Artykuł metodologiczny

Obrazowanie in vivo w pełni aktywnej tkanki mózgowej u wybudzonych larw i osobników młodocianych danio pręgowanego poprzez usunięcie czaszki i skóry

5.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62166

⸱

10 lutego 2021

 ,  ,  , 
1Cellular and Molecular Neurobiology, Zoological Institute, Technische Universität Braunschweig, 2Institute of Pathophysiology, University Medical Center of the Johannes Gutenberg University, 3Cell Physiology, Zoological institute, Technische Universität Braunschweig

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy metodę obrazowania embrionalnego mózgu danio pręgowanego in vivo, aż do stadium larwalnego i młodocianego. Ta mikroinwazyjna procedura, zaadaptowana z podejść elektrofizjologicznych, zapewnia dostęp do szczegółów komórkowych i subkomórkowych dojrzałego neuronu i może być połączona z badaniami optogenetycznymi i neurofarmakologicznymi w celu scharakteryzowania funkcji mózgu i interwencji farmakologicznej.

Streszczenie

Zrozumienie efemerycznych zmian, które zachodzą podczas rozwoju i dojrzewania mózgu, wymaga szczegółowego obrazowania w wysokiej rozdzielczości w czasie i przestrzeni w rozdzielczości komórkowej i subkomórkowej. Postępy w technologiach molekularnych i obrazowania pozwoliły nam uzyskać wiele szczegółowych informacji na temat komórkowych i molekularnych mechanizmów rozwoju mózgu w przezroczystym zarodku danio pręgowanego. Ostatnio w centrum badań znalazły się procesy udoskonalania połączeń neuronalnych, które zachodzą w późniejszych stadiach larwalnych kilka tygodni po zapłodnieniu, które są na przykład kontrolą zachowań społecznych, podejmowaniem decyzji lub zachowaniem motywowanym. Na tych etapach pigmentacja skóry danio pręgowanego zakłóca przenikanie światła do tkanki mózgowej, a rozwiązania dla stadiów embrionalnych, np. farmakologiczne hamowanie pigmentacji, nie są już możliwe.

Dlatego zapewnione jest minimalnie inwazyjne rozwiązanie chirurgiczne do mikroskopowego dostępu do mózgu obudzonego danio pręgowanego, które pochodzi z metod elektrofizjologicznych. W teleostach skórę i miękką chrząstkę czaszki można ostrożnie usunąć poprzez mikropeeling tych warstw, odsłaniając leżące pod nimi neurony i drogi aksonalne bez uszkodzenia. Pozwala to na rejestrację morfologii neuronów, w tym struktur synaptycznych i ich zawartości molekularnej, oraz obserwację zmian fizjologicznych, takich jak stany przejściowe Ca2+ lub zdarzenia transportu wewnątrzkomórkowego. Ponadto możliwe jest zbadanie tych procesów za pomocą hamowania farmakologicznego lub manipulacji optogenetycznej. Takie podejście do ekspozycji mózgu dostarcza informacji o zmianach strukturalnych i fizjologicznych w neuronach, a także o korelacji i współzależności tych zdarzeń w żywej tkance mózgowej w zakresie minut lub godzin. Technika ta nadaje się do obrazowania in vivo mózgu larw danio pręgowanego do 30 dni po zapłodnieniu, co jest najnowszym testowanym do tej pory etapem rozwoju. Daje tym samym dostęp do tak ważnych pytań, jak udoskonalanie i skalowanie synaptyczne, transport aksonalny i dendrytyczny, celowanie synaptyczne ładunku cytoszkieletu czy ekspresja zależna od lokalnej aktywności. W związku z tym można spodziewać się szerokiego zastosowania tego podejścia do montażu i obrazowania.

Wprowadzenie

W ciągu ostatnich dziesięcioleci danio pręgowany (Danio rerio) stał się jednym z najpopularniejszych organizmów modelowych kręgowców do badań nad rozwojem embrionalnym i larwalnym. Duża płodność samic danio pręgowanego w połączeniu z szybkim rozwojem zarodka ex utero i jego przezroczystością we wczesnych stadiach rozwoju embrionalnego to tylko kilka kluczowych czynników, które sprawiają, że danio pręgowany jest potężnym organizmem modelowym, który odpowiada na pytania rozwojowe1. Postępy w technologiach genetyki molekularnej w połączeniu z badaniami obrazowania in vivo o wysokiej rozdzielczości pozwoliły na zajęcie się mechanizmami biologicznymi komórek leżącymi u podstaw procesów rozwojowych2. W szczególności w dziedzinie różnicowania neuronów, fizjologii, łączności i funkcji, danio pręgowany rzucił światło na wzajemne oddziaływanie dynamiki molekularnej, funkcji mózgu i zachowania organizmu w niespotykanych dotąd szczegółach.

Jednak większość tych badań ogranicza się do etapów embrionalnych i wczesnych larw w pierwszym tygodniu rozwoju, ponieważ przejrzystość tkanki układu nerwowego jest stopniowo tracona. Na tych etapach dostęp do tkanki mózgowej jest uniemożliwiony przez mikroskopię o wysokiej rozdzielczości, która jest chroniona przez różnicowanie i pigmentację czaszki3.

Dlatego też kluczowe kwestie różnicowania, dojrzewania i plastyczności neuronów, takie jak udoskonalenie połączeń neuronalnych czy skalowanie synaptyczne, są trudne do zbadania. Te procesy komórkowe są ważne w celu zdefiniowania mechanizmów komórkowych kierujących, na przykład, zachowaniami społecznymi, podejmowaniem decyzji lub zachowaniem opartym na motywacji, obszarach, do których badania nad danio pręgowanym na kilkutygodniowych larwach przyniosły ostatnio kluczowe wnioski oparte na badaniach behawioralnych4.

Farmakologiczne metody hamowania pigmentacji u larw danio pręgowanego przez kilka tygodni są ledwo wykonalne lub mogą nawet powodować szkodliwe skutki5,6,7,8. Podwójnie lub potrójnie zmutowane szczepy ze specyficznymi defektami pigmentacji, takie jak casper9 lub crystal10, stały się niezwykle cennymi narzędziami, ale są pracochłonne w hodowli, dostarczają niewiele potomstwa i stwarzają niebezpieczeństwo akumulacji wad genetycznych z powodu nadmiernego chowu wsobnego.

Tutaj przewidziana jest minimalnie inwazyjna procedura jako alternatywa, która ma zastosowanie do każdego szczepu danio pręgowanego. Procedura ta została zaadaptowana z badań elektrofizjologicznych w celu zarejestrowania aktywności neuronalnej u żywych i przytomnych larw danio pręgowanego. W teleostach skórę i miękką chrząstkę czaszki można ostrożnie usunąć poprzez mikropeeling tych warstw, ponieważ nie są one ściśle splecione z naczyniami krwionośnymi mózgu. Pozwala to na odsłonięcie tkanki mózgowej zawierającej neurony i drogi aksonalne bez uszkodzeń oraz na rejestrację morfologii neuronów, w tym struktur synaptycznych i ich zawartości molekularnej, co z kolei obejmuje obserwację zmian fizjologicznych, takich jak stany przejścioweCa2+ lub zdarzenia transportu wewnątrzkomórkowego przez okres do kilku godzin. Ponadto, poza charakterystyką opisową, bezpośredni dostęp do tkanki mózgowej umożliwia badanie dojrzałych funkcji neuronalnych za pomocą podawania substancji neurofarmakologicznych i podejść optogenetycznych. W związku z tym prawdziwe zależności funkcji struktury można ujawnić w mózgu młodego danio pręgowanego przy użyciu tej strategii ekspozycji mózgu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj prace z udziałem zwierząt są zgodne z przepisami prawnymi (dyrektywa UE 2010/63). Utrzymanie i postępowanie z rybami zostały zatwierdzone przez lokalne organy nadzorcze oraz przez przedstawiciela ds. dobrostanu zwierząt Technische Universität Braunschweig.

1. Przygotowanie sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF), agarozy niskotopliwej i ostrych szklanych igieł

  1. Przygotować ACSF, rozpuszczając wymienione odczynniki chemiczne w wodzie destylowanej w następujących stężeniach: 134 mM NaCl (58,44 g/mol), 2,9 mM KCl (74,55 g/mol), 2,1 mM CaCl2 (110,99 g/mol), 1,2 mM MgCl2 6x H2O (203,3 g/mol), 10 mM HEPES (238,31 g/mol) oraz 10 mM d-glukozy (180,16 g/mol).
    UWAGA: W przypadku MgCl2, CaCl2 i KCl roztwory stokowe 1 M przygotowuje się w odsolonej sterylnej wodzie i przechowuje w 4 °C do późniejszego przygotowania świeżego ACSF. Glukozę, HEPES i NaCl rozpuszcza się jako związki stałe w świeżym roztworze ACSF. Podczas rozpuszczania odczynników należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Dostosować pH ACSF do wartości 7,8 za pomocą 10 M NaOH. Przygotowanie ACSF wymaga precyzyjnego odważenia odczynników i dokładnej regulacji pH, ponieważ roztwór ten zastępuje płyn mózgowo-rdzeniowy i utrzymuje warunki fizjologiczne niezbędne do pełnego funkcjonowania neuronów; w przeciwnym razie może dojść do dysfunkcji mózgu i śmierci neuronów.
  3. Świeżo przygotowany ACSF przechowywać w 4 °C przez maksymalnie 4 tygodnie. Do celów roboczych odmierzyć wymaganą objętość ACSF na dany dzień lub eksperyment i podgrzać do 25-28 °C (opcjonalnie napowietrzyć, krok 2.5).
    UWAGA: Świeżo przygotowany ASCF jest stabilny przez 1 dzień. Jeśli planowane jest jego używanie przez kilka dni, ACSF musi zostać poddany filtracji sterylnej.
  4. Do późniejszej anestezji larw przygotować roztwór stokowy d-tubokuraryny o stężeniu 50 mM w wodzie destylowanej i przechowywać roztwór w zamrażarce w temperaturze -20 °C w alikwotach po 100 µL do momentu użycia.
  5. W celu unieruchomienia ryb przygotować 2,5% agarozę niskotopliwą (LM), rozpuszczając 1,25 g agarozy LM (Tabela materiałów) w 50 mL ACSF i gotując do całkowitego rozpuszczenia agarozy.
    UWAGA: Alternatywnie można zastosować wyższe lub niższe stężenia agarozy LM, zależnie od konfiguracji eksperymentalnej. Należy jednak pamiętać, że jeśli agaroza będzie zbyt miękka, nie utrzyma ryby w pozycji podczas otwierania czaszki.
  6. Agarozę przechowywać w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, aby zapobiec jej zestaleniu oraz dlatego, że temperatura ta nie zaszkodzi larwom podczas unieruchamiania. Po schłodzeniu ugotowanej agarozy do 37 °C w kąpieli wodnej, do odmierzonej na dany dzień porcji agarozy dodać niezbędną ilość d-tubokuraryny, aby osiągnąć stężenie robocze 10 µM. Pozostałą agarozę przechowywać w 4 °C w celu uniknięcia kontaminacji.
  7. Przygotować ostre i cienkie igły szklane z kapilar szklanych (Rycina uzupełniająca 1), używając wyciągarki do mikropipet z następującymi ustawieniami:
    1. Wyciągarka I, kapilara typu 1: Heat 1: 65,8; Heat 2: 55,1; wyciąganie dwuetapowe
      Wyciągarka II, kapilara typu 2: Heat = 700; Fil = 4; Vel = 55; Del = 130; Pul = 55; wyciąganie jednoetapowe.
      UWAGA: Jednostki są specyficzne dla każdej z użytych tutaj wyciągarek i kapilar szklanych (patrz Tabela materiałów). Do przygotowania igieł szklanych można użyć również innych kapilar i wyciągarek. Igły szklane nie powinny być jednak zbyt cienkie, ponieważ mogłyby pęknąć podczas kontaktu z czaszką. Kapilara: długość: 100 mm (4 cale); średnica zewnętrzna (OD): 1,5 mm; średnica wewnętrzna (ID): 0,84 mm; włókno: tak

2. Znieczulenie larw i przygotowanie do zatopienia

  1. Rozpoczynając eksperyment w danym dniu, przenieś potrzebne zwierzęta za pomocą plastikowej pipety Pasteura do szalki Petriego o średnicy 90 mm, wypełnionej roztworem Danieau (w przypadku larw nadal utrzymywanych w szalce z roztworem Danieau) lub wodą z hodowli ryb (w przypadku larw starszych niż 7 dpf utrzymywanych w hodowli).
    1. Podczas pobierania pipetą ryb starszych niż 2 tygodnie upewnij się, że otwór pipety jest wystarczająco duży, aby uniknąć zranienia ryb podczas przenoszenia. Nie używaj siatki, ponieważ spowoduje ona uszkodzenia mechaniczne, szczególnie u młodszych larw.
  2. Dodaj rotifera lub nauplii artemia odpowiednie do wielkości larw znajdujących się w szalce Petriego, aby zapewnić swobodny dostęp do pożywienia i maksymalny stan zdrowia larw oraz zredukować stres.
  3. Do unieruchomienia przenieś wybrane larwy do szalki Petriego o średnicy 35 mm wypełnionej ACSF. Dodaj niezbędną objętość d-tubokuraryny, aby osiągnąć robocze stężenie/dawkę skuteczną 10 µM, i odczekaj kilka minut, aż larwy zostaną całkowicie unieruchomione11.
    UWAGA: W miarę wzrostu ryb lub w przypadku potrzeby szybszej pełnej anestezji (poniżej 5 min), można zwiększyć stężenie d-tubokuraryny (LD50 dla myszy wynosi 0,13 mg/kg dożylnie12). Można również zastosować inny środek anestetyczny, taki jak α-bungarotoksyna (stężenie robocze: 1 mg/mL), która wykazuje takie samo działanie jak kurara i pozwala zachować pełną aktywność mózgu13. Jeśli pełna aktywność mózgu nie jest wymagana dla badanego obiektu, opcją całkowitego znieczulenia larw jest również Tricaina w dawce nieśmiercionośnej (0,02%). Jednak Tricaina blokuje kanały sodowe, upośledzając tym samym aktywność mózgu14.
  4. Przygotuj komorę montażową, biorąc pokrywkę szalki Petriego o średnicy 35 mm, odwracając ją do góry dnem i kładąc kwadratowe szkiełko nakrywowe (24 x 24 mm) na dnie pokrywki. Schematyczny opis tych kroków przedstawiono na Rysunku 1 (część górna). Gładka powierzchnia szkła zapobiega przesuwaniu się bloku agarozy, w którym znajdują się larwy podczas procedury otwierania czaszki.
  5. Odmierz ilość ACSF potrzebną na dany dzień do odpowiedniej fiolki (np. probówki 50 mL, zlewki, butelki Schotta itp.) i natlenij ją karbogenem (5% CO2, 95% O2). W przypadku obrazowania wyłącznie morfologii (np. wzorów fluorescencji) ACSF jest nadal niezbędny, aby zapewnić integralność mózgu i uniknąć negatywnego wpływu efektów osmolarity, jednak natlenianie ACSF nie jest wymagane. Ten krok należy wykonać tylko wtedy, gdy do obrazowania niezbędna jest pełna aktywność mózgu.
    UWAGA: Aby uzyskać optymalne nasycenie medium tlenem, dodaj kamień napowietrzający do końca rurki z karbogenem. Aby zagwarantować wystarczająco wysoki poziom tlenu, konieczna jest wymiana ACSF w komorach obrazowania na świeżo natleniony ACSF co 20-60 min, w zależności od liczby i wieku larw unieruchomionych w tej samej komorze (np. dla pojedynczej larwy wymiana ACSF co godzinę jest wystarczająca; dla sześciu larw starszych niż 14 dpf unieruchomionych równolegle konieczna jest wymiana ACSF co 20 min), dlatego zaplanuj odpowiednią ilość nasyconego tlenem ACSF zgodnie z planowanym eksperymentem.

3. Osadzanie larw w bloku

  1. Przenieś w pełni znieczulone larwy za pomocą plastikowej pipety Pasteura do przygotowanej (w kroku 2.4) komory montażowej. Następnie ostrożnie usuń nadmiar medium, aby uniknąć rozcieńczenia agarozy LM. Wszystkie kolejne kroki powinny być wykonywane pod stereomikroskopem o odpowiednim powiększeniu.
    UWAGA: Przechylenie komory montażowej może pomóc w całkowitym usunięciu medium.
  2. Przejdź niezwłocznie do następnego kroku, dodając na wierzch larw wystarczająco dużą kroplę agarozy LM (około 1 mL, w zależności od rozmiaru larw), aby chronić zwierzęta przed wysychaniem i zredukować zbędny stres.
  3. Zorientuj larwy w odpowiedniej pozycji przed zastygnięciem agarozy. Upewnij się, że grzbietowa część larw jest skierowana do góry. Należy również zadbać o to, aby larwy znajdowały się jak najbliżej powierzchni agarozy.
    UWAGA: W zależności od rozmiaru i liczby larw planowanych do jednoczesnego zatopienia, można dostosować stężenie agarozy. Na przykład dla 1-3 larw w wieku 30 dpf zaleca się stężenie 1.8%-2% agarozy LM. Dla 1-4 larw w wieku 7 dpf najbardziej praktyczne jest użycie 2.5% agarozy LM, natomiast dla 5-8 larw bardziej odpowiednie jest stężenie 2%. Jeśli wymagany jest w pełni aktywny mózg, zaleca się zatapianie tylko trzech ryb jednocześnie, aby skrócić czas potrzebny na operowanie larwami. Generalnie zaleca się stosowanie niższych stężeń (1.8%-2%) im starsze są larwy lub im więcej larw planuje się zatopić jednocześnie.
  4. Jeśli obrazy będą rejestrowane przy użyciu mikroskopu odwróconego, przytnij blok agarozy zawierający larwy do kształtu małego prostopadłościanu. Jest to ważne dla późniejszego przeniesienia larw do komory obrazowania. W przypadku korzystania z mikroskopu prostego takie przycinanie nie jest konieczne, ponieważ komora montażowa może służyć również jako komora obrazowania. Na Rysunku 1 (część górna) znajduje się schematyczny opis tych kroków.

4. Odsłanianie mózgu

UWAGA: Wszystkie poniższe kroki należy przeprowadzać z najwyższą starannością, aby nie zranić niepotrzebnie larw. Jeśli do eksperymentu wymagany jest w pełni aktywny mózg, należy pamiętać, że z każdą mijającą sekundą, gdy ryba pozostaje całkowicie zamocowana w agarozie i ma odsłoniętą czaszkę bez dostępu natlenionego ACSF, mózg będzie cierpiał z powodu niedotlenienia oraz wysychania. Skutki niedoboru tlenu będą tym bardziej drastyczne, im starsze są zatopione larwy. Dlatego ważne jest, aby zabieg przeprowadzić nie tylko w możliwie najkrótszym czasie, ale także z maksymalną precyzją, aby nie spowodować mechanicznego uszkodzenia mózgu igłą. Po przeszkoleniu kroki 4.2-4.4 nie powinny zajmować więcej niż 30 s na rybę.

  1. Rozpocznij zabieg natychmiast po zastygnięciu agarozy. Najpierw odetnij nadmiar agarozy nad obszarem mózgu, który jest przedmiotem zainteresowania, aby uzyskać swobodny dostęp do głowy i wolną przestrzeń roboczą. Jeśli grzbietowa część głowy wystaje już poza agarozę, pomiń ten krok.
  2. W zależności od obszaru zainteresowania wybierz miejsce rozpoczęcia zabiegu. Za pomocą szklanej igły wykonaj niewielkie nacięcie skóry, nie wnikając zbyt głęboko w tkankę. Będzie to punkt wyjścia do oddzielania nakładającej się skóry.
    UWAGA: Aby uzyskać optymalne wyniki, nigdy nie zaczynaj bezpośrednio nad obszarem zainteresowania, aby zmniejszyć ryzyko uszkodzenia ważnych struktur. W razie potrzeby można rozpocząć nawet za tylnym mózgiem i stamtąd przesuwać się do przodu, aż do usunięcia niepożądanej części skóry.
  3. Kontynuuj, wykonując bardzo małe nacięcia wzdłuż części skóry przeznaczonej do usunięcia, przesuwając igłę tuż pod powierzchnią. W większości przypadków nie jest konieczne opasanie całego mózgu i wycinanie okrągłego fragmentu skóry i czaszki; zamiast tego wystarczy wykonać dwa nacięcia wzdłuż głowy, a następnie odsunąć skórę na jedną z stron. Rysunek 2 przedstawia schemat optymalnej strategii nacinania w celu uzyskania swobodnego dostępu do móżdżku.
    UWAGA: Ta mikrochurgia jest delikatną procedurą i prawdopodobnie będzie wymagać treningu, aby perfekcyjnie usunąć skórę bez uszkodzenia leżącego pod nią mózgu. Zaleca się również opracowanie optymalnej strategii nacinania dla danego obszaru mózgu i stosowanie jej przez cały okres eksperymentu.
  4. Natychmiast po usunięciu skóry ze wszystkich zatopionych larw wlej (natleniony) ACSF na agarozę, aby wypłukać niepożądane cząstki skóry i krew, a także utrzymać pełną aktywność mózgu i chronić go przed wyschnięciem.
    UWAGA: Jeśli do eksperymentu wymagany jest zdrowy mózg, zaleca się opracowywać maksymalnie trzy ryby jednocześnie.
  5. W przypadku korzystania z mikroskopu pionowego, przejdź bezpośrednio do obrazowania.
    1. Przy użyciu mikroskopu odwróconego, wsuń małą szpatułkę pod sześcianowy blok agarozy (krok 3.4).
    2. Dodaj małą kroplę LM-agarozy na dno komory obrazującej (np. szalki z szklanym dnem) i natychmiast obróć blok agarozy z larwami o 180° za pomocą szpatułki, a następnie delikatnie dociśnij go do dna komory obrazującej, tak aby ciekła kropla agarozy zadziałała jak klej.
    3. Po zastygnięciu agarozy wypełnij komorę obrazującą (natlenionym) ACSF, a następnie rozpocznij obrazowanie. Opis schematyczny znajduje się na Rysunku 1 (część dolna).
  6. Gdy do eksperymentu wymagana jest pełna aktywność mózgu, zawsze upewnij się, że ACSF w komorze obrazującej ma wystarczająco wysoki poziom tlenu. Aby to zapewnić, wymieniaj medium ostrożnie na świeżo natleniony ACSF, w miarę możliwości co 20-60 min (w zależności od liczby i wielkości ryb, wielkości i powierzchni komory obrazującej oraz czasu trwania obrazowania).

Proces przygotowania larw do obrazowania; schemat ustawienia eksperymentalnego do użytku z mikroskopem; etapy znieczulenia, aplikacji agarozy i wyrównania.
Rycina 1: Schematyczna procedura przygotowania danio pręgowanego z otwartą czaszką do obrazowania in vivo przedstawiona w formie etapowej. Instrukcje wykonania poszczególnych kroków znajdują się na samym schemacie. Grafika opracowana przez Floriana Hetscha i dostosowana przez Paula Schramma. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat procesu odsłaniania móżdżku w embrionach zebrafish; zilustrowana technika dostępu chirurgicznego.
Rysunek 2: Szczegółowy schemat mikrochiruurgii wykonanej w celu usunięcia fragmentów skóry i czaszki nad obszarem mózgu będącym przedmiotem zainteresowania. Czerwone koło zaznacza miejsce, w którym należy wykonać pierwsze cięcie. Czerwona przerywana linia wyznacza optymalną ścieżkę cięcia igłą, aby uzyskać swobodny dostęp do móżdżku bez jego uszkodzenia. Zielona strzałka wskazuje kierunek, w którym można łatwo odsunąć nadmiar skóry i fragmenty czaszki. Należy dopilnować, aby podczas całej procedury nigdy nie naruszyć tkanki mózgowej. Po pomyślnym odwarstwieniu skóry obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania (tutaj: móżdżek) będzie swobodnie dostępny dla każdego rodzaju obrazowania in vivo o wysokiej rozdzielczości. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 3A,C przedstawia 14 dpf larwę linii transgenicznej Tg[-7.5Ca8:GFP]bz12[15] z nienaruszoną czaszką. Komórki pigmentowe w okrywającej ją skórze są rozproszone na całej głowie i zakłócają sygnał fluorescencyjny w obszarze zainteresowania (tutaj: móżdżek). W takim stanie larwy nie jest możliwe uzyskanie obrazów mózgu o wysokiej rozdzielczości. Rysunek 3B przedstaw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiona metoda stanowi alternatywne podejście do izolacji mózgu lub leczenia larw danio pręgowanego farmaceutykami hamującymi pigmentację w celu rejestrowania obrazów neuronów w wysokiej rozdzielczości w ich środowisku in vivo . Jakość obrazów zarejestrowanych tą metodą jest porównywalna do obrazów z eksplantowanych mózgów, ale w warunkach naturalnych.

Ponadto unika się utraty intensywności fluorescencji, ponieważ nie ma potrzeby leczenia utrwalaczami18. ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Szczególnie dziękujemy Timo Fritschowi za doskonałą opiekę nad zwierzętami oraz Hermannowi Döringowi, Mohamedowi Elsaeyowi, Solowi Pose-Méndezowi, Jakobowi von Trotha, Komali Valishetti i Barbarze Winter za ich pomocne wsparcie. Jesteśmy również wdzięczni wszystkim pozostałym członkom laboratorium Köster za ich opinie. Projekt został częściowo sfinansowany przez Niemiecką Fundację Badawczą (DFG, KO1949/7-2) w ramach projektu 241961032 (dla RWK) oraz Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF; Era-Net NEURON II CIPRESS projekt 01EW1520 do JCM) zostaje uznany.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chlorek wapniaRothA119.1
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowyLeicaTCS SP8
d-GlucoseSigmaG8270-1KG
d-TubocurareSigma-AldrichT2379-100MG
Kapilara szklana typu 1WPI1B150F-4
Kapilara szklana typu 2Aparat HarvardGC100F-10
Szkiełko nakrywkowedeltalabD102424
HEPESRoth9105.4
Hoechst 33342Invitrogen (Thermo Fischer)H3570
Komora obrazowaniaIbidi81156
Chlorek potasuNormapur26764298
LM-AgarozaCondalab8050.55
Chlorek magnezu (sześciowodny)RothA537.4
Kamera mikroskopowaLeicaDFC9000 GTC
Ściągacz igieł typ 1NARISHIGEModel PC-10
Ściągacz igieł typ 2Sutter InstrumentsModel P-2000
Pipety Pasteura 3mlA.Hartenstein20170718
Chlorek soduRothP029.2
Wodorotlenek soduNormapur28244262
TricainSigma-AldrichE10521-50G
Kąpiel wodnaPhoenix InstrumentWB-12
Szalka Petriego 35 mmSarstedt833900
Szalka Petriego 90 mmSarstedt821473001

Bibliografia

  1. Hill, M. A. Embryology. Zebrafish Development. , Available from: https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development (2020).
  2. Sassen, W. A., Köster, R. W. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. Dove Medical Press. 2015 (5), 151-163 (2015).
  3. Singh, A. P., Nüsslein-Volhard, C. Zebrafish stripes as a model for vertebrate colour pattern formation. Current Biology. 25 (2), 81-92 (2015).
  4. Kalueff, A. V., et al. Time to recognize zebrafish 'affective' behavior. Brill: Behaviour. 149 (10-12), 1019-1036 (2012).
  5. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. -E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3, 522-527 (2001).
  6. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS One. 6, 22991(2011).
  7. Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development Genes and Evolution. 212, 593-598 (2003).
  8. Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C. F., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (Danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
  9. White, R., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
  10. Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490(2016).
  11. Burr, S. A., Leung, Y. L. Curare (d-Tubocurarine). Encyclopedia of Toxicology (3rd Edition). , 1088-1089 (2014).
  12. Gesler, H. M., Hoppe, J. 3,6-bis(3-diethylaminopropoxy) pyridazine bismethiodide, a long-acting neuromuscular blocking agent. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 118 (4), 395-406 (1956).
  13. Furman, B. Alpha Bungarotxin. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2018).
  14. Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PLoS One. 9 (8), 103751(2014).
  15. Namikawa, K., et al. Modeling neurodegenerative spinocerebellar ataxia type 13 in zebrafish using a Purkinje neuron specific tunable coexpression system. Journal of Neuroscience. 39 (20), 3948-3969 (2019).
  16. Hennig, M. Theoretical models of synaptic short term plasticity. Frontiers in Computational Neuroscience. 7 (45), (2013).
  17. Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
  18. Hobro, A., Smith, N. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
  19. Knogler, L. D., Kist, A. M., Portugues, R. Motor context dominates output from purkinje cell functional regions during reflexive visuomotor behaviours. eLife. 8, 42138(2019).
  20. Hsieh, J., Ulrich, B., Issa, F. A., Wan, J., Papazian, D. M. Rapid development of Purkinje cell excitability, functional cerebellar circuit, and afferent sensory input to cerebellum in zebrafish. Frontier in Neural Circuits. 8 (147), (2014).
  21. Scalise, K., Shimizu, T., Hibi, M., Sawtell, N. B. Responses of cerebellar Purkinje cells during fictive optomotor behavior in larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2067-2080 (2016).
  22. Harmon, T. C., Magaram, U., McLean, D. L., Raman, I. M. Distinct responses of Purkinje neurons and roles of simple spikes during associative motor learning in larval zebrafish. eLife. 6, 22537(2017).
  23. Zehendner, C. M., et al. Moderate hypoxia followed by reoxygenation results in blood-brain barrier breakdown via oxidative stress-dependent tight-junction protein disruption. PLoS One. 8 (12), 82823(2013).
  24. Dhabhar, F. S. The short-term stress response - mother nature's mechanism for enhancing protection and performance under conditions of threat, challenge, and opportunity. Frontiers of Neuroendocrinology. 49, 175-192 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

M zg rybki zebraobrazowanie tkanki m zgowejusuwanie czaszkilarwy rybki zebramorfologia neuron wstruktury synaptycznemikroskopia wysokiej rozdzielczo ci

Powiązane artykuły