Artykuł metodologiczny

Izolacja i obrazowanie poklatkowe pierwotnych embrionalnych komórek mezenchymy podniebiennej myszy w celu analizy zbiorowych atrybutów ruchowych

DOI:

10.3791/62151

⸱

13 lutego 2021

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Kansas Medical Center, 2Department of Biological Physics, Eotvos University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy protokół izolacji i hodowli pierwotnych embrionalnych komórek mezenchymalnych podniebienia myszy do obrazowania poklatkowego dwuwymiarowego (2D) wzrostu i gojenia ran. Udostępniamy również metodologię analizy danych z obrazowania poklatkowego w celu określenia powstawania strumienia komórkowego i ruchliwości kierunkowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój podniebienia to dynamiczny proces, który obejmuje pionowy wzrost obustronnych półek podniebiennych obok języka, a następnie wyniesienie i fuzję ponad językiem. Wady tego procesu prowadzą do rozszczepu podniebienia, powszechnej wady wrodzonej. Ostatnie badania wykazały, że uniesienie półki podniebiennej obejmuje proces przebudowy, który zmienia orientację półki z pionowej na poziomą. Rola komórek mezenchymalnych szelfu podniebiennego w tej dynamicznej przebudowie była trudna do zbadania. Analiza ilościowa oparta na obrazowaniu poklatkowym została ostatnio wykorzystana do wykazania, że pierwotne embrionalne komórki mezenchymalne podniebienia myszy (MEPM) mogą samoorganizować się w ruch zbiorowy. Analizy ilościowe pozwoliły zidentyfikować różnice w zmutowanych komórkach MEPM w porównaniu z modelem mysim z wadami uniesienia podniebienia. W artykule opisano metody izolacji i hodowli komórek MEPM z zarodków E13.5 - w szczególności do obrazowania poklatkowego - oraz określenia różnych atrybutów komórkowych ruchu zbiorowego, w tym pomiarów tworzenia strumieni, wyrównania kształtu i trwałości kierunku. Zakłada ona, że komórki MEPM mogą służyć jako model zastępczy do badania roli mezenchymy szelfu podniebiennego podczas dynamicznego procesu podnoszenia. Te metody ilościowe pozwolą badaczom zajmującym się twarzoczaszką ocenić i porównać zbiorowe atrybuty ruchowe w komórkach kontrolnych i zmutowanych, co poszerzy wiedzę na temat przebudowy mezenchymalnej podczas podnoszenia półki podniebiennej. Co więcej, komórki MEPM stanowią rzadki mezenchymalny model komórkowy do badania zbiorowych ruchów komórek w ogóle.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój podniebienia był intensywnie badany, ponieważ defekty w palatogenezie prowadzą do rozszczepu podniebienia - powszechnej wady wrodzonej, która występuje w pojedynczych przypadkach lub jako część setek zespołów1,2. Rozwój podniebienia embrionalnego jest procesem dynamicznym, który obejmuje ruch i fuzję tkanki embrionalnej. Proces ten można podzielić na cztery główne etapy: 1) indukcja półek podniebiennych, 2) pionowy wzrost półek podniebiennych obok języka, 3) podniesienie półek podniebiennych powyżej języka oraz 4) fuzja półek podniebiennych w linii środkowej1,3,4. W ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat zidentyfikowano wiele mutantów myszy, które manifestują rozszczep podniebienia5,6,7,8. Charakterystyka tych modeli wykazała defekty w etapach indukcji, proliferacji i fuzji szelfu podniebiennego; Wady elewacji półki podniebiennej były jednak rzadkie. Tak więc zrozumienie dynamiki podnoszenia się szelfu podniebiennego jest intrygującym obszarem badań.

Dokładna analiza niektórych mutantów myszy z wadami wysokości półki podniebiennej doprowadziła do obecnego modelu pokazującego, że bardzo przedni obszar półki podniebiennej wydaje się przechylać do góry, podczas gdy ruch pionowy do poziomego lub "przebudowa" półek podniebiennych występuje w środkowych i tylnych obszarach podniebienia1, 3,4,9,10,11. Nabłonek krawędzi przyśrodkowej półki podniebiennej prawdopodobnie inicjuje sygnalizację wymaganą do tej przebudowy, która jest następnie napędzana przez mezenchymę szelfu podniebiennego. Ostatnio wielu badaczy zidentyfikowało opóźnienie uniesienia półki podniebiennej w modelach mysich, które wykazały przejściowe zrosty jamy ustnej obejmujące półki podniebienne12,13. Remodeling mezenchymalny polega na reorganizacji komórek w celu utworzenia wybrzuszenia w kierunku poziomym, przy jednoczesnym cofnięciu półki podniebiennej w kierunku pionowym9,10,14. Wśród kilku proponowanych mechanizmów wpływających na uniesienie półki podniebiennej i leżącą u podstaw przebudowę mezenchymalną są: proliferacja komórek15,16,17, gradienty chemotaktyczne18 i komponenty macierzy zewnątrzkomórkowej19,20. Pojawiło się ważne pytanie: czy opóźnienie podniesienia półki podniebiennej obserwowane u myszy z niedoborem Specc1l jest również częściowo spowodowane defektem w przebudowie półki podniebiennej i czy ten defekt przebudowy może przejawiać się w wewnętrznej defektywności w zachowaniu pierwotnych komórek MEPM21?

Pierwotne komórki MEPM były używane w polu twarzoczaszki do wielu badań związanych z ekspresją genów22,23,24,25,26,27,28,29, oraz kilka związanych z rozprzestrzenianiem30,31 i migration25,31,32, ale brak do zbiorczej analizy zachowania komórek. Obrazowanie poklatkowe komórek MEPM przeprowadzono w hodowli 2D i testach gojenia ran, aby pokazać, że komórki MEPM wykazywały ruch kierunkowy i tworzyły strumienie komórkowe zależne od gęstości - atrybuty ruchu zbiorowego21. Co więcej, zmutowane komórki Specc1l tworzyły węższe strumienie komórkowe i wykazywały bardzo zmienne trajektorie migracji komórek. Uważa się, że ten brak skoordynowanej ruchliwości przyczynia się do opóźnienia uniesienia podniebienia u zmutowanych zarodków Specc1l13,21. Tak więc te stosunkowo proste testy wykorzystujące pierwotne komórki MEPM mogą służyć jako proxy do badania przebudowy mezenchymalnej podczas podnoszenia półki podniebiennej. W artykule opisano izolację i hodowlę pierwotnych komórek MEPM, a także obrazowanie i analizę poklatkową w testach 2D i gojeniu ran

.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Instytucjonalnych KUMC, zgodnie z ich wytycznymi i przepisami (Numer protokołu: 2018-2447).

1. Zbieranie zarodków E13.5

  1. Poddać eutanazji ciężarne samice myszy za pomocą komory inhalacyjnej CO2 lub zgodnie z procedurą zatwierdzoną przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt. Natychmiast przystąp do sekcji.
  2. Odsłoń dolną połowę jamy brzusznej, usuwając skórę i otrzewną. Wyciąć oba rogi macicy, które zawierają zarodki E13,5.
  3. Na krótko umieść macicę w podgrzanym sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) o temperaturze 37 °C, aby spłukać nadmiar krwi, włosów lub innych zanieczyszczeń. Umieść macicę w sterylnym naczyniu o średnicy 10 cm wypełnionym sterylnym PBS.
  4. Za pomocą małych nożyczek przetnij ścianę macicy wzdłuż macicy, aby odsłonić każdy zarodek, wciąż w woreczku żółtkowym. Usuń woreczek żółtkowy otaczający zarodek, ale w razie potrzeby zachowaj go do genotypowania. Po usunięciu zarodków umieść każdy zarodek w osobnym dołku na 12-dołkowej płytce wypełnionej PBS.

2. Sekcja półek podniebiennych z zarodków (Rysunek 1)

UWAGA: Wysterylizuj narzędzia do preparowania ze stali nierdzewnej (zobacz Tabelę Materiałów) po przetworzeniu każdego zarodka, umieszczając narzędzia najpierw w zlewce ze 100% alkoholem etylowym (EtOH), następnie w sterylizatorze narzędzi w temperaturze 350 °C przez 10 s, a następnie schładzając je w drugiej zlewce ze 100% EtOH.

  1. Za pomocą wysterylizowanej łyżki perforowanej umieść zarodek w nowym 10-centymetrowym naczyniu wypełnionym pożywką hodowlaną MEPM składającą się z minimalnej niezbędnej pożywki (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), L-glutaminy (4 mM L-Glu) oraz antybiotyków - penicyliny i streptomycyny (50 jednostek/ml).
  2. Odetnij zarodek tuż poniżej linii żuchwy za pomocą sterylnych nożyczek (Ryc. 1A, czerwona przerywana linia). Usuń dolną szczękę, wkładając jeden punkt wysterylizowanych cienkich kleszczy #5 do ust, trzymając go tuż wewnątrz policzka. Przepchnij czubek włożonych kleszczyków, aż wyjdzie z tyłu czaszki.
  3. Ustaw kleszcze wzdłuż żółtej linii w Rysunek 1B, tak aby druga strona kleszczy (która nadal znajduje się na zewnątrz zarodka) unosiła się tuż nad kanałem słuchowym, a następnie ściśnij kleszcze, aby przeciąć tkankę. Jeśli to konieczne, przesuń kolejne cienkie kleszcze wzdłuż szwu teraz zamkniętych kleszczy, aby przeciąć każdą tkankę, która nie została całkowicie odcięta przez szczypanie.
  4. Powtórz poprzedni krok dla drugiej strony główki zarodka. Kontynuuj procedurę szczypania, aby całkowicie usunąć dolną szczękę, język i dolną część czaszki oraz odsłonić półki podniebienne.
  5. Usuń czaszkę czaszki, przecinając ją tuż nad oczami, jak pokazano na Rysunek 1C (zielona linia). Zrób to, umieszczając głowę po lewej lub prawej stronie i ustawiając czubki małych nożyczek ze stali nierdzewnej przed i za czaszką tuż nad poziomem oczu zarodka. Odetnij górną część czaszki jednym szybkim cięciem nożyczek, tworząc płaską powierzchnię, która będzie ważna dla stabilności w późniejszych krokach i która powinna wyglądać jak Rysunek 1D, gdy patrzy się na nią z boku.
  6. Pozostałą część głowy połóż do góry nogami, tak aby górna część głowy (usunięta czaszka) spoczywała płasko na dnie naczynia, co zapewni stabilną powierzchnię do wyjmowania półki podniebiennej. Poświęć chwilę, aby zidentyfikować półki podniebienne, które są teraz odsłonięte i skierowane do góry i pojawią się jako dwa wypukłe grzbiety po obu stronach centralnego rowka w przedniej połowie głowy (Ryc. 1E).
  7. Przypnij pozostałą część głowy do naczynia, aby ją unieruchomić na czas wyjmowania półek. Zrób to, wkładając jeden punkt cienkich kleszczy przez tkankę w pobliżu nosowej okolicy głowy, przed półkami podniebiennymi, a drugi punkt kleszczy przez podstawę czaszki, za półkami podniebiennymi. Przytrzymaj je na miejscu podczas wykonywania wycinania półek podniebiennych.
    1. Unieruchamiając głowę jedną ręką, wybierz jedną z dwóch półek do usunięcia jako pierwszą, a następnie włóż oba punkty drugiej pary cienkich kleszczyków w tkankę u podstawy bocznej powierzchni półki i uszczypnij, aby przeciąć tkankę (Rysunek 1F). Powtórz to wzdłuż podstawy przyśrodkowej powierzchni półki, a następnie zarówno na przednim, jak i tylnym końcu półki, aby odłączyć się od głowy.
  8. Delikatnie podnieś półkę, w razie potrzeby wykonując dodatkowe szczypanie, aby całkowicie uwolnić półkę od otaczającej tkanki.
  9. Powtórz poprzednie dwa kroki, aby usunąć drugą półkę podniebienną.
  10. Po uwolnieniu półek podniebiennych z otaczającej tkanki i umieszczeniu ich w PBS (ryc. G), użyj sterylnej plastikowej pipety do przenoszenia gruszki, aby wyciągnąć półki w pipecie i przenieś je do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml wraz z około 500 μl PBS. Probówki zawierające półki podniebienne należy trzymać na lodzie, ponieważ reszta ściółki jest przetwarzana w ten sam sposób.
    UWAGA: Alternatywnie, półki można umieścić w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej podgrzaną trypsynę (0,25%) natychmiast po rozbiorze (zamiast umieszczać je na lodzie). Próbki będą świeższe, ale należy zadbać o to, aby wszystkie kroki postępowania były mierzone w czasie dla każdej pojedynczej próbki, a nie traktowane razem.

3. Hodowla komórek MEPM

UWAGA: W opisanych tutaj warunkach, komórki nabłonkowe podniebienia nie przeżywają pierwszego przejścia, co skutkuje hodowlą komórek mezenchymalnych czystego podniebienia. Użyj sterylnej techniki, aby wykonać wszystkie kroki w kapturze do hodowli tkankowej.

  1. Odessać i wyrzucić PBS z probówki o pojemności 1,5 ml, uważając, aby nie wyrzucić półek w tym procesie. Natychmiast dodaj 200 μl wstępnie podgrzanej (37 °C) trypsyny (0,25%) do każdej probówki zawierającej półki podniebienne. Krótko pipetuj półki w górę i w dół trypsyny za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1000 μl, aby przyspieszyć trypsynizację.
  2. Inkubować probówki przez 5 minut w temperaturze 37 °C, a następnie ponownie pipetować każdą próbkę w górę i w dół, aby pomóc w rozdrobnieniu tkanki. Inkubować probówki przez kolejne 5 minut w temperaturze 37 °C i ponownie pipetować w górę i w dół, aby zakończyć dysocjację tkanki.
    UWAGA: Półki muszą być całkowicie lub prawie całkowicie oddzielone i zawieszone w trypsynie bez widocznych kawałków tkanki.
  3. Dodać 800 μl pożywki hodowlanej MEPM (krok 2.1) do każdej probówki o pojemności 1,5 ml. Odwirować probówkę o pojemności 1,5 ml o masie 200 × g przez 5 minut, aby osadzać komórki. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki hodowlanej MEPM.
  4. Umieść komórki MEPM na 6-dołkowej płytce poddanej działaniu kultur tkankowych zawierającej pożywkę hodowlaną MEPM. Pozostawić komórki do przylegania do powierzchni z tworzywa sztucznego przez 12 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2,
    UWAGA: Po całonocnej inkubacji zdecydowana większość (~90%) komórek się przyłączy. W tym momencie przylegające komórki będą wyglądać na dość jednorodne, o trójkątnym lub lekko wydłużonym kształcie.
  5. Zmieniaj pożywkę codziennie, delikatnie zasysając starą pożywkę i natychmiast zastępując ją 1 ml ciepłego sterylnego PBS bez wapnia i magnezu na ~1 min. Odessać PBS i zastąpić 3 ml wstępnie podgrzanej pożywki MEPM.
  6. Przejdź przez komórki, gdy staną się w 100% zlewne.
    UWAGA: Komórki MEPM powinny się namnażać, podwajając swoją liczbę prawie codziennie.
    1. Aby przejść przez komórki, delikatnie odessaj starą pożywkę i natychmiast zastąp ją ciepłym PBS bez wapnia i magnezu na ~1 min. Odessaj PBS i zastąp go 0,5 ml podgrzanej 0,25% trypsyny.
    2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez ~5 minut lub do momentu, gdy komórki oderwą się od powierzchni naczynia po delikatnym kołysaniu w przód i w tył ręką. Po odłączeniu komórek natychmiast dodaj 5 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej MEPM do trypsynizowanych komórek.
    3. Używając pipety serologicznej o pojemności 10 ml, delikatnie zebrać komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować probówkę o stężeniu 200 × g przez 5 minut, aby granulować komórki. Odessać trypsynę i pożywkę, a następnie ponownie zawiesić komórki w 3 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej MEPM. Delikatnie odpipetować 1 ml komórek do pojedynczego dołka 6-dołkowego naczynia i dodać 2 ml pożywki hodowlanej MEPM, aby uzyskać całkowitą objętość do 3 ml.
      UWAGA: Jest to podział komórek w stosunku 1:3. Posłowie do PEMP mogą zostać przegłosowani maksymalnie trzy razy. Gęstość wysiewu MEPM jest nieco elastyczna, a liczba obecnych komórek różni się w zależności od naczynia hodowlanego. Jednak MEPM nie rozmnażają się prawidłowo, gdy są zbyt rzadko rozdrobnione i powinny być co najmniej 20-25% zlewające się z nowym daniem, gdy przylegają.

4. Kriokonserwacja komórek MEPM

  1. Po granulowaniu trypsynizowanych komórek MEPM ponownie zawieś je w pożywce hodowlanej MEPM, aby uzyskać stężenie ~ 1 × 106 komórek/ml. Odpipetować komórki do kriowiali i dodać końcowe stężenie 5% dimetylosulfotlenku do zapasu komórek. Zakręć kriowial, krótko wymieszaj przez odwrócenie i natychmiast umieść fiolki w pojemniku do zamrażania, który ochładza się z prędkością 1 °C/min.
  2. Umieść chłodziarkę w zamrażarce o temperaturze -80 °C na noc. Następnego dnia przenieś kriowiale do zbiornika z ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania.
  3. Rozmrażanie kriokonserwowanych komórek MEPM
    1. Wyjmij kriowiale ze zbiornika ciekłego azotu i rozmrażaj w temperaturze pokojowej, aż zawartość zacznie stawać się płynna. Opróżnij zawartość do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 9 ml wstępnie podgrzanej pożywki MEPM.
    2. Odwirować probówkę o masie 200 × g, aby rozpuść komórki. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki hodowlanej MEPM i odpipetować komórki do pojedynczego dołka na płytce 6-dołkowej. Dodać 2 ml ciepłej pożywki hodowlanej MEPM, aby uzyskać całkowitą objętość do 3 ml.
    3. Hodować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 . Zmieniaj medium codziennie.

5. Obrazowanie na żywo komórek MEPM - test migracji zbiorowej 2D (Rysunek 2)

  1. Przygotuj płytkę do użycia do obrazowania na żywo.
    1. Użyj małych nożyczek chirurgicznych lub ostrego skalpela, aby skrócić sterylną 2-dołkową wkładkę silikonową do wysokości ~1 mm. Przygotuj wkładkę dla każdej używanej próbki.
    2. Za pomocą kleszczy umieść skróconą 2-dołkową wkładkę silikonową na środku dołka płytki 6-dołkowej. Dociśnij wzdłuż wszystkich krawędzi, aby upewnić się, że jest całkowicie przylegający.
  2. Rozmrozić komórki kriokonserwowane, wykonując czynności opisane w sekcji 4.3 niniejszego protokołu. Policz komórki MEPM i zasiej 300 komórek/mm2 skróconych wkładek silikonowych w całkowitej objętości 40-50 μl pożywki hodowlanej MEPM na basenik. Hodować komórki przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 .
  3. Następnego dnia przygotuj się do obrazowania poklatkowego na żywo.
    1. Użyj mikroskopu z kontrastem fazowym z inkubatorem na stoliku i funkcją automatycznego obrazowania. Dodać wodę do zbiornika inkubatora na etapie hodowli, aby zmniejszyć parowanie pożywki hodowlanej; ustawić temperaturę na 37 °C i CO2 do 5%. Odczekaj ~30 minut, aż wilgotność się nagromadzi przed umieszczeniem 6-dołkowej płytki w inkubatorze na etapie.
  4. Użyj ustawień równoważnych poniższym dla obrazowania poklatkowego.
    1. Wybierz obiektyw 4x, aby mieć duże pola widzenia i filtr kontrastu fazowego.
      UWAGA: Autofokus, automatyczne wyszukiwanie próbki, stos z i automatyczne oświetlenie zwykle nie są konieczne.
    2. Wybierz dwa mikroskopijne pola na studzienkę, aby uchwycić światło skróconych wkładek silikonowych. Upewnij się, że wszystkie pozycje obrazowania mają prawidłową ostrość.
      UWAGA: Płaszczyzny obrazu można regulować podczas obrazowania, ale taka regulacja zwykle nie jest konieczna.
    3. Wybierz żądany typ pliku wyjściowego obrazu, a następnie zaznacz lub odznacz opcje po obrazowaniu, takie jak automatyczne tworzenie wideo i znaki wodne, zgodnie z potrzebami. W razie potrzeby wybierz kontrast fazowy jako tryb obrazowania.
      UWAGA: Używanie znaków wodnych może utrudniać kolejne etapy przetwarzania obrazu.
    4. Ustaw czas trwania nagrania na 72 godziny. Ustaw program tak, aby robił zdjęcia co 10 minut
      UWAGA: Zwykle wymagane jest tylko 48 godzin obrazowania, ale obrazowanie można zatrzymać w dowolnym momencie przed upływem 72 godzin bez utraty już zrobionych zdjęć.
    5. Upewnij się, że komora środowiskowa jest sprawna zgodnie z wymaganiami ppkt 5.3.1. Zapisz te ustawienia (procedurę) i rozpocznij obrazowanie.
  5. Kontynuuj obrazowanie do 72 godzin (lub określonego czasu).

6. Obrazowanie na żywo komórek MEPM w teście gojenia ran (Rysunek 3)

  1. Przygotuj płytkę do użycia do obrazowania na żywo. Za pomocą kleszczy umieść sterylną 2-dołkową wkładkę silikonową na środku dołka 6-dołkowej płytki i dociśnij wzdłuż wszystkich krawędzi, aby upewnić się, że jest w pełni przylegająca. Przygotuj jedną wkładkę 2-dołkową dla każdej używanej próbki.
  2. Rozmrozić komórki kriokonserwowane, wykonując czynności opisane w sekcji 4.3 niniejszego protokołu. Policz komórki MEPM i jeśli to konieczne, skoncentruj komórki do co najmniej 350 komórek/μl.
  3. Wysiewać 1400 komórek/mm2 do wkładek silikonowych w objętości 100 μl pożywki hodowlanej MEPM na studzienkę. Hodować komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 i codziennie zmieniać pożywkę.
  4. Po 48 godzinach przygotować mikroskop do obrazowania poklatkowego na żywo zgodnie z opisem w punktach 5.3 i 5.4. Bezpośrednio przed umieszczeniem komórek w inkubatorze na etapie należy dodać 3 ml podgrzanej pożywki hodowlanej MEPM do dołka (ale poza wkładkami), a następnie ostrożnie usunąć wkładki silikonowe.
    UWAGA: Ściana oddzielająca 2 komory pozostawia szczelinę, która jest "raną".
  5. Rozpocznij obrazowanie poklatkowe zgodnie z opisem w 5.4, z następującymi różnicami:
    1. Użyj obiektywu o większym powiększeniu (np. 10x). Aby uchwycić zamknięcie rany, wybierz 5 pól widzenia wzdłuż każdej rany, tak aby rana była równoległa do pionowej osi obrazu.
  6. Obrazowanie należy przerwać po 72 godzinach lub gdy rany całkowicie się zamknęły.

7. Analiza obliczeniowa sekwencji obrazów poklatkowych

UWAGA: Wykonaj następujące procedury na komputerze wyposażonym w standardowe narzędzia obliczeniowe, takie jak interpreter Pythona, kompilator C i powłoka (zobacz Spis Materiałów).

  1. Analiza konfluencji
    UWAGA: Ta procedura może być wykorzystana do oszacowania proliferacji komórek w rzadkiej kulturze lub do ilościowego określenia eksperymentów z zamykaniem ran. Aby wykryć obszary zajmowane przez komórki, do lokalnego odchylenia standardowego jasności obrazu stosuje się próg segmentacji. Kod został opisany wcześniej przez Wu et al.33 oraz Neufeld et al.34 i jest dostępny pod adresem http://github.com/aczirok/cellconfluency.
    1. Określ próg segmentacji obrazów. Na przykład, aby wyświetlić segmentację z progiem 4, wydaj polecenie
      segment.py -i inout-image.jpg -S 4 -test output.jpg
      a następnie sprawdź wyjście (output.jpg).
      UWAGA: Jeśli próg jest zbyt niski, obszary tła na mikrofotografii są klasyfikowane jako pokryte komórkami. Z drugiej strony, jeśli próg jest zbyt wysoki, obszary pokryte komórkami nie są klasyfikowane jako takie. Optymalna wartość progowa ogranicza oba błędy do minimum.
    2. Użyj dostarczonego skryptu area.sh, aby obliczyć wartości konfluencji dla sekwencji obrazów jako
      area.sh -S 4 img_001.jpg img_002.jpg .... > confluency.dat
      UWAGA: Wartość progu dyskryminacji 4 jest weryfikowana w kroku 1, a wyniki są przechowywane w pliku >confluency.dat. Sortując obrazy w odpowiednich folderach, listę nazw plików obrazów można zastąpić notacją wieloznaczną:
      area.sh -S4 *.jpg > confluency.dat
    3. W przypadku eksperymentów z zamykaniem ran przekształć dane o konfluencji A(t) - wielkość obszaru pokrytego komórką wyrażoną w procentach w funkcji czasu - w prędkość propagacji krawędzi rany V jako
      figure-protocol-1
      gdzie w oznacza szerokość pola, a dA/dt jest pochodną czasową A(t), tj. szybkością rozszerzania się obszaru pokrytego komórką.
  2. Mapa ruchliwości komórek
    1. Wykonaj algorytm prędkości obrazu cząstek (PIV) w celu scharakteryzowania ruchliwości komórek i wyodrębnienia zakresu lokalnego ruchu "przepływu optycznego" między parami obrazów, ale nie w celu identyfikacji pojedynczych komórek.
      UWAGA: W tym przypadku używany jest początkowy rozmiar okna 50 μm, jak szczegółowo opisano przez Zamir et al.35 i Czirok et al.36, z początkowym rozmiarem okna 50 μm. Analiza PIV daje pole prędkości v(x,t) dla każdej klatki obrazu t i lokalizacji (w obrazie) x.
    2. Wyodrębnić średnią prędkość ruchliwości komórek z v(x,t) jako średnią przestrzenną obliczoną dla obszaru zajmowanego przez komórkę, jak określono w sekcji 7.1.
  3. Ręczne śledzenie komórek
    UWAGA: Podczas gdy analiza PIV zapewnia automatyczną ocenę ruchliwości komórek, skupienie się na zachowaniu poszczególnych komórek często wymaga ręcznego śledzenia. Chociaż kilka narzędzi zapewnia tę funkcjonalność, jest to bardzo pomocne, jeśli ręcznie ustawione znaczniki można modyfikować po ich początkowym umieszczeniu i jeśli śledzenie można wykonywać zarówno do przodu, jak i do tyłu w czasie.
    1. Wykonuj śledzenie komórek za pomocą specjalnie opracowanego narzędzia Python (http://github.com/donnagreta/cm_track), które zapewnia również podstawowe funkcje edytora, takie jak usuwanie segmentów trajektorii.
      UWAGA: To ręczne narzędzie do śledzenia zwraca pozycje P(i,t) komórki i w czasie t w pliku tekstowym i wywoływane jako
      cm_track.py -i obrazy/ -o track.dat
      gdzie zdjęcia poklatkowe znajdują się w folderze images/, a dane o pozycji są zbierane w pliku track.dat (Rysunek 4).

figure-protocol-2
Rysunek 4: Analiza trajektorii poszczególnych komórek. (A) Mikrofotografie poklatkowe z kontrastem fazowym są poddawane (B, C) ręcznej procedurze śledzenia, która oznacza komórki (zielone kropki). (D) Pozycje komórek (x,y) są przechowywane dla każdej komórki wyróżnionej jej identyfikatorem i dla każdej klatki f. (E) Trajektorie mogą być nałożone na mikrofotografie i oznaczone kolorami w celu wskazania informacji czasowych. Na przykład w każdej trajektorii paleta kolorów od niebieskiego do czerwonego wskazuje stopniowo późniejsze segmenty trajektorii, przy czym kolor czerwony i niebieski oznaczają odpowiednio początkową i końcową lokalizację komórek. (F) Różne właściwości statystyczne trajektorii, takie jak średnie przemieszczenie kwadratowe, można wyodrębnić i wykorzystać do scharakteryzowania ruchliwości różnych populacji komórek, które w tym przykładzie obejmują komórki MEPM typu dzikiego (wt, niebieski) i knockdown (kd, red). Podziałki liniowe reprezentują 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Nakładaj trajektorie na obrazy za pomocą drugiego narzędzia, wywoływanego jako
    visdat.py -d track.dat -i obrazy/ -o nakładka/ -l999 -r3 -C2
  2. Zbierz obrazy z trajektoriami nałożonymi w folderze overlay.
    UWAGA: W tym przykładzie dane o położeniu komórki są przechowywane w pliku track.dat, podczas gdy sekwencja obrazów poklatkowych znajduje się w obrazach folderu. Pozostałe parametry kontrolują maksymalną długość rysowanych trajektorii (-l), rozmiar symboli (-r) oraz użyty schemat kolorów (-C).
  1. Analiza trajektorii poszczególnych komórek
    1. Scharakteryzuj trajektorie według całkowitej długości ścieżki
      figure-protocol-3,
      i przemieszczenie netto w kierunku rany
      figure-protocol-4,
      gdzie X oznacza rzut P w kierunku prostopadłym do rany: współrzędna x położeń, gdy rana jest równoległa do osi y.
    2. Oblicz skuteczność prowadzenia jako figure-protocol-5 dla każdej komórki i i punktu czasowego t37. Scharakteryzuj kultury na podstawie średniej populacji tych miar jednokomórkowych, ocenianych w odpowiednim punkcie czasowym t.
  2. Zbiorczy ruch strumieniowy komórek
    1. Scharakteryzuj lokalne korelacje przestrzenne ruchów komórek za pomocą średniej prędkości innych komórek, które znajdują się w pobliżu poruszającej się komórki, jak opisano wcześniej38,39.
      UWAGA: Kod obliczeniowy jest dostępny pod adresem https://github.com/aczirok/flowfield.
      1. Dopasuj układ odniesienia z kierunkami do przodu, do tyłu, w lewo i w prawo do każdego wektora v(x,t) (Rysunek 5A). Przypisz każdą z otaczających komórek lub wektorów prędkości PIV do odpowiedniej komórki przestrzennej układu odniesienia (Rysunek 5B). Powtórz procedurę, ponieważ każdy wektor służy jako początek układów odniesienia (Rysunek 5C,D) tak, aby dany wektor prędkości był przypisany do wielu przedziałów.
        UWAGA: Punkt danych może znajdować się przed wektorem i na lewo od innego wektora.
      2. Obróć układy odniesienia do wspólnej orientacji (Rysunek 5C,F) i połącz je (Rysunek 5G).
        UWAGA: Średnia z każdego przedziału zbiorczych danych prędkości jest wektorem prędkości (U), który wskazuje na korelację przestrzenną: średnia jest miarą wspólnej składowej prędkości (Rysunek 5H).
      3. Dopasuj pola przepływu U(x) do funkcji wykładniczej figure-protocol-6, gdzie a, x0 i U0 są parametrami pasującymi. Spośród trzech parametrów dopasowania skup się na x0, długości korelacji (Rysunek 5I, J), która jest charakterystyczną odległością, na której znikają lokalne korelacje prędkość-prędkość.

figure-protocol-7
Rysunek 5: Charakterystyka tworzenia strumienia przez hodowane komórki. (A,D) Obrazy poklatkowe z kontrastem fazowym z Rysunek 4A służy do identyfikacji ruchów komórek. Dla każdej przenoszonej komórki układ odniesienia (niebieski) i pojemniki przestrzenne (białe) zostały wyrównane w celu skategoryzowania sąsiednich komórek jako znajdujących się z przodu, z tyłu, po lewej lub po prawej stronie. (B,E) Prędkość sąsiednich komórek (czarnych wektorów) była związana z tym samym układem odniesienia (C,F). Procedurę tę powtórzono dla każdej komórki i punktu czasowego. (G) Po zebraniu tych lokalnych informacji, każdy pojemnik będzie zawierał wiele wektorów prędkości (szary), które można uśrednić w celu określenia średniej prędkości współruchu (karmazynowe strzałki) w różnych miejscach względem średniej ruchliwej komórki. (H) Mapa średnich prędkości charakteryzuje zatem typowe prędkości komórek w różnych miejscach względem poruszającej się komórki. (I,J) Na koniec pole to pobrano wzdłuż osi przód-tył (równoległej), a także wzdłuż osi lewo-prawo (prostopadłej). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sekcja półek podniebiennych jest zilustrowana w Rysunek 1. Sekwencja nacięć ma na celu zminimalizowanie poślizgu tkanki. Po zdjęciu głowy (Rysunek 1A,B), dolna szczęka jest usuwana (Rysunek 1B,C). Nacięcie górnej części głowy (Rysunek 1C,D) ma na celu ustabilizowanie tkanki po umieszczeniu do góry nogami (Rycina 1E) w celu wizualizacji (Rysune...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elewacja szelfu podniebiennego stanowi przebudowę pionowo-poziomą 1,3,4,9,11. Postuluje się, że ten proces przebudowy wymaga, aby komórki mezenchymalne szelfu podniebienia zachowywały się koordynacyjnie. Analizy z komórkami MEPM typu dzikiego pokazują, że to zachowanie komórek jest wewnętrzne i można je określić ilościowo21. W związku z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten projekt był częściowo wspierany przez granty National Institutes of Health DE026172 (I.S.) i GM102801 (A.C.). I.S. był również częściowo wspierany przez grant Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) (National Institute of General Medical Sciences P20 GM104936), grant Kansas IDeA Network for Biomedical Research Excellence (National Institute of General Medical Sciences P20 GM103418), oraz grant Centrum Badań nad Niepełnosprawnością Intelektualną i Rozwojową w Kansas (KIDDRC) (U54 Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, HD090216).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zlewka, 250 ml (x2)Fisher ScientificFB-100-250
CO2Matheson GasUN1013
Probówki stożkowe, 15 ml (x1)Midwest ScientificC15B
Analizaobliczeniowa obrazów poklatkowych
Zmodyfikowane Orły Dulbecco Średni/Wysoki poziom glukozy z 4 mM L-glutamina i pirogronian soduCytiva Life SciencesSH30243.01
EtOH, 100%Decon Laboratories2701
EVOS FL AutoThermoFisher ScientificAMAFD1000
Inkubator sceniczny EVOSThermoFisher ScientificAMC1000
EVOS Uchwyt na naczynia na scenie, płytki wielodołkoweThermoFisher ScientificAMEPVH028
Surowica bydlęcaCorning35-010-CV
Fine point #5 Kleszcze ze stali nierdzewnej (x2)Fine Science Tools11295-10do preparacji
sterylizator kąpiel koralikowaFine Science Tools18000-45
Probówki do mikrocetrifugi, 1,5 mlNożyczki2925
mikropreparacji, prosteRobozRS-5910Rozwarstwienie
NucBlue (Hoechst) Sondy gotowe do użyciana żywo ThermoFisher ScientificR37605
Roztwór streptomycyny penicyliny, 100xCorning30-002-CI
, 2-dołkowaIbidi80209
Mała perforowana łyżka ze stali nierdzewnejFine Science ToolsMC17C
Sprężyna preparcyjna Nożyczki, 4 mmFine Science Tools15018-10
Sterylna 10 cm dyszafka(e)Corning430293
Sterylna płytka 12-dołkowa(e)PR1MA667512
Sterylna płytka(a) 6-dołkowa(e)ThermoFisher Scientific140675
Sterylna PBSCorning21-031-CV
Sterylna plastikowa pipetado przenoszenia bańkiThermoFisher Scientific202-1S
Trypsyna, 0,25%ThermoFisher Scientific25200056
płodu Narzędzie ze stali nierdzewnej Avant do wkładka silikonowa

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
  2. Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374 (9703), 1773-1785 (2009).
  3. Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and molecular mechanisms of palatogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 115, 59-84 (2015).
  4. Li, C., Lan, Y., Jiang, R. Molecular and cellular mechanisms of palate development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1184-1191 (2017).
  5. Gritli-Linde, A. The etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Current Topics in Developmental Biology. 84, 37(2008).
  6. Meng, L., Bian, Z., Torensma, R., Vonden Hoff, J. W. Biological mechanisms in palatogenesis and cleft palate. Journal of Dental Research. 88 (1), 22-33 (2009).
  7. Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature Reviews Genetics. 12 (3), 167-178 (2011).
  8. Kousa, Y. A., Schutte, B. C. Toward an orofacial gene regulatory network. Developmental Dynamics. 245 (3), 220-232 (2016).
  9. Jin, J. Z., et al. Mesenchymal cell remodeling during mouse secondary palate reorientation. Developmental Dynamics. 239 (7), 2110-2117 (2010).
  10. Yu, K., Ornitz, D. M. Histomorphological study of palatal shelf elevation during murine secondary palate formation. Developmental Dynamics. 240 (7), 1737-1744 (2011).
  11. Chiquet, M., Blumer, S., Angelini, M., Mitsiadis, T. A., Katsaros, C. Mesenchymal remodeling during palatal shelf elevation revealed by extracellular matrix and F-actin expression patterns. Frontiers in Physiology. 7, 392(2016).
  12. Paul, B. J., et al. ARHGAP29 mutation is associated with abnormal oral epithelial adhesions. Journal of Dental Research. 96 (11), 1298-1305 (2017).
  13. Hall, E. G., et al. SPECC1L regulates palate development downstream of IRF6. Human Molecular Genetics. 29 (5), 845-858 (2020).
  14. Walker, B. E., Fraser, F. C. Closure of the secondary palate in three strains of mice. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 4 (2), 176-189 (1956).
  15. Jin, J. Z., Li, Q., Higashi, Y., Darling, D. S., Ding, J. Analysis of Zfhx1a mutant mice reveals palatal shelf contact-independent medial edge epithelial differentiation during palate fusion. Cell Tissue Research. 333 (1), 29-38 (2008).
  16. Kouskoura, T., et al. The etiology of cleft palate formation in BMP7-deficient mice. PLoS One. 8 (3), 59463(2013).
  17. Lan, Y., Zhang, N., Liu, H., Xu, J., Jiang, R. Golgb1 regulates protein glycosylation and is crucial for mammalian palate development. Development. 143 (13), 2344-2355 (2016).
  18. He, F., et al. Wnt5a regulates directional cell migration and cell proliferation via Ror2-mediated noncanonical pathway in mammalian palate development. Development. 135 (23), 3871-3879 (2008).
  19. Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
  20. Yonemitsu, M. A., Lin, T. Y., Yu, K. Hyaluronic acid is required for palatal shelf movement and its interaction with the tongue during palatal shelf elevation. Developmental Biology. 457 (1), 57-68 (2020).
  21. Goering, J. P., et al. SPECC1L-deficient palate mesenchyme cells show speed and directionality defect. Scientific Reports. 11 (1), 1452(2021).
  22. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes and Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
  23. Vasudevan, H. N., Soriano, P. SRF regulates craniofacial development through selective recruitment of MRTF cofactors by PDGF signaling. Developmental Cell. 31 (3), 332-344 (2014).
  24. Vasudevan, H. N., Mazot, P., He, F., Soriano, P. Receptor tyrosine kinases modulate distinct transcriptional programs by differential usage of intracellular pathways. Elife. 4, 07186(2015).
  25. Gao, L., et al. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin and TGFbeta3-mediated mouse embryonic palatal mesenchymal cells. Dose Response. 17 (1), 1559325818786822(2019).
  26. Iyyanar, P. P. R., Nazarali, A. J. Hoxa2 inhibits bone morphogenetic protein signaling during osteogenic differentiation of the palatal mesenchyme. Frontiers in Physiology. 8, 929(2017).
  27. Jiang, Z., Pan, L., Chen, X., Chen, Z., Xu, D. Wnt6 influences the viability of mouse embryonic palatal mesenchymal cells via the beta-catenin pathway. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (6), 5339-5344 (2017).
  28. Liu, X., et al. Negative interplay of retinoic acid and TGF-beta signaling mediated by TG-interacting factor to modulate mouse embryonic palate mesenchymal-cell proliferation. Birth Defects Research Part B: Developmental and Reproductive Toxicology. 101 (6), 403-409 (2014).
  29. Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
  30. Mo, J., Long, R., Fantauzzo, K. A. Pdgfra and Pdgfrb genetically interact in the murine neural crest cell lineage to regulate migration and proliferation. Frontiers in Physiology. 11, 588901(2020).
  31. He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851(2013).
  32. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078(2017).
  33. Wu, K., Gauthier, D., Levine, M. D. Live cell image segmentation. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 42 (1), 1-12 (1995).
  34. Neufeld, Z., et al. The role of Allee effect in modelling post resection recurrence of glioblastoma. PLoS Computational Biology. 13 (11), 1005818(2017).
  35. Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis. Annals of Biomedical Engineering. 33 (6), 854-865 (2005).
  36. Czirok, A., et al. Optical-flow based non-invasive analysis of cardiomyocyte contractility. Scientific Reports. 7 (1), 10404(2017).
  37. Biggs, L. C., et al. Interferon regulatory factor 6 regulates keratinocyte migration. Journal of Cell Science. 127, Pt 13 2840-2848 (2014).
  38. Czirok, A., Varga, K., Mehes, E., Szabo, A. Collective cell streams in epithelial monolayers depend on cell adhesion. New Journal of Physics. 15, 75006(2013).
  39. Szabo, A., et al. Collective cell motion in endothelial monolayers. Physical Biology. 7 (4), 046007(2010).
  40. Gulyas, M., Csiszer, M., Mehes, E., Czirok, A. Software tools for cell culture-related 3D printed structures. PLoS One. 13 (9), 0203203(2018).
  41. Soderholm, J., Heald, R. Scratch n' screen for inhibitors of cell migration. Chemistry & Biology. 12 (3), 263-265 (2005).
  42. Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 59-65 (2012).
  43. Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry Part A. 93 (3), 357-370 (2018).
  44. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PDGFRbeta regulates craniofacial development through homodimers and functional heterodimers with PDGFRalpha. Genes & Development. 30 (21), 2443-2458 (2016).
  45. Rafi, S. K., et al. Anti-epileptic drug topiramate upregulates TGFβ1 and SOX9 expression in primary embryonic palatal mesenchyme cells: Implications for teratogenicity. PLoS ONE. , In Press (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Collective Cell MovementPalatal Shelf ElevationMouse Embryo DissectionCell Migration AssayWound Repair AssayMesenchymal RemodelingCraniofacial DevelopmentCell Motility Analysis

Powiązane artykuły