórkowej. Zamknij kriotubkę, krótko wymieszaj poprzez odwrócenie i niezwłocznie umieść probówki w pojemniku do mrożenia, który chłodzi w tempie 1 °C/min.
  2. Umieść pojemnik w zamrażarce o temperaturze -80 °C na noc. Następnego dnia przenieś kriotubeki do zbiornika z ciekłym azotem w celu długoterminowego przechowywania.
  3. Rozmrażanie krio konserwowanych komórek MEPM
    1. Wyjmij kriotubeki ze zbiornika z ciekłym azotem i rozmrażaj w temperaturze pokojowej, aż zawartość zacznie przechodzić w stan ciekły. Przelej zawartość do stożkowej probówki 15 mL zawierającej 9 mL uprzednio ogrzanej pożywki hodowlanej MEPM.
    2. Wiruj probówkę przy 200 × g, aby zgranulować komórki. Resuspenduj komórki w 1 mL pożywki hodowlanej MEPM i przenieś je pipetą do pojedynczej studni płytki 6-dołkowej. Dodaj 2 mL ciepłej pożywki hodowlanej MEPM, aby uzyskać całkowitą objętość 3 mL.
    3. Hoduj komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2. Wymieniaj pożywkę codziennie.

5. Obrazowanie na żywo komórek MEPM - test zbiorowej migracji 2D (Rysunek 2)

  1. Przygotuj płytkę do obrazowania na żywo.
    1. Używając małych nożyczek chirurgicznych lub ostrego skalpela, przytnij sterylną wkładkę silikonową z 2 dołkami do wysokości ~1 mm. Przygotuj jedną wkładkę dla każdej używanej próbki.
    2. Za pomocą pęsety umieść przyciętą wkładkę silikonową z 2 dołkami w centrum dołka płytki 6-dołkowej. Dociśnij wszystkie krawędzie, aby upewnić się, że wkładka przylega w pełni.
  2. Rozmroź kriokonserwowane komórki, postępując zgodnie z krokami opisanymi w sekcji 4.3 niniejszego protokołu. Policz komórki MEPM i zasiać 300 komórek/mm2 w przyciętych wkładkach silikonowych w całkowitej objętości 40-50 µL pożywki hodowlanej MEPM na dołek. Hoduj komórki przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2.
  3. Następnego dnia przygotuj zestaw do obrazowania time-lapse na żywo.
    1. Użyj mikroskopu kontrastowego z inkubatorem na stoliku i funkcją automatycznego obrazowania. Dolej wodę do zbiornika inkubatora na stoliku, aby ograniczyć odparowywanie pożywki hodowlanej; ustaw temperaturę na 37 °C oraz CO2 na 5%. Odczekaj ~30 min do uzyskania odpowiedniej wilgotności przed umieszczeniem płytki 6-dołkowej w inkubatorze na stoliku.
  4. Do obrazowania time-lapse zastosuj ustawienia odpowiadające następującym parametrom.
    1. Wybierz obiektyw 4x, aby uzyskać szerokie pole widzenia, oraz filtr kontrastowy.
      UWAGA: Funkcje takie jak Autofocus, Auto find sample, z-stack oraz automatyczne oświetlenie zazwyczaj nie są wymagane.
    2. Wybierz dwa pola mikroskopowe na dołek, aby uchwycić światło przyciętych wkładek silikonowych. Upewnij się, że wszystkie pozycje obrazowania mają poprawną ostrość.
      UWAGA: Płaszczyzny obrazowania można korygować w trakcie obrazowania, jednak taka korekta zazwyczaj nie jest konieczna.
    3. Wybierz pożądany typ pliku wyjściowego dla obrazów, a następnie zaznacz lub odznacz opcje po obrazowaniu, takie jak automatyczne tworzenie wideo i znaki wodne, zgodnie z potrzebami. Jeśli jest to możliwe, wybierz kontrast fazowy jako tryb obrazowania.
      UWAGA: Stosowanie znaków wodnych może utrudnić późniejsze etapy przetwarzania obrazów.
    4. Ustaw czas trwania rejestracji na 72 h. Ustaw program tak, aby przechwytywał obrazy co 10 min.
      UWAGA: Zazwyczaj wymagane jest tylko 48 h obrazowania, jednak proces można przerwać w dowolnym momencie przed upływem 72 h bez utraty obrazów, które zostały już wykonane.
    5. Upewnij się, że komora środowiskowa działa zgodnie z wymaganiami określonymi w punkcie 5.3.1. Zapisz te ustawienia (rutynę) i rozpocznij obrazowanie.
  5. Kontynuuj obrazowanie aż do upływu 72 h (lub określonego czasu).

6. Obrazowanie na żywo komórek MEPM w teście naprawy rany (Rycina 3)

  1. Przygotować płytkę do obrazowania na żywo. Za pomocą pęsety umieścić sterylną silikonową wkładkę 2-dołkową w centrum dołka płytki 6-dołkowej, a następnie docisnąć wszystkie krawędzie, aby upewnić się, że wkładka ściśle przylega. Przygotować jedną wkładkę 2-dołkową dla każdej używanej próbki.
  2. Rozmrozić kriokonserwowane komórki, postępując zgodnie z krokami opisanymi w sekcji 4.3 niniejszego protokołu. Policzyć komórki MEPM i w razie potrzeby skoncentrować je do stężenia co najmniej 350 cells/µL.
  3. Zasiać komórki w zagęszczeniu 1400 cells/mm2 do wkładkek silikonowych w objętości 100 µL pożywki hodowlanej MEPM na dołek. Hodować komórki przez 48 h w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2, wymieniając pożywkę codziennie.
  4. Po 48 h przygotować mikroskop do obrazowania time-lapse na żywo, zgodnie z opisem w sekcjach 5.3 i 5.4. Bezpośrednio przed umieszczeniem komórek w inkubatorze na stoliku mikroskopu, dodać 3 mL uprzednio ogrzanej pożywki hodowlanej MEPM do dołka (na zewnątrz wkładkek), a następnie ostrożnie usunąć wkładki silikonowe.
    UWAGA: Ścianka oddzielająca dwie komory pozostawia przerwę, która stanowi „ranę”.
  5. Rozpocząć obrazowanie time-lapse zgodnie z opisem w sekcji 5.4, z następującymi zmianami:
    1. Użyć obiektywu o większym powiększeniu (np. 10x). Aby uchwycić proces zamykania rany, wybrać 5 pól widzenia wzdłuż każdej rany w taki sposób, aby rana była równoległa do pionowej osi obrazu.
  6. Zakończyć obrazowanie po 72 h lub po całkowitym zamknięciu się ran.

7. Analiza obliczeniowa sekwencji obrazów time-lapse

UWAGA: Poniższe procedury należy przeprowadzić na komputerze wyposażonym w standardowe narzędzia obliczeniowe, takie jak interpreter języka Python, kompilator C oraz powłoka (shell) (patrz na Tabela materiałów).

  1. Analiza konfluencji
    UWAGA: Niniejszą procedurę można wykorzystać do szacowania proliferacji komórek w kulturze o niskiej gęstości lub do ilościowej oceny eksperymentów dotyczących zamykania rany. W celu wykrycia obszarów zajętych przez komórki, do lokalnego odchylenia standardowego jasności obrazu stosuje się próg segmentacji. Kod ten został opisany wcześniej przez Wu i wsp.33 oraz Neufeld i wsp.34 i jest dostępny pod adresem http://github.com/aczirok/cellconfluency.
    1. Wyznacz próg segmentacji dla obrazów. Przykładowo, aby wyświetlić segmentację z progiem 4, wprowadź polecenie
      segment.py -i inout-image.jpg -S 4 -test output.jpg
      a następnie sprawdź wynik (wynik.jpg).
      UWAGA: Jeśli próg jest zbyt niski, obszary tła na mikrofotografii zostaną zaklasyfikowane jako pokryte komórkami. Z kolei, jeśli próg jest zbyt wysoki, obszary pokryte komórkami nie zostaną tak zaklasyfikowane. Optymalna wartość progu pozwala zminimalizować oba rodzaje błędów.
    2. Użyj dostarczonego skryptu area.sh, aby obliczyć wartości konfluencji dla sekwencji obrazów jako
      area.sh -S 4 img_001.jpg img_002.jpg .... > confluency.dat
      UWAGA: Wartość progu dyskryminacji 4 jest weryfikowana w kroku 1, a wyniki są zapisywane w pliku konfluencyjność.datPoprzez posegregowanie obrazów do odpowiednich folderów listę nazw plików obrazów można zastąpić przez symbol wieloznaczny notacja:
      area.sh -S4 *.jpg > stopien_konfluencji.dat
    3. W przypadku eksperymentów z gojeniem ran (wound-closure) przekształć dane dotyczące konfluencji. A(t)-wielkość obszaru pokrytego komórkami wyrażona jako procent w funkcji czasu – prędkość propagacji krawędzi rany V jako
      Równanie obliczania prędkości, V=w/2·dA/dt, wzór matematyczny do analizy fizycznej.
      gdzie w oznacza szerokość pola, a dA/dt jest pochodną po czasie A(t), czyli szybkością rozszerzania się obszaru pokrytego komórkami.
  2. Mapa motywności komórek
    1. Zastosuj algorytm welocymetrii obrazu cząstek (PIV) w celu scharakteryzowania motywności komórek i wyodrębnij zakres lokalnego ruchu („przepływu optycznego”) między parami obrazów, nie identyfikując poszczególnych komórek.
      UWAGA: W tym przypadku początkowy rozmiar okna wynoszący 50 µm stosuje się zgodnie ze szczegółowym opisem Zamira i wsp.35 oraz Czirok i wsp.36z początkową wielkością okna wynoszącą 50 µmAnaliza PIV pozwala na wyznaczenie pola prędkości v(x,t) dla każdej klatki obrazu t oraz lokalizacji x (w obrębie obrazu).
    2. Należy wyznaczyć średnią prędkość motywności komórek z v(x,t) jako średnią przestrzenną obliczoną dla obszaru zajmowanego przez komórkę, zgodnie z metodą opisaną w sekcji 7.1.
  3. Ręczne śledzenie komórek
    UWAGA: Chociaż analiza PIV umożliwia automatyczną ocenę ruchliwości komórek, skupienie się na zachowaniu pojedynczych komórek często wymaga ręcznego śledzenia. Choć funkcjonalność ta jest dostępna w wielu narzędziach, bardzo pomocne jest możliwości modyfikowania markerów ustawionych ręcznie po ich wstępnym rozmieszczeniu oraz możliwość śledzenia zarówno w przód, jak i wstecz w czasie.
    1. Przeprowadź śledzenie komórek za pomocą specjalnie opracowanego narzędzia w języku Python (http://github.com/donnagreta/cm_track), które oferuje również podstawowe funkcje edycyjne, takie jak usuwanie fragmentów trajektorii.
      UWAGA: To narzędzie do śledzenia ręcznego generuje pozycje P(i,t) komórki i w czasie t w pliku tekstowym i jest wywoływane jako
      cm_track.py -i images/ -o track.dat
      gdzie obrazy z serii czasowej znajdują się w folderze images/, a dane o pozycji zostały zebrane w pliku track.dat (Rycina 4).

Analiza migracji komórek; schemat przedstawiający śledzenie komórek, dane o pozycji i wykres przemieszczenia.
Rysunek 4: Analiza indywidualnych trajektorii komórek. (A) Mikrofotografie z odstępami czasu wykonane w kontraście fazowym poddaje się (B, C) procedurze ręcznego śledzenia, w której zaznaczane są komórki (zielone kropki). (D) Pozycje komórek (x,y) są zapisywane dla każdej komórki wyróżnionej identyfikatorem (ID) oraz dla każdej klatki obrazu f. (E) Trajektorie mogą być nałożone na mikrofotografie i zakodowane kolorami, aby wskazać informacje czasowe. Przykładowo, w każdej trajektorii paleta kolorów od niebieskiego do czerwonego wskazuje sukcesywnie późniejsze segmenty trajektorii, przy czym kolor czerwony i niebieski oznacza odpowiednio początkową i końcową lokalizację komórki. (F) Różne właściwości statystyczne trajektorii, takie jak średni kwadrat przemieszczenia, mogą zostać wyekstrahowane i wykorzystane do charakterystyki ruchliwości różnych populacji komórek, które w tym przykładzie obejmują komórki MEPM typu dzikiego (wt, niebieski) oraz z knockdownem (kd, czerwony). Paski skali reprezentują 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Nałóż trajektorie na obrazy za pomocą drugiego narzędzia, wywołując polecenie
    visdat.py -d track.dat -i images/ -o overlay/ -l999 -r3 -C2
  2. Zbierz obrazy z nałożonymi trajektoriami w folderze overlay.
    UWAGA: W tym przykładzie dane o pozycji komórek są przechowywane w pliku track.dat, natomiast sekwencja obrazów time-lapse znajduje się w folderze images. Pozostałe parametry kontrolują maksymalną długość rysowanych trajektorii (-l), rozmiar symboli (-r) oraz użyty schemat kolorów (-C).
  1. Analiza indywidualnych trajektorii komórek
    1. Opisać trajektorie za pomocą całkowitej długości ścieżki
      Równanie procesu Markowa, P(i,t)=Σt'Ot|P(i,t'+1)-P(i,t'), dla dynamiki stochastycznej.,
      oraz przemieszczenia wypadkowego w kierunku rany
      Wzór na przemieszczenie dynamiczne, D(i,t)=|X(i,t)-X(i,0)|, równanie ilustrujące analizę ruchu.,
      gdzie X oznacza rzut P w kierunku prostopadłym do rany: współrzędną x pozycji, gdy rana jest równoległa do osi y.
    2. Obliczyć efektywność naprowadzania jako Stosunek D(i,t)/P(i,t), wzór matematyczny, stosowany w analizie danych lub badaniach modelowych. dla każdej komórki i i punktu czasowego t37. Opisać hodowle za pomocą średniej populacyjnej tych pomiarów dla pojedynczych komórek, ocenianej w odpowiednim punkcie czasowym t.
  2. Kolektywny ruch strumieniowy komórek
    1. Opisać lokalne korelacje przestrzenne ruchów komórek za pomocą średniej prędkości innych komórek znajdujących się w sąsiedztwie poruszającej się komórki, zgodnie z wcześniejszym opisem38,39.
      UWAGA: Kod obliczeniowy jest dostępny pod adresem https://github.com/aczirok/flowfield.
      1. Dopasować układ odniesienia z kierunkami przodu, tyłu, lewej i prawej strony do każdego wektora v(x,t) (Rycina 5A). Przypisać każdy z wektorów prędkości sąsiednich komórek lub wektor prędkości PIV do odpowiedniej komórki przestrzennej układu odniesienia (Rycina 5B). Powtórzyć procedurę dla każdego wektora służącego jako początek układów odniesienia (Rycina 5C,D), tak aby dany wektor prędkości został przypisany do wielu przedziałów.
        UWAGA: Punkt danych może znajdować się przed jednym wektorem i po lewej stronie innego.
      2. Obrócić układy odniesienia do wspólnej orientacji (Rycina 5C,F) i je połączyć (Rycina 5G).
        UWAGA: Średnia z każdego przedziału połączonych danych o prędkości jest wektorem prędkości (U), który wskazuje na korelację przestrzenną: średnia ta jest miarą wspólnej składowej prędkości (Rycina 5H).
      3. Dopasować pola przepływu U(x) do funkcji wykładniczej Wzór zaniku wykładniczego U(x)=ae^(-x/x0)+U0; koncepcja równowagi statycznej., gdzie a, x0 i U0 są parametrami dopasowania. spośród trzech parametrów dopasowania skoncentrować się na x0, długości korelacji (Rycina 5I,J), która jest charakterystyczną odległością, przy której lokalne korelacje prędkość-prędkość zanikają.

Schemat analizy motylości komórek z polami wektorowymi; zawiera wykresy uśredniania wektorów i korelacji.
Rycina 5: Charakterystyka tworzenia się strumieni przez hodowane komórki. (A,D) Obrazy time-lapse w kontraście fazowym z Ryciny 4A służą do identyfikacji ruchów komórek. Dla każdej ruchomej komórki współसमोरowano układ odniesienia (niebieski) i przedziały przestrzenne (białe), aby sklasyfikować sąsiednie komórki jako znajdujące się z przodu, z tyłu, z lewej lub z prawej strony. (B,E) Prędkość sąsiednich komórek (czarne wektory) odniesiono do tego samego układu odniesienia (C,F). Procedurę tę powtórzono dla każdej komórki i punktu czasowego. (G) Po zgromadzeniu tych lokalnych informacji, każdy przedział zawiera wiele wektorów prędkości (szare), które można uśrednić, aby wyznaczyć średnią prędkość współruchu (magenta strzałki) w różnych lokalizacjach względem średniej komórki motylnej. (H) Mapa średniej prędkości charakteryzuje w ten sposób typowe prędkości komórek w różnych lokalizacjach względem ruchomej komórki. (I,J) Na koniec pole to zostało próbkowane wzdłuż osi przód-tył (równoległej) oraz wzdłuż osi lewo-prawo (prostopadłej). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Preparatoryka podniebienia jest przedstawiona na Rysunku 1. Sekwencja nacięć została zaprojektowana tak, aby zminimalizować przesuwanie się tkanki. Po usunięciu głowy (Rysunek 1A,B), usuwa się żuchwę (Rysunek 1B,C). Nacięcie górnej części głowy (Rysunek 1C,D) wykonuje się w celu stabilizacji tkanki po umieszczeniu jej odwróconą stroną do góry (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Elewacja szelfu podniebiennego stanowi przebudowę pionowo-poziomą 1,3,4,9,11. Postuluje się, że ten proces przebudowy wymaga, aby komórki mezenchymalne szelfu podniebienia zachowywały się koordynacyjnie. Analizy z komórkami MEPM typu dzikiego pokazują, że to zachowanie komórek jest wewnętrzne i można je określić ilościowo21. W związku z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ten projekt był częściowo wspierany przez granty National Institutes of Health DE026172 (I.S.) i GM102801 (A.C.). I.S. był również częściowo wspierany przez grant Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) (National Institute of General Medical Sciences P20 GM104936), grant Kansas IDeA Network for Biomedical Research Excellence (National Institute of General Medical Sciences P20 GM103418), oraz grant Centrum Badań nad Niepełnosprawnością Intelektualną i Rozwojową w Kansas (KIDDRC) (U54 Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, HD090216).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zlewka, 250 ml (x2)Fisher ScientificFB-100-250
CO2Matheson GasUN1013
Probówki stożkowe, 15 ml (x1)Midwest ScientificC15B
Analizaobliczeniowa obrazów poklatkowych
Zmodyfikowane Orły Dulbecco Średni/Wysoki poziom glukozy z 4 mM L-glutamina i pirogronian soduCytiva Life SciencesSH30243.01
EtOH, 100%Decon Laboratories2701
EVOS FL AutoThermoFisher ScientificAMAFD1000
Inkubator sceniczny EVOSThermoFisher ScientificAMC1000
EVOS Uchwyt na naczynia na scenie, płytki wielodołkoweThermoFisher ScientificAMEPVH028
Surowica bydlęcaCorning35-010-CV
Fine point #5 Kleszcze ze stali nierdzewnej (x2)Fine Science Tools11295-10do preparacji
sterylizator kąpiel koralikowaFine Science Tools18000-45
Probówki do mikrocetrifugi, 1,5 mlNożyczki2925
mikropreparacji, prosteRobozRS-5910Rozwarstwienie
NucBlue (Hoechst) Sondy gotowe do użyciana żywo ThermoFisher ScientificR37605
Roztwór streptomycyny penicyliny, 100xCorning30-002-CI
, 2-dołkowaIbidi80209
Mała perforowana łyżka ze stali nierdzewnejFine Science ToolsMC17C
Sprężyna preparcyjna Nożyczki, 4 mmFine Science Tools15018-10
Sterylna 10 cm dyszafka(e)Corning430293
Sterylna płytka 12-dołkowa(e)PR1MA667512
Sterylna płytka(a) 6-dołkowa(e)ThermoFisher Scientific140675
Sterylna PBSCorning21-031-CV
Sterylna plastikowa pipetado przenoszenia bańkiThermoFisher Scientific202-1S
Trypsyna, 0,25%ThermoFisher Scientific25200056
płodu Narzędzie ze stali nierdzewnej Avant do wkładka silikonowa

Bibliografia

  1. Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
  2. Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374 (9703), 1773-1785 (2009).
  3. Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and molecular mechanisms of palatogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 115, 59-84 (2015).
  4. Li, C., Lan, Y., Jiang, R. Molecular and cellular mechanisms of palate development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1184-1191 (2017).
  5. Gritli-Linde, A. The etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Current Topics in Developmental Biology. 84, 37(2008).
  6. Meng, L., Bian, Z., Torensma, R., Vonden Hoff, J. W. Biological mechanisms in palatogenesis and cleft palate. Journal of Dental Research. 88 (1), 22-33 (2009).
  7. Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature Reviews Genetics. 12 (3), 167-178 (2011).
  8. Kousa, Y. A., Schutte, B. C. Toward an orofacial gene regulatory network. Developmental Dynamics. 245 (3), 220-232 (2016).
  9. Jin, J. Z., et al. Mesenchymal cell remodeling during mouse secondary palate reorientation. Developmental Dynamics. 239 (7), 2110-2117 (2010).
  10. Yu, K., Ornitz, D. M. Histomorphological study of palatal shelf elevation during murine secondary palate formation. Developmental Dynamics. 240 (7), 1737-1744 (2011).
  11. Chiquet, M., Blumer, S., Angelini, M., Mitsiadis, T. A., Katsaros, C. Mesenchymal remodeling during palatal shelf elevation revealed by extracellular matrix and F-actin expression patterns. Frontiers in Physiology. 7, 392(2016).
  12. Paul, B. J., et al. ARHGAP29 mutation is associated with abnormal oral epithelial adhesions. Journal of Dental Research. 96 (11), 1298-1305 (2017).
  13. Hall, E. G., et al. SPECC1L regulates palate development downstream of IRF6. Human Molecular Genetics. 29 (5), 845-858 (2020).
  14. Walker, B. E., Fraser, F. C. Closure of the secondary palate in three strains of mice. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 4 (2), 176-189 (1956).
  15. Jin, J. Z., Li, Q., Higashi, Y., Darling, D. S., Ding, J. Analysis of Zfhx1a mutant mice reveals palatal shelf contact-independent medial edge epithelial differentiation during palate fusion. Cell Tissue Research. 333 (1), 29-38 (2008).
  16. Kouskoura, T., et al. The etiology of cleft palate formation in BMP7-deficient mice. PLoS One. 8 (3), 59463(2013).
  17. Lan, Y., Zhang, N., Liu, H., Xu, J., Jiang, R. Golgb1 regulates protein glycosylation and is crucial for mammalian palate development. Development. 143 (13), 2344-2355 (2016).
  18. He, F., et al. Wnt5a regulates directional cell migration and cell proliferation via Ror2-mediated noncanonical pathway in mammalian palate development. Development. 135 (23), 3871-3879 (2008).
  19. Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
  20. Yonemitsu, M. A., Lin, T. Y., Yu, K. Hyaluronic acid is required for palatal shelf movement and its interaction with the tongue during palatal shelf elevation. Developmental Biology. 457 (1), 57-68 (2020).
  21. Goering, J. P., et al. SPECC1L-deficient palate mesenchyme cells show speed and directionality defect. Scientific Reports. 11 (1), 1452(2021).
  22. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes and Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
  23. Vasudevan, H. N., Soriano, P. SRF regulates craniofacial development through selective recruitment of MRTF cofactors by PDGF signaling. Developmental Cell. 31 (3), 332-344 (2014).
  24. Vasudevan, H. N., Mazot, P., He, F., Soriano, P. Receptor tyrosine kinases modulate distinct transcriptional programs by differential usage of intracellular pathways. Elife. 4, 07186(2015).
  25. Gao, L., et al. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin and TGFbeta3-mediated mouse embryonic palatal mesenchymal cells. Dose Response. 17 (1), 1559325818786822(2019).
  26. Iyyanar, P. P. R., Nazarali, A. J. Hoxa2 inhibits bone morphogenetic protein signaling during osteogenic differentiation of the palatal mesenchyme. Frontiers in Physiology. 8, 929(2017).
  27. Jiang, Z., Pan, L., Chen, X., Chen, Z., Xu, D. Wnt6 influences the viability of mouse embryonic palatal mesenchymal cells via the beta-catenin pathway. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (6), 5339-5344 (2017).
  28. Liu, X., et al. Negative interplay of retinoic acid and TGF-beta signaling mediated by TG-interacting factor to modulate mouse embryonic palate mesenchymal-cell proliferation. Birth Defects Research Part B: Developmental and Reproductive Toxicology. 101 (6), 403-409 (2014).
  29. Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
  30. Mo, J., Long, R., Fantauzzo, K. A. Pdgfra and Pdgfrb genetically interact in the murine neural crest cell lineage to regulate migration and proliferation. Frontiers in Physiology. 11, 588901(2020).
  31. He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851(2013).
  32. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078(2017).
  33. Wu, K., Gauthier, D., Levine, M. D. Live cell image segmentation. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 42 (1), 1-12 (1995).
  34. Neufeld, Z., et al. The role of Allee effect in modelling post resection recurrence of glioblastoma. PLoS Computational Biology. 13 (11), 1005818(2017).
  35. Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis. Annals of Biomedical Engineering. 33 (6), 854-865 (2005).
  36. Czirok, A., et al. Optical-flow based non-invasive analysis of cardiomyocyte contractility. Scientific Reports. 7 (1), 10404(2017).
  37. Biggs, L. C., et al. Interferon regulatory factor 6 regulates keratinocyte migration. Journal of Cell Science. 127, Pt 13 2840-2848 (2014).
  38. Czirok, A., Varga, K., Mehes, E., Szabo, A. Collective cell streams in epithelial monolayers depend on cell adhesion. New Journal of Physics. 15, 75006(2013).
  39. Szabo, A., et al. Collective cell motion in endothelial monolayers. Physical Biology. 7 (4), 046007(2010).
  40. Gulyas, M., Csiszer, M., Mehes, E., Czirok, A. Software tools for cell culture-related 3D printed structures. PLoS One. 13 (9), 0203203(2018).
  41. Soderholm, J., Heald, R. Scratch n' screen for inhibitors of cell migration. Chemistry & Biology. 12 (3), 263-265 (2005).
  42. Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 59-65 (2012).
  43. Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry Part A. 93 (3), 357-370 (2018).
  44. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PDGFRbeta regulates craniofacial development through homodimers and functional heterodimers with PDGFRalpha. Genes & Development. 30 (21), 2443-2458 (2016).
  45. Rafi, S. K., et al. Anti-epileptic drug topiramate upregulates TGFβ1 and SOX9 expression in primary embryonic palatal mesenchyme cells: Implications for teratogenicity. PLoS ONE. , In Press (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zbiorowy ruch kom rekuniesienie p ek podniebiennychsekcja embrionu myszytest migracji kom rektest gojenia ranprzebudowa mezenchymalnarozw j kraniofacjalnyanaliza motywno ci kom rek

Powiązane artykuły