Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie narzędzia E1A Minigene do badania zmian splicingu mRNA

DOI:

10.3791/62181

⸱

22 kwietnia 2021

 ,  , 
1Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual de Campinas

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia szybkie i użyteczne narzędzie do oceny roli białka o niescharakteryzowanej funkcji w alternatywnej regulacji splicingu po leczeniu chemioterapeutycznym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

przetwarzanie mRNA obejmuje wiele jednoczesnych etapów przygotowania mRNA do translacji, takich jak capping 5', dodawanie poli-A i splicing. Oprócz konstytutywnego splicingu, alternatywny splicing mRNA umożliwia ekspresję wielofunkcyjnych białek z jednego genu. Ponieważ badania interaktomu są na ogół pierwszą analizą nowych lub nieznanych białek, powiązanie białka przynęty z czynnikami splicingu wskazuje, że może ono uczestniczyć w procesie splicingu mRNA, ale określenie, w jakim kontekście lub jakie geny są regulowane, jest procesem empirycznym. Dobrym punktem wyjścia do oceny tej funkcji jest użycie klasycznego narzędzia minigene. W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie minigenu adenowirusowego E1A do oceny alternatywnych zmian splicingu po różnych bodźcach stresu komórkowego. Oceniliśmy splicing minigenu E1A w HEK293 stabilnie nadekspresjonującym białko Nek4 po różnych zabiegach stresowych. Protokół obejmuje transfekcję minigenu E1A, leczenie komórkowe, ekstrakcję RNA i syntezę cDNA, a następnie analizę PCR i żelu oraz kwantyfikację wariantów splicingu E1A. Zastosowanie tej prostej i sprawdzonej metody w połączeniu z konkretnymi terapiami jest wiarygodnym punktem wyjścia do rzucenia światła na procesy komórkowe lub na to, jakie geny mogą być regulowane przez splicing mRNA.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Splicing jest jednym z najważniejszych etapów przetwarzania eukariotycznego mRNA, który następuje jednocześnie z cappingiem 5'mRNA i poliadenylacją 3'mRNA, składającą się z usunięcia intronów, a następnie połączenia eksonowego. Rozpoznawanie miejsc splicingu (SS) przez spliceosom, kompleks rybonukleoprotein zawierający małe rybonukleoproteiny (snRNP U1, U2, U4 i U6), małe RNA (snRNA) i kilka białek regulatorowych1 jest niezbędne do splicingu.

Oprócz usuwania intronów (konstytutywnego splicingu), u eukariontów, introny mogą być zachowane, a eksony mogą być wykluczone, konfigurując proces zwany alternatywnym splicing mRNA (AS). Alternatywny splicing pre-mRNA rozszerza zdolność kodowania genomów eukariotycznych, umożliwiając produkcję dużej i zróżnicowanej liczby białek ze stosunkowo niewielkiej liczby genów. Szacuje się, że 95-100% ludzkich mRNA, które zawierają więcej niż jeden ekson, może zostać poddanych alternatywnemu splicingowi2,3. Ma to fundamentalne znaczenie dla procesów biologicznych, takich jak rozwój neuronów, aktywacja apoptozy i komórkowa reakcja na stres4, zapewniając organizmowi alternatywy do regulacji funkcjonowania komórek przy użyciu tego samego repertuaru genów.

Maszyneria niezbędna do alternatywnego łączenia jest taka sama, jak używana do konstytutywnego splicingu, a użycie SS jest głównym czynnikiem decydującym o alternatywnym występowaniu splicingu. Splicing konstytutywny jest związany z wykorzystaniem silnych miejsc splicingu, które są zwykle bardziej podobne do motywów konsensusu dla rozpoznawania spliceosomów5.

Alternatywne eksony są zazwyczaj rozpoznawane mniej efektywnie niż konstytutywne eksony, gdy ich cis-regulatorowe elementy, sekwencje w 5'SS i 3'SS flankujące te eksony, wykazują gorszą zdolność wiązania ze spliceosomem. mRNA zawiera również regiony zwane wzmacniaczami lub tłumikami zlokalizowanymi w eksonach (egzoniczne wzmacniacze splicingu (ESE) i egzoniczne tłumiki splicingu (ESS)) oraz introny (introniczne wzmacniacze splicingu (ISE) i introniczne tłumiki splicingu (ISS)) które odpowiednio zwiększają lub tłumią użycie eksonów5. Sekwencje te są rozpoznawane przez elementy transregulacyjne lub czynniki splicingowe (SF). SF są reprezentowane głównie przez dwie rodziny białek, czynniki splicingowe bogate w serynę/argininę (SRSF), które wiążą się z ESE, oraz rodzinę heterogenicznych rybonukleoprotein jądrowych (hnRNP), które wiążą się z sekwencjami ESSs5.

Alternatywny splicing może być modulowany przez fosforylację/defosforylację czynników trans-, modyfikując partnerów interakcji i lokalizację komórkową czynników splicingowych6,7,8. Zidentyfikowanie nowych regulatorów czynników splicingu może dostarczyć nowych narzędzi do regulacji splicingu, a w konsekwencji niektórych metod leczenia raka.

Anufrieva et al.9, w profilu ekspresji genów mikromacierzy mRNA, zaobserwował stałe zmiany w poziomach składników spliceosomalnych w 101 liniach komórkowych i po różnych warunkach stresu (leki na bazie platyny, promieniowanie gamma, inhibitory topoizomerazy, inhibitory kinazy tyrozynowej i taksany). Związek między wzorcem splicingu a skutecznością chemioterapii został już wykazany w komórkach raka płuc, które są oporne na chemioterapię, wykazując zmiany w częstości wariantów kaspazy-910. Komórki HEK293 leczone panelem chemioterapeutyków wykazują zmiany w splicingu ze wzrostem wariantów proapoptotycznych. Gabriel et al.11 zaobserwowali zmiany w co najmniej 700 zdarzeniach splicingu po leczeniu cisplatyną w różnych liniach komórkowych, wskazując, że szlaki splicingu są dotknięte cisplatyną. Modulatory splicingu wykazały już działanie przeciwnowotworowe, co pokazuje, że splicing jest ważny dla rozwoju nowotworu, a przede wszystkim odpowiedzi na chemioterapię12. W związku z tym scharakteryzowanie nowych białek, które regulują splicing po czynnikach stresorów komórkowych, takich jak chemioterapeutyki, jest bardzo ważne dla odkrycia nowych strategii leczenia.

Wskazówki dotyczące alternatywnej regulacji splicingu z badań interaktomowych, szczególnie ważne dla scharakteryzowania funkcji nowych lub niescharakteryzowanych białek, mogą wymagać bardziej ogólnego i prostego podejścia do weryfikacji rzeczywistej roli białka w AS. Minigeny są ważnymi narzędziami do analizy ogólnej roli białka wpływającego na regulację splicingu. Zawierają one segmenty z genu będącego przedmiotem zainteresowania, zawierające naprzemiennie splicingowane i flankujące regiony genomowe13. Użycie narzędzia minigenu umożliwia analizę splicingu in vivo z kilkoma zaletami, takimi jak długość minigenu, która jest niewielka i dlatego nie stanowi ograniczenia dla reakcji amplifikacji; ten sam minigen może być oceniany w różnych liniach komórkowych; Wszystkie składniki komórkowe, głównie ich regulujące modyfikacje potranslacyjne (fosforylacja i zmiany w kompartmentach komórkowych) są obecne i można się do nich zaadresować13,14. Co więcej, zmiany w alternatywnym wzorcu splicingu można zaobserwować po stresie komórkowym, a zastosowanie systemu minigenu pozwala zidentyfikować szlak modulowany przez różne bodźce.

Istnieje już kilka systemów minigenów, które są specyficzne dla różnych rodzajów zdarzeń splicingu13,14, jednakże, jako test wstępny, minigene E1A15 jest bardzo dobrze ugruntowanym alternatywnym systemem reporterowym do badania selekcji 5'SS in vivo. Tylko z jednego genu, E1A, pięć mRNA jest wytwarzanych przez alternatywne splicingowanie oparte na wyborze trzech różnych miejsc splicingu 5′ i jednego głównego lub jednego mniejszego miejsca splicingu 3′16,17,18. Ekspresja wariantów E1A zmienia się w zależności od okresu infekcji adenowirusowej19,20.

Pokazaliśmy wcześniej, że obie izoformy Nek4 oddziałują z czynnikami splicingowymi, takimi jak SRSF1 i hnRNPA1, i podczas gdy izoforma 2 zmienia alternatywny splicing minigenu E1A, izoforma 1 nie ma wpływu na to21. Ponieważ izoforma 1 jest najliczniejszą izoformą i zmienia oporność na chemioterapię i odpowiedź na uszkodzenie DNA, oceniamy, czy może zmienić alternatywny splicing minigenu E1A w warunkach stresu.

Test Minigene jest prostą, tanią i szybką metodą, ponieważ wymaga jedynie ekstrakcji RNA, syntezy cDNA, amplifikacji i analiz żelu agarozowego, i może być użytecznym narzędziem do oceny od możliwego wpływu na alternatywny splicing przez białko będące przedmiotem zainteresowania, aż do wpływu różnych zabiegów na komórkowy alternatywny wzór splicingu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Komórki poszycia

UWAGA: W tym opisanym protokole użyto stabilnych linii komórkowych HEK293, wcześniej wygenerowanych dla stabilnej indukowalnej ekspresji Nek421, jednak ten sam protokół jest odpowiedni dla wielu innych linii komórkowych, takich jak HEK29322, HeLa23,24,25,26, U-2 OS27, COS728, SH-SY5Y29. Wzorzec ekspresji izoform minigenu E1A w warunkach podstawowych różni się w zależności od tych komórek i powinien być scharakteryzowany dla każdego stanu. Protokół ten nie ogranicza się do stabilnych linii komórkowych. Najpowszechniejszym podejściem do oceny białka kandydującego jest przejściowa kotransfekcja polegająca na zwiększaniu jego ilości przy ustalonej ilości minigenu. Ten sam protokół jest odpowiedni dla ogniw nokautujących.

  1. Komórki tabliczkowe z uwzględnieniem kontroli nośnika, nietransfekowanej i GFP.
  2. Hodowla komórek HEK293 ze stabilną ekspresją interesującego genu w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 4,5 g/l glukozy, 4 mM L-glutaminy i utrzymywana w 100 μg/ml higromycyny B, na płytkach poddanych działaniu kultur tkankowych w temperaturze 37 °C w 5% CO2 i wilgotnej atmosferze.
  3. Podziel komórki za pomocą 0,25% trypsyny-EDTA. Płytka 3 x 105 komórek na płytkach 6-dołkowych i inkubować je przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w 5% CO2,
    UWAGA: W przypadku transfekcji komórki muszą być zlewane w 70-80%, aby zmniejszyć śmierć komórki po transfekcji.

2. Transfekcja komórkowa

UWAGA: użyto tutaj 1-2 μg plazmidu minigenu pMTE1A, jednak ilość DNA, jak również czas ekspresji, muszą być utrzymywane na minimalnym poziomie, aby uniknąć toksyczności. Na przykład wysoką toksyczność zaobserwowano w komórkach HeLa po 30 godzinach transfekcji 1 μg DNA pMTE1A. Do opisanej tutaj transfekcji użyto odczynnika do transfekcji na bazie lipidów

  1. Sprawdź konfluencję komórek 24 godziny po posiewie i transfekuj stabilne komórki HEK293 tylko wtedy, gdy 70-80% zlewania się.
  2. Ostrożnie usuń pożywkę do hodowli komórkowych za pomocą pipety, zamiast używać systemu pompy próżniowej. Następnie ostrożnie dodać 2 ml kompletnej pożywki DMEM bez antybiotyków i włożyć płytkę z powrotem do inkubatora.
  3. Przygotować probówkę z buforem do transfekcji (200 μl/studzienkę), dodać 2 μg DNA pMTE1A, przetrząsnąć, a następnie dodać 2 μl odczynnika do transfekcji. Ponownie wirować i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Wyjąć płytki z inkubatora i ostrożnie dodawać kroplami mieszaninę transfekcji.
  5. Do stabilnych komórek HEK293 dodać tetracyklinę (0,5 μg/ml) w celu indukcji ekspresji Nek4 6 godzin po transfekcji. Zmiana medium nie jest konieczna.
    UWAGA: Objętości/ilości opisane w tej sekcji dotyczą jednego dołka. Przygotuj mieszaninę dla wszystkich studzienek użytych w eksperymencie w tej samej probówce.
  6. Przygotuj jeden dobrze do transfekcji EGFP lub innego plazmidu wyrażającego fluorofor, aby oszacować skuteczność transfekcji. Lepsze wyniki można zaobserwować przy skuteczności transfekcji wynoszącej co najmniej 40%, ale wcześniej obserwowano dobre wyniki przy niższej wydajności transfekcji.
  7. Podczas korzystania z kotransfekcji (białko odsetek i minigen) należy dobrze współpracować z komórkami nietransfekowanymi, aby uniknąć uzyskania wyników z endogennego mRNA. W przypadku E1A komórki HEK293 już wyrażają gen E1A30.

3. Przygotowanie leków

UWAGA: Czas i koncentracja leczenia zostały wybrane na podstawie wyników literatury, które wskazują na zmiany w alternatywnym splicingu dla niektórych genów.

  1. Przed rozpoczęciem testu należy wykonać krzywą dawka-odpowiedź, aby określić minimalne stężenie alternatywnej indukcji splicingu bez wpływu na żywotność komórek.
  2. Przygotować roztwór podstawowy paklitakselu w etanolu o stężeniu 5 mM. Końcowe stężenie wynosi 1 μM. Przechowywać w temperaturze -20 °C. Użyć 0,02% etanolu jako kontroli pojazdu.
  3. Przygotować roztwór cisplatyny, rozcieńczając w 0,9% NaCl w stężeniu około 0,5 mg/ml (1,66 mM). Chronić przed światłem, wirować i inkubować w łaźni termalnej w temperaturze 37 °C przez 30 min. Końcowe stężenie wynosi 30 μM. Przygotować świeże lub przechowywać w temperaturze 2-10 °C przez okres do jednego miesiąca.
    UWAGA: Wszystkie leki muszą być chronione przed światłem.

4. Leczenie i pobieranie komórek

UWAGA: Stabilne komórki HEK293 zostały pobrane 48 godzin po transfekcji i w tym celu zostały poddane leczeniu 24 godziny po transfekcji, ponieważ najwyższy poziom ekspresji Nek4 osiągany jest w ciągu 48 godzin. Jednak w tym czasie zaobserwowano wysoki poziom ekspresji izoformy 13S (do 90%). Aby zmniejszyć udział izoformy 13S, spróbuj poddać leczeniu i zebrać komórki 30 godzin po maksymalnej transfekcji.

  1. Używaj końcówek i probówek wolnych od RNA/DNaz. Przeprowadzić ekstrakcję całkowitego RNA odczynnikiem fenolowo-chloroformowym zgodnie z zaleceniami producenta.
  2. 24 godziny po transfekcji sprawdzić morfologię komórek i skuteczność transfekcji za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
  3. Usuń pożywkę do hodowli komórkowych, najlepiej za pomocą pipety zamiast systemu pompy próżniowej. Następnie dodać pożywkę do hodowli komórkowych z chemioterapeutykami w opisanym wcześniej stężeniu końcowym.
  4. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 18 - 24 godziny.
  5. Zebrać RNA, wyrzucając pożywkę do hodowli komórkowych do pojemnika i dodając 0,5 - 1 ml odczynnika do ekstrakcji RNA bezpośrednio do studzienki. Jeśli studzienki są bardzo zlewające, użyj 1 ml odczynnika do ekstrakcji RNA, aby poprawić jakość RNA.
  6. Homogenizować pipetą i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. W tym momencie protokół można wstrzymać, przechowując próbki w temperaturze -80 °C lub natychmiast przejść do ekstrakcji RNA.
    UWAGA: Odczynnik do ekstrakcji RNA na bazie fenolu jest toksyczny i wszystkie procedury należy wykonywać w dygestoriach chemicznych, a pozostałości należy odpowiednio zutylizować.

5. Ekstrakcja RNA i synteza cDNA

  1. W dygestorii rozmrozić próbki i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Dodać 0,1 -0,2 ml chloroformu i energicznie wymieszać.
  2. Inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  3. Wirować przez 15 minut w temperaturze 12 000 x g i temperaturze 4 °C.
  4. Zebrać górną fazę wodną i przenieść do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Zbierz około 60% całkowitej objętości; jednak nie pobieraj DNA ani fazy organicznej (dolnej).
  5. Dodać 0,25 - 0,5 ml izopropanolu i mieszać przez odwrócenie 4 razy. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Wirować przy 12 000 x g przez 10 minut, w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
  7. Przemyć osad RNA dwukrotnie etanolem (75% w wodzie uzdatnionej dietylowęglanem (DEPC)). Wirować przy 7 500 x g przez 5 minut i wyrzucić etanol.
  8. Usuń nadmiar etanolu, odwracając rurkę na ręczniku papierowym, a następnie pozostaw rurkę otwartą w dygestorium, aby częściowo wysuszyć granulkę przez 5 - 10 minut.
  9. Zawiesić osad RNA w 15 μl wody uzdatnionej DEPC.
  10. Określ ilościowo całkowite RNA za pomocą absorbancji przy 230 nm, 260 nm i 280 nm w celu sprawdzenia jakości RNA.
  11. Aby zweryfikować całkowitą jakość RNA, uruchom 1% żel agarozowy wstępnie potraktowany 1,2% (v/v) 2,5% roztworu podchlorynu sodu przez 30 min31.
  12. Przeprowadź syntezę cDNA przy użyciu 1-2 μg całkowitego RNA.
    1. Odpipetować RNA, 1 μl oligo-dT (50 μM), 1 μl dNTP (10 mM) i uzupełnić objętość do 12 μl wodą wolną od nukleaz. Inkubować w termocyklerze przez 5 minut w temperaturze 65 °C.
    2. Wyjąć próbki z termocyklera do ochłodzenia i przygotować mieszaninę reakcyjną: 4 μl buforu odwrotnej transkryptazy, 2 μl ditiotreitolu (DTT) i 1 μl inhibitora rybonukleazy. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 minuty.
    3. Dodać 1 μl termostabilnej odwrotnej transkryptazy. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 50 minut i inaktywować enzym w temperaturze 70 °C przez 15 minut
      UWAGA: cDNA może być przechowywane w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni. Przeprowadzić kontrolę bez odwrotnej transkryptazy (NRT) pod kątem zanieczyszczenia genomu spowodowanego dyskryminacją przypuszczalnych zdarzeń retencji intronacyjnej.

6. PCR minigenu pMTE1A

  1. Wykonaj PCR ze składem reakcji (1,5 mM MgCl2, 0,3 mM mieszaniny dNTP, 0,5 μM każdego startera, 2,5 U polimerazy Taq na gorąco i 150 ng cDNA) w następujących warunkach:
    94 °C przez 2 min, 29 cykli: 94 °C przez 1 min, 50 °C przez 2 min, 72 °C przez 2 min, 72 °C przez 10 min.
  2. Załaduj 20-25 μl produktu PCR do 3% żelu agarozowego zawierającego barwnik kwasem nukleinowym i pracuj pod napięciem 100 V przez około 1 godzinę.

7. Analiza żelu za pomocą oprogramowania do przetwarzania i analizy obrazu32

  1. Po serii sfotografuj żel (za pomocą systemu akwizycji obrazu żelu), unikając nasycenia pasm i określ ilościowo prążki za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu.
  2. W celu kwantyfikacji rozważ pasma na ~631 pz, ~493 pz i ~156 pz, które odpowiadają odpowiednio izoformom 13S, 12S i 9S.
  3. Z menu Plik oprogramowania otwórz plik obrazu uzyskany z systemu akwizycji obrazu. Przekonwertuj na skalę szarości, dostosuj jasność i kontrast oraz usuń szumy odstające, jeśli to konieczne.
  4. Narysuj prostokąt wokół pierwszego pasa ruchu za pomocą narzędzia Zaznaczanie prostokąta i zaznacz go za pomocą przycisku Analizuj | Żele | Wybierz polecenie Pierwszy pas lub naciskając skrót klawiaturowy.
  5. Użyj myszy, aby kliknąć i przytrzymać środek prostokąta na pierwszym pasie ruchu i przeciągnij go na następny pas. Przejdź do punktu Analiza | Żele | Wybierz opcję Next Lane (Następny pas) lub naciśnij dostępny skrót. Powtórz ten krok dla wszystkich pozostałych pasów ruchu.
  6. Po podświetleniu i ponumerowaniu wszystkich pasów ruchu przejdź do punktu menu Analizuj | Żele | Narysuj pasy ruchu, aby narysować wykres profilu każdego pasa ruchu.
  7. Za pomocą narzędzia Zaznaczanie linii prostej narysuj linię w poprzek podstawy każdego szczytu odpowiadającego każdemu pasmu, pomijając szum tła. Po zamknięciu wszystkich szczytów z każdej alei wybierz narzędzie Różdżka i kliknij wewnątrz każdego szczytu. Dla każdego wyróżnionego piku pomiary powinny pojawić się w wyświetlonym oknie Wyniki.
  8. Zsumować natężenie ze wszystkich 3 pasm dla każdej próbki i obliczyć wartość procentową dla każdej izoformy w stosunku do całości.
  9. Wykreślić zawartość procentową każdej izoformy lub różnice w zawartości procentowej w stosunku do próbek niepoddanych działaniu substancji.
    UWAGA: Upewnij się, że suma trzech wariantów E1A musi być równa 100%.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A 5' przy użyciu minigenu E1A został przeprowadzony w celu oceny zmian w profilu splicingu w komórkach po ekspozycji na chemioterapię. Oceniono rolę Nek4 - izoformy 1 w regulacji AS w stabilnych komórkach HEK293 po leczeniu paklitakselem lub cisplatyną.

Region E1A adenowirusa jest odpowiedzialny za produkcję trzech głównych mRNA z jednego prekursora RNA ze względu na użycie różnych donorów splicingu. Mają w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Minigeny są ważnymi narzędziami do określania skutków globalnego alternatywnego splicingu in vivo. Minigen adenowirusowy E1A jest z powodzeniem stosowany od dziesięcioleci do oceny roli białek poprzez zwiększenie ich ilości w komórce13,14. W tym miejscu proponujemy zastosowanie minigenu E1A do oceny alternatywnego splicingu po ekspozycji na chemioterapeutyk. Zastosowano stabilną linię komórkową eksprymującą izoformę Nek4 1, unikając artefaktów nadekspresji spowod...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, poprzez Grant Temático 2017/03489-1 dla JK i stypendium dla FLB 2018/05350-3) oraz Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) za finansowanie tych badań. Chcielibyśmy podziękować dr Adrianowi Krainerowi za dostarczenie plazmidu pMTE1A oraz Zerlerowi i współpracownikom za ich pracę nad klonowaniem E1A. Dziękujemy również prof. dr Patrícii Moriel, prof. dr Wandzie Pereirze Almeidzie, prof. dr Marcelo Lancellottiemu i prof. dr Karinie Kogo Cogo Müller za umożliwienie nam korzystania z ich przestrzeni laboratoryjnej i sprzętu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100 pb Drabinka DNAInvitrogen15628-050
Płytka 6-dołkowaSarstedt833920
AgarozaSigmaA9539-250G
CisplatynaSigmaP4394
DEPC wodaThermoFisherAM9920
DMEMThermoFisher11965118
dNTP mixThermoFisher10297-018
Surowica bydlęca - FBSMikroskop12657029
System akwizycji obrazowania żelu Leica DMIL LED FLUO - ChemiDoc Gel Imagin SystemBio-Rad
GFP - pEGFPC3Clontech
Wygenerowane z Flp-In™ T-REx&handel; 293 - Invitrogen i opisany w ref 21
Hygromycyna BThermoFisher10687010Używany do konserwacji komórek Flp-In
Oprogramowanie do przetwarzania i analizy obrazu - oprogramowanieref. 32
Odczynnik do transfekcji na bazie lipidów - jetOPTIMUS Polyplus OdczynnikPolyplus117-07
Oligo DTThermoFisher18418020
Czytnik płytek PaclitxelInvitrogenP3456
/ absorbancja UVBiotechEpoch Biotek / adapter Take3
pMTE1ADostarczone przez dr Adriana Krainera
pMTE1AF Invitrogen  5' -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3
pMTE1A RInvitrogen5' -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3'
Wirówka z chłodzeniemEppendorfF5810R
Odwrotna transkryptaza - M-MLVThermoFisher28025013
Odwrotna transkryptaza - Indeks górny IVThermoFisher18090050
Inhibitor rybukleazy RNAse OUTThermoFisher10777-019
Ekstrakcja RNA odczynnik na bazie fenolu i chloroformu - TrizolThermoFisher15596018
SybrSafe Barwnik żelowy DNAThermoFisherS33102
TaqPlatinum Thermo10966026
TetracyklinaSigmaT3383Używany do indukcji ekspresji Flaga pusta lub Nek4- Flag
Termocykler Bio-RadBio-RadT100
TrypsynaSigmaT4799
fluorescencyjny ThermoFisher Stabilne komórki HEK293 - HEK293 Flp-In FIJI plazmid

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ule, J., Blencowe, B. J. Alternative Splicing Regulatory Networks: Functions, Mechanisms, and Evolution. Molecular Cell. 76 (2), 329-345 (2019).
  2. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nature Genetics. 40 (12), 1413-1415 (2008).
  3. Nilsen, T. W., Graveley, B. R. Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing. Nature. 463 (7280), 457-463 (2010).
  4. Stamm, S. Signals and their transduction pathways regulating alternative splicing: a new dimension of the human genome. Human Molecular Genetics. 11 (20), 2409-2416 (2002).
  5. Kornblihtt, A. R., et al. Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).
  6. Zhong, X. -Y., Ding, J. -H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -D. Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones. Genes & Development. 23 (4), 482-495 (2009).
  7. Misteli, T., Cáceres, J. F., Clement, J. Q., Krainer, A. R., Wilkinson, M. F., Spector, D. L. Serine Phosphorylation of SR Proteins Is Required for Their Recruitment to Sites of Transcription In Vivo. Journal of Cell Biology. 143 (2), 297-307 (1998).
  8. Kanopka, A., et al. Regulation of adenovirus alternative RNA splicing by dephosphorylation of SR proteins. Nature. 393 (6681), 185-187 (1998).
  9. Anufrieva, K. S., et al. Therapy-induced stress response is associated with downregulation of pre-mRNA splicing in cancer cells. Genome Medicine. 10 (1), 49(2018).
  10. Shultz, J. C., et al. SRSF1 Regulates the Alternative Splicing of Caspase 9 Via A Novel Intronic Splicing Enhancer Affecting the Chemotherapeutic Sensitivity of Non-Small Cell Lung Cancer Cells. Molecular Cancer Research. 9 (7), 889-900 (2011).
  11. Gabriel, M., et al. Role of the splicing factor SRSF4 in cisplatin-induced modifications of pre-mRNA splicing and apoptosis. BMC Cancer. 15, (2015).
  12. Lee, S. C. -W., Abdel-Wahab, O. Therapeutic targeting of splicing in cancer. Nature Medicine. 22 (9), 976-986 (2016).
  13. Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37 (4), 331-340 (2005).
  14. Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing. Brain Research Protocols. 4 (3), 383-394 (1999).
  15. Zerler, B., et al. Adenovirus E1A coding sequences that enable ras and pmt oncogenes to transform cultured primary cells. Molecular and Cellular Biology. 6 (3), 887-899 (1986).
  16. Gattoni, R., Schmitt, P., Stevenin, J. In vitro splicing of adenovirus E1A transcripts: characterization of novel reactions and of multiple branch points abnormally far from the 3' splice site. Nucleic Acids Research. 16 (6), 2389-2409 (1988).
  17. Stephens, C., Harlow, E. Differential splicing yields novel adenovirus 5 E1A mRNAs that encode 30 kd and 35 kd proteins. The EMBO journal. 6 (7), 2027-2035 (1987).
  18. Ulfendahl, P. J., et al. A novel adenovirus-2 E1A mRNA encoding a protein with transcription activation properties. The EMBO journal. 6 (7), 2037-2044 (1987).
  19. Berk, A. J., Sharp, P. A. Structure of the adenovirus 2 early mRNAs. Cell. 14 (3), 695-711 (1978).
  20. Svensson, C., Pettersson, U., Akusjärvi, G. Splicing of adenovirus 2 early region 1A mRNAs is non-sequential. Journal of Molecular Biology. 165 (3), 475-495 (1983).
  21. Basei, F. L., Meirelles, G. V., Righetto, G. L., dos Santos Migueleti, D. L., Smetana, J. H. C., Kobarg, J. New interaction partners for Nek4.1 and Nek4.2 isoforms: from the DNA damage response to RNA splicing. Proteome Science. 13 (1), 11(2015).
  22. Zhou, Z., et al. The Akt-SRPK-SR Axis Constitutes a Major Pathway in Transducing EGF Signaling to Regulate Alternative Splicing in the Nucleus. Molecular Cell. 47 (3), 422-433 (2012).
  23. Caceres, J., Stamm, S., Helfman, D., Krainer, A. Regulation of alternative splicing in vivo by overexpression of antagonistic splicing factors. Science. 265 (5179), 1706-1709 (1994).
  24. Zhong, X. -Y., Ding, J. -H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -D. Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones. Genes & Development. 23 (4), 482-495 (2009).
  25. Naro, C., et al. The centrosomal kinase NEK2 is a novel splicing factor kinase involved in cell survival. Nucleic Acids Research. 42 (5), 3218-3227 (2014).
  26. Lu, C. -C., Chen, T. -H., Wu, J. -R., Chen, H. -H., Yu, H. -Y., Tarn, W. -Y. Phylogenetic and Molecular Characterization of the Splicing Factor RBM4. PLoS ONE. 8 (3), 59092(2013).
  27. Jarnæss, E., et al. Splicing Factor Arginine/Serine-rich 17A (SFRS17A) Is an A-kinase Anchoring Protein That Targets Protein Kinase A to Splicing Factor Compartments. Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 35154-35164 (2009).
  28. Bressan, G. C., et al. Functional association of human Ki-1/57 with pre-mRNA splicing events. FEBS Journal. 276 (14), 3770-3783 (2009).
  29. Vivarelli, S., et al. Paraquat Modulates Alternative Pre-mRNA Splicing by Modifying the Intracellular Distribution of SRPK2. PLoS ONE. 8 (4), 61980(2013).
  30. Russell, W. C., Graham, F. L., Smiley, J., Nairn, R. Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5. Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).
  31. Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. Bleach gel: A simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Bai, Y. Control of 3' splice site choice in vivo by ASF/SF2 and hnRNP A1. Nucleic Acids Research. 27 (4), 1126-1134 (1999).
  34. Cote, G. J., Nguyen, N., Lips, C. J. M., Berget, S. M., Gagel, R. F. Validation of an in vitro RNA processing system for CT/CGRP precursor mRNA. Nucleic Acids Research. 19 (13), 3601-3606 (1991).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Splicing alternatywnykom rki HEK293transfekcja minigenuizolacja RNAsynteza cDNAanaliza PCRkwantyfikacja elu

Powiązane artykuły