Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Opracowanie wysokoprzepustowego systemu hodowli sferoidów naskórka do modelowania plastyczności komórek macierzystych keratynocytów

3.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62182

⸱

30 stycznia 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Microbiology and Immunology, University of South Carolina School of Medicine, 2Department of Dermatology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Maryland School of Medicine Baltimore, 4Department of Pathology, Albert Einstein College of Medicine, 5Department of Pediatrics, Vanderbilt University Medical Center, 6Department of Drug Discovery and Biomedical Sciences, College of Pharmacy, University of South Carolina

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół systematycznej hodowli sferoidów naskórka w hodowli zawiesinowej 3D. Protokół ten ma szerokie zastosowanie do stosowania w różnych typach tkanek nabłonkowych oraz do modelowania kilku chorób i stanów u ludzi.

Streszczenie

Dysregulacja nabłonka jest przyczyną różnych ludzkich schorzeń i dolegliwości, w tym przewlekłych ran, stanów zapalnych i ponad 80% wszystkich ludzkich nowotworów. Jako tkanka wyściółkowa, nabłonek skóry jest często narażony na urazy i ewolucyjnie przystosował się, nabywając plastyczność komórkową niezbędną do naprawy uszkodzonej tkanki. Na przestrzeni lat podjęto szereg wysiłków w celu zbadania plastyczności nabłonka przy użyciu modeli komórkowych in vitro i ex vivo. Jednak wysiłki te były ograniczone pod względem zdolności do podsumowania różnych faz plastyczności komórek nabłonkowych. Opisujemy tutaj protokół generowania sferoid naskórka 3D i komórek pochodzących ze sferoid naskórka z pierwotnych ludzkich keratynocytów noworodków. Protokół ten określa zdolność kultur sferoidalnych naskórka do funkcjonalnego modelowania różnych etapów plastyczności generatywnej keratynocytów i pokazuje, że ponowne powlekanie sferoidów naskórka może wzbogacić heterogenne normalne kultury keratynocytów ludzkich (NHKc) dla subpopulacji keratynocytów integrynyα6hi/EGFRlo o ulepszonych cechach przypominających łodygę. Nasz raport opisuje opracowanie i utrzymanie wysokoprzepustowego systemu do badania plastyczności keratynocytów skóry i regeneracji naskórka.

Wprowadzenie

Warstwowy nabłonek ssaków jest najbardziej złożoną architekturą nabłonkową we wszystkich systemach żywych i najczęściej ulega uszkodzeniom i urazom. Jako tkanka ochronna, nabłonek warstwowy ewoluował, aby wytworzyć złożoną i skuteczną odpowiedź na uszkodzenie tkanki. Po urazie komórki te muszą aktywować programy plastyczności linii, które umożliwiają im migrację do uszkodzonego miejsca i przeprowadzenie naprawy1,2,3. Ta wieloaspektowa reakcja zachodzi w kilku następujących po sobie krokach, które pozostają słabo poznane.

Główną przeszkodą w badaniu skomplikowanego procesu regeneracji nabłonka jest brak wysokoprzepustowych systemów modelowych, które mogłyby uchwycić dynamiczną aktywność komórkową na określonych etapach regeneracji komórki. Podczas gdy modele mysie in vivo oferują istotny wgląd w gojenie się ran i najdokładniej odwzorowują proces regeneracji człowieka, ich opracowanie wymaga pracochłonnych wysiłków i znacznych kosztów, co ogranicza ich przepustowość. W związku z tym istnieje pilna potrzeba stworzenia systemów, które umożliwią funkcjonalne badanie regeneracji tkanek nabłonkowych człowieka na dużą skalę.

W ostatnich latach podjęto kilka prób sprostania wyzwaniu skalowalności. Jest to widoczne dzięki znacznemu rozwojowi innowacyjnych modeli komórkowych opartych na in vitro i ex vivo, które ściśle naśladują kontekst regeneracyjny in vivo. Należą do nich postępy w dziedzinie organ-on-chip4, spheroid5, organoid6 i kultur organotypowych7. Każdy z tych systemów 3D opartych na komórkach oferuje unikalne zalety i przedstawia wyraźne ograniczenia eksperymentalne. Do tej pory hodowla sferoidalna pozostaje najbardziej opłacalnym i szeroko stosowanym modelem hodowli komórkowej 3D. I chociaż kilka doniesień wskazywało, że hodowle sferoidalne mogą być wykorzystywane do badania cech komórek macierzystych skóry, badania te zostały w dużej mierze przeprowadzone na tkankach zwierzęcych8,9, lub na fibroblastach skórnych10, praktycznie bez doniesień dokładnie charakteryzujących właściwości regeneracyjne ludzkich kultur sferoidalnych naskórka. W tym protokole szczegółowo opisujemy rozwój funkcjonalny, hodowlę i utrzymanie kultur sferoidalnych naskórka z normalnych ludzkich keratynocytów (NHKc). W równym stopniu opisujemy przydatność tego systemu do modelowania sekwencyjnych faz regeneracji naskórka i plastyczności komórek macierzystych keratynocytów in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół pobierania i obchodzenia się z próbkami skóry oraz izolacji ludzkich keratynocytów został sprawdzony przez IRB Uniwersytetu Południowej Karoliny (UofSC) i sklasyfikowany jako "badania nie z udziałem ludzi", ponieważ próbki napletka były odpadkami chirurgicznymi powstałymi podczas rutynowych zabiegów chirurgicznych (obrzezanie noworodków) i były całkowicie pozbawione informacji identyfikujących. Protokół był również regularnie weryfikowany i zatwierdzany przez Komitet ds. Bezpieczeństwa Biologicznego UofSC, a cały personel laboratorium przeszedł szkolenie w zakresie bezpieczeństwa biologicznego. Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie ze standardami bezpieczeństwa i etyki UofSC.

1. Izolacja i hodowla ludzkich keratynocytów z tkanki napletka noworodka

  1. Przygotować pożywkę myjącą, dodając 0,1 M buforu HEPES do 500 ml pożywki KSFM i dostosować ją do pH 7,2. Wysterylizuj pożywkę w filtrze próżniowym o pojemności 500 ml (wielkość porów 0,22 μm). Podłoże podstawowe MCDB 153-LB może być również stosowane jako alternatywny roztwór myjący zamiast KSFM.
  2. W kapturze z przepływem laminarnym umyj napletek noworodka 5 ml środka myjącego w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Powtórz dwa razy.
  3. Umyty napletek przenieść na sterylną szalkę Petriego. Za pomocą skalpela i kleszczy zeskrob tkankę tłuszczową i luźną tkankę łączną z warstwy skóry właściwej. Ponownie umyj napletek 5 ml środka myjącego w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
  4. Umieść naskórek napletka do góry na 6-dołkowej płytce zawierającej 2 ml enzymu dyspazy rozcieńczonego w podłożu myjącym (50 U/ml).
  5. Przenieść płytkę do inkubatora na 4 godziny (37 °C, 5% CO2, 95% wilgotności).
  6. Wyjąć napletek z inkubatora i w sterylnych warunkach przenieść go na szalkę Petriego. Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką oddziel naskórek od warstwy skóry właściwej.
  7. Umieść naskórek w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 2 ml 0,25% trypsyny-EDTA. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml mechanicznie rozdrobnij pływający naskórek. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C z okresowym wirowaniem przez 5 s co 5 minut.
  8. Po inkubacji dodać 2 ml inhibitora trypsyny sojowej i wymieszać pipetując, aby zneutralizować trypsynę.
  9. Zawiesinę komórek wirować przez 2 minuty przy 450 x g, a następnie przez 8 minut przy 250 x g.
  10. Usuń pływające zanieczyszczenia za pomocą kleszczy, uważając, aby nie usunąć granulki komórek. Ostrożnie odessać supernatant z osadu komórkowego.
  11. Zawiesić osad w 12 ml kompletnego podłoża KSFM-scm i płytce w 10-centymetrowym naczyniu. Inkubować naczynie przez noc (37 °C, 5% CO2, 95% wilgotności).
  12. Następnego dnia usunąć pożywkę za pomocą pipety zasysającej i zastąpić 12 ml kompletnym KSFM-scm. Powtórz w dniach 4 i 7.
  13. Aby utrzymać optymalny wzrost normalnych kultur ludzkich keratynocytów (NHKc), należy pasować komórki w stosunku 1:5 w 10 dniu, aby zapobiec osiągnięciu przez komórki zbiegu większego niż 80%.

2. Tworzenie kultur naskórka skóry in vitro

  1. Przygotuj 5% mieszaninę agarozy, dodając 2,5 g agarozy do 50 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) w szklanej butelce o pojemności 50 ml. Butelka autoklawu w cyklu cieczy. Pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej.
  2. Aby przygotować płytki, umieść schłodzoną szklaną butelkę zawierającą roztwór agarozy w plastikowej zlewce o pojemności 1 l wypełnionej 200 ml wody dejonizowanej (dH2O). Rozpuść mieszaninę agarozy w kuchence mikrofalowej klasy badawczej przez maksymalnie 2 minuty, mieszając agar co 60 sekund, delikatnie przechylając butelkę na boki.
    UWAGA: Stopienie agaru w kuchence mikrofalowej spowoduje, że pojemnik kolby stanie się bardzo gorący, co spowoduje wzrost ciśnienia. Uwalniaj wzrost ciśnienia co 30 s. Nosić odpowiedni sprzęt ochronny, aby zapobiec obrażeniom.
  3. Dodać 3 ml stopionej 5% agarozy do 12 ml KSFM-scm podgrzanego do 42 °C, aby uzyskać końcowe stężenie 1% agarozy (wag./obj.).
    Opcjonalnie: wstępnie podgrzać pipety serologiczne i końcówki pipet, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji miękkiego agaru.
  4. Szybko odpipetować 200 μl 1% mieszanki agarowej do indywidualnych dołków 96-dołkowej płytki okrągłodennej za pomocą pipety wielokanałowej (Rysunek 1A). Pozostawić płytkę w sterylnym środowisku w temperaturze 25 °C na 4 godziny, aby agaroza mogła się w pełni spolimeryzować.
    UWAGA: Eksperymentowanie można przerwać w tym miejscu i kontynuować następnego dnia. Spolimeryzowane płytki agarozowe mogą być przechowywane w temperaturze 37 °C do 24 godzin lub w temperaturze 4 °C do 48 godzin po zgrzewaniu folią parafilmową. Podgrzać płytkę do temperatury 37 °C w nawilżanym inkubatorze przez co najmniej 1 godzinę przed użyciem.
  5. Przejście NHKc tworzące sferoidy przez zasysanie pożywki i komórki myjące w 2 ml PBS. Odessać PBS i dodać 2 ml 0,25% trypsyny-EDTA do umytych komórek. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C lub do całkowitego oderwania wszystkich komórek. Dodaj 2 ml inhibitora trypsyny sojowej na płytkę i zmyj komórki z płytki do probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 250 x g przez 5 min.
  6. Zawiesić osad w 1 ml PBS. Określ ilościowo żywotność komórek za pomocą barwienia błękitem trypanowym i hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
  7. Podwielokrotność 2 x 104 NHKc w 100 μL KSFM-scm i wysiewać do indywidualnych dołków na wcześniej przygotowanej 96-dołkowej płytce okrągłodennej. Inkubować płytkę przez noc (37 °C, 5% CO2, 95% wilgotności).
  8. Używając mikroskopu z kontrastem z odwróconymi fazami, dobrze przeanalizuj ziarno pod kątem tworzenia się naskórka.
    UWAGA: Ludzkie naskórki z normalnych ludzkich keratynocytów mogą pozostać żywotne w hodowli zawiesinowej 3D przez okres do 96 godzin, chociaż ze znacznym spadkiem żywotności komórek (Ryc. 2).

3. Test ponownego posiewu sferoidów naskórka

  1. 24-48 godzin po utworzeniu naskórka 3D dodaj 4 ml podgrzanego KSFM-scm do 6 cm naczynia. Użyj końcówki do pipety o szerokim otworze 1 ml, aby przenieść pojedynczą sferoidę na płytkę, upewniając się, że jej nie rozbijesz. Alternatywnie, poszerz końcówkę pipety o pojemności 1 ml za pomocą sterylnej żyletki, aby przeciąć końcówkę.
  2. Inkubować płytkę przez noc (37 °C, 5% CO2, 95% wilgotności).
  3. Przeanalizuj sferoidę z nasionami pod kątem przyłączenia do dna płytki i obserwuj rozmnażające się komórki za pomocą mikroskopu z kontrastem z odwróconymi fazami (Ryc. 3). Podawaj komórki co 96 godzin, delikatnie usuwając 2 ml pożywki z wnętrza płytki i powoli dodając do płytki 2 ml świeżej pożywki KSFM-scm.
  4. Pasaż sferoidalny (SD) NHKc, gdy osiągną 70-80% konfluencji i kontynuują test wyboru. Często monitoruj SD-NHKc, aby zapobiec osiągnięciu przez komórki pełnej konfluencji w hodowli, ponieważ powoduje to przedwczesne różnicowanie i zatrzymanie wzrostu komórek (Rysunek 3E-F).
  5. Test remembranacji sferoidów naskórka modeluje gojenie się ran za pośrednictwem keratynocytów poprzez uchwycenie każdej z kluczowych kolejnych faz plastyczności regeneracyjnej naskórka: a) utrzymanie homeostazy, b) zatrzymanie/odwrócenie różnicowania c) ruchliwość linii stresu oraz d) odbudowa tkanek (Rysunek 1B; Tabela 2). Test ten może być również wykorzystany do produkcji populacji komórek do organtypowych kultur tratw lub do modelowania nowotworowości za pośrednictwem HPV, jak wykazano w naszej poprzedniej pracy 11,12.

4. 3D śledzenie komórek fluorescencyjnych

  1. W 6-centymetrowej naczyniu transfekcyjne, tworzące sferoidy monowarstwowe kultury NHKc 2D z 1 μg wektora plazmidowego pMSCV-IRES-EGFP przenoszącego gen wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (eGFP). Inkubuj płytkę przez noc (37 °C, 5% CO2, 95% wilgotności) mikroskop (Rysunek 4A).
    UWAGA: Ważne jest, aby transfekcja została zakończona w warunkach wolnych od antybiotyków bez surowicy.
  2. Nie usuwając mieszanki transfekcyjnej, dodaj 2 ml podgrzanego KSFM-scm do komórek. Inkubować płytkę przez noc (37 °C, 5% CO2, 95% wilgotności).
  3. Odessać wszystkie pożywki transfekcyjne z płytki i komórek podającej za pomocą 3 ml wstępnie podgrzanego KSFM-scm. Ocenić obecność komórek wykazujących ekspresję EGFP pod kanałem FITC mikroskopu fluorescencyjnego.
  4. Przejście i wysiew 2 x 104 komórek transfekowanych EGFP do pojedynczych dołków uprzednio przygotowanej 96-dołkowej płytki z okrągłym dnem. Inkubować płytkę przez noc (37 °C, 5% CO2, 95% wilgotności). Wizualizuj i monitoruj ruch komórek sferoidalnychEGFP pos pod kanałem FITC mikroskopu fluorescencyjnego (Rysunek 4B-C).
  5. 24 godziny po posianiu dodać 3 ml podgrzanego KSFM-scm do 6 cm naczynia. Użyj końcówki do pipety o szerokim otworze 1 ml, aby przenieść pojedynczą sferoidę na płytkę, upewniając się, że jej nie rozbijesz. Inkubować płytkę przez noc (37 °C, 5% CO2, 95% wilgotności).
  6. Obserwuj i analizuj propagację SD-NHKcEGFP za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Podawaj komórki co 96 godzin, delikatnie wyjmując 2 ml pożywki z wnętrza płytki i powoli dodając 2 ml świeżej pożywki KSFM-scm do płytki.
  7. Zbierz SD-NHKCEGFP do izolacji FACS lub wybranych testów.

5. Charakterystyka subpopulacji pochodzących od sferoid (SD) za pomocą FACS

  1. Pasaż SD-NHKc i odpowiadające mu autologiczne hodowle jednowarstwowe 2D poprzez zasysanie starych pożywek i mycie komórek w 2 ml PBS. Usuń PBS i dodaj 2 ml 0,25% trypsyny-EDTA do umytych komórek. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut lub do całkowitego oderwania się wszystkich komórek.
  2. Dodaj 2 ml inhibitora trypsyny sojowej na płytkę i przenieś komórki do probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 250 x g przez 5 min.
  3. Zawiesić granulki w 1 ml PBS. Określ ilościowo żywotność komórek za pomocą błękitu trypanowego i automatycznego licznika komórek hemocytometru.
  4. Podwielokrotność 100 μl zawierająca 0,1-4 x 106 komórek NHKc do 1,5 ml probówek mikrowirówek. Umieść rurkę na lodzie w ciemnym otoczeniu, utworzonym przez wyłączenie jasnych świateł w okapie laminarnym.
  5. Dodać 2 μl antyintegryny sprzężonej z FITC, α6 i 2 μl anty-EGFR sprzężonego z PE do probówek, aby uzyskać rozcieńczenie 1:50. Przygotować probówkę bez dodatku przeciwciał, która posłuży jako niebarwiona kontrola. Inkubować probówki na lodzie w ciemności lub w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Użycie kulek lub linii SCC skóry może służyć jako kontrola pozytywna, ponieważ komórki SCC skóry wyrażają podwyższone poziomy integrynyα6 i EGFR.
  6. Przeprowadzić analizę cytometrii przepływowej za pomocą wybranego cytometru przepływowego zawierającego odpowiednie lasery.
  7. Użyj kontroli negatywnej i dodatniej, aby ustanowić bramki. Sortuj subpopulację komórek integrynyα6hi/EGFRlo; Są to frakcje komórek macierzystych naskórka. Integrynaα6hi / EGFRhi komórki są proliferacyjną frakcją komórek progenitorowych. Komórki integrynyα6lo / EGFRhi są zaangażowaną frakcją komórek progenitorowych (Rysunek 4D). Probówka (probówki) do sortowania FACS powinna zawierać co najmniej 1 ml lodowatego KSFM-scm.
  8. Zbadać zdolność proliferacyjną posortowanych subpopulacji komórek, przenosząc zawartość każdej odpowiedniej probówki sortującej do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 razy objętość posortowanych komórek w PBS. UWAGA: Ważne jest, aby usunąć wszystkie komórki przyczepione do brzegu poprzez kilkukrotne pipetowanie ścianki probówki (probówek) FACS do sortowania, ponieważ keratynocyty często mogą tam przylegać.
  9. Odwirować 15 ml probówek o sile 250 x g przez 5 min. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 12 ml KSFM-scm. Przenieść zawieszone komórki na 6 cm płytkę i inkubować przez noc (37 °C, 5% CO2, 95% wilgotności).
  10. Następnego dnia wyjmij pożywkę z płytek i dodaj 8 ml wstępnie podgrzanego KSFM-scm. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2, 95% wilgotności. Ponownie podawaj komórki 12 ml pożywki co 3 dni, aż do uzyskania 70-80% zlewu (Rysunek 4E).

6. Immunofluorescencja i barwienie naskórka dla markerów podstawowych komórek macierzystych

  1. Przenieś naskórek na szkiełka nakrywkowe pokryte polilizyną. Pozwól SD-NHKc rozprzestrzeniać się aż do 75% zlewania się.
  2. Umyć komórki dwukrotnie w PBS (4 °C) przez 5 minut każda.
  3. Utrwal komórki za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA) przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Przepuszczalność komórek za pomocą 0,5% Triton X-100 w 1% glicynie. Blokuj za pomocą 0,5% BSA i 5% koziej surowicy przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Próbki inkubować z przeciwciałami przeciwko P63 (1:200) i cytokeratynie 14 (1:200) w roztworze blokującym przez noc w temperaturze 4 °C.
  6. Przemyć trzykrotnie PBS (4 °C) zawierającym Tween 20 (PBST), a następnie inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z FITC i Alexa 568 (rozcieńczenie 1:1000).
  7. Wybarwić jądra 4', 6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) (rozcieńczenie 1:5000) przed zamontowaniem komórek.
  8. Obserwuj komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z liniami laserowymi FITC i PE (Rysunek 4F).

7. Analiza transkrypcyjna kultur epidermosfery

  1. Ustaw potrójne płytki kultur NHKc o niskim pasażowaniu, aby wyizolować RNA, które mogą pochodzić z kultur jednowarstwowych, sferoidalnych i sferoidalnych z tej samej autologicznej linii komórkowej.
  2. Zbierz 3-5 odpowiednich epidermosfer w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Oddzielnie zbieraj autologiczne kultury jednowarstwowe SD-NHKc i 2D.
  3. Wyizoluj całkowite RNA ze wszystkich trzech grup.
  4. Wykonaj odwrotną transkrypcję z 1 μg całkowitego RNA.
  5. Używając cDNA, wykonaj PCR w czasie rzeczywistym, używając GAPDH jako kontroli wewnętrznej (Tabela 1).
  6. Sprawdzić rozmiar produktu amplikonowego za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (2% v/v).
    UWAGA: W celu profilowania transkryptomicznego kultur naskórka za pomocą analizy mikromacierzy całego genomu, należy wyizolować całkowite RNA z masowych kultur pojedynczego dawcy NHKc i odpowiadającego mu SD-NHKc od tego samego dawcy, w sześciu powtórzeniach każdy.
  7. Oceń jakość RNA za pomocą bioanalizatora, aby uzyskać liczbę integralności RNA (RIN) w zakresie od co najmniej 9,0 do 9,1.
  8. Przeprowadzaj eksperymenty z mikromacierzami, amplifikując i biotynylując całkowite próbki RNA.
  9. Odwrotna transkrypcja 100 ng całkowitego RNA na próbkę do ds-cDNA przy użyciu losowych starterów NNN zawierających sekwencję promotora polimerazy T7 RNA.
  10. Dodaj polimerazę RNA T7 do próbek cDNA, aby amplifikować RNA, a następnie skopiuj RNA do ss-cDNA. Degradacja nadmiaru RNA przy użyciu RNazy H.
  11. Fragmentuj cząsteczki sscDNA i znakuj biotyną.
  12. Amplifikować znakowane próbki przez 16 godzin w temperaturze 45 °C.
  13. Hybrydyzuj próbki za pomocą pieca do hybrydyzacji oraz zestawu do mycia i bejcowania.
  14. Umyj i zabejcuj hybrydowe tablice.
  15. Skanuj tablice za pomocą systemu i stacji roboczej komputera.
  16. Po zakończeniu skanowania macierzy zaimportuj pliki intensywności komórek sondy (CEL) do oprogramowania konsoli ekspresji i przetwarzaj na poziomie genów za pomocą pliku biblioteki i algorytmu Robust Multichip Analysis (RMA) w celu wygenerowania plików CHP.
  17. Po potwierdzeniu jakości danych w Expression Console zaimportuj pliki CHP zawierające sygnały ekspresji log2 dla każdej sondy do oprogramowania do analizy transkryptomu w celu przeanalizowania odpowiedzi transkrypcyjnych specyficznych dla typu komórki przy użyciu jednokierunkowej analizy wariancji między obiektami.

8. Ocena skuteczności tworzenia kolonii SD-NHKc

  1. Odsysaj pożywkę z płytek, gdy komórki osiągną 70-80% zbieżności. Umyć komórki trzy razy w PBS (4 °C) przez 5 minut każda.
  2. Utrwalić komórki 3 ml 100% metanolu (4 °C) przez 15 minut. Umyć trzy razy w PBS przez 5 minut każde.
  3. Zabarwić komórki w 3 ml 10% Giemsa przez 30 min. Umyć trzy razy w PBS przez 5 min każde. Pozostaw komórki do wyschnięcia na powietrzu przez noc.
  4. Przeanalizuj tworzenie się kolonii następnego dnia i określ ilościowo liczbę uzyskanych kolonii

9. Określ podwojenie populacji SD-NHKc

  1. Pasaż SD-NHKc i odpowiadające mu autologiczne hodowle jednowarstwowe 2D poprzez zasysanie starych pożywek i mycie komórek w 2 ml PBS. Usuń PBS i dodaj 2 ml 0,25% trypsyny-EDTA do umytych komórek. Inkubować przez 5 minut lub do całkowitego oderwania wszystkich komórek (37 °C, 5% CO2, 95% wilgotności).
  2. Dodaj 2 ml inhibitora trypsyny sojowej na płytkę i przenieś komórki do probówki o pojemności 15 ml.
  3. Wirować przy 250 x g przez 5 min.
  4. Usunąć supernatant i zawiesić osad w 12 ml KSFM-scm.
  5. Komórki nasienne o niskiej gęstości 1-2 x 104 NHKc do pojedynczych 10 cm szalek i inkubować przez noc (37 °C, 5% CO2, 95% wilgotności).
  6. Następnego dnia podawać płytki z 8 ml KSMF-scm. Karm co 4 dni, aż co najmniej 25% zlewa się, a następnie karmić co 2 dni.
  7. Szeregowo przechodź komórki 1:5 na 60 cm szalkach, aż do wyczerpania zdolności proliferacyjnej komórek. Określ ilościowo żywotność komórek za pomocą barwienia błękitem trypanowym. Określ podwojenia populacji w każdym pasażu za pomocą wzoru: log(N/N0) / log2, gdzie N oznacza całkowitą liczbę komórek uzyskaną przy każdym pasażu, a N0 oznacza liczbę komórek posianych na początku eksperymentu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Podczas testu epidermofory skóry, hodowle NHKc są wysiewane do studzienek płytki 96-dołkowej pokrytych agarozą (Rysunek 1A). Komórki tworzące sferoidy powinny ulec samoagregacji w ciągu 48h. Autonomiczną formację sferoidów można ocenić już po 24h za pomocą standardowego odwróconego mikroskopu fazowo-kontrastowego. Formowanie epidermofory skóry i test ponownego wysiewu modelują różne fazy regeneracji tkanki naskórkowej (Rysunek 1B). Rysunek 2...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zastosowanie systemów hodowli sferoidalnych 3D ma szerokie zastosowanie w ocenie pnia komórek. Wykazano, że systemy te zwiększają wzbogacanie tkankowych komórek macierzystych13, jednak ich użyteczność w badaniu ludzkich komórek macierzystych naskórka została zbadana w ograniczonym zakresie. W tym miejscu opisujemy strategię wzbogacania ludzkich komórek macierzystych keratynocytów przy użyciu technik hodowli 3D. W tym systemie NHKc są uprawiane jako samoorganizujące się wielokomórkowe zawiesiny sfe...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają powiązań finansowych do ujawnienia.

Podziękowania

UofSC School of Medicine Instrumentation Resource Facility (IRF) zapewnił dostęp do sprzętu do obrazowania i sortowania komórek oraz pomocy technicznej. Prace te zostały częściowo wsparte grantem 1R21CA201853. MCF i IRF otrzymują częściowe wsparcie z grantu NIH P20GM103499, SC INBRE. MCF otrzymuje również wsparcie z grantu NIH P20GM109091. Yvon Woappi był częściowo wspierany przez granty NIH 2R25GM066526-06A1 (PREP) i R25GM076277 (IMSD) oraz przez stypendium w ramach programu profesorskiego Grace Jordan McFadden na UofSC. Geraldine Ezeka i Justin Vercellino byli wspierani przez granty NIH 2R25GM066526-10A1 (PREP) na UofSC. Sean M. Bloos otrzymał w 2016 r. nagrodę Magellan Scholar Award na Uniwersytecie Kalifornijskim.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Platforma AffymetrixAffymetrixDo eksperymentów z mikromacierzami
Affymetrix' s Plik biblioteki HuGene-2_0-stAffymetrixProcess
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentDo eksperymentów z mikromacierzami
All Prep DNA/RNA Mini KitQiagen80204Używany do izolacji RNA
Konsola analityczna Oprogramowanie w wersji 3.0.0.466analizuje odpowiedzi transkrypcyjne specyficzne dla typu komórki za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji między obiektami
Cytometr przepływowy BD FACSAria IIBeckmanDo cytometrii przepływowej
Konsola Wersja oprogramowania 3.0.0.466/Konsola ekspresji OprogramowanieAffymetrix/Thermo Fisher ScientificDo potwierdzania jakości danych
Cytokeratyna 14Santa Cruz Biotechnologysc-53253Rozcieńczenie 1:200
DispaseSigma-AldrichD4818Do nośników komórkowych
Antyintegryna sprzężona z FITC i alfa; 6Abcamab30496Do analizy FACS
Oprogramowanie GeneChip Command Console 4.0Affymetrix/Thermo Fisher ScientificDo potwierdzania jakości danych
GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific)Affymetrix/Thermo Fisher ScientificDo mycia i barwienia matryc hybrydowych
GeneChip HuGene 2.0 ST ArraysAffymetrix/Thermo Fisher ScientificDo hybrydyzacji i amplifikacji całkowitego RNA
Piec do hybrydyzacji GeneChip 640Thermo Fisher ScientificDo hybrydyzacji i amplifikacji całkowitego RNA | Amplifikuj znakowane próbki
, GeneChip Hybridization Wash i Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific).Affymetrix/Thermo Fisher ScientificDo mycia i barwienia matryc hybrydowych
System GeneChip Scanner 3000 7GAffymetrix/Thermo Fisher ScientificSkaningowe matryce hybrydowe
Zestaw odczynników GeneChip WT PLUSAffymetrix/Thermo Fisher ScientificDo amplifikacji biotynylującego całkowitego RNA
Ludzki podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (hFGF basic / FGF2)Komórka Technologia sygnalizacji8910Dla pożywek komórkowych
Ludzki naskórkowy czynnik wzrostu (hEGF)Technologia sygnalizacji komórkowej8916Dla pożywek komórkowych
Ludzka insulinaMillipore Sigma9011-MDo pożywek komórkowych
iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad)Bio-Rad1708880Używany do RT-qPCR
Zestaw do syntezy cDNAiScript Bio-Rad1708890używany do RT-qPCR
KSFMThermoFisher Scientific17005041Uzupełniony 1% penicyliną/streptomycyną, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml
zasadowym czynnikiem wzrostu fibroblastów, 0,4% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) oraz 4 &mikro; g/ml
insuliny KSFM-scmThermoFisher Scientific17005042Uzupełniony o 1% penicyliny/streptomycyny, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml
podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów, 0,4% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) oraz 4 i mikro; g/ml insuliny
MCDB 153-LB podłoże podstawoweSigma-AldrichM7403MCDB 153-LB podłoże podstawowe z buforem HEPES
NEST Scientific 1-dołkowa komora do hodowli komórkowych Szkiełko podstawowe, CZARNE Ścianki na szkiełku podstawowym, 6/PK, 12/CSStellar ScientificNST230111Do barwienia immunologicznego
P63Thermo Scientific7038091:200 rozcieńczenie
anty-EGFR sprzężone z PE ( San Jose, CA; numer katalogowy )BD Pharmingen555997Do analizy FACS
Wektor plazmidowy pMSCV-IRES-EGFP Addgene20672Do transfekcji
Zestaw Promega TransFastPromegaE2431Do transfekcji
Qiagen RNeasy Plus Micro KitQiagenDo eksperymentów z mikromacierzami
Thermo Scientific™ Sterylne jednorazowe filtry próżnioweThermo Scientific09-740-63DDo mediów komórkowych
Mikroskop fluorescencyjny Zeiss Axionvert 135ZeissUse z oprogramowaniem Axiovision Rel. 4.5

Bibliografia

  1. Patel, G. K., Wilson, C. H., Harding, K. G., Finlay, A. Y., Bowden, P. E. Numerous keratinocyte subtypes involved in wound re-epithelialization. Journal of Investigative Dermatology. 126 (2), 497-502 (2006).
  2. Dekoninck, S., Blanpain, C. Stem cell dynamics, migration and plasticity during wound healing. Nature Cell Biology. 21 (1), 18-24 (2019).
  3. Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within Stratified Epithelial Stem Cell Populations Maintains the Oral Mucosa in Response to Physiological Stress. Cell Stem Cell. , (2019).
  4. Rothbauer, M., Rosser, J. M., Zirath, H., Ertl, P. Tomorrow today: organ-on-a-chip advances towards clinically relevant pharmaceutical and medical in vitro models. Current Opinion in Biotechnology. 55, 81-86 (2019).
  5. Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering Multi-Cellular Spheroids for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Advanced Healthcare Materials. , 2000608(2020).
  6. Lee, J., et al. Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells. Nature. 582 (7812), 399-404 (2020).
  7. Zhang, Q., et al. Early-stage bilayer tissue-engineered skin substitute formed by adult skin progenitor cells produces an improved skin structure in vivo. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 407(2020).
  8. Borena, B. M., et al. Sphere-forming capacity as an enrichment strategy for epithelial-like stem cells from equine skin. Cellular Physiology and Biochemistry. 34 (4), 1291-1303 (2014).
  9. Vollmers, A., et al. Two- and three-dimensional culture of keratinocyte stem and precursor cells derived from primary murine epidermal cultures. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 402-413 (2012).
  10. Kang, B. M., Kwack, M. H., Kim, M. K., Kim, J. C., Sung, Y. K. Sphere formation increases the ability of cultured human dermal papilla cells to induce hair follicles from mouse epidermal cells in a reconstitution assay. Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 237-239 (2012).
  11. Woappi, Y., Hosseinipour, M., Creek, K. E., Pirisi, L. Stem Cell Properties of Normal Human Keratinocytes Determine Transformation Responses to Human Papillomavirus 16 DNA. Journal of Virology. 92 (11), (2018).
  12. Woappi, Y., Altomare, D., Creek, K., Pirisi, L. Self-assembling 3D spheroid cultures of human neonatal keratinocytes have enhanced regenerative properties. Stem Cell Research. , (2020).
  13. Toma, J. G., McKenzie, I. A., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23 (6), 727-737 (2005).
  14. Li, F., et al. Loss of the Epigenetic Mark 5-hmC in Psoriasis: Implications for Epidermal Stem Cell Dysregulation. Journal of Investigative Dermatology. , (2020).
  15. Kuo, C. T., et al. Three-dimensional spheroid culture targeting versatile tissue bioassays using a PDMS-based hanging drop array. Scientific Reports. , (2017).
  16. Woappi, Y., Ezeka, G., Vercellino, J., Bloos, S. M., Creek, K. E., Pirisi, L. GSE94244 - Expression data from normal human spheroid-forming keratinocytes in monolayer mass culture and from corresponding cornified-like spheroid ring structures. Gene Expression Omnibus (GEO). , (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Macierzyste kom rki keratynocyt wtest ponownego wysiewu sferoid wsystem wysokoprzepustowyregeneracja nask rkacytometria przep ywowanormalne ludzkie keratynocytyintegryna alfa szekom rki o niskiej ekspresji EGFR3D hodowla kom rkowa
Opracowanie wysokoprzepustowego systemu hodowli sferoidów naskórka do modelowania plastyczności komórek macierzystych keratynocytów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.