Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Kondensaty białkowe wywołane dimeryzacją chemiczną na telomerach

2.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62173

⸱

12 kwietnia 2021

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Mellon College of Science, Carnegie Mellon University, 2Department of Chemistry, School of Arts and Sciences, University of Pennsylvania

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół ilustruje chemicznie indukowany system dimeryzacji białek w celu tworzenia kondensatów na chromatynie. Pokazano tworzenie ciała jądrowego białaczki promielocytowej (PML) na telomerach za pomocą chemicznych dimeryzatorów. Wzrost, rozpuszczanie, lokalizacja i skład kropel są monitorowane za pomocą obrazowania żywych komórek, immunofluorescencji (IF) i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH).

Streszczenie

Kondensaty związane z chromatyną są zaangażowane w wiele procesów jądrowych, ale mechanizmy leżące u ich podstaw pozostają nieuchwytne. Protokół ten opisuje chemicznie indukowany system dimeryzacji białek w celu wytworzenia kondensatów na telomerach. Dimeryzator chemiczny składa się z dwóch połączonych ligandów, z których każdy może wiązać się z białkiem: odpowiednio ligand Halo z enzymem Halo i trimetoprim (TMP) z reduktazą dihydrofolianu E. coli (eDHFR). Fuzja enzymu Halo z białkiem telomeru zakotwicza dimeryzatory w telomerach poprzez kowalencyjne wiązanie ligandu i enzymu Halo. Wiązanie TMP z eDHFR rekrutuje białka oddzielające fazę fuzji eDHFR do telomerów i indukuje tworzenie kondensatu. Ponieważ interakcja TMP-eDHFR jest niekowalencyjna, kondensację można odwrócić, wykorzystując nadmiar wolnego TMP do konkurowania z dimeryzatorem o wiązanie eDHFR. Przedstawiono przykład indukowania tworzenia ciał jądrowych białaczki promielocytowej (PML) na telomerach oraz określania wzrostu, rozpuszczania, lokalizacji i składu kondensatu. Metodę tę można łatwo dostosować do indukowania kondensatów w innych lokalizacjach genomu poprzez fuzję Halo z białkiem, które bezpośrednio wiąże się z lokalną chromatyną lub z dCas9, które jest ukierunkowane na locus genomu z przewodnikiem RNA. Oferując rozdzielczość czasową wymaganą do obrazowania na żywo pojedynczej komórki przy jednoczesnym zachowaniu separacji faz w populacji komórek do testów biochemicznych, metoda ta jest odpowiednia do badania zarówno powstawania, jak i funkcji kondensatów związanych z chromatyną.

Wprowadzenie

Wiele białek i kwasów nukleinowych przechodzi separację faz ciecz-ciecz (LLPS) i samoorganizuje się w kondensaty biomolekularne, aby uporządkować biochemię w komórkach1,2. LLPS białek wiążących chromatynę prowadzi do powstawania kondensatów, które są związane z określonymi loci genomowymi i są zaangażowane w różne lokalne funkcje chromatyny3. Na przykład LLPS białka HP1 leży u podstaw tworzenia domen heterochromatyny w celu uporządkowania genomu4,5, LLPS czynników transkrypcyjnych tworzy centra transkrypcyjne do regulacji transkrypcji6, LLPS powstających mRNA i wielopłciowych białek grzebieniowych generuje ciała locus histonów w celu regulacji transkrypcji i przetwarzania mRNA histonów7. Jednak pomimo wielu przykładów odkrycia kondensatów związanych z chromatyną, mechanizmy leżące u podstaw powstawania, regulacji i funkcji kondensatu pozostają słabo poznane. W szczególności nie wszystkie kondensaty związane z chromatyną są tworzone przez LLPS i nadal potrzebne są dokładne oceny tworzenia się kondensatu w żywych komórkach8,9. Na przykład wykazano, że białko HP1 u myszy ma tylko słabą zdolność do tworzenia kropelek płynu w żywych komórkach, a ogniska heterochromatyny zachowują się jak zapadnięte kuleczki polimerowe10. Dlatego pożądane są narzędzia do indukowania kondensatów de novo na chromatynie w żywych komórkach, szczególnie te, które pozwalają na wykorzystanie obrazowania na żywo i testów biochemicznych do monitorowania kinetyki tworzenia się kondensatu, właściwości fizycznych i chemicznych powstałych kondensatów oraz komórkowych konsekwencji tworzenia się kondensatu.

Ten protokół informuje o chemicznym systemie dimeryzacji do indukowania kondensatów białkowych na chromatynie11 (Rysunek 1A). Dimeryzator składa się z dwóch połączonych ligandów oddziałujących z białkami: trimetoprimu (TMP) i ligandu Halo i może dimeryzować białka połączone z pokrewnymi receptorami: odpowiednio reduktazę dihydrofolianu Escherichia coli (eDHFR) i bakteryjny enzym alkilodehalogenazę (enzym Halo)12. Interakcja między ligandem Halo a enzymem Halo jest kowalencyjna, co pozwala na wykorzystanie enzymu Halo jako kotwicy poprzez fuzję go z białkiem wiążącym chromatynę w celu rekrutacji białka oddzielającego fazy połączonego z eDHFR do chromatyny. Po wstępnej rekrutacji, zwiększone lokalne stężenie białka rozdzielającego fazę przekracza krytyczne stężenie potrzebne do separacji faz i w ten sposób nukleuje kondensat w kotwicy (Rysunek 1B). Poprzez fuzję białek fluorescencyjnych (np. mCherry i eGFP) z eDHFR i Halo, zarodkowanie i wzrost kondensatów można wizualizować w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Ponieważ interakcja między eDHFR i TMP jest niekowalencyjna, nadmiar wolnego TMP może zostać dodany, aby konkurować z dimeryzatorem o wiązanie eDHFR. Spowoduje to uwolnienie białka separacji faz z kotwicy i rozpuszczenie kondensatu związanego z chromatyną.

Użyliśmy tego narzędzia do wywołania de novo tworzenia ciał jądrowych białaczki promielocytowej (PML) na telomerach w telomerach w telomerazo-ujemnych komórkach nowotworowych, które wykorzystują alternatywny szlak wydłużania telomerów (ALT) do utrzymania telomerów13,14. Ciała jądrowe PML to pozbawione błony przedziały biorące udział w wielu procesach jądrowych15,16 i są unikalnie zlokalizowane w telomerach ALT, tworząc APB, dla ciał PML związanych z telomerami ALT17,18. Telomery grupują się w APB, przypuszczalnie w celu zapewnienia szablonów naprawczych dla ukierunkowanej na homologię syntezy telomerów DNA w ALT19. Rzeczywiście, synteza DNA telomerów została wykryta w APB, a APB odgrywają istotną rolę we wzbogacaniu czynników naprawy DNA na telomerach20,21. Jednak mechanizmy leżące u podstaw składania APB i grupowania telomerów w APB były nieznane. Ponieważ białka telomerów w komórkach ALT są unikalnie modyfikowane przez małe modyfikatory podobne do ubikwityny (SUMO)22, wiele składników APB zawiera miejsca sumoilacji 22,23,24,25 i/lub motywy oddziałujące z SUMO (SIM)26,27 i interakcje SUMO-SIM napędzają separację faz28, postawiliśmy hipotezę, że sumoilacja na telomerach prowadzi do wzbogacenia białek zawierających SUMO/SIM, a interakcje SUMO-SIM między tymi białkami prowadzą do separacji faz. Białko PML, które ma trzy miejsca sumoilacji i jedno miejsce SIM, może być rekrutowane do sumoilowanych telomerów w celu utworzenia APB, a koalescencja płynnych APB prowadzi do grupowania telomerów. Aby przetestować tę hipotezę, użyliśmy systemu dimeryzacji chemicznej, aby naśladować tworzenie APB wywołane sumoilacją poprzez rekrutację SIM do telomerów ( Rysunek 2A) < sup class = "xref">11. GFP jest połączony z haloenzymem w celu wizualizacji oraz z białkiem wiążącym telomery TRF1 w celu zakotwiczenia dimeryzatora w telomerach. Karta SIM jest połączona z eDHFR i mCherry. Kinetyka tworzenia kondensatu i grupowania telomerów wywołanego fuzją kropel jest śledzona za pomocą obrazowania żywych komórek. Separacja faz jest odwracana przez dodanie nadmiaru wolnego TMP, aby konkurować z wiązaniem eDHFR. Immunofluorescencja (IF) i fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) służą do określania składu kondensatu i asocjacji telomerowej. Rekrutacja SIM wzbogaca SUMO o telomery, a indukowane kondensaty zawierają PML, a zatem są APB. Rekrutacja mutanta SIM, który nie może wchodzić w interakcje z SUMO, nie wzbogaca SUMO w telomery ani nie indukuje separacji faz, co wskazuje, że podstawową siłą napędową kondensacji APB jest interakcja SUMO-SIM. Zgadzając się z tą obserwacją, polimery polySUMO-polySIM, które połączyły się z czynnikiem wiążącym TRF2 RAP1, mogą również indukować tworzenie APB29. W porównaniu z systemem fuzji polySUMO-polySIM, w którym separacja faz zachodzi tak długo, jak długo produkowana jest wystarczająca ilość białek, przedstawione tutaj podejście do dimeryzacji chemicznej indukuje separację faz na żądanie, a tym samym oferuje lepszą rozdzielczość czasową w celu monitorowania kinetyki separacji faz i procesu grupowania telomerów. Ponadto ten system dimeryzacji chemicznej pozwala na rekrutację innych białek w celu oceny ich zdolności do indukowania separacji faz i grupowania telomerów. Na przykład, nieuporządkowane białko rekrutowane do telomerów może również tworzyć kropelki i grupować telomery bez indukowania tworzenia APB, co sugeruje, że grupowanie telomerów jest niezależne od chemii APB i opiera się tylko na właściwości cieczy APB11.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Produkcja przejściowych linii komórkowych

  1. Komórki akceptorowe U2OS hodowli na szkiełkach nakrywkowych o wymiarach 22 x 22 mm (do obrazowania na żywo) lub okrągłych szkiełkach nakrywkowych o średnicy 12 mm (dla IF lub FISH) pokrytych poli-D-lizyną na 6-dołkowej płytce z pożywką wzrostową (10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% roztworu penicyliny-streptomycyny w DMEM), aż osiągną 60-70% zgrywki.
  2. Zastąp pożywkę wzrostową 1 ml pożywką do transfekcji (pożywka wzrostowa bez roztworu penicyliny-streptomycyny) przed transfekcją.
  3. Do każdej studzienki transfekcyjnej dodać 4 μl odczynnika do transfekcji do 150 μl zredukowanej pożywki surowicy, wirować przez 10 sekund, a następnie inkubować przez 5 minut.
  4. Do każdej studzienki dodać plazmid konstruktu Halo (Halo-GFP-TRF1 lub Halo-TRF1) i plazmid konstruktu eDHFR (mutant mCherry-eDHFR-SIM lub mCherry-eDHFR-SIM) w stosunku masowym 1:1 (0,5 μg plazmidu konstrukującego Halo z 0,5 μg plazmidu konstrukującego eDHFR) do 150 μl zredukowanej pożywki surowicy, kroplami, mieszać przez pipetowanie.
    UWAGA: Znaczniki są stosunkowo małe (Halo 33 kD, eDHFR 28 kD, mCherry 30 kD, eGFP 27 kD) i nie zaobserwowano wpływu na separację faz. Zaleca się jednak używanie mutantów, takich jak mutant SIM używany tutaj, aby upewnić się, że zachowanie fazy jest wrażliwe na mutacje, a nie na tagi. Karta SIM pochodzi z PIASx28,30. Sekwencja SIM to AAAGTCGATGTAATTGACTTAACGATCGAATCTAGCAGCGATGAAGAAGAAGATCCACCGGCTAAACGT. Mutacja SIM jest generowana przez mutację aminokwasów SIM VIDL do VADA28, a sekwencja to AAAGTCGATGTAGCCGACGCCACGATCGAATCTAGCAGGATGAAGAAGAAGAAGATCCACCGGCTAAACGT. Zdeponowaliśmy nasze plazmidy w addgene: #164644 3XHalo-GFP-TRF1; #164646 mWiśnia-eDHFR-SIM; #164649 Mutant mCherry-eDHFR-SIM.
  5. Dodać 150 μl mieszaniny odczynnika do transfekcji i zredukowanej pożywki surowicy do 150 μl zredukowanej pożywki surowicy z DNA, kroplami, mieszać pipetując, inkubować przez 5 minut.
  6. Dodać 300 μl mieszaniny odczynnika do transfekcji i DNA do komórek, kroplami, a następnie umieścić komórki z powrotem w inkubatorze.
  7. Odczekaj 24-48 godzin przed obrazowaniem na żywo, immunofluorescencją (IF) lub fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH).

2. Dimeryzacja telomerów

  1. Rozpuścić dimeryzatory w dimetylosulfotlenku w stężeniu 10 mM i przechowywać w plastikowych probówkach do mikrowirówek w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania.
    UWAGA: Zamiast używać dimeryzatora z TMP bezpośrednio połączonym z Halo (TMP-Halo, TH), używany jest dimeryzator TMP-NVOC-Halo (TNH), który ma światłoczuły łącznik, 6-nitroweratryl oksykarbonylowy (NVOC), między TMP a Haloligand31. Dzieje się tak, ponieważ TNH (~5 minut) potrzebuje mniej czasu, aby dyfundować do komórki niż TH (~20 minut). Przedstawione tutaj wyniki można również uzyskać za pomocą TH. Podczas korzystania z TNH należy uważać, aby nie wystawiać dimeryzatora na działanie światła, aby uniknąć rozszczepienia NOVC. Z TNH należy obchodzić się w ciemnym pomieszczeniu ze słabą lampą światła czerwonego, przechowywać dimeryzator w bursztynowych plastikowych rurkach i owinąć pojemnik zawierający TNH lub poddane działaniu substancji ogniwa folią aluminiową. Obrazowanie TNH za pomocą DIC jest bezpieczne.
  2. Pobrać podwielokrotność 10 mM dimeryzatora od -80 °C i rozcieńczyć w pożywce do stężenia podstawowego 10 μM i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  3. Gdy są gotowe do użycia, rozcieńczyć dimeryzatory z 10 μM roztworu podstawowego do końcowego stężenia roboczego 100 nM w pożywce wzrostowej (do utrwalonego obrazowania) lub pożywce do obrazowania. Potraktuj komórki dimeryzatorami 100 nM (stężenie końcowe) na scenie w celu obrazowania na żywo lub inkubuj przez 4-5 godzin w celu immunofluorescencji (IF) i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH).
    UWAGA: Stężenie zastosowanych dimerizerów wpływa na wydajność dimeryzacji, a tym samym na separację faz. Stężenie dimeryzatora pozwalające na maksymalną wydajność dimeryzacji zależy od typu komórki i stężenia białka kotwicznego, dlatego będzie musiało zostać określone dla różnych eksperymentów. Jednym z prostych sposobów jest inkubacja komórek wykazujących ekspresję białka kotwiczącego i mCherry-eDHFR (bez fuzji z białkiem rozdzielającym fazy lub fuzji z mutantem nierozdzielającym faz) i określenie stężenia dimeryzatora, przy którym osiąga się najwyższą intensywność mCherry w kotwicy. Bardziej systematycznym podejściem jest inkubacja komórek wyrażających kotwicę tylko z różnymi stężeniami dimeryzatorów, a następnie z barwnikiem wiążącym Halo, aby pomóc określić stężenie dimeryzatora, przy którym intensywność barwnika wiążącego Halo zaczyna się stabilizować (tj. wszystkie kotwice połączone Halo są zajęte przez dimeryzator i nie pozostają już dla barwnika wiążącego Halo)32.
  4. Aby odwrócić dimeryzację, inkubuj komórki z dimeryzatorami przez 2-5 godzin (z obrazowaniem na żywo lub bez) lub do momentu osiągnięcia pożądanej wielkości kropelki i dodaj do komórek 100 μM wolnego TMP (stężenie końcowe) rozcieńczonego w pożywce do obrazowania.

3. Immunofluorescencja (IF)

  1. Wysiew 105 komórek na okrągłych szkiełkach nakrywkowych o średnicy 12 mm pokrytych poli-D-lizyną na płytce 6-dołkowej. Następnie przetransfekuj dwa plazmidy (Halo-GFP-TRF1 z mutantem mCherry-eDHFR-SIM lub mCherry-eDHFR-SIM) i odczekaj 24-48 godzin przed przystąpieniem do immunofluorescencji.
    UWAGA: Odczekaj więcej niż jeden dzień po transfekcji, aby uzyskać wyższą ekspresję.  
  2. Rozcieńczyć dimeryzatory pożywką wzrostową do osiągnięcia końcowego stężenia 100 nM, dodać rozcieńczone dimeryzatory do komórek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 4-5 godzin.
    UWAGA: Separacja faz jest szybko indukowana po dodaniu dimerizerów (< 30 minut). Dłuższa inkubacja pomaga kropelkom zgrubić się do większych rozmiarów. Śledzenie wzrostu kropel za pomocą obrazowania na żywo może być wykorzystane do określenia czasu potrzebnego kropelkom do osiągnięcia pożądanego stanu.
  3. Utrwal komórki w roztworze PBS zawierającym 4% formaldehydu i 0,1% Triton X-100 przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby przepuszczalność komórek. Umyj komórki 3 razy za pomocą PBS.
    UWAGA: Po tym kroku można go wstrzymać, a komórki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia.
    Uwaga: Formaldehyd jest szkodliwy przez drogi oddechowe, a po połknięciu podrażnia również oczy, układ oddechowy i skórę oraz stanowi potencjalne zagrożenie rakiem. Należy nosić środki ochrony osobistej, używać tylko w okapie chemicznym. Po użyciu wrzuć go również do pojemnika na odpady, nie wyrzucaj go do zlewu.
  4. Szkiełka nakrywkowe przemyć dwukrotnie 50 μl TBS-Tx i raz 50 μl buforu do rozcieńczania przeciwciał (AbDil). TBS-Tx był produkowany przez TBS, 0,1% Triton X-100 i 0,05% Na-azydku. AbDil został wyprodukowany przez TBS-Tx, 2% BSA i 0,05% Na-azydku.
  5. Inkubować każde szkiełko nakrywkowe z 50 μl pierwszorzędowego przeciwciała anty-PML (rozcieńczenie 1:50 w AbDil) / anty-SUMO1 (rozcieńczenie 1:200 w AbDil) / anty-SUMO2/3 (rozcieńczenie 1:200 w AbDil) w temperaturze 4 °C w wilgotnej komorze przez noc. Można również użyć przeciwciała mCherry (rozcieńczenie 1:200 w AbDil), aby pomóc w wykryciu sygnału mCherry dla FISH.
    UWAGA: FISH wygasza sygnał fluorescencyjny mCherry, co utrudnia różnicowanie komórek transfekowanych plazmidami mCherry od tych, które nie były transfekowane w eksperymentach FISH. Zaleca się stosowanie przeciwciał mCherry. Alternatywnie można stworzyć stabilną linię komórkową eksprymującą białko zawierające eDHFR.
  6. Przemyj szkiełka nakrywkowe 3 razy za pomocą AbDil, aby usunąć niezwiązane przeciwciało pierwszorzędowe.
  7. Inkubować komórki z przeciwciałem drugorzędowym [przeciwciało drugorzędowe anty-mysie IgG (H+L) sprzężone z Alexa Fluor 647 dla PML i SUMO, przeciwciałem anty-króliczym IgG (H+L) skoniugowanym z Alexa Fluor 555 dla mCherry, oba w rozcieńczeniu 1:1000 w AbDil] przez 1 godzinę w ciemnym pudełku w temperaturze pokojowej.
  8. Umyj szkiełka nakrywkowe 3 razy za pomocą TBS-Tx.
  9. Na szkiełkach należy oznaczyć DAPI rozcieńczonym w podłożu montażowym, aby osiągnąć końcowe stężenie DAPI 1 μg/ml. Następnie umieść 2 μl rozcieńczonego DAPI na szkiełku. Odwróć szkiełka nakrywkowe i umieść je na kropli DAPI, zaczerpnij dodatkowy płyn z krawędzi szkiełka nakrywkowego.
  10. Uszczelnij lakierem do paznokci, pozostaw do wyschnięcia i spłucz wodą od wierzchu szkiełka nakrywkowego. Zapisz w zamrażarce do obrazowania.

4. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH)

  1. Wysiew 105 komórek na okrągłych szkiełkach nakrywkowych o średnicy 12 mm pokrytych poli-D-lizyną na płytce 6-dołkowej. Komórki transfekcyjne ze zmutowanymi plazmidami Halo-TRF1 i mCherry-eDHFR-SIM lub mCherry-eDHFR-SIM i odczekać 24-48 godzin przed przystąpieniem do FISH. Etap dimeryzacji jest taki sam, jak opisano w 3.2.
    UWAGA: W tym przypadku TRF1 nie jest połączony z GFP, więc zielony kanał jest zwolniony dla sondy telomerowego DNA.
  2. Utrwal komórki 4% formaldehydem przez 10 minut w temperaturze pokojowej i umyj 4 razy PBS. W przypadku IF-FISH należy przejść do protokołu IF i po zmyciu przeciwciał drugorzędowych w IF (3.8) ponownie połączyć komórki z 4% formaldehydem przez 10 minut w temperaturze pokojowej i przemyć trzykrotnie PBS.
  3. Odwodnić szkiełka nakrywkowe w serii etanolowej (70%, 80%, 90%, po 2 minuty).
  4. Inkubować szkiełka nakrywkowe za pomocą sondy PNA 488-telC (stosunek 1:2000) w 5 μl roztworu hybrydyzacyjnego w temperaturze 75 °C przez 5 minut. Roztwór hybrydyzacyjny zawiera 70% dejonizowanego formamidu, 10 mM Tris (pH 7,4), 0,5% odczynnika blokującego. Następnie inkubować przez noc w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej.
  5. Szkiełka nakrywkowe umyć buforem do płukania (70% formamidu, 10 mM Tris) 2 minuty 3 razy w temperaturze pokojowej i zamontować za pomocą 1 μg/ml DAPI w podłożu montażowym do obrazowania.
    UWAGA: Protokół FISH jest opublikowanym protokołem33'34.

5. Obrazowanie na żywo

  1. Gdy komórki są gotowe do obrazowania, zamontuj szkiełka nakrywkowe w komorach magnetycznych z komórkami utrzymywanymi w 1 ml pożywki obrazowej bez czerwieni fenolowej na podgrzewanym stoliku w komorze środowiskowej.
  2. Ustaw mikroskop i aparaturę do kontroli środowiska. Obrazy uzyskano za pomocą mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem z obiektywem 1,4 NA 100x, napędem Piezo Z-Drive, kamerą EMCCD (Electron Multipling Charge-coupled Device) oraz modułem laserowym wyposażonym w lasery 455, 488, 561, 594 i 647 nm sterowane przez oprogramowanie do obrazowania. Moce wyjściowe dla wszystkich laserów wynoszą 20 mW mierzone na końcu światłowodu.
  3. Zlokalizuj komórki z jasnym sygnałem GFP na telomerach i dyfuzyjnie zlokalizowanym sygnałem mCherry w nukleoplazmie. Znajdź około 20 komórek, zapamiętaj każdą pozycję z informacjami x, y, z i ustaw parametry obrazowania poklatkowego z odstępem 0,5 μm, co daje łącznie 8 μm w Z i 5-minutowym interwałem czasowym przez 2-4 godziny zarówno dla kanałów GFP, jak i mCherry. Używaj 30% intensywności 594 nm i 50% 488 nm, z czasami naświetlania 200 ms i wzmocnieniem kamery 300,
    UWAGA: Moc wyjściowa jednostek laserowych wynosi 20 mW. Jasne ogniska GFP wskazują na większy rozmiar kotwicy, który może łatwiej zarodkować kondensaty. Znajdź komórki o szerokim zakresie sygnału mCherry, ponieważ separacja faz zależy od stężenia SIM w komórce. Ogniwa ze zbyt słabym lub zbyt jasnym sygnałem mCherry mogą nie rozdzielać faz. Aby uniknąć fotowybielania, nie używaj zbyt dużej mocy lasera ani zbyt długiego czasu naświetlania.
  4. Rozpocznij obrazowanie i wykonaj jednorazową pętlę jako wstępną dimeryzację. Wstrzymać obrazowanie, dodać 0,5 ml pożywki obrazowej zawierającej 15 μl 10 μM dimeryzatora do komory obrazowania na stoliku, tak aby końcowe stężenie dimeryzatora wynosiło 100 nM. Wznów obrazowanie.
  5. Gdy jesteś gotowy do odwrócenia dimeryzacji, przerwij obrazowanie, dodaj 0,5 ml pożywki obrazowej zawierającej 2 μl 100 mM podstawowego TMP do komory obrazowania na stoliku, aby uzyskać końcowe stężenie 100 μM TMP. Kontynuuj obrazowanie komórek przez 1-2 godziny.

6. Poprawiono obrazowanie

  1. Ten sam mikroskop ustawiony co obrazowanie na żywo, podgrzewanie sceny nie jest potrzebne. Użyj 488 nm do obrazowania telomerów FISH, 561 nm dla mCherry If i 647 nm dla PML lub SUMO IF.
    UWAGA: Jeśli nie używasz przeciwciała mCherry, po prostu bezpośrednio zobrazuj białko mCherry, ale sygnał może być przyciemniony z powodu wygaszania w FISH. Nadal używaj lasera 561 nm zamiast 594 nm do obrazowania mCherry, aby uniknąć przebijania sygnału Cy5 do mCherry.
  2. Zlokalizuj około 30-50 komórek z czerwonym sygnałem (mCherry lub mCherry IF), aby wybrać transfekowane komórki.
  3. Zdjęcia zostały wykonane w odstępach 0,3 μm, co daje łącznie 8 μm w Z, aby zebrać więcej sygnałów. Użyj 80% intensywności 647 nm, 80% 561 nm i 70% intensywności 488 nm, z czasami naświetlania 600 ms i wzmocnieniem aparatu 300.

7. Przetwarzanie obrazów poklatkowych

  1. Zdefiniuj binarny dla telomerów
    Wybierz jedną komórkę z informacjami o całym czasie i stosie z, wybierz tylko kanał GFP i utwórz warstwę binarną, definiując próg. Dostosuj dolną i górną wartość progu i użyj funkcji, takich jak "Gładki", "Wyczyść" i "Wypełnij otwory", aby zobaczyć, jak dobrze próg podnosi żądane obiekty we wszystkich punktach czasowych.
  2. Odejmij tło
    Wybierz wszystkie kanały, narysuj prostokątny region zainteresowania (ROI) na tle (oprócz komórki). Zdefiniuj ten zwrot z inwestycji jako tło, a następnie odejmij intensywność tła.
  3. Połącz binarne telomery z intensywnością telomerów
    Wybierz binarny telomery i połącz go z kanałem GFP, aby obliczyć intensywność GFP w obiektach binarnych jako intensywność telomerów.
  4. Obliczać liczbę telomerów i intensywność w czasie
    Określ, które informacje mają zostać wyeksportowane, takie jak czas, identyfikator obiektu, średnia intensywność, suma intensywności i dane eksportu. Użyj oprogramowania do wykreślania figur, aby odczytać wyeksportowaną tabelę i wygenerować dane liczbowe liczby telomerów i intensywności telomerów (zsumuj intensywność w objętości każdego telomera, a następnie uśrednij dla wszystkich telomerów w komórce) w czasie.

8. Przetwarzanie obrazów o stałych komórkach

  1. Zdefiniuj plik binarny dla APBs
    Wybierz transfekowane komórki do analizy, szukając sygnału w kanale 561 nm. Postępując zgodnie z procedurą opisaną w 7.1, zdefiniuj próg zarówno w kanale GFP (telomer DNA FISH), jak i Cy5 (PML lub SUMO IF), aby wygenerować plik binarny odpowiednio dla telomerów i ciał PML lub SUMO. Połącz warstwy binarne GFP i Cy5 i utwórz nową warstwę zawierającą cząstki, które mają sygnał GFP i Cy5, aby reprezentować kolokalizację ciała PML na telomerach, a więc APB.
  2. Obliczać liczbę i intensywność APB/SUMO
    Odejmij tło obrazu zgodnie z 7.2. Połącz warstwę binarną APB/SUMO z kanałem Cy5 zgodnie z 7.3. Obliczać liczbę i intensywność APB/SUMO. Eksport i wykreślenie danych zgodnie z punktem 7.4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reprezentatywne obrazy lokalizacji telomerowej SUMO, zidentyfikowane za pomocą telomerowej hybrydyzacji in situ DNA (FISH) oraz immunofluorescencji (IF) białka SUMO, przedstawiono na Rysunku 2. Komórki z rekrutacją SIM wykazywały zwiększone wzbogacenie SUMO1 oraz SUMO 2/3 na telomerach w porównaniu z komórkami z rekrutacją zmutowanego SIM. Wskazuje to, że indukowane dimeryzacją SIM wzbogacenie SUMO na telomerach zależy od oddziaływań SUMO-SIM.

Reprezentatywny film...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten wykazał tworzenie i rozpuszczanie kondensatów na telomerach za pomocą systemu dimeryzacji chemicznej. Kinetyka separacji faz i grupowania telomerów wywołanego fuzją kropelek jest monitorowana za pomocą obrazowania na żywo. Lokalizacja i skład kondensatu są określane za pomocą DNA FISH i białka IF.

W tym protokole istnieją dwa krytyczne kroki. Pierwszym z nich jest określenie stężenia białka i dimeryza. Sukces w indukowaniu lokalnej separacji faz w locus genomu opiera się na wzrośc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez amerykańskie Narodowe Instytuty Zdrowia (1K22CA23763201 do H.Z., GM118510 do D.M.C.) i fundację Charlesa E. Kaufmana do H.Z. Autorzy pragną podziękować Jasonowi Tonesowi za korektę rękopisu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% trypsyna, 0,1% EDTA w HBSS bez wodorowęglanu wapnia, magnezu i soduCorningMT25053CI
16% formaldehydu (w/v), bez metanoluThermo Scientific28906Przygotuj 1% w 1x PBS
6-dołkowa płytka hodowlanaVWR10861-554
Folia aluminiowaFisher Scientific01-213-101
Przeciwciało anty-mCherryAbcamAb183628
Przeciwciało anty-PMLSanta Cruzsc966
Przeciwciało anty-SUMO1AbcamAb32058
Przeciwciało anty-SUMO2/3CytoszkieletAsm23
Roche11096176001
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Fisher ScientificBP9706100
Tuba BTX micro 1,5ML VWR89511-258
Szkiełka nakrywkowe kołoweThermo Scientific3350
 NikonMQS31000
DAPIFisher ScientificD1306
Dimetylosulfotlenek  Sigma-Aldrich472301
DMEM z L-Glutaminą, 4,5 g/l glukozy i pirogronianem soduCorningMT10017CV
Kamera EMCCDiXon Life 897
EthanolFisher Scientific4355221
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, regiony zatwierdzone przez USDAGibcoA4766801
Formamid, DejonizowanyMilliporeSigma46-101-00ML
Kozia anty-mysia IgG (H + L), rekombinowane przeciwciało wtórne, Alexa Fluor 647InvitrogenA28181
Kozia anty-królicza IgG (H+L), rekombinowane przeciwciało drugorzędowe, Alexa Fluor 647InvitrogenA32733
Precyzyjna, prosta, stożkowa, ultra cienka pęseta punktowa / kleszczeFisher Scientific12-000-122
Moduł scalania laserowego NikonNIIMHF47180
Leibovitz's L-15 MediumGibco21083027
Lipofectamine 2000 Odczynnik do transfekcjiInvitrogen11668027
Oprogramowanie do kreślenia figurek, MATLABmikroskopu MathWorks
Fisher Scientific34487
Lakier do paznokciFisher Scientific50-949-071
Oprogramowanie do obrazowania, NIS-Elements Nikon
Opti-MEM Zredukowany środek surowicyGibco51985091
ParafilmBemis13-374-12
PBS 10x, pH 7,4Fisher Scientific70-011-044
Roztwór penicyliny-streptomycyny, 100XGibco15140122
Piezo Z-Drive Physik Instrumente (PI)91985
Końcówki do pipetVWR10017
Szkiełka mikroskopowe z gładkimi i matowymi narożnikamiFisher Scientific22-037-246
Roztwór poli-D-lizynySigma-AldrichA-003-E
Azydek soduFisher ScientificBP922I-500
Wirujący dyskYokogawaCSU-X1
Kwadratowe szkiełka nakrywkoweThermo Scientific3305
TBS 10x rozwiązanieFisher ScientificBP2471500
TelC-Alexa488PNA BioF1004
TMPZsyntetyzowane przez laboratoriumDostępne na żądanie
TNHZsyntetyzowane przez laboratoriumDostępne na żądanie
Tris SolutionFisher Scientific92-901-00ML
Triton X-100 10% roztwórMilliporeSigma64-846-350MLPrzygotuj 0,5% w 1x linia komórkowa PBS
U2OsZ laboratorium E.V. Makayev (Uniwersytet Technologiczny Nanyang, Singapur)HTB-96
VECTASHIELD Antifade Mounting MediumVector LaboratoriesNC9524612
Odczynnik blokujący Mikroskop konfokalny Pudełko na slajdy Chenoweth Chenoweth

Bibliografia

  1. Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
  2. Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).
  3. Sabari, B. R., Dall'Agnese, A., Young, R. A. Biomolecular condensates in the nucleus. Trends in Biochemical Sciences. , 1-17 (2020).
  4. Strom, A. R., et al. Phase separation drives heterochromatin domain formation. Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).
  5. Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1α suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).
  6. Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
  7. Hur, W., et al. CDK-Regulated phase separation seeded by histone genes ensures precise growth and function of histone locus bodies. Developmental Cell. 54 (3), 379-394 (2020).
  8. McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences. Genes & Development. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).
  9. Peng, A., Weber, S. C. Evidence for and against liquid-liquid phase separation in the nucleus. Non-coding RNA. 5 (4), (2019).
  10. Erdel, F., et al. Mouse heterochromatin adopts digital compaction states without showing hallmarks of HP1-driven liquid-liquid phase separation. Molecular Cell. 78 (2), 236-249 (2020).
  11. Zhang, H., et al. Nuclear body phase separation drives telomere clustering in ALT cancer cells. Molecular Biology of the Cell. 31 (18), 2048-2056 (2020).
  12. Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer. Nature Communications. 5, 1-9 (2014).
  13. Yeager, T. R., et al. Telomerase-negative immortalized human cells contain a novel type of promyelocytic leukemia (PML) body. Cancer Research. 59 (17), 4175-4179 (1999).
  14. Zhang, J. M., Zou, L. Alternative lengthening of telomeres: From molecular mechanisms to therapeutic outlooks. Cell and Bioscience. 10 (1), 1-9 (2020).
  15. Corpet, A., et al. PML nuclear bodies and chromatin dynamics: catch me if you can. Nucleic Acids Research. , 1-23 (2020).
  16. Li, Y., Ma, X., Wu, W., Chen, Z., Meng, G. PML nuclear body biogenesis, carcinogenesis, and targeted therapy. Trends in Cancer. 6 (10), 889-906 (2020).
  17. Dilley, R. L., Greenberg, R. A. ALTernative telomere maintenance and cancer. Trends in Cancer. 1 (2), 145-156 (2015).
  18. Sobinoff, A. P., Pickett, H. A. Alternative lengthening of telomeres: DNA repair pathways converge. Trends in Genetics. 33 (12), 921-932 (2017).
  19. Draskovic, I., et al. Probing PML body function in ALT cells reveals spatiotemporal requirements for telomere recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15726(2009).
  20. Zhang, J. M., Yadav, T., Ouyang, J., Lan, L., Zou, L. Alternative lengthening of telomeres through two distinct break-induced replication pathways. Cell Reports. 26 (4), 955-968 (2019).
  21. Loe, T. K., et al. Telomere length heterogeneity in ALT cells is maintained by PML-dependent localization of the BTR complex to telomeres. Genes and Development. 34 (9-10), 650-662 (2020).
  22. Potts, P. R., Yu, H. The SMC5/6 complex maintains telomere length in ALT cancer cells through SUMOylation of telomere-binding proteins. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (7), 581-590 (2007).
  23. Chung, I., Leonhardt, H., Rippe, K. De novo assembly of a PML nuclear subcompartment occurs through multiple pathways and induces telomere elongation. Journal of Cell Science. 124 (21), 3603-3618 (2011).
  24. Shen, T. H., Lin, H. K., Scaglioni, P. P., Yung, T. M., Pandolfi, P. P. The mechanisms of PML-nuclear body formation. Molecular Cell. 24 (3), 331-339 (2006).
  25. Shima, H., et al. Activation of the SUMO modification system is required for the accumulation of RAD51 at sites of DNA damage. Journal of Cell Science. 126 (22), 5284-5292 (2013).
  26. Yalçin, Z., Selenz, C., Jacobs, J. J. L. Ubiquitination and SUMOylation in telomere maintenance and dysfunction. Frontiers in Genetics. 8, 1-15 (2017).
  27. Sarangi, P., Zhao, X. SUMO-mediated regulation of DNA damage repair and responses. Trends in Biochemical Sciences. 40 (4), 233-242 (2015).
  28. Banani, S. F., et al. Compositional control of phase-separated cellular bodies. Cell. 166 (3), 651-663 (2016).
  29. Min, J., Wright, W. E., Shay, J. W. Clustered telomeres in phase-separated nuclear condensates engage mitotic DNA synthesis through BLM and RAD52. Genes and Development. 33 (13-14), 814-827 (2019).
  30. Song, J., Durrin, L. K., Wilkinson, T. A., Krontiris, T. G., Chen, Y. Identification of a SUMO-binding motif that recognizes SUMO-modified proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14373-14378 (2004).
  31. Zhang, H., Chenoweth, D. M., Lampson, M. A. Chapter 7 - Optogenetic control of mitosis with photocaged chemical dimerizers. Mitosis and Meiosis Part A. 144, 157-164 (2018).
  32. Zhang, H., et al. Optogenetic control of kinetochore function. Nature Chemical Biology. 13 (10), 1096-1101 (2017).
  33. Cho, N. W., Dilley, R. L., Lampson, M. A., Greenberg, R. A. Interchromosomal homology searches drive directional ALT telomere movement and synapsis. Cell. 159 (1), 108-121 (2014).
  34. Dilley, R. L., et al. Break-induced telomere synthesis underlies alternative telomere maintenance. Nature. 539 (7627), 54-58 (2016).
  35. Aonbangkhen, C., Zhang, H., Wu, D. Z., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Reversible control of protein localization in living cells using a photocaged-photocleavable chemical dimerizer. Journal of the American Chemical Society. 140 (38), 11926-11930 (2018).
  36. Shin, Y., et al. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optoDroplets. Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).
  37. Shin, Y., et al. Liquid nuclear condensates mechanically sense and restructure the genome. Cell. 175 (6), 1481-1491 (2018).
  38. Xiang, X., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene tagging: a step-by-step protocol. Methods in Molecular Biology. 1961, 255-269 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Klastrowanie telomer wseparacja fazkondensaty chromatynyobrazowanie ywych kom rekimmunofluorescencyjna hybrydyzacja in situ FISHinterakcja SUMO SIMznakowanie blisko ciowecia a j drowe PML
Kondensaty białkowe wywołane dimeryzacją chemiczną na telomerach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.