Kartograficzny opis 3D komórki za pomocą kriomiękkiej tomografii rentgenowskiej

Podsumowanie

Tutaj przedstawiono protokół opisujący etapy przygotowania próbki i zbierania danych wymagane w kriogenicznej tomografii rentgenowskiej (SXT) do obrazowania ultrastruktury całych komórek kriokonserwowanych w rozdzielczości połowy tonu 25 nm.

Streszczenie

Techniki obrazowania są niezbędne do zrozumienia organizacji i maszynerii komórek w badaniach biologicznych i pokrewnych dziedzinach. Wśród tych technik krio-miękka tomografia rentgenowska (SXT) umożliwia obrazowanie całych komórek kriokonserwowanych w zakresie energii promieniowania rentgenowskiego okna wodnego (284-543 eV), w których struktury węglowe mają z natury wyższą absorpcję niż woda, co pozwala na rekonstrukcję 3D liniowego współczynnika absorpcji materiału zawartego w każdym wokselu. W ten sposób można uzyskać ilościowe informacje strukturalne na poziomie całych komórek o grubości do 10 μm, z wysoką przepustowością i rozdzielczością przestrzenną do połowy podziałki 25-30 nm. Cryo-SXT okazał się istotny dla obecnych badań biomedycznych, dostarczając informacji 3D na temat procesów infekcji komórkowych (wirusów, bakterii lub pasożytów), zmian morfologicznych spowodowanych chorobami (takimi jak recesywne choroby genetyczne) i pomagając nam zrozumieć działanie leku na poziomie komórkowym lub lokalizując określone struktury w środowisku komórkowym 3D. Ponadto, wykorzystując przestrajalną długość fali w obiektach synchrotronowych, spektromikroskopia lub jej odpowiednik 3D, spektrotomografia, może być również wykorzystywana do obrazowania i ilościowego oznaczania określonych pierwiastków w komórce, takich jak wapń w procesach biomineralizacji. Cryo-SXT dostarcza informacji uzupełniających do innych technik obrazowania biologicznego, takich jak mikroskopia elektronowa, fluorescencja rentgenowska lub fluorescencja światła widzialnego, i jest zwykle stosowana jako metoda partnerska do obrazowania korelacyjnego 2D lub 3D w warunkach kriogenicznych w celu powiązania funkcji, lokalizacji i morfologii.

Wprowadzenie

Cryo-SXT może odgrywać kluczową rolę w badaniach nad obrazowaniem biologicznym, ponieważ dostarcza objętości 3D o średniej rozdzielczości (25-30 nm half pitch) uwodnionych całych komórek^1,2,3^,4,5,6. W zakresie energii okna wodnego, między krawędziami K węgla i absorpcji tlenu (4,4-2,3 nm), struktury komórkowe bogate w węgiel pochłaniają 10 razy więcej niż ośrodek bogaty w tlen, który je przenika i otacza. W tym zakresie energii zeszklone komórki o grubości do 10 μm mogą być obrazowane bez konieczności cięcia lub barwienia, co prowadzi do ilościowych projekcji kontrastu o wysokiej absorpcji, co w połączeniu z możliwościami rotacji próbki pozwala na tomograficzną rekonstrukcję struktury komórkowej. Cryo-SXT wypełnia niszę pod względem wymiarów próbki i rozdzielczości przestrzennej, która nie jest łatwo dostępna za pomocą żadnej innej techniki obrazowania.

W skrócie, kontrast absorpcji krio-SXT jest ilościowy, ponieważ tłumienie fotonów przez próbkę o grubości t jest zgodne z prawem Beera-Lamberta w następujący sposób: , gdzie I₀ oznacza intensywność padania, a μ_lliniowy współczynnik absorpcji, który zależy od długości fali λ i wyimaginowanej części β współczynnika załamania światła próbki (). Tłumienie jest funkcją składu biochemicznego i grubości obrazowanych struktur, przy czym każdy składnik biochemiczny ma określony współczynnik absorpcji liniowej promieniowania rentgenowskiego μ_l (LAC). Oznacza to, że każda wartość woksela w tomografii zależy od pierwiastków chemicznych i ich stężenia w tym wokselu⁷. Pozwala to na naturalne rozróżnianie różnych organelli, takich jak jądra, jąderka, ciała lipidowe lub mitochondria, lub różnych stanów zagęszczenia chromatyny wyłącznie na podstawie ich nieodłącznych wartości LAC zrekonstruowanych^2,8,9.

Ponadto, cryo-SXT to technika o wysokiej przepustowości, w której tomogramy są pobierane w ciągu kilku minut. Umożliwia to w szczególności obrazowanie mezoskalowe populacji komórek, które można uchwycić w kluczowych punktach czasowych, takich jak podział, różnicowanie i apoptoza, ale także w różnych stanach reakcji, takich jak te wywołane ekspozycją chemiczną na określone terapie lekowe lub infekcje patogenne. Dane zebrane w tych kluczowych punktach dostarczą trójwymiarowego opisu systemu z wiernym zapisem organizacji przestrzennej różnych organelli komórkowych w tych konkretnych momentach.

Zazwyczaj, cryo-SXT jest używany w połączeniu z innymi technikami stosującymi podejścia korelacyjne, które pozwalają zlokalizować określone cechy, zdarzenia lub makrocząsteczki w środowisku komórkowym 3D^{4,10,11,12,13,14,15,16}, lub dane z twardej fluorescencji rentgenowskiej^17,18. Podejścia korelacyjne w warunkach kriogenicznych mają ogromne znaczenie dla uzyskania jak najpełniejszego i najbardziej wartościowego obrazu systemu będącego przedmiotem zainteresowania. Zwięzłe podsumowanie typowego przepływu pracy na liniach badawczych Mistral (Alba) i B24 (Diamond) cryo-SXT jest naszkicowane w Rysunek 1.

Ponadto, korzystając z możliwości dostrajania długości fali w obiektach synchrotronowych, można uzyskać informacje spektroskopowe oprócz strukturalnej, wykorzystując specyficzną absorpcję różnicową poszczególnych pierwiastków zawartych w próbce. Przykładem może być lokalizacja wapnia w badaniu procesów biomineralizacji w komórkach^19,20,21. Wykonując obrazy 2D przy różnych energiach fotonów (widmach) lub tomogramach poniżej oraz na interesującej nas krawędzi absorpcji promieniowania rentgenowskiego, można zidentyfikować piksele lub woksele zawierające wybrany pierwiastek. Spectra pozwala również na różnicowanie stanów chemicznych (tj. ewolucja amorficznego wapnia do hydroksyapatytu, jak w poprzednim przykładzie biomineralizacji²⁰). Kwantyfikacja różnych pierwiastków jest możliwa w 2D i 3D. Obrazowanie spektroskopowe zeszklonych komórek jest zwykle wykonywane w oknie wodnym, ale jest również możliwe w innych zakresach energii, jeśli zawartość wody jest wystarczająco niska lub jeśli stosowane są inne protokoły przygotowania próbki, w tym odwodnienie²². Szczegółowy protokół spektroskopii krok po kroku wykracza poza zakres niniejszego protokołu.

W dalszej części protokół skupia się na krótkim podsumowaniu głównych etapów przygotowania próbki, chociaż każdy system może wymagać indywidualnego dopracowania, po którym następuje szczegółowa procedura zbierania danych krok po kroku dla kriogenicznej tomografii rentgenowskiej.

Protokół

1. Przygotowanie próbki

1. Przygotowanie podpory sieci
   1. Naświetlać kratki promieniami UV przez 3 godziny, z folią węglową skierowaną do góry w celu sterylizacji.
   2. Opcjonalnie: W przypadku problemów z komórkami, które nie są przyczepiane do siatki, wykonaj jedną z poniższych czynności.
      1. Hydrofilizuj węglową folię nośną poprzez obróbkę plazmową siatek w celu zwiększenia rozprzestrzeniania się próbki i lepszej adhezji komórek.
         1. Umieść siatki stroną węglową do góry w komorze rozżarzenia i wystawiaj siatkę na działanie plazmy przez 30 s do 15 minut (przy użyciu Ar / i / i O₂) w zależności od sprzętu.
      2. Funkcjonalizacja siatek za pomocą poli-L-lizyny (PLL)
         1. Dodaj pojedyncze krople 60 μl PLL na szalce Petriego i umieść siatkę na wierzchu kropli PLL folią węglową skierowaną w dół. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C i osuszyć PLL za pomocą bibuły filtracyjnej.
      3. Funkcjonalizować siatki za pomocą płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
         1. Zanurz siatki w FBS na noc. Zanurz kratki w roztworze buforowym do umycia i pozostaw siatkę na bibule filtracyjnej, aby usunąć nadmiar płynu.
2. Hodowla przylegających komórek na siatkach
   1. Hoduj komórki w naczyniu do hodowli komórkowej o średnicy 100 mm, aby osiągnąć 80%-90% konfluencji (Rysunek 2A).
   2. Wysiewaj 1-5 x 10⁵ komórek/ml (dostosuj wartość do systemu) na siatkach Au na szalce Petriego P60 (łącznie 3 ml).
      nuta: Dodawanie zawiesiny komórkowej musi odbywać się bardzo ostrożnie, z warstwą węglową siatki skierowaną do góry w naczyniu do hodowli komórkowej o średnicy 60 mm. Przygotuj kilka siatek na warunek, po jednej na szalkę Petriego P60 (Rysunek 2B).
   3. Pozwól komórkom się uspokoić, aż zbieg na siatce osiągnie kilka komórek (od 1 do 10 w zależności od rozmiaru komórki) w każdym kwadracie siatki (w zależności od linii komórkowej może to potrwać do 24 godzin).
      nuta: Przed zamrożeniem siatki należy sprawdzić za pomocą mikroskopu światła widzialnego (VLM), oceniając integralność filmu węglowego, a także zbieganie komórek w każdej siatce (Rysunek 2C). Poczekaj, aż zostanie osiągnięta odpowiednia gęstość komórek na siatce. Jeśli siatka jest zbyt zlewająca się lub folia węglowa jest uszkodzona, zacznij od nowa.
3. Osadzanie komórek w zawiesinie na siatkach
   1. Pobrać przygotowaną siatkę Au lub Cu za pomocą pęsety z zamrażarki wgłębnej (patrz sekcja 1.6).
   2. Przygotować zawiesinę 1-5 x 10⁵ komórek (absorbancja gęstości optycznej 0,3 w przypadku bakterii) i dodać 4 μl przygotowanej zawiesiny do siatki.
   3. Inkubować siatkę z kroplą przez kilka minut poziomo, aby umożliwić osadzanie się komórek, a następnie umieścić pęsetę przytrzymującą siatkę w komorze witryfikacyjnej z kontrolowanym klimatem, ustawionej na odpowiednie warunki temperatury i wilgotności (krok 1.6.1).
4. Opcjonalnie: znakowanie fluorescencyjne próbek
   nuta: Korzystne może być fluorescencyjne znakowanie niektórych organelli próbki. W zależności od zainteresowania można zastosować określone fluorofory lub komórki stabilnie eksprymujące białko fluorescencyjne lub transfekowane w celu przejściowej ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania. Umożliwia to łatwe wykrywanie komórek za pomocą mikroskopii krioepifluorescencyjnej i pomaga w znalezieniu interesujących komórek do późniejszego obrazowania rentgenowskiego. W dalszej części protokołu szczegółowo opisano jedynie stosowanie fluoroforów.
   1. Przygotuj roztwór roboczy dla fluoroforu (patrz zalecenie producenta) i postępuj zgodnie z określonym protokołem.
   2. Dodaj fluorofory na szalkę Petriego zawierającą kratki i delikatnie wymieszaj.
   3. Pozostawić do inkubacji w ciemnym otoczeniu i przejść bezpośrednio do kroku 1.6 po zakończeniu inkubacji.
      UWAGA: Ważne jest, aby być gotowym do witryfikacji po zakończeniu inkubacji, aby uniknąć niespecyficznego znakowania, a w konsekwencji rozmytego sygnału fluorescencyjnego.
5. Przygotowanie nanocząstek Au (NPs) do wyrównania projekcji tomogramu
   1. Pobrać jedną porcję 1 ml referencyjnego roztworu podstawowego Au (100 nm przy Mistralu lub 250 nm przy B24) i odwirować z niską prędkością (aby uniknąć agregacji) przez 1 minutę, aby umożliwić osadzanie się nanocząste.
      nuta: Jeśli to możliwe, zaleca się pozostawienie powierników do naturalnego ustabilizowania się na noc lub dłużej, aby uniknąć agregacji.
   2. Usunąć supernatant. Bezpośrednio przed zamrożeniem ponownie zawiesić nanocząsteczki w 20 μl pożywki niezawierającej surowicy lub roztworze buforowym, aby uzyskać jednorodny roztwór.
      nuta: Zaleca się sonikację i wirowanie, aby pomóc w homogenizacji roztworu.
6. Kraty do zamrażania wgłębnego
   UWAGA: Ciekły azot może powodować oparzenia zimnem i należy nosić odpowiedni sprzęt ochronny (długi fartuch laboratoryjny, okulary ochronne, rękawice, długie spodnie i zamknięte buty). Etan jest wysoce wybuchowy i należy go trzymać z dala od iskier lub otwartego ognia.
   1. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby przygotować i używać zamrażarki wgłębnej.
      nuta: Wilgotność jest zwykle ustawiona na 80%-90%; temperatura będzie zależeć od rodzaju komórek (drożdże maksymalnie 30 °C, komórki ssaków 37 °C, komórki owadów 28 °C itp.).
   2. Weź siatkę z pęsetą montażową z szalki Petriego za krawędź, bardzo uważając, aby nie zgiąć siatki i zamontuj ją na zamrażarce wgłębnej. Upewnij się, że komórki są odwrócone od bibuły.
   3. Opcjonalnie: trzykrotnie umyć siatkę w buforze w przypadku przylegających komórek.
   4. Dodać 1,5 μl Au NP Fiducials na wierzch komórek (przez otwór po prawej stronie komory) i pozostawić na 30 sekund przed osuszeniem i zanurzeniem siatki.
      nuta: W przypadku komórek w zawiesinie, przed zamontowaniem pęsety dodaj Au NP fiducials do siatki, gdy jest ona jeszcze w pozycji poziomej i pozwól im osiąść przez 30 sekund. Blotting ma kluczowe znaczenie dla wysokiej jakości siatek. Odległość blottingu należy skalibrować przed rozpoczęciem; Płaskość bibuły jest ważna dla powtarzalnego bibuły (postępuj zgodnie z instrukcjami producenta). Czas krzepnięcia należy ocenić dla każdego typu komórek.
   5. Przygotuj kilka siatek na warunek. Przenieś siatkę i przechowuj w temperaturach kriogenicznych, aby zachować witryfikację.
7. Siatki przesiewowe z kriomikroskopią światła widzialnego
   1. Przenieś kratki pod ciekłym azotem z kriopojemników do standardowej kriokasety (trzy pozycje dla siatek TEM 3 mm) wewnątrz wstępnie schłodzonego kriostage (patrz instrukcje producenta).
   2. Kriokaseta jest umieszczana na mostku krioetapu, a kriostolik jest montowany na mikroskopie epifluorescencyjnym o szerokim polu widzenia.
   3. Zobrazuj siatki w temperaturze -196,5 °C za pomocą obiektywu o dużej odległości roboczej (10x, 50x, 100x) w celu zlokalizowania odpowiednich komórek do obrazowania cryo-SXT i oceny jakości siatki (obecność grubego lodu, integralność warstwy nośnej węgla, obecność sygnału fluorescencyjnego itp.).
   4. Zlokalizuj interesujące komórki za pomocą jasnego pola i/lub obrazowania fluorescencyjnego.
      UWAGA: Na tym etapie uchwyć obrazy, jeśli w mikroskopie znajduje się podłączona kamera. Użyj go do korelacji obrazu.
   5. Po przesiewaniu włóż kratki z powrotem do kriopojemników w zbiorniku Dewara do przechowywania ciekłego azotu.
      UWAGA: Jeśli nie zostaną znalezione żadne dobre próbki, powtórz czynności związane z przygotowaniem próbki, modyfikując dowolny z parametrów. Zwykle parametrami, które wymagają modyfikacji, są czas krzepnięcia, w przypadku, gdy lód jest zbyt gruby lub zbieg, jeśli na kwadrat siatki przypada zbyt wiele komórek.

2. Ładowanie do transmisyjnego mikroskopu rentgenowskiego (TXM)

1. Schłodzić komorę transferową ciekłym azotem, aż osiągnie <100 K, schłodzić stanowisko pracy (Rysunek 3A) i włączyć grzałkę na krawędzi stanowiska pracy. Poczekaj, aż przestanie wrzeć.
2. Umieść potrzebne krio-boxy zawierające siatki w odpowiednich miejscach na stacji roboczej (Rysunek 3A). Zwróć uwagę, aby bezpiecznie przenieść je w warunkach kriogenicznych.
3. Załaduj wybrane siatki do uprzednio schłodzonych uchwytów na próbki (Rysunek 3B); załaduj uchwyty na wahadłowiec i zabezpiecz je osłonami (Rysunek 3C).
4. Załaduj czółenko do komory transferowej o temperaturze <100 K i przepompuj je do niskiej próżni ( Rysunek 3D).
5. Podłącz komorę transferową do TXM (Rysunek 4A) i załaduj czółenko z komory transferowej do TXM zgodnie z procedurą podciśnienia na ekranie (Rysunek 4B).
6. Gdy wózek znajdzie się w środku z próbkami, ramię robota TXM może przynosić jeden uchwyt na próbkę na raz do etapu próbkowania ( Rysunek 4C).

3. Obrazowanie za pomocą oprogramowania TXM

UWAGA: Siatki na etapie próbkowania są najpierw obrazowane za pomocą mikroskopu światła widzialnego on-line (VLM) w celu zmapowania siatki w trybie jasnego pola i/lub fluorescencji, zanim zostaną zobrazowane za pomocą promieni rentgenowskich. Użyj ikony joysticka odpowiadającej karcie Sterowanie ruchem w lewym górnym panelu, aby otworzyć Sterowanie ruchem.

1. Obrazowanie siatki za pomocą VLM on-line.
   1. Akwizycja mozaiki jasnego pola
      1. Wybierz kamerę VLM (Soczewka powiększająca > VLM) i włącz źródło LED VLM do obrazowania w jasnym polu (Ustawienia akwizycji > akwizycji mikroskopu > > Ustawienia źródła i wybierz Transmisja).
      2. Obróć próbkę do -60 stopni, aby była zwrócona w stronę obiektywu VLM (Sterowanie ruchem > próbki > próbki θ) i przesuń próbkę do oczekiwanych pozycji środkowych (Sterowanie ruchem > próbki i zmień próbkę X, próbkę Y).
      3. Podczas pozyskiwania obrazów w krokach od 20 do 50 μm należy najpierw ustawić ostrość siatki (ustawienia akwizycji > akwizycji > mikroskopu > tryby akwizycji > Ciągły > start; Sterowanie ruchem > Próbka i zmień próbkę Z).
      4. Udoskonalaj ostrość, zmniejszając ostrość mniejszymi krokami do 5 μm, aż komórki i/lub otwory w węglowej folii nośnej będą ostre (ustawienia akwizycji > akwizycji > mikroskopu > tryby akwizycji > ciągły start >; Motion Control > Sample and change Sample Z) i rozpocznij akwizycję pełnej mapy mozaikowej siatki w trybie jasnego pola. Użyj wartości domyślnych dla mozaiki. (Ustawienia akwizycji > akwizycji mikroskop>u > trybach akwizycji > Mosaic > start).
         >nuta: Mapa mozaikowa składa się z pojedynczych obrazów. Liczba obrazów (liczba kolumn, wierszy i rozmiar kroku w X i Y) powinna być ustawiona tak, aby wizualizować całą siatkę. Rozmiar kroku zależy od wielkości pola widzenia (FoV). W tym miejscu używane są wartości domyślne. Jeśli siatka nie jest dobrze wyśrodkowana w płaszczyźnie X-Y w stosunku do pełnego pola widzenia mozaiki, przerwij akwizycję, skoryguj współrzędne X i Y próbki i powtórz akwizycję.
   2. Akwizycja mozaiki w trybie fluorescencji
      1. Wyłącz źródło VLM do obrazowania w jasnym polu (Mikroskop > Akwizycja > Ustawienia akwizycji > Ustawienia źródła i usuń zaznaczenie opcji Transmisja) i ręcznie wybierz źródło światła LED odpowiadające żądanej długości fali wzbudzenia (czerwonej, zielonej lub niebieskiej) i odpowiedniemu filtrowi optycznemu w konfiguracji.
      2. Uściślij ostrość na obrazie fluorescencyjnym (Mikroskop > Akwizycja > Ustawienia akwizycji > Tryby akwizycji > Ciągły start >; Motion Control > próbkowanie i zmiana próbki Z), a następnie uzyskaj mapę mozaikową zachowującą parametry pozycyjne (X i Y) z mozaiki jasnego pola (Mikroskop > Akwizycja > Ustawienia akwizycji > Tryby akwizycji > Mozaika > Start).
      3. Wyłącz źródło światła LED
      4. Opcjonalnie: Na podstawie map jasnego pola i mozaiki fluorescencyjnej opisz obszary zainteresowania (ROI) zidentyfikowane wcześniej (krok 1.7.4) lub nowe obszary zainteresowania (pozycje X-Y na obrazie).
2. Nabywanie mozaiki rentgenowskiej
   1. Wybierz detektor promieniowania rentgenowskiego CCD (Soczewka powiększająca > wybierz Pixis), ustaw próbkę w rotacji o 0 stopni (Sterowanie ruchem > Próbka i zmień próbkę θ) i przesuń optykę promieniowania rentgenowskiego (kondensor i płytka strefowa) do wyrównanych pozycji (Sterowanie ruchem > Kondensator > zmień Kondensator z; Sterowanie ruchem > Płytka strefy i zmiana płyty strefy Z).
      >nuta: Ostudź chip CCD do -65 °C przed obrazowaniem (Mikroskop > Temperatura kamery > Pixis i zmień ustawioną temperaturę na -65 °C i kliknij Zastosuj).
   2. Przesuń próbkę do środka kwadratu siatki jednego z wybranych ROI (Motion Control > Sample i zmień Sample X, Sample Y).
   3. Użyj binningu 2 i szczeliny wyjściowej na 5 μm, aby zminimalizować napromieniowanie i ekspozycję 1 s na Mistral, a przy kategoryzacji 1 i 60 μm na B24, dostosuj ostrość za pomocą translacji próbki Z (Ustawienia akwizycji > akwizycji > mikroskopu > Ustawienia kamery i zmień bining; Sterowanie ruchem > XS i zmiana XS; Ustawienia akwizycji > akwizycji mikroskopu >> tryby akwizycji > ciągły start >; Sterowanie ruchem > Próbka i zmiana próbki Z). Zacznij od kroków co 5 μm i zmniejszaj do 0,5 μm, aż otwory w ogniwie lub folii węglowej będą dobrze ostre.
   4. Uzyskaj mozaikową mapę kwadratu siatki (Ustawienia akwizycji > akwizycji mikroskopu > > trybie akwizycji > Mosaic > Start).
      >nuta: Parametry akwizycji mozaiki można określić w taki sam sposób, jak w przypadku mozaiki VLM (sekcja 3.1.1.4). Wielkość kroku zależy od powiększenia wstępnie wybranego przez obsługę linii badawczej.
   5. Przenieś próbkę do pozycji płaskiego pola (FF) (pusty obszar w siatce, najlepiej otwór w podporze węglowej) (Sterowanie ruchem > próbki i zmień próbkę X, próbkę Y).
   6. Ustaw czas ekspozycji na 1 s w trybie Mistral i 0,5 s w trybie B24 (ustawienia akwizycji > akwizycji mikroskopu > > ustawień aparatu i zmień czas ekspozycji) i uzyskaj pojedynczy obraz (Mikroskop > trybach akwizycji > akwizycji > Pojedynczy start >).
   7. Znormalizuj (podziel) pozyskaną mozaikę przez obraz FF, aby uzyskać transmisję (z wartościami od 0 do 1) i zapisz znormalizowaną mozaikę (kliknij ikonę pierwszego prawego górnego rogu po prawej stronie obrazu, aby otworzyć menu>wybierz kartę Odniesienie> kliknij Pojedyncze odniesienie i przeglądaj konkretny FF).
3. Przygotowanie do odbioru prześwietlenia rentgenowskiego serii
   nuta: Znajdź oś obrotu dla każdego obszaru zainteresowania, który jest obrazowany.
   1. Dokonaj wyboru obszarów w mozaice do wykonania tomografii, tj. umieszczając kwadratowy kształt (kliknij Narzędzie po lewej stronie okna obrazu) z rozmiarem FoV na mapie mozaiki rentgenowskiej.
      nuta: Wybierając obszary, należy wziąć pod uwagę odległość od obramowania (≥10 μm) i innych komórek, aby uniknąć nakładania się komórek podczas obracania. Ponadto sprawdź stan komórki (oczekiwany kształt komórki, grubość lodu, powodzenie witryfikacji, rozprzestrzenianie się fiducial itp.).
   2. Wyrównanie próbki na osi obrotu
      nuta: Opisana procedura ma charakter iteracyjny. Iteracja zbiega się szybciej, wykorzystując kąty 60° jako maksymalne kąty obrotu (θ_M) ±. Jeśli nie są one dostępne, użyj kątów jak najbardziej zbliżonych do ± 60°.
      1. Ustaw w aparacie binning 2, czas ekspozycji 1 s (Mikroskop > Akwizycja > Ustawienia akwizycji > Ustawienia aparatu i zmień Czas ekspozycji; zmień Binning; Mikroskop > tryby akwizycji > akwizycji > ciągły > start), ustaw szczelinę wyjściową na 5 μm.
         >nuta: Zminimalizuj dawkę tak bardzo, jak to możliwe, pracując z minimalnym otworem szczeliny wyjściowej.
      2. Przy obrocie pod kątem 0° przejdź do poprzednio wybranego obszaru za pomocą translacji próbki X i próbki Y i skup się na funkcji komórki, aby umieścić ją w osi obrotu za pomocą translacji próbki Z (Sterowanie ruchem > próbka i zmiana próbki x; Próbka y; Próbka z).
      3. Obróć próbkę do + θ_M (Sterowanie ruchem > Próbka i zmień próbkę θ) i narysuj linię (L+) (kliknij przycisk narzędzia linii po prawej stronie okna obrazu) na obiekcie komórki, który ma zostać umieszczony na osi obrotu.
      4. Obróć do -θ_M (Sterowanie ruchem > próbkowanie i zmień próbkę θ) i narysuj linię (L-) (kliknij przycisk narzędzia linii po prawej stronie okna obrazu) na elemencie komórki, którą chcesz umieścić na osi obrotu.
      5. Będąc przy +θ_M lub -θ_M, użyj translacji próbki Z, aby przesunąć wybrany element do pozycji środkowej między obiema liniami (Sterowanie ruchem > Próbka i zmień Próbka Z).
      6. Powtarzaj procedurę od kroku 3.3.2.3 iteracyjnie, aż do osiągnięcia minimalnej odległości L+ do L-.
         nuta: Odległość między dwiema liniami L+ i L- powinna być mniejsza w stosunku do poprzedniej iteracji.
      7. Przy próbie θ = 0 (Sterowanie ruchem > Próbka i zmiana próbki θ), przesuń próbkę X o dwukrotność odległości potrzebnej do umieszczenia wybranego elementu w środku obu linii (Sterowanie ruchem > Próbka i zmień Próbkę X). Przesuń płytę strefy (ZP) X, aby przesunąć funkcję z powrotem do środka pola widzenia (Motion Control > ZP i zmień ZP X). Wykonaj ten krok tylko raz na siatkę.
      8. Ponownie zoptymalizuj pozycję ZP Z względem nowej osi obrotu, rejestrując serię ogniskowych ZP Z (zbiory obrazów w różnych pozycjach ZP Z, zwykle w krokach co 0,3 μm) (Mikroskop > Pobieranie > Ustawienia akwizycji > Tryby akwizycji > serii ogniskowych > Start) i przesuń ZP Z do pozycji, w której próbka jest ostra (Sterowanie ruchem > Blacha strefy i zmień Płytę strefy z).
      9. Ustaw parametry akwizycji serii pochylenia.
         nuta: Maksymalny zakres kątowy jest ostatecznie ograniczony przez ogniskową ZP (odpowiednio ±70 lub ±65 stopni dla ZP 40 nm lub 25 nm dla płaskiej próbki). Zoptymalizuj stosunek sygnału do szumu (S/N) i uszkodzenia spowodowane promieniowaniem, aby określić czas ekspozycji. W przypadku tomografii należy stosować różne czasy naświetlania w różnych zakresach kątowych.
      10. Określ najwyższy zakres kątowy obrotu, w przypadku gdy zacienienie występuje przed osiągnięciem maksymalnego kąta obrotu.
      11. Ustaw kategoryzację kamery na 1 (Mikroskop > Akwizycja > Ustawienia akwizycji > Ustawienia kamery i zmień Binning), otwórz szczelinę wyjściową na 15 μm w Mistral (Motion Control > XS i zmień XS) i ustaw obrót na 0° (Sterowanie ruchem > Próbka i zmień próbkę θ).
      12. Uzyskaj pojedynczy obraz z czasem naświetlania 1 s (Mikroskop > Akwizycja > Ustawienia akwizycji > Tryby akwizycji > Pojedynczy start >) i oszacuj czas ekspozycji wymagany dla każdego kąta nachylenia tomografii.
4. Akwizycja tomografii
   1. Przejście do ujemnego kąta maksymalnego +0,1 (na przykład dla ZP 25 nm przejdź do -65,1°) (Sterowanie ruchem > Próbka i zmień Próbka θ).
   2. Ustaw liczbę obrazów jako całkowitą liczbę kątów (biorąc pod uwagę obraz pod kątem 0) i zakres kątowy (Mikroskop > Ustawień akwizycji > akwizycji > Tryby akwizycji > Tomografia i zmień liczbę obrazów, a następnie zmień Kąt początkowy i końcowy
   ).
   3. Ustaw zdefiniowany czas ekspozycji i rozpocznij akwizycję (Mikroskop > Akwizycja > Ustawienia akwizycji > Ustawienia kamery i zmień Czas ekspozycji, a następnie kliknij Start).
   4. Przejdź do pozycji FF (Motion Control > Sample i zmień Sample X; następnie zmień Sample Y) i uzyskaj 10 obrazów FF (Mikroskop > Tryby akwizycji > Akwizycji > Średnia i zmień liczbę obrazów , a następnie kliknij Start).
      >nuta: W Mistral spektromikroskopia lub mikroskopia zależna od energii jest możliwa podczas uzyskiwania projekcji podczas skanowania energii przez krawędź absorpcji będącą przedmiotem zainteresowania. Końcowym wynikiem jest stos projekcji 2D, który będzie zawierał widmo absorpcji promieniowania rentgenowskiego (XAS) w każdym pikselu, tj. obrazy z informacją chemiczną. Rozszerzenie do 3D łączące spektroskopię z tomografią jest w zasadzie możliwe. Całkowita wymagana dawka może być ograniczeniem i wtedy mogą być wymagane określone strategie, takie jak obrazowanie absorpcji różnicowej.

4. Analiza danych

UWAGA: Wszystkie analizy danych są wykonywane za pomocą dostępnego otwartego oprogramowania i skryptów opracowanych za pomocą zautomatyzowanych potoków.

1. W Mistralu
   1. Pipeline konwertuje stosy tomografii z rozszerzenia txrm (rozszerzenie oprogramowania TXM) na hdf5 (open source hierarchical data format) ze wszystkimi potrzebnymi metadanymi, następnie normalizuje stos według średniej FF i prądu maszyny, a na koniec dekonwolucjonizuje stosy za pomocą funkcji zmierzonego rozproszenia punktów układu optycznego dla określonej soczewki płytki strefy Fresnela (ZP) i energy^{23, 24}. Aby uzyskać dekonwolucję, znajdź odpowiednią wartość k = 1/SNR (w zależności od grubości próbki). Dla skryptu opracowanego w Mistralu wpisz polecenie: txrm2deconv "input tomo" "input FF" -zp="ZP used" - e= " energy " - dx= " rozmiar piksela " - k= " 1/SNR " - t=-1.
   2. Dla skryptu opracowanego w Mistral do automatycznego wyrównywania wpisz polecenie: ctalignxcorr "znormalizowany zdekonwoluowany stos.mrc" "znormalizowany stos.hdf5".
      UWAGA: Do wyrównania rzutów do wspólnej osi obrotu można użyć wielu aplikacji, korzystając z Au NP fiducials^25,26. Wyrównanie projekcji wymaga dokładności subpikselowej. Automatyczne wyrównanie może być zadowalające tylko wtedy, gdy odniesienia Au NP są wystarczające (>7) i dobrze rozłożone w polu widzenia. Ręczne wyrównanie jest często potrzebne a posteriori, aby skorygować automatyczne wyrównanie w celu osiągnięcia najwyższej możliwej dokładności.
   3. Aby zrekonstruować wyrównany znormalizowany stos, użyj dowolnego z kilku dostępnych algorytmów.
      UWAGA: Wyrównany stos można zrekonstruować za pomocą Weighted Back Projection (WBP) lub Simultaneous Iterative Reconstruction Techniques (SIRT) w ciągu kilku minut. Jednakże, aby zachować liniowe współczynniki absorpcji (LAC), preferowane są Algebraiczne Techniki Rekonstrukcji (ART)²⁷. ART wymaga więcej czasu obliczeniowego, więc SIRT²⁸ jest wykonywany jako pierwszy w celu szybkiej rekonstrukcji serii nachylenia z automatycznym wyrównaniem (30 iteracji w kilka minut). Gdy wyrównanie będzie zadowalające, zostanie użyty ART.
2. W B24
   1. Niestandardowy potok konwertuje pliki danych txrm na standardowe pliki TIFF ze wszystkimi potrzebnymi metadanymi, a następnie wysyła je do przepływu pracy runtomo wsadowego, który przetwarza zestawy danych na trzy sposoby: WBP, SIRT i poprawka.

Wyniki

Przygotowanie próbek do krio-SXT może być wyzwaniem. Nawet w obrębie tej samej siatki próbki możliwe jest posiadanie obszarów, które są idealne, i obszarów, które nie są idealne, co można zobaczyć na Rysunek 5, który pokazuje dwa kwadraty z tej samej siatki szukacza Au. Idealna próbka powinna mieć pojedyncze komórki w środku kwadratowej siatki, osadzone w cienkiej warstwie lodu i otoczone dobrze rozproszonymi znacznikami odniesienia Au używanymi do wyrównania projekcji nachylenia przed rekonstrukcją tomograficzną. Rysunek 5A przedstawia komórkę podobną do fibroblastu (NIH 3T3), która spełnia wiele z tych kryteriów. Pojedynczy wycinek z rekonstrukcji 3D przy użyciu ART²⁷ obszaru oznaczonego czerwoną ramką wskazującą pole widzenia (FoV) jest pokazany w Rysunek 5B. Dzięki ilościowej rekonstrukcji LAC można wyróżnić wiele różnych organelli, takich jak mitochondria (M), retikulum endoplazmatyczne (ER), pęcherzyki (V) i jądro (N). Ponadto stosunek sygnału do szumu rekonstrukcji jest bardzo wysoki, co pozwala na uzyskanie wysokiego kontrastu cech komórkowych. Z drugiej strony, Rysunek 5C pokazuje kwadrat o większej gęstości komórek. Z tego powodu blotting jest zwykle mniej wydajny, co prowadzi do grubszej warstwy lodu, a nawet problemów z witryfikacją. W niektórych przypadkach można to zaobserwować już podczas badań przesiewowych siatki za pomocą mapowania epifluorescencji przed obrazowaniem rentgenowskim i za wszelką cenę należy unikać tych siatek. W Rysunek 5C, można zaobserwować pęknięcie w siatce i zeszklony lód przechodzący przez cały kwadrat siatki (zaznaczony czerwonymi strzałkami). Należy unikać obrazowania w pobliżu pęknięć ze względu na prawdopodobną niestabilność siatki pod wpływem wiązki. Ponadto pęknięcia mogą być oznaką grubego lodu, tak jak miało to miejsce w tym obszarze. Serię przechyłów zarejestrowano w obszarze oznaczonym czerwoną ramką. W Rysunek 5D, pokazany jest pojedynczy wycinek z odpowiedniej rekonstrukcji 3D. Nawet jeśli można rozpoznać niektóre większe struktury, drobne szczegóły giną w szumie i ziarnistej fakturze ze względu na słabą jakość zeszklenia grubego lodu, co można zobaczyć na przykład na górnych mitochondriach wskazanych strzałką.

Rysunek 1: Przepływ pracy. Schematyczny przebieg pracy przeprowadzony przed zebraniem danych cryo-SXT. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Rosnące komórki na siatkach. (A) Komórki rosnące na szalce Petriego P100 z konfluencją około 80%-90%. (B) Szalka Petriego P60 z kilkoma siatkami po wysianiu komórek. (C) Komórki rosnące na siatce po 24 godzinach. Podziałka skali: 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Ładowanie siatek na uchwyty próbek i do komory transferowej. (A) Stacja robocza wypełniona ciekłym azotem z wózkiem i krioboxami gotowymi do załadunku siatek. (B) Uchwyt na próbkę włożony do ładowarki z załadowaną siatką. (C) Czółenko z uchwytem na próbkę w pozycji 3 bez pokrywy. (D) Stacja robocza z dołączoną komorą transferową. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Ładowanie próbek do TXM (A) Podłączanie komory transferowej do TXM. (B) Wahadłowiec wewnątrz TXM. (C) Ramię robota TXM wkładające uchwyt próbki do stolika na próbkę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Przykład kriomiękkich tomogramów rentgenowskich. Górny rząd: idealna próbka, (A) mozaikowy widok 2D kwadratu siatki pokazujący izolowaną komórkę w środku. (B) Jeden wycinek ze zrekonstruowanej objętości 3D pokazujący zaznaczony obszar z czerwoną ramką (A). W porównaniu do (D) obraz jest znacznie płynniejszy i widać więcej szczegółów. Dolny rząd: próbki nieidealne, (C) mozaikowy widok 2D kwadratu siatki pokazujący zbyt dużą konfluencję komórek i pęknięcia w lodzie i folii siatki (czerwone strzałki). (D) Jeden wycinek ze zrekonstruowanej objętości 3D pokazujący obszar zaznaczony czerwoną ramką w (C). Słabą lub nieoptymalną witryfikację można rozpoznać po ziarnistej teksturze obrazu. N: jądro; M: Mitochondria; ER: Retikulum endoplazmatyczne; MV: Ciała wielopęcherzykowe; V: Wakuola; Podziałki liniowe: A i C 20 μm; B & D 2 μm.VKliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Przygotowanie próbki jest kluczowym krokiem do uzyskania wysokiej jakości miękkich tomogramów rentgenowskich, ponieważ ich jakość zależy bezpośrednio od jakości witryfikacji próbki i grubości warstwy lodu, w której osadzona jest komórka. Projekcje o wysokim stosunku sygnału do szumu będą zbierane w regionach z cienką warstwą lodu, co pozwoli zminimalizować dawkę promieniowania wymaganą do osiągnięcia najwyższej możliwej rozdzielczości. Ponadto zbieg komórek będzie również miał wpływ na końcową jakość tomogramu, ponieważ należy unikać sytuacji, w której sąsiednie komórki wchodzą w pole widzenia podczas rotacji. Wreszcie, właściwa dyspersja znaczników odniesienia Au określi dokładność wyrównania projekcji, a następnie ostatecznie określi jakość końcowej objętości zrekonstruowanej w 3D. Należy pamiętać, że odpowiednie rozproszenie Au fiducials na siatce umożliwia automatyzację kroku wyrównania projekcji, bez którego potrzebna jest wysoka wiedza specjalistyczna dla tak krytycznego kroku.

Niniejszy protokół przedstawia tylko jedną możliwą strategię przygotowania próbki, która jest podobna do tych stosowanych w kriotomografii elektronowej (cryo-ET). W obu przypadkach protokoły poprawiające wymagające przygotowanie próbek w celu uzyskania lepszej odtwarzalności będą miały fundamentalne znaczenie dla powodzenia tych technik i podejmowane są wysiłki w tym kierunku²⁹. Warto wspomnieć, że oprócz obrazowania izolowanych komórek, można również wizualizować wycinki tkanki, pod warunkiem, że sygnał transmisyjny przez przekrój będzie wystarczający przy dużych kątach nachylenia. Zazwyczaj oznacza to przekroje o wielkości kilku mikronów (poniżej 10 μm).

Aby zobrazować określoną strukturę lub zdarzenie wewnątrz komórki, należy upewnić się, że ta konkretna cecha znajduje się wewnątrz pola widzenia serii pochylenia. Ponieważ pole widzenia w cryo-SXT jest ograniczone do 10 x 10 μm² do 15 x 15 μm² w zależności od obiektywu i uwzględnia nadpróbkowanie pikseli rozdzielczości do co najmniej współczynnika 2, często jest mniejsze niż pełne rozszerzenie komórki (patrz czerwone kwadraty wskazane na rysunku 5). Dlatego zwrot z inwestycji musi zostać znaleziony i odpowiednio oznaczony. Odbywa się to zwykle za pomocą znaczników fluorescencyjnych i podejść korelacyjnych w świetle widzialnym. Strategie 2D łączące epifluorescencję są proste, ponieważ mikroskop transmisyjny miękkiego promieniowania rentgenowskiego ma zintegrowany mikroskop fluorescencyjny światła widzialnego on-line, ale dostępne są również inne podejścia do sygnału fluorescencji 2D lub 3D^o wysokiej rozdzielczości 4,12,13,15,16 . W takich przypadkach siatka musi być najpierw zobrazowana w określonych instrumentach, takich jak mikroskopy o wysokiej rozdzielczości. Należy zauważyć, że najbardziej efektywne podejścia korelacyjne to te, które obejmują gromadzenie danych w warunkach kriogenicznych. Dzieje się tak, ponieważ upływ czasu między temperaturą pokojową (RT), obrazowaniem fluorescencyjnym w świetle widzialnym i witryfikacją próbki, na przykład, utrudni uchwycenie właściwego zdarzenia komórkowego na czas; ponadto procedura witryfikacji może odłączyć komórkę będącą przedmiotem zainteresowania, która została zobrazowana w RT, od siatki. Nawet jeśli większość metod obrazowania korelacyjnego może sugerować, że siatki próbek muszą być manipulowane i transportowane z jednego instrumentu do drugiego, i pomimo zwiększonego ryzyka zanieczyszczenia siatki lub uszkodzenia, jakie to stwarza, nagroda jest jasna: możliwość wskazania określonych zdarzeń lub cząsteczek w krajobrazie komórkowym.

Gdy wymagane jest obrazowanie całych komórek, możliwe jest zszywanie różnych tomogramów, pod warunkiem, że całkowita zastosowana dawka nie przekracza limitu uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem. Zazwyczaj zdeponowana dawka do pobrania kilku tomogramów na tej samej komórce jest znacznie niższa od limitu w osiągalnej rozdzielczości (10⁹ Gy) i dlatego nie jest wymagana żadna szczególna strategia obniżania dawki, chociaż jest to zależne od próbki i eksperymentu. W przypadku intensywnego gromadzenia danych, takiego jak spektrotomografia, konieczne byłoby zminimalizowanie dawki i zastosowanie wygodnych strategii gromadzenia danych i ich przetwarzania.

Cryo-SXT ma kilka ograniczeń, o których należy tutaj wspomnieć. Pierwszym z nich jest dobrze znany brakujący klin, który jest nieodłącznym elementem stosowania płaskich podpór próbek. Kapilarne nośniki próbek umożliwiające obrót o 180 stopni były stosowane w przeszłości i nadal są stosowane w niektórych obiektach, ale mają również wady, takie jak zubożony kontrast spowodowany absorpcją szkła i ograniczenie stosowania komórek w zawiesinie. Sposobem na zmniejszenie efektu brakującego klina jest wykonanie tomografii z podwójnym pochyleniem. Jest to obecnie możliwe na linii badawczej Mistral. Drugim ograniczeniem jest stosowana w tego typu mikroskopach soczewka ze strefą Fresnela. Ten obiektyw ustawia najwyższą osiągalną rozdzielczość i głębię ostrości (DoF), które są ze sobą ściśle powiązane. Oznacza to, że zwiększenie rozdzielczości zmniejszy głębię ostrości, podczas gdy grubość komórki będzie często większa. Na przykład obiektyw 40 nm będzie miał teoretycznie głębię ostrości 3 μm i rozdzielczość 24,4 nm o połowie skoku. Kompromis między rozdzielczością a DoF jest więc strategiczny, a wybór obiektywu będzie zależał od typu ogniwa^30,31. Wreszcie, działające TXM na całym świecie są dalekie od bycia idealnymi mikroskopami i podejmowane są wysiłki w celu ulepszenia systemów optycznych, aby spełniały teoretyczne oczekiwania. Wreszcie, wizualizację i segmentację zrekonstruowanych woluminów można przeprowadzić za pomocą specjalnych narzędzi programowych 25,32,33,34.

Podsumowując, cryo-SXT pozwala na obrazowanie komórek ilościowo w średniej rozdzielczości (25-30 nm half pitch) i w liczbach statystycznych (kilkadziesiąt tomogramów dziennie). Pozwala to na uzyskanie organizacji, rozmieszczenia i wymiaru organelli w określonych warunkach, na przykład podczas infekcji patogenami lub chorobami, w określonych punktach czasowych lub po określonych zabiegach. Jest to zatem użyteczna technika obrazowania biologicznego uzupełniająca bardziej powszechne mikroskopy elektronowe i mikroskopy światła widzialnego, z których każda zajmuje się określonym zakresem wymiarów i rozdzielczości próbki. Cryo-SXT jest często stosowany w podejściach korelacyjnych obejmujących fluorescencję światła widzialnego, ale możliwe są również inne strategie kriokorelacji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Oprogramowanie Amira	Thermo Fisher		do segmentacji
Au Holey Carbon Films  siatki szukające	(Quantifoil Micro Tools Gmb	R 2/2 Au G200F1	Au Holey Carbon Films szukaj siatek
Au nanocząstki	BBI Group, Cardiff, Wielka Brytania	Nanocząstki Au 100nm	100nm Nanocząstki Au (NPs) w nanocząstkach Mistral (Alba)
Au	BBI Group, Cardiff, Wielka Brytania	Nanocząstki Au 250nm	250 nm Nanocząstki Au (NPs) przy B24 (Diament)
Axio Scope A1	Mikroskop fluorescencyjny	Zeiss	430035 9060
Bibuła filtracyjna Bloksy nr 1	Whatman	WHA10010155	Filtr bibułowy
Bsoft			Oprogramowanie do wyrównywania, rekonstrukcji i wizualizacji projekcji (Heymann i in., 2008)
Chimera			Oprogramowanie do segmentacji (Pettersen i wsp. 2004)
Zestaw do wyładowywania jarzeniowego	Cryo-EM PELCO easiGlow	91000S	System czyszczenia wyładowań jarzeniowych
Cu Holey Carbon Films  siatki szukacza	(Quantifoil Micro Tools Gmb	R 2/2Cu G200F1	Cu Holey Carbon Films siatki szukacza
Surowica cielęca płodu	Sigma	F9665	Inaktywowana termicznie, sterylnie filtrowana, odpowiednia do hodowli komórkowych
ImageJ			Oprogramowanie do przetwarzania i analizy obrazów w języku Java (NIH & LOCI University of Wisconsin)
Oprogramowanie IMOD			do wyrównywania, rekonstrukcji i wizualizacji projekcji (Kremer et al., 1996)
Tłok siatkowy Leica EM GP	Automatyczna zamrażarka wgłębna Leica		16706401
Stolik kriogeniczny EM LINKAM	Linkam Scientific Instruments	CMS 196	Mikroskopia kriokorelacyjna, podstawa
MIB			Oprogramowanie do segmentacji (Belevich i wsp. 2016)
P100 szalka Petriego	Sigma	P6106	Poddana obróbce do hodowli komórkowych i sterylna
P60 szalka Petriego	Sigma	D8054	Poddana obróbce do hodowli komórkowych i sterylna
Polilizyna	Sigma	P4707	Roztwór poli-L-lizyny 0,01%, sterylnie filtrowany
miękki mikroskop rentgenowski 0,25-1,2keV	Xradia	NCT-SB	Transmisja miękka Mikroskop rentgenowski
SURVOS			Oprogramowanie do segmentacji  (Luengo i wsp. 2017)
Tomo3d			Oprogramowanie do rekonstrukcji (SIRT, WBP) (Agulleiro i wsp. 2011)
TomoJ			Oprogramowanie do rekonstrukcji (ART) (Messaoudi i wsp., 2007)
XM Data Explorer	Oprogramowanie Zeiss		TXM