Dysocjacja komórek z nabłonka języka i mezenchymy/tkanki łącznej myszy w wieku 12,5 dnia zarodkowego i 8 tygodni

Podsumowanie

Opracowaliśmy uogólniony protokół do dysocjacji dużej ilości wysokiej jakości pojedynczych komórek z nabłonka i mezenchymy/tkanki łącznej embrionalnych i dorosłych języków myszy.

Streszczenie

Dysocjacja komórek była niezbędną procedurą do badań na poziomie pojedynczej komórki i/lub na poziomie populacji komórek (np. sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki i hodowla komórek pierwotnych). Uzyskanie żywotnych, zdrowych komórek w dużych ilościach ma kluczowe znaczenie, a optymalne warunki do tego zależą od tkanek. Populacje komórek w nabłonku języka i leżącej pod nim mezenchymie/tkance łącznej są niejednorodne, a struktury tkanek różnią się w różnych regionach i na różnych etapach rozwoju. Przetestowaliśmy protokoły izolacji komórek z nabłonka języka myszy i mezenchymy/tkanki łącznej we wczesnym stadium rozwojowym [12,5 dnia embrionalnego (E12,5)] i młodych dorosłych (8 tygodni). Czysta separacja między nabłonkiem a leżącą pod nim mezenchymą/tkanką łączną była łatwa do osiągnięcia. Jednak dalsze przetwarzanie i izolowanie komórek ma kluczowe znaczenie dla uzyskania żywotnych zdrowych komórek w dużych ilościach oraz staranny dobór bufora trawienia enzymatycznego, czasu inkubacji oraz szybkości i czasu wirowania. Inkubacja oddzielonego nabłonka lub leżącej pod nim mezenchymy/tkanki łącznej w 0,25% trypsyny-EDTA przez 30 minut w temperaturze 37 °C, a następnie wirowanie w temperaturze 200 x g przez 8 minut dała wysoką wydajność komórek przy wysokim wskaźniku żywotności (>90%), niezależnie od stadiów myszy i regionów języka. Co więcej, stwierdziliśmy, że zarówno zdysocjowane komórki nabłonkowe, jak i mezenchymalne/tkanki łącznej z języka embrionalnego i dorosłego mogą przetrwać w pożywce opartej na kulturze komórkowej przez co najmniej 3 godziny bez znacznego spadku żywotności komórek. Protokoły będą przydatne w badaniach, które wymagają przygotowania wyizolowanych komórek z języków myszy we wczesnym stadium rozwojowym (E12.5) i młodych dorosłych (8 tygodni) wymagającym dysocjacji komórek z różnych przedziałów tkankowych.

Wprowadzenie

Język ssaków jest złożonym organem decydującym o smaku, mówieniu i przetwarzaniu żywności. Składa się z wielu rodzajów wysoce zorganizowanych tkanek podzielonych na mezenchymy / tkankę łączną i pokrytych warstwowym arkuszem nabłonkowym zawierającym brodawki smakowe i kubki smakowe. Populacje komórek zarówno w nabłonku języka, jak i mezenchymie/tkance łącznej są niejednorodne. Aby lepiej zrozumieć funkcje i rozmieszczenie określonego typu komórek w języku, konieczne są badania z wykorzystaniem komórek zdysocjowanych. Na przykład sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki jest potężną i wysokoprzepustową metodą profilowania transkryptomicznego w pojedynczych komórkach, która ma na celu zrozumienie transkryptomu złożonej tkanki w rozdzielczości pojedynczej komórki^1,2,3,4. Udowodniono, że pierwotna hodowla komórkowa jest użytecznym narzędziem do badania funkcji i różnicowania komórek macierzystych/progenitorowych dla kubków smakowych^5,6. Badania te wymagają dużej ilości wysokiej jakości izolowanych populacji komórek (np. wystarczająca całkowita liczba komórek o odpowiednim stężeniu i wysokiej żywotności).

Dlatego istnieje potrzeba izolowania komórek z różnych regionów tkanek językowych i na różnych etapach rozwoju. Obecnie nie ma szczegółowego protokołu dysocjacji komórek z nabłonka języka i leżącej pod nim mezenchymy/tkanki łącznej. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowaną metodę dysocjacji komórek w celu przygotowania komórek do eksperymentów wymagających wysokiej jakości żywych komórek, takich jak sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki i pierwotne hodowle komórek macierzystych. Odkryliśmy, że wybór buforu do trawienia enzymatycznego, delikatne pipetowanie, wybór pożywki do reprodukcji oraz optymalny czas i prędkość wirowania mają kluczowe znaczenie dla wytworzenia tych dużych ilości komórek wysokiej jakości.

Protokół

Wykorzystanie zwierząt (myszy C57BL/6 w całym badaniu) zostało zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Georgii i było zgodne z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt w badaniach.

1. Wykorzystanie zwierząt

UWAGA: Myszy hodowano i utrzymywano w zwierzęciu wydziale Animal and Dairy Science na University of Georgia w temperaturze 22 °C przy 12-godzinnym cyklu dzień/noc.

1. Południe dnia wykrycia czopu pochwowego u myszy uznaje się za dzień embrionalny (E) 0,5. W poniższych eksperymentach należy wykorzystać embriony w stadium E12,5 oraz myszy postnatalne w wieku 8 tygodni.

2. Przygotowania przed eksperymentem

UWAGA: Instrumenty wymagane do tego protokołu są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Przed eksperymentem wysterylizuj instrumenty w autoklawie. W trakcie eksperymentu do sterylizacji narzędzi używaj sterylizatora koralikowego.
2. Oczyść obszar operacyjny, mikroskop stereoskopowy oraz komorę z laminarnym przepływem powietrza za pomocą chusteczek nasączonych 70% etanolem. Włącz lampę UV w komorze i pozostaw ją włączoną przez 20 min przed rozpoczęciem procedury eksperymentalnej.
3. Przygotuj mieszaninę enzymów składającą się z dispazy (5,0 mg/mL) i kolagenazy (2,0 mg/mL) w stosunku 1:1, tak aby końcowe stężenia wynosiły odpowiednio 2,5 i 1,0 mg/mL, a następnie przefiltruj roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 µm⁷.
   1. Przygotuj 1 mL mieszaniny enzymów dla języka dorosłego osobnika lub 0,5 mL dla konkretnego regionu języka (np. tylnej lub przedniej części języka).
   2. Przygotuj 2 mL mieszaniny enzymów dla języków embrionalnych.
4. Przygotuj 10 mL 2,5% BSA w 0,1 M PBS i przefiltruj roztwór za pomocą strzykawki 1 mL i filtra strzykawkowego 0,22 µm.
5. Przygotuj 500 µL 5% FBS w DMEM/F12.
6. Przygotuj 3 mL DMEM/F12 zawierającego 10% FBS i 1% BSA i przefiltruj roztwór za pomocą strzykawki 1 mL i filtra strzykawkowego 0,22 µm.

3. Oddzielenie nabłonka języka od mezenchymy/podległej tkanki łącznej

1. Oddzielenie nabłonka od mezenchymy języka myszy w stadium E12.5
   1. Uśmierć ciężarne samice myszy z embrionami w stadium E12.5 poprzez umieszczenie w komorze z CO₂, a następnie zastosowanie zwichnięcia szyjnego.
      UWAGA: Embriony myszy w stadium E12.5 pobiera się po godzinie 12:00 (po południu) w 12. dniu po wykryciu czopu pochwowego u ciężarnych samic.
   2. Przenieś myszy do strefy operacyjnej. Zwilż brzuch myszy 70% etanolem, aby zapobiec przedostawaniu się sierści do pola operacyjnego.
   3. Otwórz jamę brzuszną za pomocą nożyczek sekcyjnych, aby odsłonić rogi macicy z embrionami. Wypreparuj rogi macicy nożyczkami sekcyjnymi i przenieś je do 15 mL świeżego roztworu Tyrode'a w 100 mm szalce hodowlanej.
   4. Wypreparuj embriony (Rycina 1A₁) z rogów macicy pod mikroskopem sekcyjnym, używając mini-nożyczek i precyzyjnej pęsety.
   5. Ostrożnie szeroko otwórz jamę ustną za pomocą precyzyjnej pęsety i oddziel język od żuchwy mini-nożyczkami (Rycina 1A₂).
   6. Przemyj języki, używając 15 mL świeżego sterylnego roztworu Tyrode'a w 100 mm szalce hodowlanej.
   7. Przenieś tkanki do 2 mL mieszaniny enzymatycznej zawierającej dyspazę (2.5 mg/mL) i kolagenazę (1.0 mg/mL) w 35 mm szalce hodowlanej, używając szpatułki i precyzyjnej pęsety w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Inkubuj przez 20 min w 37 °C.
   8. Przenieś języki do 15 mL świeżego sterylnego roztworu Tyrode'a w 100 mm szalce hodowlanej i delikatnie oddziel mezenchymę od nabłonka od strony brzusznej za pomocą precyzyjnej pęsety.
      ​UWAGA: Płaty nabłonka mogą oddzielić się bez użycia siły mechanicznej podczas inkubacji.
   9. Przemyj oddzielony nabłonek i mezenchymę dwukrotnie w 15 mL świeżego sterylnego roztworu Tyrode'a w 100 mm szalce hodowlanej.
      UWAGA: Aktywność dyspazy i kolagenazy zostanie zahamowana przez EDTA podczas procedury dysocjacji komórek (krok 4.1).
2. Oddzielenie nabłonka języka od leżącej pod nim tkanki łącznej u dorosłych myszy
   1. Uśmierć mysz w wieku 8 tygodni, umieszczając ją w komorze z CO₂. Potwierdź uśmiercenie myszy brakiem oddechów oraz brakiem reakcji na uciśnięcie przedniej łapy.
   2. Przenieś myszy do strefy operacyjnej. Zwilż głowę myszy 70% etanolem, aby zapobiec przedostawaniu się sierści do jamy ustnej.
   3. Nacinij kąciki ust wzdłuż policzka nożyczkami sekcyjnymi, aby otworzyć jamę ustną. Wypreparuj język wraz z żuchwą (Rycina 1B₁) i umieść go w plastikowym naczyniu wyłożonym folią spożywczą.
   4. Trzymając język pęsetą chirurgiczną pod mikroskopem sekcyjnym, wstrzyknij mieszaninę enzymatyczną dyspazy (2.5 mg/mL) i kolagenazy (1.0 mg/mL) do przestrzeni podnabłonkowej języka poprzez krawędź cięcia (Rycina 1B₁, strzałki) tylnej części języka.
      1. Wstrzyknij 1 mL mieszaniny enzymatycznej równomiernie w cały język, aby pobrać tkankę zarówno z przedniej, jak i tylnej części języka.
      2. Wstrzyknij 0.5 mL mieszaniny enzymatycznej miejscowo w przednią część języka w celu pobrania tkanki z czubka języka lub w tylną część języka w celu pobrania tkanki z brodawek okrężnych.
         ​UWAGA: Język spuchnie w miarę gromadzenia się enzymu (Rycina 1B₂). Delikatne wstrzykiwanie enzymu może zapobiec uszkodzeniu nabłonka przez ciśnienie i pozwolić na zatrzymanie jak największej ilości enzymu w języku.
   5. Owiń język folią spożywczą i inkubuj przez 30 min w 37 °C.
   6. Użyj mini-nożyczek, aby wypreparować czubek języka i/lub brodawki okrężne, a następnie użyj szpatułki i precyzyjnej pęsety, aby przenieść tkankę do 15 mL świeżego sterylnego roztworu Tyrode'a w 100 mm szalce hodowlanej.
   7. Oddziel nabłonek od leżącej pod nim tkanki łącznej w przestrzeni podnabłonkowej przetrawionej enzymatycznie za pomocą mini-nożyczek. Przytnij tkanki do odpowiedniej wielkości zgodnie z wymaganiami dalszych eksperymentów.
   8. Przemyj oddzielony nabłonek i leżącą pod nim tkankę łączną dwukrotnie w 15 mL świeżego sterylnego roztworu Tyrode'a w 100 mm szalce hodowlanej.
      ​UWAGA: Aktywność dyspazy i kolagenazy zostanie zahamowana przez EDTA podczas procedury dysocjacji komórek (krok 4.1).

4. Dysocjacja komórek

UWAGA: Opisany tutaj protokół dysocjacji komórek można zastosować do nabłonka języka oraz mezenchymy/tkanki łącznej u myszy w stadium embrionalnym E12.5, jak i u myszy 8-tygodniowych. Aby zmniejszyć utratę komórek podczas wytrząsania i przenoszenia zawiesiny komórkowej, należy stosować komercyjne końcówki do pipet o niskiej retencji lub końcówki pokryte wcześniej 2,5% BSA w 0,1 M PBS o pH 7,4⁸.

1. Przenieść tkanki za pomocą szpatułki i precyzyjnych pęsety do 3 mL 0,25% trypsyny-EDTA w nowej szalce hodowlanej 35 mm na 30 min w temperaturze 37 °C. Delikatnie mieszać tkanki co 5 min za pomocą końcówek do pipet 1 mL.
   UWAGA: Nie należy ucinać końcówki pipety, ponieważ ostra krawędź może fizycznie uszkodzić zdysocjowane komórki.
2. Dodać 500 µL 5% FBS w DMEM/F12, aby zatrzymać reakcję, a następnie przenieść medium do probówki wirówkowej o niskiej wiązalności o pojemności 5 mL.
3. Wirować zawiesinę komórkową przy 200 x g przez 8 min w temperaturze pokojowej i usunąć nadsącz.
4. Delikatnie resuspender komórki w 3 mL DMEM/F12 zawierającego 10% FBS i 1% BSA przy użyciu końcówek do pipet 1 mL, a następnie przefiltrować komórki przez sito komórkowe 70 µm, a następnie przez sito komórkowe 35 µm.
5. Wirować zawiesinę komórkową przy 200 x g przez 8 min w temperaturze pokojowej. Usunąć większość medium, pozostawiając 50-300 µL jako objętość końcową do resuspensji komórek.
   ​UWAGA: Stężenie komórek należy dostosować do wymagań dalszych eksperymentów poprzez zmianę końcowej objętości zawiesiny pojedynczych komórek.

5. Liczenie komórek i test żywotności z użyciem komory countingowej (hemocytometru)

UWAGA: Aby zwiększyć dokładność pomiaru, zaleca się wykonanie 3 powtórzeń technicznych dla każdej próbki.

1. Delikatnie zmieszać 5-10 µL zawiesiny pojedynczych komórek z równą objętością błękitu trypanu i nanieść na komorę countingową.
   UWAGA: Przed użyciem dokładnie oczyścić komorę countingową 70% etanolem. Cząsteczki kurzu na komorze zostaną zabarwione na ciemnoniebiesko, co wpłynie na dokładność testu żywotności. Sprawdzić czystość komory pod mikroskopem.
2. Oznaczyć całkowitą liczbę komórek, liczbę komórek żywych (białe) oraz liczbę komórek martwych (ciemnoniebieskie) zabarwionych błękitem trypanu (Rycina 2, strzałki) odpowiednio w 4 polach zawierających 16 siatek (Rycina 2), korzystając z mikroskopu odwróconego z systemem obrazowania.
3. Obliczyć stężenie komórek:
   Stężenie komórek =
   1. Obliczyć żywotność:
      Żywotność =

Wyniki

Oddzielenie nabłonka języka od leżącego pod nim mezenchymy/tkanki łącznej
W embrionalnym języku myszy, po prawidłowym trawieniu enzymatycznym, widoczna jest szczelina w przestrzeni podnabłonkowej. Arkusze nabłonka w niektórych językach oddzielają się bez użycia siły mechanicznej podczas inkubacji.

W języku dorosłej myszy o pomyślnym wstrzyknięciu enzymu świadczy obrzęk w miejscach iniekcji (Rycina 1B₂), co sugeruje,...

Dyskusja

Do tej pory nie był dostępny szczegółowy protokół dysocjacji komórek z nabłonka języka i leżącej pod nim mezenchymy/tkanki łącznej. Ten obecny protokół dysocjacji komórek zapewnia powtarzalną procedurę generowania zawiesiny pojedynczej komórki o wysokiej żywotności komórek (>90%) z tkanek języka myszy, w tym arkuszy nabłonka i mezenchymów / tkanek łącznych zarówno w stadium embrionalnym, jak i pourodzeniowym, mimo że izolowane komórki z E12.5 i dorosłych myszy różnią się wielkością. Na przykład izolowane komórki z nabłon...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Gold Biotechnology	A-420-100
Mysz C57BL/6 (C57BL/6J)	Kolagenaza Jackson Laboratory	000664
(Kolagenaza A)	Sigma-Aldrich	10103586001
(średnica 35 mm)	Genesee Naczynie	32-103G
(średnica 100 mm)	Genesee Naukowa	32-107G
(Dispase II)	Sigma-Aldrich	04942078001
(Fine Scissors dla studentów)	Znajdź narzędzie naukowe	91460-11
DMEM/F12	Gibco	11320033
płodowa surowica bydlęca (FBS)	Kleszczyki higieniczne	C838U82
(kleszcze Dumount #3)	Znajdź narzędzie naukowe	Hemocytometr 11293-00
	Hausser Scientific	3520
z systemem obrazowania (EVOS XL Core Cell Imaging System)	Life Technologies	AMEX1000
końcówki do pipet o niskiej retencji	METTLER TOLEDO	17014342
(nożyczki sprężynowe Evo)	Narzędzie do nauki	15800-01
plastikowa osnowa	VWR	46610-056
(łyżka Moria)	Kleszcze chirurgiczne Fine Science Tool	10321-08
(kleszcze do laminektomii Dumount #2)	Narzędzie do nauki o	11223-20
Trypan niebieski	Gibco	15250061
Tyrode' s roztwór	Sigma-Aldrich	T2145-10L	wykonany z soli Tyrode
0,25% typozyny-EDTA	Gibco	25200056
0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)	Hoefer	33946	wykonany z 1 M PBS
0,22-μ m filtr strzykawkowy	Genesee Scientific	25-243
70% etanol	Koptec	233919	wykonany ze 100% etanolu
1-mL strzykawka	BD	8194938
5-mL probówka do mikrowirówki o niskim poziomie wiązania	Eppendorf	30122348
30-G igła	BD	9193532
35-μ m sitko do komórek	Falcon	64750
70-μ m sitko do komórek	Falcon	64752

Naczynie hodowlane hodowlane Scientific dypaza Nożyczki preparacyjne Mikroskop odwrócony Mininożyczki precyzyjnej Szpatułka nauce