Celem tego manuskryptu jest przedstawienie metody opartej na ultrasonografii, która pozwala na obrazowanie in vivo przepływu krwi w tętnicach mózgowych u myszy. Pokazujemy jego zastosowanie do określania zmian prędkości przepływu krwi związanych ze skurczem naczyń krwionośnych w mysich modelach krwotoku podpajęczynówkowego (SAH).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Analiza skurczu naczyń krwionośnych mózgu w mysim modelu krwotoku podpajęczynówkowego z przezczaszkowym ultrasonografem dupleksowym o wysokiej częstotliwości
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Skurcz naczyń mózgowych, który występuje w ciągu kilku tygodni po krwotoku podpajęczynówkowym, rodzaj udaru krwotocznego, przyczynia się do opóźnionego niedokrwienia mózgu. Problemem napotkanym w badaniach eksperymentalnych z wykorzystaniem mysich modeli SAH jest brak metod monitorowania in vivo skurczu naczyń mózgowych u myszy. Tutaj demonstrujemy zastosowanie ultradźwięków o wysokiej częstotliwości do wykonywania przezczaszkowych badań ultrasonograficznych Duplex na myszach. Za pomocą tej metody można było zidentyfikować tętnice szyjne wewnętrzne (ICA). Prędkości przepływu krwi w wewnątrzczaszkowych ICA uległy znacznemu przyspieszeniu po indukcji SAH, podczas gdy prędkości przepływu krwi w zewnątrzczaszkowych ICA pozostały niskie, co wskazuje na skurcz naczyń mózgowych. Podsumowując, zaprezentowana tutaj metoda pozwala na funkcjonalne, nieinwazyjne monitorowanie in vivo skurczu naczyń mózgowych w mysim modelu SAH.
Wprowadzenie
Spontaniczny krwotok podpajęczynówkowy (SAH) jest formą udaru krwotocznego spowodowaną głównie pęknięciem tętniaka wewnątrzczaszkowego1. Na wynik neurologiczny wpływają głównie dwa czynniki: wczesne uszkodzenie mózgu (EBI), które jest spowodowane skutkami krwawienia i związanym z nim przejściowym globalnym niedokrwieniem mózgu, oraz opóźnione niedokrwienie mózgu (DCI), które występuje w ciągu kilku tygodni po krwawieniu2,3. Doniesiono, że DCI dotyka do 30% pacjentów z SAH2. Patofizjologia DCI obejmuje angiograficzny skurcz naczyń mózgowych, zaburzone mikrokrążenie spowodowane mikroskurczami naczyń krwionośnych i mikrozakrzepicą, zagłębienia w korze mózgowej i efekty wywołane stanem zapalnym4. Niestety, dokładna patofizjologia pozostaje niejasna i nie ma dostępnego leczenia, które skutecznie zapobiegałoby DCI3. Dlatego DCI jest badany w wielu badaniach klinicznych i eksperymentalnych.
Obecnie większość badań eksperymentalnych nad SAH wykorzystuje małe modele zwierzęce, szczególnie u myszy5,6,7,8,9,10,11,12,13. W takich badaniach skurcz naczyń mózgowych jest często badany jako punkt końcowy. Często określa się stopień skurczu naczyń krwionośnych ex vivo. Dzieje się tak dlatego, że brakuje nieinwazyjnych metod badania in vivo skurczu naczyń mózgowych, wymagających krótkiego czasu znieczulenia i powodujących jedynie niewielki stres u zwierząt. Jednak badanie skurczu naczyń mózgowych in vivo byłoby korzystne. Dzieje się tak, ponieważ umożliwiłoby to podłużne badania in vivo nad skurczem naczyń krwionośnych u myszy (tj. obrazowanie skurczu naczyń mózgowych w różnych punktach czasowych w ciągu dni po indukcji SAH). Zwiększyłoby to porównywalność danych uzyskanych w różnych punktach czasowych. Co więcej, stosowanie projektu badania podłużnego jest strategią mającą na celu zmniejszenie liczby zwierząt.
Tutaj demonstrujemy użycie przezczaszkowego ultrasonografu o wysokiej częstotliwości do określenia przepływu krwi w tętnicach mózgowych u myszy. Pokazujemy, że podobnie jak w przypadku przezczaszkowej ultrasonografii dopplerowskiej (TCD) lub przezczaszkowej ultrasonografii dupleksowej kodowanej kolorami (TCCD) w praktyce klinicznej14,15,16,17,18, ta metoda może być stosowana do monitorowania skurczu naczyń mózgowych poprzez pomiar prędkości przepływu krwi w tętnicach wewnątrzczaszkowych po indukcji SAH w modelu mysim.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Doświadczenia na zwierzętach zostały zatwierdzone przez odpowiedzialny komitet ds. opieki nad zwierzętami (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz) i przeprowadzone zgodnie z niemiecką ustawą o ochronie zwierząt (TierSchG). Przestrzegano wszystkich obowiązujących międzynarodowych, krajowych i instytucjonalnych wytycznych dotyczących opieki nad zwierzętami i ich wykorzystywania. W tym badaniu przeprowadziliśmy pomiary prędkości przepływu krwi w tętnicach wewnątrzczaszkowych i zewnątrzczaszkowych u samic myszy C57BL / 6N w wieku 11-12 tygodni o masie ciała w zakresie 19-21 g. Myszy poddano indukcji SAH lub pozorowanej operacji, która została szczegółowo opisana w innym miejscu10,12,13.
1. Przygotowanie materiałów
- Włącz aparat USG i wprowadź identyfikator zwierzęcia.
- Podgrzej płytę grzewczą systemu ultradźwiękowego do 37 °C. Upewnij się, że sonda temperatury doodbytniczej jest gotowa do użycia.
- Za pomocą kąpieli wodnej podgrzej żel ultradźwiękowy do 37 °C. Przygotuj krem do depilacji, krem kontaktowy do elektrod i maść pod oczy.
2. Znieczulenie
- Wywołaj znieczulenie, umieszczając mysz w komorze przepłukanej 4% izofluranem i 40%O2 na 1 minutę. Chronić oczy maścią do oczu. Kontynuuj dopiero po osiągnięciu wystarczająco głębokiego znieczulenia (brak reakcji na bodźce bólowe).
- Utrzymuj znieczulenie za pomocą 1,5% izofluranu i 40%O2 za pomocą maski anestezjologicznej przez cały czas trwania zabiegu.
3. Wyznaczanie prędkości przepływu krwi w wewnątrzczaszkowych tętnicach szyjnych wewnętrznych za pomocą przezczaszkowego ultrasonografu dupleksowego o wysokiej częstotliwości
- Umieść mysz w pozycji leżącej na płycie grzewczej systemu ultradźwiękowego, aby utrzymać temperaturę ciała 37 °C.
- Pokryj cztery kończyny zwierzęcia pastą przewodzącą i przymocuj je taśmą do elektrod EKG osadzonych w tablicy. Sprawdź, czy parametry fizjologiczne (EKG, sygnał oddechowy) są prawidłowo wyświetlane na ekranie systemu obrazowania (np. Vevo3100). W razie potrzeby dostosuj poziom znieczulenia, aby uzyskać docelowe tętno 400-500 uderzeń na minutę (bpm).
- Umieść lubrykant na sondzie temperatury doodbytniczej i ostrożnie włóż go, aby monitorować temperaturę ciała. W razie potrzeby użyj dodatkowej lampy grzewczej.
- Przed pierwszym badaniem usuń sierść na potylicy chemicznie za pomocą kremu do depilacji. Za pomocą bawełnianego wacika rozprowadź i wcieraj krem przez 2 minuty, aż włoski zaczną wypadać.
- Po dodatkowych 2 minutach usuń krem i włoski szpatułką i zdezynfekuj skórę alkoholowym środkiem antyseptycznym do skóry. Pokryj go żelem ultradźwiękowym podgrzanym do 37 °C.
- Użyj przetwornika liniowego 38 MHz i szybkości odświeżania powyżej 200 klatek/s, aby uzyskać obrazy ultradźwiękowe i zamocować sondę w ramieniu mechanicznym. Umieść przetwornik na potylicy odchylonej do tyłu o 30°.
- Użyj trybu jasności (B) i trybu Dopplera fali barwnej (CW), aby uwidocznić prawą wewnątrzczaszkową tętnicę szyjną wewnętrzną i przesuwać przetwornik z jednostką sterującą do tyłu i do przodu, aż zostanie znaleziony maksymalny przepływ tętnic.
- Aby zebrać informacje anatomiczne, użyj tradycyjnego trybu B i trybu CW-Dopplera i rozpocznij akwizycję, klikając przycisk Acquire.
- Aby zarejestrować informacje o charakterystyce przepływu naczyń wewnątrzczaszkowych, kliknij przycisk Dopplera Pulse-Wave (PW), umieść objętość próbki w środku naczynia i uzyskaj pętlę cine dłuższą niż 3 s.
- Postępuj identycznie z lewą stroną.
- Kontynuuj z zewnątrzczaszkowymi tętnicami szyjnymi.
4. Wyznaczanie prędkości przepływu krwi w zewnątrzczaszkowych tętnicach szyjnych wewnętrznych za pomocą ultrasonografii dupleksowej o wysokiej częstotliwości
- Umieść mysz w pozycji leżącej na płycie grzewczej systemu ultradźwiękowego, aby utrzymać temperaturę ciała 37 °C.
- Pokryj cztery kończyny zwierzęcia pastą przewodzącą i przymocuj je taśmą do elektrod EKG osadzonych w tablicy. Sprawdź ponownie, czy parametry fizjologiczne są prawidłowo wyświetlane na ekranie.
- Przed pierwszym badaniem usuń chemicznie włosy z przedniej szyi, używając kremu do depilacji, jak opisano powyżej. Posmaruj przednią szyję żelem ultradźwiękowym podgrzanym do 37 °C.
- Użyj przetwornika liniowego 38 MHz i szybkości odświeżania powyżej 200 klatek/s, aby uzyskać obrazy ultradźwiękowe. Umieść przetwornik równolegle do zwierzęcia i dostosuj pozycję, aby uzyskać podłużne obrazy prawej tętnicy szyjnej.
- Użyj trybu jasności (B) i trybu Dopplera fali barwnej (CW), aby uwidocznić prawą tętnicę szyjną. Obraz powinien zawierać prawą tętnicę szyjną wspólną (RCC), prawą tętnicę szyjną wewnętrzną (RICA) i prawą tętnicę szyjną zewnętrzną (RECA).
- Aby zebrać informacje anatomiczne, użyj tradycyjnego trybu B i trybu CW-Dopplera i rozpocznij akwizycję, klikając przycisk Acquire.
- Aby zarejestrować informacje o charakterystyce przepływu tętnicy szyjnej zewnątrzczaszkowej, kliknij przycisk Dopplera Pulse-Wave (PW), umieść objętość próbki w środku środka tętnicy szyjnej wspólnej, tętnicy szyjnej wewnętrznej i tętnicy szyjnej zewnętrznej i uzyskaj pętlę cine dłuższą niż 3 s.
- Postępuj identycznie z lewą stroną.
- Zakończ znieczulenie i wyjmij zwierzę z płyty grzewczej. Zwierzę należy umieścić w klatce umieszczonej w inkubatorze podgrzanym do temperatury 37 °C na 1 godzinę, aby zapobiec hipotermii i sprawdzić, czy w pełni wyzdrowiało.
5. Przetwarzanie danych ultrasonograficznych
- Użyj zewnętrznej stacji roboczej do końcowego przetwarzania danych ultrasonograficznych o wysokiej częstotliwości. Eksportuj obrazy w trybie B, CW-Doppler i PW-Doppler oraz pętle cine.
- Otwórz wyeksportowane badanie ultrasonograficzne. Wybierz jedno zwierzę i otwórz pętlę filmową PW-Doppler wewnątrzczaszkowej tętnicy szyjnej. W tym protokole rejestruje się zazwyczaj od 7 do 8 uderzeń serca i odpowiadające im krzywe przepływu-prędkości.
- Zatrzymaj pętlę cine i kliknij przycisk Pomiar. Wybierz pakiet naczyniowy i kliknij RICA PSV, aby zmierzyć szczytowe ciśnienie skurczowe (PSV). Teraz kliknij w lewo na szczycie krzywej prędkości i przeciągnij linię prostą do linii zerowej. Określ pomiar jednym kliknięciem prawym przyciskiem myszy.
- Teraz wybierz RICA EDV, aby zmierzyć prędkość końcoworozkurczową (EDV). Kliknij w lewo na minimalnym wysypie krzywej prędkości na końcu rozkurczu. Przeciągnij linię prosto do linii zerowej i określ pomiar jednym kliknięciem prawym przyciskiem myszy.
- Wybierz RICA VTI, aby zmierzyć całkę w czasie prędkości (VTI). Kliknij w lewo na początku krzywej prędkości i podążaj za krzywą myszą aż do końca płaskowyżu rozkurczowego. Następnie ponownie kliknij w prawo, aby określić pomiar.
- Eksportuj dane śródmózgowych tętnic szyjnych wewnętrznych za pomocą przycisku raportu. Naciśnij przycisk Eksportuj i zapisz dane jako plik raportu VSI.
- Użyj tego samego podejścia do pomiaru PSV, EDV i VTI prawej zewnątrzczaszkowej tętnicy szyjnej wewnętrznej i odpowiednio wyeksportuj dane.
- Postępuj identycznie z lewą stroną.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
U 6 myszy, z których u 3 indukowano krwotok podpadowy (SAH) z wykorzystaniem modelu endowaskularnej perforacji filamentem, a 3 pozostałe poddano operacji pozorowanej, określono prędkości przepływu krwi w dokraniowej tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA) oraz pozaczaszkowej tętnicy ICA jeden dzień przed operacją oraz 1, 3 i 7 dni po operacji. Pomiary wykonano w ramach badań echokardiograficznych w innym badaniu, pod narkozą izofluranem, utrzymując temperaturę ciała na poziomie 37 °C19.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, badanie to jest pierwszym, w którym przedstawiono protokół monitorowania skurczu naczyń mózgowych w mysim modelu SAH z przezczaszkowym ultrasonografem Duplex o wysokiej częstotliwości. Pokazujemy, że ta metoda może mierzyć wzrost prędkości przepływu krwi śródczaszkowej po indukcji SAH u myszy. W medycynie ludzkiej zjawisko to jest dobrze znane 3,15. Kilka badań klinicznych wykazało, że podwyższone prędkości przepływu krwi w dużyc...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Stefanowi Kindelowi za przygotowanie ilustracji do filmu. PW, MM i SHK były wspierane przez niemieckie Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań Naukowych (BMBF 01EO1503). Prace zostały wsparte przez Large Instrumentation Grant Niemieckiej Fundacji Badawczej (DFG INST 371/47-1 FUGG). Projekt MM otrzymał stypendium z Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2020_EKEA.144).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Krem do depilacji Balea | Balea; Niemcy | ASIN B0759XM39V | krem do depilacji |
| C57BL/6N myszy | Janvier; Saint-Berthevin Cedex, Francja | n.a.mice | |
| Corneregel | Bausch& Lomb; Rochester, Nowy Jork, USA | ref maść | |
| waciki bawełniane | Hecht Assistent; Sondenheim vor der Rö hn, Niemcy | REF 44302010 | waciki bawełniane |
| Ecco-XS maszynka do golenia | Tondeo; Soligen, Niemcy | DE 28693396 | maszynka do golenia |
| Krem z elektrodą | GE; Boston, MA, USA | REF 21708318 | pasta przewodząca |
| Płyta grzewcza | Medax; Kilonia, Niemcy | 2005-205-01 | |
| Isoflurane | Abvie; Wiesbaden, Niemcy | n.d. | lotny środek znieczulający |
| Leukofix | BSN medyczny; Hamburg, Niemcy | REF 02137-00 | taśma |
| Ramię mechaniczne + mikromanipulator | VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA | P/N 11277 | |
| Tkanki mikrobakiczne | Paul Hartmann AG; Hamburg, Niemcy | REF 981387 | tkanki przeciwdrobnoustrojowe |
| MZ400, 38 MHz przetwornik liniowy | VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA | REF 51068-30 | przetwornik ultradźwiękowy |
| Sonosid | ASID Bonz GmbH; Herrenberg, Niemcy | REF 782010 | żel ultrasonograficzny Platforma ultrasonograficzna |
| z płytką grzewczą i zapisem EKG | VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA | P/N 11179 | |
| UniVet-Porta | Groppler; Oberperasberg, Niemcy | S/N BKGM0437 | waporyzator izofluranowy |
| Vevo3100 | VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA | REF 51073-45 | urządzenie ultrasonograficzne |
| Oprogramowanie VevoLab | VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA | n.a. | oprogramowanie ewaluacyjne |
Bibliografia
- Macdonald, R. L., Schweizer, T. A. Spontaneous subarachnoid haemorrhage. Lancet. 389 (10069), 655-666 (2017).
- Macdonald, R. L. Delayed neurological deterioration after subarachnoid haemorrhage. Nature Reviews Neurology. 10 (1), 44-58 (2014).
- Francoeur, C. L., Mayer, S. A. Management of delayed cerebral ischemia after subarachnoid hemorrhage. Critical Care. 20 (1), 277(2016).
- van Lieshout, J. H., et al. An introduction to the pathophysiology of aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Neurosurgical Review. , (2017).
- Altay, T., et al. A novel method for subarachnoid hemorrhage to induce vasospasm in mice. J Neurosci Methods. 183 (2), 136-140 (2009).
- Momin, E. N., et al. Controlled delivery of nitric oxide inhibits leukocyte migration and prevents vasospasm in haptoglobin 2-2 mice after subarachnoid hemorrhage. Neurosurgery. 65 (5), 937-945 (2009).
- Froehler, M. T., et al. Vasospasm after subarachnoid hemorrhage in haptoglobin 2-2 mice can be prevented with a glutathione peroxidase mimetic. Journal of Clinical Neuroscience. 17 (9), 1169-1172 (2010).
- Provencio, J. J., Altay, T., Smithason, S., Moore, S. K., Ransohoff, R. M. Depletion of Ly6G/C(+) cells ameliorates delayed cerebral vasospasm in subarachnoid hemorrhage. Journal of Neuroimmunology. 232 (1-2), 94-100 (2011).
- Kamp, M. A., et al. Evaluation of a murine single-blood-injection SAH model. PLoS One. 9 (12), 114946(2014).
- Luh, C., et al. The Contractile Apparatus Is Essential for the Integrity of the Blood-Brain Barrier After Experimental Subarachnoid Hemorrhage. Translational Stroke Research. , (2018).
- Neulen, A., et al. A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
- Neulen, A., et al. Large Vessel Vasospasm Is Not Associated with Cerebral Cortical Hypoperfusion in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage. Translational Stroke Research. , (2018).
- Neulen, A., et al. Neutrophils mediate early cerebral cortical hypoperfusion in a murine model of subarachnoid haemorrhage. Scientific Reports. 9 (1), 8460(2019).
- Neulen, A., et al. Volumetric analysis of intracranial vessels: a novel tool for evaluation of cerebral vasospasm. Int J Comput Assist Radiol Surg. 14 (1), 157-167 (2019).
- Washington, C. W., Zipfel, G. J. Participants in the International Multi-disciplinary Consensus Conference on the Critical Care Management of Subarachnoid, H. Detection and monitoring of vasospasm and delayed cerebral ischemia: a review and assessment of the literature. NeuroCritical Care. 15 (2), 312-317 (2011).
- Greke, C., et al. Image-guided transcranial Doppler sonography for monitoring of defined segments of intracranial arteries. Journal of Neurosurgical Anesthesiology. 25 (1), 55-61 (2013).
- Neulen, A., Prokesch, E., Stein, M., Konig, J., Giese, A. Image-guided transcranial Doppler sonography for monitoring of vasospasm after subarachnoid hemorrhage. Clinical Neurology and Neurosurgery. 145, 14-18 (2016).
- Neulen, A., et al. Image-Guided Transcranial Doppler Ultrasound for Monitoring Posthemorrhagic Vasospasms of Infratentorial Arteries: A Feasibility Study. World Neurosurgery. 134, 284-291 (2020).
- Neulen, A., et al. Correlation of cardiac function and cerebral perfusion in a murine model of subarachnoid hemorrhage. Scientific Reports. 11 (1), 3317(2021).
- Neulen, A., et al. A segmentation-based volumetric approach to localize and quantify cerebral vasospasm based on tomographic imaging data. PLoS One. 12 (2), 0172010(2017).
- Marbacher, S., et al. Systematic Review of In Vivo Animal Models of Subarachnoid Hemorrhage: Species, Standard Parameters, and Outcomes. Translational Stroke Research. , (2018).
- Figueiredo, G., et al. Comparison of digital subtraction angiography, micro-computed tomography angiography and magnetic resonance angiography in the assessment of the cerebrovascular system in live mice. Clinical Neuroradiology. 22 (1), 21-28 (2012).
- Lindegaard, K. F., Nornes, H., Bakke, S. J., Sorteberg, W., Nakstad, P. Cerebral vasospasm diagnosis by means of angiography and blood velocity measurements. Acta Neurochirurgica. 100 (1-2), 12-24 (1989).
- Cassia, G. S., Faingold, R., Bernard, C., Sant'Anna, G. M. Neonatal hypoxic-ischemic injury: sonography and dynamic color Doppler sonography perfusion of the brain and abdomen with pathologic correlation. American Journal of Roentgenology. 199 (6), 743-752 (2012).
- Shen, Q., Stuart, J., Venkatesh, B., Wallace, J., Lipman, J. Inter observer variability of the transcranial Doppler ultrasound technique: impact of lack of practice on the accuracy of measurement. Journal of Clinical Monitoring and Computing. 15 (3-4), 179-184 (1999).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
