Method Article

Obrazowanie wapnia in vivo reakcji neuronów zwojowych układu nerwowego myszy na bodźce smakowe

DOI:

10.3791/62172

⸱

February 11th, 2021

 , 
1Department of Biology, The University of Texas at San Antonio

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy, jak odsłonić kolankowaty ganglion żywej, znieczulonej myszy laboratoryjnej i jak wykorzystać obrazowanie wapnia do pomiaru reakcji zespołów tych neuronów na bodźce smakowe, co pozwala na wielokrotne próby z różnymi stymulantami. Pozwala to na dogłębne porównania, które neurony reagują na które degustacje.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich dziesięciu lat, postęp w genetycznie kodowanych wskaźnikach wapnia (GECI) przyczynił się do rewolucji w funkcjonalnym obrazowaniu in vivo. Wykorzystując wapń jako wskaźnik aktywności neuronalnej, techniki te umożliwiają monitorowanie reakcji poszczególnych komórek w dużych zespołach neuronalnych na różne bodźce w czasie rzeczywistym. My i inni zastosowaliśmy te techniki do zobrazowania reakcji poszczególnych neuronów kolankowatego zwoju na bodźce smakowe zastosowane na języki żywych, znieczulonych myszy. Zwój kolankowaty składa się z ciał komórkowych neuronów smakowych unerwiających przedni język i podniebienie, a także niektórych neuronów somatosensorycznych unerwiających małżowinę uszną ucha. Obrazowanie reakcji wywołanych smakiem poszczególnych neuronów kolankowatych zwojów za pomocą GCaMP dostarczyło ważnych informacji na temat profili strojenia tych neuronów u myszy typu dzikiego, a także sposobu na wykrycie fenotypów błędnych połączeń smaku obwodowego u myszy zmodyfikowanych genetycznie. Tutaj pokazujemy procedurę chirurgiczną polegającą na odsłonięciu zwoju kolankowatego, akwizycję obrazu fluorescencyjnego GCaMP, początkowe kroki analizy danych i rozwiązywanie problemów. Technika ta może być stosowana z transgenicznie kodowanym GCaMP lub z ekspresją GCaMP za pośrednictwem AAV i może być modyfikowana w celu zobrazowania określonych podzbiorów genetycznych będących przedmiotem zainteresowania (tj. Ekspresji GCaMP za pośrednictwem Cre). Ogólnie rzecz biorąc, obrazowanie wapnia in vivo neuronów kolankowatych jest potężną techniką monitorowania aktywności obwodowych neuronów smakowych i dostarcza informacji uzupełniających do bardziej tradycyjnych nagrań struny bębenkowej całego nerwu lub testów zachowań smakowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowym elementem obwodowego systemu smakowego ssaków jest kolankowaty ganglion. Oprócz niektórych neuronów somatosensorycznych, które unerwiają małżowinę uszną ucha, kolankowate składa się z ciał komórkowych neuronów smakowych unerwiających przedni język i podniebienie. Podobnie jak inne obwodowe neurony czuciowe, neurony kolankowate są pseudo-jednobiegunowe z długim aksonem wystającym obwodowo do kubków smakowych i centralnie do jądra pnia mózgu samotnego odcinka komunikacyjnego1. Neurony te są aktywowane głównie przez uwalnianie ATP przez komórki receptora smaku reagujące na bodźce smakowe w jamie ustnej2,3. ATP jest niezbędnym neuroprzekaźnikiem do sygnalizacji smaku, a receptory P2rx wyrażane przez neurony zwojowe smaku są niezbędne do ich aktywacji4. Biorąc pod uwagę, że komórki receptorów smaku wyrażają specyficzne receptory smaku dla określonej modalności smaku (słodkiego, gorzkiego, słonego, umami lub kwaśnego), postawiono hipotezę, że reakcje neuronów zwojowych smaku na bodźce smakowe byłyby również wąsko dostrojone5.

Nagrania całego nerwu wykazały, że zarówno struna bębenkowa, jak i większy górny nerw petrosalny przewodzą sygnały smakowe reprezentujące wszystkie pięć modalności smaku do zwoju kolankowatego6,7. Wciąż jednak pozostawiało to pytania o specyfikę reakcji neuronalnych na dany smak: czy istnieją neurony specyficzne dla modalności smaku, neurony polimodalne, czy też mieszanina obu. Zapisy pojedynczych włókien dostarczają więcej informacji na temat aktywności poszczególnych włókien i ich wrażliwości chemicznej8,9,10, ale ta metodologia ogranicza się do zbierania danych z niewielkiej liczby włókien. Podobnie, zapisy elektrofizjologiczne in vivo poszczególnych neuronów kolankowatych szczurów dostarczają informacji o reakcjach poszczególnych neuronów11,12,13, ale nadal traci aktywność populacji i daje stosunkowo niewiele zapisów neuronów na zwierzę. Aby przeanalizować wzorce odpowiedzi zespołów neuronalnych bez utraty z oczu aktywności poszczególnych neuronów, konieczne było zastosowanie nowych technik.

Obrazowanie wapnia, szczególnie przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia, takich jak GCaMP, dostarczyło tego przełomu technicznego14,15,16,17,18. GCaMP wykorzystuje wapń jako wskaźnik aktywności neuronalnej, zwiększając zieloną fluorescencję wraz ze wzrostem poziomu wapnia w komórce. Wciąż rozwijane są nowe formy GCaMP w celu poprawy stosunku sygnału do szumu, dostosowania kinetyki wiązania i dostosowania do specjalistycznych eksperymentów19. GCaMP zapewnia rozdzielczość pojedynczego neuronu, w przeciwieństwie do zapisu całego nerwu, i może jednocześnie mierzyć odpowiedzi zespołów neuronów, w przeciwieństwie do zapisu pojedynczego włókna lub pojedynczej komórki. Obrazowanie wapniowe zwojów kolankowatych dostarczyło już ważnych informacji na temat profili strojenia tych neuronów u myszy typu dzikiego16,20 i zidentyfikowało fenotypy błędnego smaku obwodowego u genetycznie zmodyfikowanych myszy18.

Jedną z głównych trudności w zastosowaniu technik obrazowania wapnia in vivo do kolankowatego ganglionu jest to, że jest on zamknięty w kostnej błonie bębenkowej. Aby uzyskać dostęp optyczny do kolankowatego, konieczna jest delikatna operacja usunięcia warstw kości, przy jednoczesnym zachowaniu nienaruszonego ganglionu. W tym celu stworzyliśmy ten przewodnik, aby pomóc innym badaczom uzyskać dostęp do zwoju kolankowatego i zobrazować reakcje fluorescencyjne tych neuronów za pośrednictwem GCaMP na bodźce smakowe in vivo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokoły dla zwierząt zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Teksańskiego w San Antonio.

1. Przygotowanie przedoperacyjne

UWAGA: Proszę zauważyć, że początkowa konfiguracja sprzętu nie jest tutaj omówiona, ponieważ będzie się różnić w zależności od używanego systemu pomp, mikroskopu, kamery i oprogramowania do obrazowania. Aby uzyskać instrukcje dotyczące konfiguracji, zapoznaj się z materiałami instruktażowymi dostarczonymi przez dostawcę sprzętu. Informacje o sprzęcie wykorzystywanym przez autorów znajdują się w Tabeli Materiałów.

  1. Upewnij się, że ciecz przepływa przez wszystkie przewody pojazdu (wody) i degustacyjne. Jeśli linia jest zablokowana, odłącz ją i spłucz wodą. Jeśli linia jest zagięta, masuj, aż płyn zacznie płynąć. Upewnij się, że płyn zaczyna się i zatrzymuje na zawołanie.
  2. Po potwierdzeniu, że wszystkie przewody są odblokowane, uruchom pojazd na 10 sekund, a następnie zamknij wszystkie zawory.
  3. Upewnij się, że oprogramowanie do obrazowania jest gotowe ze wszystkimi wymaganymi zmiennymi (np. długością próby, nazwami plików, liczbą klatek na sekundę itp.). Korzystając z μManager, pakietu oprogramowania do akwizycji obrazów typu open source, wprowadź 200 ms w polu oznaczonym Czas ekspozycji dla klatek na sekundę 5 Hz, wybierz x2 w obszarze Binning i naciśnij przycisk oznaczony Na żywo. Po rozpoczęciu wideo naciśnij przycisk po lewej stronie oznaczony ROI. Spowoduje to uzyskanie pola widzenia o wymiarach 512x512.

2. Znieczulenie i unieruchomienie zwierzęcia

UWAGA: Poniższy protokół jest procedurą terminalną zoptymalizowaną dla myszy obu płci o wadze 18-35 g. Zalecany jest do stosowania u zwierząt w wieku od 10 do 12 tygodni. Może być stosowany u zwierząt transgenicznych z ekspresją genetycznie kodowanych wskaźników wapnia (GECI), takich jak Snap25-GCaMP6s, lub zwierząt, którym stereotaktycznie wstrzyknięto wirusowe GECI. Rękawiczki, fartuch laboratoryjny i maska na twarz powinny być noszone przez cały protokół.

  1. Zwierzę należy oczyścić i wykonać dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg). Oceń głębokość znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi przed kontynuowaniem.
  2. Ogol czubek głowy i obszar chirurgiczny z przodu szyi.
  3. Włącz poduszkę grzewczą i połóż zwierzę na brzuchu na podkładce.
  4. Nałóż maść na oczy zwierzęcia, aby uniknąć wysuszenia oczu.
  5. Wykonaj nacięcie (~1 cm) w linii środkowej głowy, aby odsłonić czaszkę zwierzęcia. Usuń tkankę łączną za pomocą sterylnego wacika, aby dostępna była goła kość. Użyj aplikatora z bawełnianą końcówką, aby upewnić się, że czaszka jest sucha.
  6. Nałóż wiązanie weterynaryjne na czaszkę. Pamiętaj, aby zakryć odsłoniętą czaszkę. Poczekaj, aż klej wyschnie.
  7. W pokrywce szalki Petriego wymieszaj i nałóż warstwę cementu dentystycznego na czaszkę. Tylny koniec aplikatora z bawełnianą końcówką użytego w kroku 2.5 będzie dobrze działał w tym procesie. Umieść słupek na cemencie dentystycznym i nałóż drugą warstwę cementu dentystycznego, aby umieścić sztycę na czaszce.
  8. Pozostaw do momentu, aż cement dentystyczny będzie suchy i solidny. Przełam aplikator z bawełnianą końcówką na pół i użyj spiczastych końcówek, aby szturchnąć cement dentystyczny w celu przetestowania. Jeśli cement dentystyczny nie poddaje się szturchnięciu, zwierzę można obrócić do pozycji leżącej.

3. Tracheotomia

  1. Nałóż peeling przedoperacyjny na obszar operacyjny. Po peelingu wykonaj nacięcie w linii środkowej ~ 2 cm w skórze gardła od mostka do podbródka.
  2. Cofnij skórę i gruczoły podszczękowe, upewniając się, że w pełni odsłaniasz mięśnie dwubrzuścowe.
  3. Znajdź szew w mięśniu przytchawiczym, oddziel go rozwarstwieniem i rozejrzyj.
  4. Ostrożnie wytnij otwór w górnej części tchawicy wystarczająco duży, aby zmieścił rurkę polietylenową (średnica wewnętrzna 0,86 mm, średnica zewnętrzna 1,27 mm). Nie przecinaj więcej niż do połowy średnicy tchawicy. Włóż rurkę do tchawicy w kierunku płuc.
  5. Zmień położenie retraktorów, aby uwolnić mięśnie przytchawicze i cofnąć gruczoły podszczękowe.
  6. Sklej mięśnie przytchawicze na rurkach za pomocą minimalnej ilości kleju weterynaryjnego (patrz Rysunek 1A).

4. Otwarcie błony bębenkowej

  1. Delikatnie drażnij pożądany mięsień dwubrzuścowy (lewy lub prawy) do góry i rozsuń tkankę łączną. Przeciąć na przednim końcu mięśnia, omijając naczynia krwionośne, i cofnąć się do tyłu, aż będzie wolny od pęcherza bębenkowego.
  2. Odchyl lekko głowę do tyłu, aby unieść pęcherz bębenkowy. Zlokalizuj gałąź tętnicy szyjnej przed tylnym punktem przyczepu mięśnia dwubrzuścowego. Poczuj tylko za tym naczyniem krwionośnym wypukłą strukturę pęcherza bębenkowego.
  3. Poszukaj szwu w muskulaturze w tym miejscu (patrz Rysunek 1B). Używając dwóch zestawów cienkich kleszczy, tępo wyciąć szew, aż kość pęcherza bębenkowego będzie widoczna. Użyj zwijaczy, aby zachować wyraźny widok pęcherza bębenkowego.
  4. Znajdź szew biegnący od przodu do tyłu na bulli (patrz Rysunek 1C). Za pomocą sondy chirurgicznej przebij dziurę w kości pośrodku tego szwu. Użyj zestawu nożyczek z cienkimi końcami, aby wyciąć okrągły obszar w kości, uważając, aby nie przeciąć naczyń krwionośnych przednich, tylnych i głęboko pod pęcherzem.

5. Odsłanianie kolankowatego

  1. W tej znajduje się wypukły kawałek kości, to jest ślimak. Przed ślimakiem znajduje się mięsień, tensor błony bębenkowej (patrz Rysunek 1D). Za pomocą nożyczek sprężynowych odetnij bębenek napinacza i usuń go.
  2. Wykonaj uszczypnięcie palca u nogi. Jeśli zwierzę zareaguje, podaj mieszaninę ketaminy i ksylazyny w dawce 1/3 w celu ponownego dawkowania.
  3. Przygotuj płyn do irygacji i przewód ssący. Za pomocą sondy chirurgicznej przebij dziurę w cyplu ślimaka. Natychmiast przepłukać wypływającą ciecz i usunąć ją za pomocą odsysania. Od tego momentu ciecz ta będzie płynąć mniej więcej w sposób ciągły i będzie musiała być okresowo zajmowana kontrolą.
  4. Powiększ otwór w ślimaku. Uważaj na naczynie krwionośne otaczające ślimak do tylnej i bocznej krawędzi.
  5. Przechyl głowę myszy do przodu. Zlokalizuj otwór w kości skroniowej pod ślimakiem (patrz Rysunek 1E). Zwróć uwagę na grzbiet przed tym otworem, ten grzbiet znajduje się bezpośrednio nad siódmym nerwem.
  6. Włóż sondę chirurgiczną do otworu i ostrożnie podnieś kość skroniową, aby odsłonić siódmy nerw (patrz Rysunek 1F). Oceń, jaka część siódmego nerwu jest widoczna, a jeśli kolanko nie jest całkowicie odsłonięte, odchyl głowę zwierzęcia do tyłu i spróbuj podciągnąć kość od przodu do nerwu.
  7. Jeśli zwój nadal nie jest w pełni widoczny, wyciągnij więcej kości od spodu. Bądź bardzo ostrożny, aby nie umieścić sondy głęboko pod kością, ponieważ może to spowodować uszkodzenie kolankowatego.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Chirurgiczne odsłonięcie zwoju kolankowatego. (A) Obraz jamy szyi myszy po tracheotomii. Strzałka wskazuje na mięsień dwubrzuścowy leżący nad obszarem operacyjnym badanym w pozostałej części rysunku. (B) Obraz obszaru pod wcześniej wskazanym mięśniem dwubrzuśkowym. Strzałka wskazuje szew w mięśniach do rozwarstwienia. (c) Obraz pęcherza bębenkowego. Strzałka wskazuje szew w kości, który ma zostać zerwany za pomocą sondy chirurgicznej. (D) Obraz pola operacyjnego po otwarciu pęcherza. Dolna strzałka w lewo wskazuje ślimak, górna strzałka wskazuje tensor błony bębenkowej. Linia ramkowa oznacza obszar w (E) i (F). (E) Obraz obszaru operacyjnego po złamaniu ślimaka i usunięciu zawartości. Biała strzałka wskazuje, gdzie należy umieścić sondę chirurgiczną, o której mowa w kroku 5.6 protokołu. (F) Obraz odsłoniętego ganglionu kolankowatego. Strzałka wskazuje ciało siódmego nerwu, przerywany trójkąt otacza kolankowaty ganglion. Panele A-B, skala = 5 mm. Panele C-F, skala = 1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Uruchom panel degustacyjny

  1. Użyj ssania, aby usunąć płyn znad kolankowatego. Opcjonalnie umieść punkt chłonny, aby złagodzić przesiąkanie i ułatwić nawigację mikroskopem.
  2. Umieść zwierzę na podkładce chłonnej pod mikroskopem. Zlokalizuj zwój kolankowaty: przydatne punkty orientacyjne obejmują dziurę pozostawioną w pęcherzu, dziurę w kości skroniowej i siódmy nerw. Korzystając z filtra FITC/GFP na zakresie epifluorescencji, sprawdź, czy nie ma pojedynczych neuronów kolankowatych z ekspresją GCaMP. Obiektyw 10x (odległość robocza 10 mm) zapewni wystarczającą rozdzielczość do śledzenia aktywności poszczególnych komórek, ale można również użyć obiektywu 20x (odległość robocza 12 mm).
  3. Umieść igłę dozującą do linii degustacyjnej mocno w pysku zwierzęcia. Umieść szalkę Petriego pod pyskiem zwierzęcia, aby złapać płyn.
  4. Upewnij się, że kamera view pole widzenia mikroskopu. Zsynchronizuj początek nagrywania wideo z rozpoczęciem prezentacji degustacji.
  5. Podczas nagrywania obserwuj transmisję na żywo pod kątem odpowiedzi, dryfu i przesiąkania.
  6. Jeśli dojdzie do przesiąkania, zassaj płyn, aż widok kolanka będzie wyraźny i powtórz. Jeśli wystąpi zdrychanie, sprawdź, czy wszystkie części sztycy górnej są mocno dokręcone. Jeśli nie wystąpią żadne odpowiedzi, sprawdź, czy ciecz płynie i czy mikroskop i kamera są skupione we właściwym miejscu, bez zasłaniania pola widzenia.
  7. Powtarzaj, aż zostanie uzyskana żądana liczba filmów. Delikatnie poluzuj zwijacze, a następnie powtórz kroki 3-6 po przeciwnej stronie.
  8. Po uzyskaniu żądanych filmów dla wszystkich pożądanych zwojów, należy poddać zwierzę eutanazji poprzez zwichnięcie szyjki macicy.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z protokołem, transgeniczne zwierzę Snap25-GCaMP6s zostało uspokojone, zwoje kolankowate zostały odsłonięte, a na język nałożono degustację podczas nagrywania wideo. Celem eksperymentu było określenie, które degustacje wywołały reakcje w każdej komórce. Degustatory (30 mM AceK, 5 mM Chininy, 60 mM NaCl, 50 mM IMP + 1 mM MPG, 50 mM Kwas cytrynowy)18 rozpuszczono w wodzie DI i nałożono na język na 2 sekundy oddzielone 13 s wody DI.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tej pracy opisano krok po kroku protokół chirurgicznego odsłaniania zwoju kolankowatego i wizualnego rejestrowania aktywności jego neuronów za pomocą GCaMP6s. Procedura ta jest bardzo podobna do opisanej wcześniej17, z kilkoma godnymi uwagi wyjątkami. Po pierwsze, zastosowanie słupka pod głowę pozwala na łatwą regulację ułożenia głowy podczas zabiegu. Po drugie, jeśli chodzi o dostarczanie bodźców, podejście Wu i Dvoryanchikova polega na przepływie bodźców smakowych przez rurki przełykowe

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zgłoszenia konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują S. Humayunowi za hodowlę myszy. Finansowanie tej pracy zostało częściowo zapewnione przez UTSA's Brain Health Consortium Graduate and Postdoctoral Seed Grant (B.E.F.) oraz NIH-SC2-GM130411 dla L.J.M.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 x #5 Kleszcze InoxNarzędzia do naukiNC9792102
1ml Strzykawka z blokadą luer FisherScientific14-823-30
2 x #3 Kleszcze InoxNarzędzia do nauki o napięciuM3S 11200-10
igła dozująca o grubości 27Fisher ScientificNC1372532
3M VetbondFisher ScientificNC0398332
4-40 Śruba maszynowa Nakrętki sześciokątne3SNMS004C
4-40 Śruba z gniazdowym3SSCS04C004
Punkty chłonneFisher Scientific50-930-668
AcesulfamK Fisher ScientificA149025G
Sztuczne łzyAkorn59399-162-35
BD Tace dla alergików z Igła przymocowana na stałeFisher Scientific14-829-6D
zwijaczeFST18200-09
Płytka do krojenia chlebaThor LabsMB8
Kwas cytrynowyFisher ScientificA95-3
Cohan-Vannas Nożyczki sprężynoweNarzędzia do nauki o naprawie15000-02
Współczesny płyn Ortho-JetLang1504
Współczesny proszek Ortho-JetLang1520
Aplikatory z bawełnianą końcówkąFisher19-062-616
Niestandardowy uchwyt słupkagłowicy eMachineShopZobacz załączony plik 202410.ems
Niestandardowy metalowy słupek głowicyeMachineShopZobacz załączony plik 202406.ems
Regulator temperatury DCFHCAparat cyfrowy 40-90-8D
, sCMOS OrcaFlash4 Mikroskop zamontowany na mikroskopieHamamatsuC13440
Luneta sekcyjnaMaszynkiM80
ScientificCL7300-Kit
IMPFisher ScientificAAJ6195906
KetaminaKetavedNDC 50989-996-06
LED Zimne światło Źródło:Leica McrosystemsKL300LED
Luer Lock 1/16" Adaptery do wężyFisher01-000-116
MikroskopOlympusBX51WI
Mini-series Słupki optyczneThorlabsMS2R
MPGFisher ScientificAAA1723230
MXC-2.5 Obrotowy zacisk sondySiskiyou14030000E
NaClFisher Scientific50-947-346
szalki PetriegoFisher ScientificFB0875713A
Powietrze pod ciśnieniemAirgasAI Z300
ChininaFisher ScientificAC163720050
Samoprzylepna taśma etykietującaFisher Scientific159015R
Silikonowa rurka zaworu zaciskowego 1/32 "x 1/16" ode (na stopę)Automate Scientific05-14
Sola SM LightEngine Lumencor
Snap25-2A-GCaMP6s-DJAX025111
Student Cienkie nożyczkiFine Science Tools91460-11
Sonda chirurgicznaRoboz Sklep chirurgicznyRS-6067
Chirurgiczny Uchwyt sondyRoboz Sklep chirurgicznyRS-6061
GwintGü termann02776
Rurka BD IntramedicFisher Scientific22-046941
Dwustopniowy regulator gazuRurkiY12FM244B580-AG
Tygon - 1/16"Automate Scientific05-11
Sterownik cyfrowy/ręczny Valvelink8.2Automate Scientific01-18
Zawór zaciskowy Valvelink8.2 System perfuzyjnyAutomate Scientific17-pp-54
KsylazynaAnazowanaNADA# 139-236
do strzyżenia włosów Leica Kent winylowe Airgas

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Krimm, R. F. Factors that regulate embryonic gustatory development. BMC Neuroscience. 8, Suppl 3 4(2007).
  2. Taruno, A., Matsumoto, I., Ma, Z., Marambaud, P., Foskett, J. K. How do taste cells lacking synapses mediate neurotransmission? CALHM1, a voltage-gated ATP channel. Bioessays. (35), 1111-1118 (2013).
  3. Taruno, A., et al. Taste transduction and channel synapses in taste buds. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 473, 3-13 (2021).
  4. Kinnamon, S. C., Finger, T. E. A taste for ATP: neurotransmission in taste buds. Frontiers in Cell Neuroscience. 7, 264(2013).
  5. Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
  6. Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139 (2), 234-244 (2009).
  7. Ninomiya, Y., Tonosaki, K., Funakoshi, M. Gustatory neural response in the mouse. Brain Research. 244 (2), 370-373 (1982).
  8. Formaker, B. K., MacKinnon, B. I., Hettinger, T. P., Frank, M. E. Opponent effects of quinine and sucrose on single fiber taste responses of the chorda tympani nerve. Brain Research. 772 (1-2), 239-242 (1997).
  9. Frank, M. The classification of mammalian afferent taste nerve fibers. Chemical Senses. 1 (1), 53-60 (1974).
  10. Ogawa, H., Yamashita, S., Sato, M. Variation in gustatory nerve fiber discharge pattern with change in stimulus concentration and quality. Journal of Neurophysiology. 37 (3), 443-457 (1974).
  11. Sollars, S. I., Hill, D. L. In vivo recordings from rat geniculate ganglia: taste response properties of individual greater superficial petrosal and chorda tympani neurones. Journal of Physiology. 564, Pt 3 877-893 (2005).
  12. Yokota, Y., Bradley, R. M. Geniculate ganglion neurons are multimodal and variable in receptive field characteristics. Neuroscience. 367, 147-158 (2017).
  13. Breza, J. M., Curtis, K. S., Contreras, R. J. Temperature modulates taste responsiveness and stimulates gustatory neurons in the rat geniculate ganglion. Journal of Neurophysiology. 95 (2), 674-685 (2006).
  14. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  15. Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits: A decade of progress. Neuron. 98 (4), 865(2018).
  16. Barreto, R. P. J., et al. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517, 373-376 (2015).
  17. Wu, A., Dvoryanchikov, G. Live animal calcium imaging of the geniculate ganglion. Protocol Exchange. , 106(2015).
  18. Lee, H., Macpherson, L. J., Parada, C. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. Rewiring the taste system. Nature. 548 (7667), 330-333 (2017).
  19. Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
  20. Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6, 8171(2015).
  21. Yarmolinsky, D. A., et al. Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system. Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).
  22. Li, K. The image stabilizer plugin for ImageJ. , Available from: http://www.cs.cmu.edu/~ kangli/code/Image_Stabilizer. html (2008).
  23. Ackman, J. dF Over F movie ImageJ Plugin. , Available from: https://gist.github.com/ackman678/5817461 (2014).
  24. Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Frontiers in Neural Circuits. 14, 25(2020).
  25. Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, (2019).
  26. Zhang, J., et al. Sour sensing from the tongue to the brain. Cell. 179 (2), 392-402 (2019).
  27. Lee, D., Kume, M., Holy, T. E. A molecular logic of sensory coding revealed by optical tagging of physiologically-defined neuronal types. bioRxiv. , 692079(2019).
  28. Moeyaert, B., et al. Improved methods for marking active neuron populations. Nature Communication. 9 (1), 4440(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

In Vivo Calcium ImagingGeniculate GanglionMouse NeuronsTaste StimuliChorda Tympani PathwayElectrophysiological MethodSurgical ProcedureTympanic BullaDigastric MuscleParatracheal MusculaturePolyethylene TubingCarotid ArteryCochleaTensor Tympani Muscle