Inkubator platformowy z ruchomym stolikiem XY: nowa platforma do wdrażania szybkiego utleniania fotochemicznego białek w komórkach

Podsumowanie

Nowa platforma statyczna służy do charakteryzowania struktury białek i miejsc interakcji w natywnym środowisku komórkowym, wykorzystując technikę śladu białkowego zwaną szybkim fotochemicznym utlenianiem białek w komórce (IC-FPOP).

Streszczenie

Szybkie Fotochemiczne Utlenianie Białek (FPOP) w połączeniu ze spektrometrią mas (MS) stało się nieocenionym narzędziem w proteomice strukturalnej do badania interakcji białek, struktury i dynamiki konformacji białek w funkcji dostępności rozpuszczalników. W ostatnich latach zakres FPOP, techniki drukowania stóp z hydroksylowo-rodnikowym białkiem (HRPF), został rozszerzony o znakowanie białek w żywych hodowlach komórkowych, zapewniając środki do badania interakcji białek w zawiłym środowisku komórkowym. Modyfikacje białek w komórkach mogą dostarczyć informacji na temat zmian strukturalnych wywołanych ligandami lub zmian konformacyjnych towarzyszących tworzeniu kompleksów białkowych, a wszystko to w kontekście komórkowym. Ślad białkowy został osiągnięty przy użyciu zwykłego systemu opartego na przepływie i lasera excimerowego KrF o długości fali 248 nm w celu uzyskania rodników hydroksylowych poprzez fotolizę nadtlenku wodoru, co wymaga 20 minut analizy dla jednej próbki komórki. Aby ułatwić eksperymenty FPOP z rozdzielczością czasową, po raz pierwszy wykorzystano nową, 6-dołkową platformę IC-FPOP opartą na płytkach. W obecnym systemie pojedynczy impuls laserowy naświetla jedną całą studzienkę, co skraca ramy czasowe eksperymentu FPOP, co skutkuje 20 sekundami czasu analizy, co stanowi 60-krotny spadek. Ten znacznie skrócony czas analizy umożliwia badanie mechanizmów komórkowych, takich jak kaskady sygnalizacji biochemicznej, fałdowanie białek i eksperymenty różnicowe (tj. wolne od leków vs. związane z lekiem) w sposób zależny od czasu. To nowe oprzyrządowanie, nazwane Platformowym Inkubatorem z Ruchomym Stopniem XY (PIXY), pozwala użytkownikowi na przeprowadzanie hodowli komórkowych i IC-FPOP bezpośrednio na stole optycznym za pomocą inkubatora platformowego z kontrolą temperatury,_CO2 i wilgotności. Platforma zawiera również stolik pozycjonujący, pompy perystaltyczne i zwierciadlaną optykę do prowadzenia wiązki laserowej. Warunki IC-FPOP, takie jak konfiguracja optyki, natężenia przepływu, transfekcje przejściowe i stężenie_H2O2 w PIXY, zostały zoptymalizowane i zrecenzowane. Automatyzacja wszystkich elementów systemu ograniczy manipulację człowieka i zwiększy przepustowość.

Wprowadzenie

Techniki śladowania białek mogą ujawnić szczegółowe informacje na temat organizacji białek. Te podstawowe techniki oparte na biologii strukturalnej MS są składnikiem zestawu narzędzi spektrometrii mas. Metody te badają strukturę wyższego rzędu białek (HOS) i synergię poprzez znakowanie kowalencyjne^1,2,3,4. Szybkie fotochemiczne utlenianie białek (FPOP) wykorzystuje rodniki hydroksylowe do oksydacyjnej modyfikacji łańcuchów bocznych aminokwasów dostępnych w rozpuszczalniku^5,6 (Tabela 1). Metoda wykorzystuje laser excimerowy o długości fali 248 nm do fotolizy nadtlenku wodoru (_H2O2) w celu wytworzenia rodników hydroksylowych. Teoretycznie 19 z 20 aminokwasów może być modyfikowanych oksydacyjnie, a Gly jest jedynym wyjątkiem. Jednak ze względu na różne szybkości reaktywności aminokwasów z rodnikami hydroksylowymi, eksperymentalnie zaobserwowano modyfikację tylko ich podzbioru. Mimo to metoda ta ma potencjał do analizy na całej długości sekwencji białka⁵. FPOP modyfikuje białka w skali mikrosekundowej, co czyni go przydatnym w badaniu słabych oddziaływań z szybkimi wskaźnikami. Dostępność rozpuszczalnika zmienia się po związaniu liganda lub zmianie konformacji białka, dlatego siła metody polega na porównaniu wzorca znakowania białka w wielu stanach (tj. bez ligandu w porównaniu z wiązanym ligandem). W rezultacie, FPOP odniósł sukces w identyfikacji miejsc interakcji białko-białko i białko-ligand oraz regionów zmian konformacyjnych^7,8,9,10. Metoda FPOP została rozszerzona z badania oczyszczonych układów białkowych na analizę wewnątrzkomórkową. In-cell FPOP (IC-FPOP) może oksydacyjnie modyfikować ponad tysiąc białek w komórkach, aby dostarczyć informacji strukturalnych w całym proteomie^11,12. Konwencjonalna platforma IC-FPOP wykorzystuje system przepływu do przepływu komórek pojedynczym plikiem obok wiązki laserowej. Opracowanie tego systemu pozwoliło poszczególnym komórkom na równą ekspozycję na promieniowanie laserowe. Doprowadziło to do 13-krotnego wzrostu liczby białek znakowanych oksydacyjnie¹². Ograniczeniem systemu przepływu jest jednak długość eksperymentu z pojedynczą próbką, składającego się z 10-minutowego interwału napromieniania, podczas którego zachodzi modyfikacja, oraz dodatkowego 10-minutowego cyklu mycia. Ograniczenia czasowe IC-FPOP sprawiają, że nie nadaje się on do badania krótkożyciowych produktów pośrednich zwijania białek lub zmian zachodzących między sieciami interakcji w biochemicznych kaskadach sygnalizacyjnych. To ograniczenie czasowe zainspirowało do zaprojektowania nowej platformy IC-FPOP wyposażonej w wyższą przepustowość.

Aby dokładnie zmierzyć strukturę białka wyższego rzędu w natywnym środowisku komórkowym, nowy projekt pozwala na przeprowadzenie hodowli komórkowej bezpośrednio na platformie laserowej, co umożliwia IC-FPOP wysoką przepustowość. Taka konfiguracja pozwala również na zminimalizowanie zakłóceń w środowisku komórkowym, w przeciwieństwie do IC-FPOP wykorzystującego przepływ, w którym przylegające komórki muszą zostać usunięte z podłoża. Nowa platforma pozwala na występowanie IC-FPOP w sterylnym systemie inkubacji przy użyciu CO₂ i górnej komory stopnia z kontrolowaną temperaturą, przy jednoczesnym wykorzystaniu skonfigurowanej optyki lustrzanej do prowadzenia wiązki laserowej, systemu pozycjonowania ruchu XY oraz pomp perystaltycznych do wymiany chemicznej. Nowa platforma do przeprowadzania IC-FPOP nosi nazwę Platform Incubator with Movable XY Stage (PIXY) (Rysunek 1). W PIXY IC-FPOP przeprowadza się na komórkach ludzkich hodowanych na płytkach sześciodołkowych w komorze inkubatora platformowego. W tej konfiguracji wiązka laserowa jest odbijana w dół na płytkę za pomocą luster kompatybilnych z wiązką, ponieważ stopień pozycjonujący, który utrzymuje inkubator, jest przesuwany w płaszczyźnie XY, więc wiązka laserowa jest strategicznie ustawiona, aby naświetlać tylko jedną studnię na raz. Badania walidacyjne pokazują, że IC-FPOP może być wykonywany szybciej w PIXY niż w systemie przepływowym i prowadzi do zwiększonych modyfikacji aminokwasów na białko. Rozwój tej nowej platformy IC-FPOP będzie opierał się na wiedzy, którą można uzyskać z eksperymentów komórkowych¹³.

Protokół

1. Montaż inkubatora platformowego z ruchomym stolikiem XY

UWAGA: Nowa platforma obejmuje system inkubacji, stół pozycjonujący wraz z kontrolerami, pompy perystaltyczne, laser ekscymerowy KrF o długości fali 248 nm oraz lustra optyczne zamontowane na stole optycznym firmy Imperial.

1. Zmontować system inkubacji: jednostkę temperatury, jednostkę dwutlenku węgla, nawilżacz, pompkę powietrzną oraz system monitorowania dotykowego (Rysunek 2A-E).
   UWAGA: Szczegółowe instrukcje montażu dostarcza producent. System inkubacji musi ustabilizować się do poziomu 5% CO₂, 37 °C i 85% wilgotności przed hodowlą komórek w inkubatorze. Parametry te mogą zależeć od linii komórkowej.
2. Zmontować niestandardowy inkubator do płytek sześciodołkowych, nanopozycyjny stół napędowy oraz stół napędowy XY. Pierwszy element przykręca się odpowiednio do pozostałych.
   UWAGA: Szczegółowe instrukcje montażu dostarcza producent.
3. Połączyć cztery pompy perystaltyczne w sekwencji szeregowej za pomocą kabli RS-232, z kablem RS-232 do USB podłączonym do komputera sterującego. Do każdego kanału na rolkach każdej pompy podłączyć polimerowe rurki o średnicy wewnętrznej 3,18 mm (np. Tygon).
   UWAGA: Każda pompa posiada cztery rolki. Kierunek i szybkość przepływu rolek są regulowane ręcznie.
4. Włożyć łączniki 1/16" x 1/8" na końcach każdej polimerowej rurki o średnicy wewnętrznej 3,18 mm. Włożyć koniec łącznika 1/16'' do polimerowej rurki o średnicy wewnętrznej 1,59 mm, a następnie wprowadzić rurkę polimerową do inkubatora przez niestandardowe porty. Drugi koniec rurki umieścić w roztworze, który będzie wprowadzany podczas eksperymentów IC-FPOP.
   UWAGA: W przypadku linii perfuzyjnych inkubator posiada 36 niestandardowych portów dla linii rurek rozmieszczonych wokół obwodu, aby pomieścić wszystkie używane odczynniki.
5. Przykręcić jedno lustro linii lasera ekscymerowego o średnicy 50 mm, długości fali 248 nm i kącie 45° w kinematycznym uchwycie lustra dla optyki Ø2" do płyty optycznej w odległości 10-11 punktów siatki od apertury lasera 248 nm. Umieścić drugie lustro pod kątem 90° względem pierwszego po drugiej stronie inkubatora. Ustawić drugie lustro pod kątem ok. 45° w dół w celu skierowania wiązki lasera do inkubatora (Rysunek 2F-J).

2. Synchronizacja i wstępna automatyzacja systemu za pomocą oprogramowania integracyjnego

1. Zainstaluj najnowszą wersję oprogramowania integrującego niezbędnego do sterowania sterownikami i pompami.
2. Zgodnie z instrukcją obsługi pompy, zmień nazwy pomp, zaczynając od „5” i zwiększając ich wartość. Polecenia do systemu pomp można wysyłać za pomocą podprogramu Manual Control w oprogramowaniu integrującym.
   UWAGA: Ustawienie pompy w trybie kanałowym (Channel Mode) automatycznie zmienia konwencję nazewnictwa pomp na zestaw 1, 2, 3 i 4, odpowiadający czterem kanałom pompy.
3. Otwórz program integrujący do automatyzacji inkubatora platformowego.
4. Z rozwijanego menu połączeń oznaczonego jako Comport for pumps wybierz odpowiednią nazwę urządzenia COM USB (np. COM4) odpowiadającą kablowi USB systemu pomp.
5. Kliknij przycisk Script Builder, aby edytować lub utworzyć skrypt dla zautomatyzowanej platformy inkubatora. Kliknij Save Script, aby zapisać sekwencję jako plik tekstowy (Rysunek 3A).
   UWAGA: Kreator skryptów posiada interfejs użytkownika do definiowania skryptu z określeniem numeru pompy, kierunku, szybkości, objętości, średnicy rurki, trybu kanałowego oraz opóźnienia czasowego.
6. Jeśli podczas tworzenia skryptu wymagany jest tryb kanałowy, w skrypcie musi znaleźć się krok dedykowany przełączaniu pompy w tryb kanałowy i poza niego, a kolejne kroki odpowiadające kanałom pompy muszą być oznaczone jako pompy 1-4.
   UWAGA: Zapewnia to, że dwie pompy nie mogą jednocześnie znajdować się w trybie kanałowym podczas wykonywania skryptu inkubatora platformowego oraz że każda pompa zostanie przełączona z powrotem do trybu tradycyjnego (legacy mode) po wysłaniu poleceń do wymaganych kanałów.
7. Kliknij przycisk Read Script i wybierz odpowiedni plik skryptu przeznaczony do pracy inkubatora platformowego.
8. Przełącz przycisk Run Sequence w pozycję ON (kolor zielony), aby uruchomić skrypt, a następnie kliknij przycisk START (Rysunek 3B).

3. Hodowla komórek w inkubatorze platformy

UWAGA: Komórki należy umieścić w inkubatorze platformy w warunkach sterylnych, w dygestorium do hodowli komórkowych, w dniu poprzedzającym przeprowadzenie eksperymentu.

1. Odkręć inkubator platformowy od stopnia nanopozycjonującego i odłącz linie temperatury, gazu oraz nawilżacza. Po spryskaniu inkubatora 70% etanolem, umieść go w komorze do hodowli komórek.
2. Hoduj komórki w kolbie T-175 do osiągnięcia około 80-90% konfluencji przed transferem.
   UWAGA: Termin konfluencja jest używany jako miara liczby/pokrycia komórek w szalce do hodowli komórek lub w kolbie.
3. Usuń pożywkę i wypłucz buforem.
4. Odczep komórki za pomocą trypsyny-EDTA zgodnie z protokołem producenta.
5. Resuspenduj w 8 mL pożywki i dokonaj zliczenia komórek.
6. Zasiej płytki sześciodołkowe pokryte fibronektyną/kolagenem¹⁴, dodając do każdego dołka około 90-95 μL resuspendowanych komórek. Objętość ta będzie odpowiednia do uzyskania 80-90% konfluencji (~1,2 miliona komórek) w każdym dołku następnego dnia.
   UWAGA: Płytki sześciodołkowe muszą być pokryte kolagenem przed zasianiem. Odczynniki stosowane podczas IC-FPOP są wprowadzane z dużymi prędkościami przepływu. Pokryte płytki zapobiegają przedwczesnemu odczepieniu komórek podczas infuzji odczynników.
7. Umieść zasianą płytkę w inkubatorze platformowym i przykryj kwarcową pokrywą.
   UWAGA: Podczas projektowania i rozwoju szklana pokrywa inkubatora została zastąpiona kwarcową, aby była kompatybilna z ultrafioletowym światłem laserowym.
8. Zamontuj i zabezpiecz inkubator platformowy z powrotem na stopniu napędowym nanopozycjonującego. Podłącz ponownie linie temperatury, gazu oraz nawilżacza.
9. Pozostaw komórki do wzrostu do pełnej konfluencji przez noc.
   UWAGA: Następujące kroki hodowli komórek są opcjonalne i przeznaczone dla eksperymentów, w których komórki ludzkie są przejściowo transfekowane. Kroki te służą do oceny wydajności transfekcji w warunkach hodowli komórkowej.
10. Transfekuj plazmid zawierający gen chimerycznego białka GCaMP2 do komórek HEK 293, używając komercyjnego zestawu do transfekcji kationowymi lipidami.
11. Przeprowadź przejściowe transfekcje GCaMP2 w komórkach HEK293T w dwóch płytkach sześciodołkowych.
12. Inkubuj jedną płytkę sześciodołkową w inkubatorze platformowym, a drugą płytkę sześciodołkową w standardowym inkubatorze CO₂.
13. Porównaj wydajność transfekcji w każdej płytce za pomocą obrazowania fluorescencyjnego przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego.

4. Przygotowanie buforu do zatrzymania reakcji oraz H₂O₂

1. Przygotować 100 mL buforu wygaszającego zawierającego 125 mM N-tert-butyl-α-fenylnitronu (PBN) oraz 125 mM N, N′-dimetylotiomocznika (DMTU).
   UWAGA: DMTU i PBN są zmiatacze wolnych rodników i wykazują przepuszczalność komórkową.
2. Rozcieńczyć H₂O₂ do stężenia 200 mM. Każda próbka wymaga 6 mL H₂O₂, aby całkowicie zanurzyć warstwę komórek na dnie każdej studzienki.
   ​UWAGA: Bufor wygaszający należy przygotować dzień wcześniej i przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc, chroniąc go przed światłem. H₂O₂ należy rozcieńczyć w dniu przeprowadzenia eksperymentu.

5. Przygotowanie inkubatora platformy do IC-FPOP

UWAGA: Inkubator platformowy musi zostać złożony w warunkach sterylnych. Złóż inkubator w sterylnej komorze do hodowli komórkowej.

1. Odkręć inkubator platformowy od stolika pozycjonującego i odłącz przewody temperatury, gazu oraz nawilżacza.
2. Po spryskaniu inkubatora 70% etanolem, umieść go w dygestorium do hodowli komórkowej.
3. Wyjmij płytkę sześciodołkową z inkubatora platformowego, zabezpiecz oryginalną pokrywkę płytki i potwierdź konfluencję komórek za pomocą mikroskopu.
4. Po potwierdzeniu konfluencji komórek, umieść płytkę sześciodołkową z konfluencyjnymi komórkami z powrotem w inkubatorze platformowym wewnątrz dygestorium do hodowli komórkowej.
5. Wprowadź trzy wcześniej przycięte (15 cm) polimerowe rurki o średnicy wewnętrznej (ID) 1.59 w każdy dołek poprzez wbudowane porty. Doprowadź rurki do ścianek dołka i utrwal je za pomocą specjalnie wydrukowanych w technologii 3D pierścieni.
   UWAGA: Zaprojektowano sześć pierścieni o średnicy 33 mm wydrukowanych z filamentu PLA w technologii 3D, aby zabezpieczyć rurki przy ściankach płytki, nie zakłócając przy tym stanu komórek i nie blokując impulsu lasera.
6. Przykryj inkubator platformowy jego kwarcową pokrywą. Ponownie zamontuj i zabezpiecz inkubator górny stolika na systemie pozycjonującym. Podłącz ponownie przewody temperatury, gazu oraz nawilżacza.
7. Podłącz polimerowe rurki o średnicy wewnętrznej (ID) 1.59 do końców 1/16" łączników 1/16x1/8".

6. Wykonywanie IC-FPOP w inkubatorze platformowym

1. Przygotuj skrypt oprogramowania integrującego dla odsysania pompą. Użyj jednej pompy perystaltycznej (Pompa 8), aby całkowicie usunąć medium hodowlane ze wszystkich sześciu studni.
2. Odpowietrz rozpuszczalniki w każdym kanale pozostałych trzech pomp perystaltycznych (Pompy 5-7). Podawaj H₂O₂ oraz bufor gaszący w odpowiednich naprzemiennych rurkach, aż odczynniki dotrą do portów inkubatora.
3. Potwierdź, że wiązka lasera została prawidłowo skierowana przez lustra i dociera do inkubatora bez przeszkód.
   UWAGA: Podczas korzystania z lasera należy zawsze nosić okulary ochronne do laserów. Nie naświetlaj komórek przedwcześnie podczas procesu ustawiania kąta/wyrównywania. Do całkowitego zakrycia pokrywy kwarcowej podczas ustawiania wiązki użyj tektury. Użyj również wydrukowanego na białym papierze obrysu płytki 6-studzienkowej, aby dodatkowo potwierdzić, że wiązka lasera trafia w środek każdej studni. Do wyrównania użyj ustawienia Continuous (ciągłe) przy najniższej częstotliwości i energii.
4. Sprawdź energię lasera za pomocą zewnętrznego czujnika. Użyj pojedynczego impulsu laserowego 160 mJ przy 50 Hz i 27 kV.
   UWAGA: Do poniższych kroków potrzebny jest stoper.
5. Po potwierdzeniu wyrównania wiązki przygotuj skrypt oprogramowania integrującego dla infuzji pompą.
6. Uruchom stoper i jednocześnie naciśnij przycisk Start w skrypcie pompy oprogramowania integrującego.
7. Wprowadź 200 mM H₂O₂ z prędkością 35 mL/min do pierwszej studni (zakres 6-10 sekundy na stoperze).
   UWAGA: Przed rozpoczęciem infuzji pompy występuje pięciosekundowe opóźnienie. Laser potrzebuje również siedmiu sekund przed wyzwoleniem impulsu. Impuls lasera musi nastąpić bezpośrednio po infuzji H₂O₂.
8. Naciśnij przycisk Start w oprogramowaniu lasera w 5. sekundzie, aby wyzwolić impuls w 11. sekundzie na stoperze.
9. Wprowadź 125 mM roztworu gaszącego z prędkością 35 mL/min do pierwszej studni bezpośrednio po impulsie lasera. Przesuń ręcznie stół pozycjonujący, aby wyrównać kolejną studnię z wiązką lasera.
10. Powtórz kroki 6.5-6.9, aż każda studnia zostanie przetworzona.
    UWAGA: IC-POP jest wykonywany w technicznych powtórzeniach trzech próbek laserowych i trzech nielaserowych. Jedna przetworzona płytka 6-studzienkowa stanowi jedną replikę biologiczną.
11. W komorze do hodowli komórek użyj skrobaka do komórek, aby przenieść komórki z każdej studni do oddzielnych stożkowych probówek 15 mL. Wirowarkuj komórki przy 1,200 x g przez 5 minut.
12. Odlej nadsącz i resuspenderuj komórki w 100 μL buforu lizującego RIPA.
13. Przenieś komórki do oddzielnych probówek polipropylenowych 1,2 mL.
14. Zamroź szybko wszystkie próbki w ciekłym azocie i umieść w zamrażarce -80 °C do czasu użycia.
    ​UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać.

7. Ekstrakcja, oczyszczanie i proteoliza białek

1. Rozmrozić próbki i podgrzewać w bloku grzewczym w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
2. Po podgrzaniu schładzać na lodzie przez 5 minut.
3. Do lizatu komórkowego dodać 25 jednostek nukleazy w celu degradacji jednoniciowego, dwuniciowego, liniowego i kolistego DNA oraz RNA, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
4. Odwirować próbki przy 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
5. Zebrać supernatant i przenieść go do czystej probówki polipropylenowej.
6. Sprawdzić stężenie białka za pomocą kolorymetrycznego testu białkowego.
7. Przenieść 100 µg próbki do czystej probówki polipropylenowej i uzupełnić objętość do 100 µL buforem do lizy komórek.
8. Redukować próbki przy użyciu 10 mM ditiotreitolu (DTT) w temperaturze 50 °C przez 45 minut.
9. Schłodzić próbki w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
10. Przeprowadzić alkilację przy użyciu 50 mM jodoacetamidu (IAA) w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
    UWAGA: Chronić IAA przed światłem.
11. Dodać 460 µL schłodzonego wcześniej (-20 °C) acetonu. Wymieszać próbki na wortexie i pozostawić w temperaturze -20 °C przez noc.
    UWAGA: Na tym etapie można przerwać protokół.
12. Następnego dnia odwirować próbki przy 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
13. Usunąć aceton, uważając, aby nie naruszyć osadu białkowego.
14. Dodać 50 µL 90% schłodzonego wcześniej (-20 °C) acetonu. Wymieszać próbki na wortexie i odwirować przy 16 000 x g przez dodatkowe 5 minut w temperaturze 4 °C.
15. Usunąć aceton i pozostawić próbki do wyschnięcia przez 2-3 minuty.
16. Resuspendować osad białkowy w buforze Tris 10 mM pH 8.
17. Resuspendować trypsynę klasy MS (roztwór stokowy 20 µg) w 40 µL buforu Tris 10 mM pH 8 i dodać 2,5 µg trypsyny do każdej próbki.
18. Inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez noc.
    ​UWAGA: Na tym etapie można przerwać protokół.
19. Ocenić stężenie peptydów za pomocą kolorymetrycznego testu peptydowego.
20. Zneutralizować próbki za pomocą 5% kwasu mrówkowego.
21. Przenieść 10 µg próbki do czystej probówki polipropylenowej.
22. Wysuszyć próbkę za pomocą wirówki próżniowej i resuspendować w 20 µL 0,1% kwasu mrówkowego (FA) w wodzie klasy MS.
23. Przenieść każdą próbkę do czystych fiolek autosamplera z naciętymi nakrętkami.

8. Wysokosprawna chromatografia cieczowa sprzężona z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS)

1. W celu lokalizacji modyfikacji FPOP należy poddać przetrawiony lizat komórkowy analizie LC-MS/MS.
2. Jako fazy ruchome należy zastosować 0,1% FA w wodzie (A) oraz 0,1% FA w acetonitrylu (ACN) (B).
3. Na kolumnę pułapkującą C18 (5 µm i 100 Å) o wymiarach 180 µm x 20 mm należy nanieść 0,5 µg próbki, a następnie przemyć kolumnę roztworem 99% (A) i 1% (B) przez 15 minut.
4. Przy użyciu kolumny analitycznej C18 (5 µm i 125 Å) o wymiarach 75 µm x 30 cm należy eluować i rozdzielać przetrawione peptydy przy szybkości przepływu 0,300 µL/min przez 120 minut.
5. Gradient LC należy przeprowadzić w następujący sposób: 0−1 min, 3% rozpuszczalnika B; 2−100 min, 10−45% B; 100−110 min, 45-100% B; 110−115 min, 100% B.
6. W czasie od 115 do 116 minuty należy rekondycjonować kolumnę przy 3% (B), a od 116 do 120 minuty utrzymywać stężenie 3% (B).
7. Eluowane peptydy należy analizować w trybie jonów dodatnich z wykorzystaniem nano-jonizacji elektrorsprayowej.
8. Widma MS1 należy rejestrować w zakresie m/z od 375 do 1500 przy rozdzielczości 60 000.
9. Wartość docelową automatycznej kontroli wzmocnienia (AGC) należy ustawić na 5,0e⁵ przy maksymalnym czasie wtrysku 50 ms i progu intensywności 5,0e⁴.
10. Jony prekursorowe o stanach ładunku 2-6 należy izolować poprzez akwizycję zależną od danych (DDA) z oknem izolacji 1,2 m/z i czasem cyklu 4 sekundy.
11. Jony MS2 należy poddać dysocjacji kolizyjnej o wysokiej energii (HCD) (32% energii znormalizowanej).
12. Peptydy należy wykluczać po jednej akwizycji MS/MS przez 60 sekund.
13. Rozdzielczość MS/MS należy ustawić na 15 000 przy wartości docelowej AGC 5,0e⁴ i maksymalnym czasie wtrysku 35 ms.

9. Proteome Discoverer/przetwarzanie danych

1. Przeszukaj surowe pliki danych tandemowych w dostępnym oprogramowaniu do analizy proteomiki bottom-up, korzystając z odpowiedniej bazy białek Homo sapiens oraz enzymu trawiennego.
2. Ustaw parametry wyszukiwania dla analizy białek.
3. Ustaw tolerancję fragmentów na 0,02 Da i tolerancję jonów prekursorowych na 10 ppm.
4. Ustaw specyficzność enzymu na trypsynę i dopuść jedno pominięte cięcie.
5. Ustaw zakres mas na 375-1500 m/z.
6. Ustal poziom ufności dla peptydów na 95% (średni) oraz dla reszt na 99% (wysoki).
7. Zaakceptuj białka, jeśli zidentyfikowano co najmniej dwa różne peptydy przy zastosowaniu filtra 5% wskaźnika fałszywych odkryć (FDR).
8. Ustaw karbamidometylację jako modyfikację statyczną, a wszystkie znane modyfikacje łańcuchów bocznych przez rodniki hydroksylowe^15,16 jako modyfikacje dynamiczne.
9. Po zakończeniu przeszukiwania plików wyeksportuj informacje o sekwencji, miejscach modyfikacji, numerach dostępowych białek, pliku widma, obfitości prekursorów oraz czasie retencji do bazy danych.
10. Oblicz stopień modyfikacji na peptyd lub resztę za pomocą następującego równania:
    
    UWAGA: EIC area modified to pole powierzchni ekstrahowanego chromatogramu jonowego (EIC) dla peptydu lub reszty z modyfikacją oksydacyjną, a EIC area to całkowita powierzchnia tego samego peptydu lub reszty z modyfikacją oksydacyjną i bez niej. Z biegiem czasu białko w obecności nadtlenku wodoru ulegnie utlenieniu, co prowadzi do utleniania tła. Aby obliczyć stopień modyfikacji, powierzchnię peptydu zmodyfikowanego dzieli się przez powierzchnię całkowitą. Próbka kontrolna nienaświetlana pozwala uwzględnić utlenianie tła. Utlenianie tła z próbki kontrolnej jest odejmowane od próbki traktowanej laserem w celu zidentyfikowania modyfikacji FPOP.

Wyniki

Aby potwierdzić, że warunki panujące w inkubatorze platformy są wystarczające do hodowli komórkowej na platformie laserowej, do komórek HEK293T przeprowadzono przejściową transfekcję GCaMP2, a następnie oceniono wydajność transfekcji dla obu płytek za pomocą obrazowania fluorescencyjnego (Rycina 4A). GCaMP2 jest fluorescencyjnym białkiem sensorowym wapnia, wykorzystywanym jako genetycznie kodowany wewnątrzkomórkowy wskaźnik wapnia. Jest to fuzja zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) oraz białka wiążącego wapń, kalmoduliny. W celu ilościowego określenia wydajności transfekcji przeprowadzono test lucyferazowy na komórkach HEK 293 transfekowanych plazmidem prl-TK (Rycina 4B). Wyniki te wskazują, że inkubator platformy przewyższył skutecznością inkubator standardowy, wykazując 1,13-krotny wzrost wydajności transfekcji, co stanowi ilościowy punkt odniesienia dla optymalnego środowiska hodowli komórkowej.

Modyfikacje FPOP w komórkach HEK293T znakowanych w systemie przepływowym porównano z modyfikacjami w komórkach znakowanych w inkubatorze platformowym; wykazano, że inkubator platformowy przewyższa system przepływowy zarówno pod względem liczby zmodyfikowanych białek (Rycina 5) , jak i całkowitego zakresu FPOP w tych białkach. Liczba białek zmodyfikowanych metodą FPOP uzyskana w inkubatorze platformowym wynosiła około 1051, co stanowi 2,2-krotny wzrost w porównaniu z wynikami uzyskanymi w typowym eksperymencie. Modyfikacje z dwóch powtórzeń biologicznych dla każdego eksperymentu zostały połączone. Ponadto system PIXY zapewnia wyższą przepustowość.

Aby zademonstrować zaletę wyższego stopnia pokrycia modyfikacjami w obrębie białka, lokalizację modyfikacji IC-FPOP określono na poziomie peptydów, a zakres modyfikacji ilościowo oceniono, aby odróżnić wyniki uzyskane dla obu systemów w przypadku aktyny, białka składającego się z 375 aminokwasów. W systemie przepływowym wykryto dwa zmodyfikowane peptydy, co dostarczyło ograniczonych informacji strukturalnych (Rysunek 6A). Jednakże w inkubatorze platformowym wykryto pięć zmodyfikowanych peptydów obejmujących sekwencję aktyny. Tandemowe widma mas wskazują, że reszta Pro322 była zmodyfikowana i wykryta w każdym eksperymencie (Rysunek 6B). Pięć peptydów zmodyfikowanych w próbkach z inkubatora platformowego zawierało dwanaście zmodyfikowanych reszt, podczas gdy w systemie przepływowym zmodyfikowano tylko cztery reszty (Rysunek 6C). Zwiększenie zakresu pokrycia utlenianiem dostarcza więcej informacji strukturalnych dotyczących białka.

Espino i wsp. wykazali możliwość przeprowadzenia metody FPOP in vivo (IV-FPOP) u C. elegans, modelu nicieniowego dla ludzkich stanów chorobowych¹⁷. Chociaż IV-FPOP wykonuje się również za pomocą systemu przepływowego, w celu sprawdzenia kompatybilności z nicieniami przetestowano system PIXY. W każdej studzience inkubatora platformy inkubowano około 10 000 nicieni w temperaturze 20 °C. Analiza LC−MS/MS wykazała, że w inkubatorze platformy metodą IV-FPOP zmodyfikowano 792 białka, w porównaniu do 545 białek zmodyfikowanych przy użyciu systemu przepływowego (Rycyna 7). Wyniki te dowodzą, że poza dwuwymiarową kulturą komórkową, ta nowa metodologia jest również kompatybilna z badaniem innych systemów biologicznych, takich jak C. elegans.

Rysunek 1. Schemat systemu PIXY. Komponenty systemu: (A) inkubator nadstołowy, (B) system pozycjonowania, (C) pompy perystaltyczne oraz (D) linie perfuzyjne. Pożywka hodowlana jest usuwana z każdej studzienki za pomocą pomp przed wprowadzeniem H₂O₂ i roztworów gaszących w obliczonych punktach czasowych. Ścieżka lasera do naświetlania pokazana na biało. Przedrukowano za zgodą Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M., Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage. Analytical Chemistry, 92(2), 1691-1696 2019. Copyright 2020 American Chemical Society. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 2. W pełni zmontowany system PIXY. (A) dotykowy system monitorowania, (B) jednostka dwutlenku węgla, (C) jednostka temperatury, (D) pompa powietrza, (E) nawilżacz, (F) lustra optyczne, (G) inkubator platformowy, (H) stół pozycjonujący, (I) laser ekscymerowy KrF 248nm oraz (J) pompy perystaltyczne. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 3. Automatyzacja pomp perystaltycznych. (A) Przykład skryptu poleceń w programie LABVIEW. Opcje poleceń obejmują objętość, szybkość przepływu, pauzy oraz kierunek przepływu. Prędkość, odległość etapu i lokalizacja są obecnie automatyzowane. (B) Czytnik skryptów w programie LABVIEW. Tutaj skrypty poleceń są przesyłane, a następnie naciska się przyciski Run Sequence i START, aby uruchomić pompy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 4. Wydajność transfekcji komórek HEK. (A) Porównanie średniej intensywności fluorescencji po transfekcji GCaMP2 w standardowym inkubatorze (Kontrola) oraz w inkubatorze nadstołowym (PIXY). Kropki i kwadraty reprezentują poszczególne punkty w studni, w których dokonano pomiaru. (B) Wydajność transfekcji ilościowo określona i zwalidowana przy użyciu innego plazmidu wektora, pRL-TK. Wartość p< 0,005. Przedrukowano za zgodą Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M., Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage. Analytical Chemistry, 92(2), 1691-1696 2019. Copyright 2020 American Chemical Society. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 5. Porównanie białek zmodyfikowanych w systemie przepływowym dla pojedynczej komórki oraz w systemie PIXY. Diagram Venna białek zmodyfikowanych w systemie przepływowym (kolor fioletowy) oraz w systemie PIXY (kolor zielony). Przedrukowano za zgodą autorów: Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M., Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage. Analytical Chemistry, 92(2), 1691-1696 2019. Copyright 2020 American Chemical Society. Aby wyświetlić tę figurę w większym rozmiarze, kliknij tutaj.

Rysunek 6. Lokalizacja modyfikacji IC-FPOP. Porównanie modyfikacji IC-FPOP pomiędzy systemami. (A) Wykres słupkowy utlenionych modyfikowanych peptydów w aktynie w systemie przepływowym (fioletowy) w porównaniu z inkubatorem platformowym (zielony). (B) Widma tandemowej MS aktyny (peptyd 316-326) z modyfikowaną proliną w obu systemach oraz niemodyfikowany peptyd aktyny (C) Pozostałości aktyny modyfikowane metodą FPOP (PDB: 6ZXJ, łańcuch A): 11 zmodyfikowanych pozostałości w inkubatorze platformowym (zielony), 3 zmodyfikowane pozostałości w systemie przepływowym (fioletowy), 1 nakładająca się zmodyfikowana pozostałość (żółty). Przedrukowano za zgodą Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M., Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage. Analytical Chemistry, 92(2), 1691-1696 2019. Copyright 2020 American Chemical Society. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 7. Porównanie białek modyfikowanych metodą FPOP w C. elegans przy użyciu przepływu względem PIXY. Stwierdzono 1,5-krotny wzrost liczby białek zmodyfikowanych utleniająco przy zastosowaniu PIXY w porównaniu z systemem przepływowym. Przedrukowano za zgodą Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M., Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage. Analytical Chemistry, 92(2), 1691-1696 2019. Copyright 2020 American Chemical Society. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela 1. Rozkład modyfikacji przepływu pracy i przesunięcia masy (Da). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Białka wykonują większość pracy w żywych komórkach. Biorąc pod uwagę to znaczenie, potrzebne są szczegółowe dane dotyczące funkcji białek i struktury wyższego rzędu (HOS) w środowisku komórkowym, aby pogłębić zrozumienie zawiłości w większych kompleksach i reakcjach enzymatycznych w komórkach, a nie w systemach oczyszczonych. W tym celu przyjęto metodę drukowania stóp z białkami rodnikowymi hydroksylowymi (HRFP) o nazwie In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins (IC-FPOP). Większość badań FPOP przeprowadzono in vitro w stosunkowo czystych układach białkowych, co wyraźnie kontrastuje z zatłoczonym środowiskiem molekularnym, które wpływa na interakcje wiążące i dynamikę konformacji białek. W rezultacie istnieje przepaść między wynikami eksperymentów in vitro ¹⁸ a tymi, które zostałyby uzyskane w rzeczywistym środowisku komórkowym. Aby wypełnić lukę między wyidealizowanymi warunkami eksperymentu FPOP in vitro a złożoną naturą komórki, opracowano nową, zautomatyzowaną, sześciodołkową platformę FPOP opartą na płytkach komórkowych. Ta nowatorska technologia FPOP jest w stanie zidentyfikować i scharakteryzować te gatunki molekularne oraz śledzić ich dynamiczne interakcje molekularne zarówno w stanie zdrowym, jak i chorym. Ta nowa platforma nazywa się Inkubator Platformy z Ruchomym Stopniem XY (PIXY).

FPOP został z powodzeniem wykorzystany do scharakteryzowania informacji strukturalnych w proteomie. Jednak każda technika biologiczna ma pewne ograniczenia, które wymagają dalszej poprawy. Podczas fotolizy laserowej i do skutecznego wygaszania nieprzereagowanych rodników hydroksylowych potrzebne są specjalne odczynniki. Separacja strawionych peptydów może wymagać dużej ilości czasu, aby zmaksymalizować informacje strukturalne. To bogactwo informacji może również wymagać obszernej kwantyfikacji podczas analizy danych po stwardnieniu rozsianym¹. Inkubator platformowy, w tym urządzenia peryferyjne potrzebne do hodowli komórek i IC-FPOP na platformie laserowej, wiąże się z dużymi kosztami, które mogą być niewykonalne dla niektórych laboratoriów. Wraz z postępami, solidne oprogramowanie i narzędzia analityczne powinny jeszcze bardziej rozwinąć tę technikę; Niektóre z nich zostały zaprezentowane w tym badaniu. Obecne badania w tym inkubatorze platformowym przeprowadzono na komórkach HEK293T i C. elegans. Wykazano, że metoda IC-FPOP jest kompatybilna z szeroką gamą linii komórkowych, w tym z komórkami jajnika chomika chińskiego (CHO), Vero, MCF-7 i MCF10-A¹⁹. Ponieważ ogólna metoda IC-FPOP jest translowana na tę statyczną platformę, te linie komórkowe powinny być również możliwe do badania przy użyciu PIXY.

IC-FPOP wykorzystuje_H2O2do oksydacyjnej modyfikacji łańcuchów bocznych aminokwasów dostępnych dla rozpuszczalników, aby następnie dalej rozróżniać interakcje białek, strukturę i efekty metaboliczne w żywotnych komórkach, co jest istotne w zapewnieniu kontekstu biologicznego. Przed eksperymentem IC-FPOP konieczne jest potwierdzenie, że komórki są żywotne po dodaniu_H2O2. Badania żywotności komórek wykazały, że komórki były żywotne w obecności stężeń_H2O2do 200 mM ¹³. Ważne jest również, aby upewnić się, że_H2O2jest podawany w końcowym stężeniu 200 mM bezpośrednio na komórki po usunięciu pożywki. Niecałkowite usunięcie pożywki do hodowli komórkowych spowoduje różne stężenia_H2O2. W porównaniu z warunkami standardowymi, wydłużenie czasu inkubacji do 10 sekund wraz ze zwiększeniem stężenia_H2O2doprowadziło do zwiększenia liczby białek modyfikowanych przez IC-FPOP w inkubatorze platformowym. Konieczne jest zalanie pomp perystaltycznych przed użyciem, aby upewnić się, że pompy działają prawidłowo, a ciecz jest rozpraszana. Niezastosowanie się do tego może spowodować powstawanie pęcherzyków powietrza w przewodach, niewystarczającą objętość_H2O2do zanurzenia komórek i/lub niewystarczającą objętość roztworu hartującego.

Kolejnym problemem, który może się pojawić, są niechciane opóźnienia w systemie. Przykładem tego jest proces weryfikacji otrzymanych poleceń dla systemów pompowych, który dodaje znaczne opóźnienia rzędu 1000 lub więcej milisekund za pomocą oprogramowania integracyjnego. Ten problem można rozwiązać, minimalizując komunikację z pompami podczas eksperymentu i używając wstępnie ustawionych poleceń z wyprzedzeniem tak bardzo, jak to możliwe.

W przyszłości celem PIXY jest wyprodukowanie w pełni zautomatyzowanego i zintegrowanego systemu. Oprócz pomp perystaltycznych wyzwalanie impulsu laserowego będzie zautomatyzowane. Nowy system pozycjonowania zostanie również wykorzystany do szybkiego ruchu inkubatora platformowego w celu zwiększenia prędkości i dokładności. Wszystkie komponenty systemu będą nadal programowane przy użyciu oprogramowania integracyjnego w celu dalszego zwiększenia przepustowości.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pompy perystaltyczne Ismatec Reglo ICC	Cole-Palmer	122270050
Mocowanie lusterka kinematycznego do Ø 2" Optyka	Thor Labs
10X trypsyna− EDTA	Corning	AB00490-00005
50,0 mm 248nm 45°, ekscymerowe lustro liniowe	Edmond Optics
Aceton, klasa HPLC	Acetonitryl Fisher Scientific
z 0,1% kwasem mrówkowym (v / v), klasa LC / MS	Fisher Scientific
ACQUITY UPLC Kolumna pułapki C18 klasy M, 100 cali, 5 i mikro; m, 180 i mikro; m x 20 mm, 2G, V/M, 1/opk	Waters	23275	inne instrumenty o wysokiej rozdzielczości (np. Q exactive Orbitrap lub Orbitrap Fusion) mogą być używane
ACQUITY UPLC M-Class System	Waters	A53225
Afinia H480 Drukarka 3D	(Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library)
pompa powietrza	OKOlabs	D12345
Folia aluminiowa	Fisher Magazyn naukowy	#63-120
Aqua 5 & mikro; m C18 125 i Aring; materiał opakowaniowy	Dwutlenek węgla Phenomenex
	OKOlabs	MadMotor®-UHV
Wirówka	Eppendorf
złącza (Y PP 1/16" i 1/16x1/8")	Cole-Palmer	116891000
Delikatne wycieraczki	do zadań Fisher Scientific	022625501
Dithiothreiotol (DTT)	AmericanBio
DMSO, bezwodny	invitrogen	LS118-500
Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)	Corning	SK-78001-82
EX350 laser excimerowy	GAM Laser PI89900
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Corning	SK-12023-78
Kwas mrówkowy, klasa LC / MS	Fisher Scientific	A929-4	ilość 4 L nie jest konieczna
HEK293T komórek	Paul Shapiro Lab (University of Maryland, Baltimore)
nawilżacz	OKOlabs	Nano-LPMW stopień
HV3-2 ZAWÓR	Hamilton	BP152-500
Nadtlenek wodoru	Fisher Scientific	LS120-500
Jodoacetamid (IAA)	ACROS Organics
LABVIEW Professional 2018	National Instruments	86728
System pozycjonowania MadMotor i kontrolery	Mad City Labs	W6-4
Metanol, LC/MS Grade	Fisher Scientific	01-213-100	wystarczy dowolna marka
Mikrowirówka	Thermo Scientific	H301-T Unit-BL-PLUS
N,N′-Dimethylthiourea (DMTU)	ACROS Organics
Etap nanopozycyjny	Mad City Labs
N-tert-butyl-&alfa;-fenylonitron (PBN)	ACROS Organics
OKO Dotykowy system monitorowania	OKOlabs
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Spektrometr masowy	Thermo Scientific	7Z02936
PE50-C Miernik energii piroelektrycznej	Ophir Optronics
Penicylina-streptomycyna	Corning
Ilościowy kolorymetryczny test peptydowy Pierce	Thermo Scientific
Zestaw do oznaczania białek BCA Pierce Rapid Gold	Thermo Scientific
Proteaza trypsyny Pierce, MS Grade	Thermo Scientific	75002436
Uniwersalna nukleaza Pierce do lizy komórek	Manometr Fisher Scientific	06-666A
	OKOlabs	Filtr OKO-AIR-PUMP-BL
PTFE	OKOlabs	CO2-UNIT-BL
Sześć pierścieni z filamentem PLA 33 mm	(Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library)
sterylny inkubator	Jednostka temperatury OKOlabs OKOlabs
Pierce RIPA	Buffer Fisher Scientific	A117-50
TiNKERcad	(Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library)
Tris Base	Fisher Scientific	H325-100	dowolna 30% nadtlenek wodoru jest wystarczająca
rurka (Tygon 3.18 i 1.59 ID)	Cole-Palmer	177350250
Woda z 0,1% kwasem mrówkowym (v / v), klasa LC / MS	Fisher Scientific	A454SK-4	4 L ilość nie jest konieczna
Woda, LC / MS Grade	Fisher Scientific	88702
		90058
		KM200
		186007496

lasera Thermo Scientific