Artykuł metodologiczny

Przejście śródbłonka do mezenchymalnego za pośrednictwem TGF-β (EndMT) i ocena funkcjonalna efektorów EndMT przy użyciu edycji genów CRISPR/Cas9

6.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62198

⸱

26 lutego 2021

 ,  ,  , 
1Dept. Cell Chemical Biology, Leiden University Medical Center, 2Oncode Institute, Leiden University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy metody badania EndMT indukowanego przez TGF-β2 w komórkach śródbłonka, obserwując zmiany morfologii komórek i badając zmiany markerów związanych z ekspresją EndMT za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Opisano edycję genu CRISPR/Cas9 i wykorzystano ją do wyczerpania genu kodującego ślimaka w celu zbadania jego roli w EndMT indukowanym przez TGF-β2.

Streszczenie

W odpowiedzi na określone sygnały zewnętrzne i aktywację pewnych czynników transkrypcyjnych, komórki śródbłonka mogą różnicować się w fenotyp podobny do mezenchymalnego, proces ten określa się mianem przejścia śródbłonka do mezenchymalnego (EndMT). Pojawiające się wyniki sugerują, że EndMT jest przyczynowo powiązany z wieloma chorobami ludzkimi, takimi jak zwłóknienie i nowotwory. Ponadto komórki mezenchymalne pochodzące ze śródbłonka mogą być stosowane w procedurach regeneracji tkanek, ponieważ mogą być dalej różnicowane w różne typy komórek (np. osteoblasty i chondrocyty). W związku z tym selektywna manipulacja EndMT może mieć potencjał kliniczny. Podobnie jak przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT), EndMT może być silnie indukowany przez wydzielany czynnik wzrostu transformujący cytokinę beta (TGF-β), który stymuluje ekspresję tak zwanych czynników transkrypcyjnych EndMT (EndMT-TF), w tym ślimaka i ślimaka. Te EndMT-TF następnie regulują poziom odpowiednio białek mezenchymalnych i śródbłonka. W tym miejscu opisujemy metody badania EndMT indukowanego przez TGF-β in vitro, w tym protokół do badania roli poszczególnych TF w EndMT indukowanym przez TGF-β. Korzystając z tych technik, dostarczamy dowodów na to, że TGF-β2 stymuluje EndMT w mysich komórkach śródbłonka mikronaczyniowego trzustki (komórki MS-1) oraz że genetyczne zubożenie ślimaka za pomocą zgrupowanych, regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR) / edycji genów za pośrednictwem białka 9 (Cas9) związanego z CRISPR, znosi to zjawisko. Podejście to może służyć jako model do badania potencjalnych modulatorów biologii śródbłonka i może być wykorzystane do wykonywania genetycznych lub farmakologicznych badań przesiewowych w celu zidentyfikowania nowych regulatorów EndMT, które mogą mieć zastosowanie w chorobach ludzkich.

Wprowadzenie

Przejście śródbłonka do mezenchymalnego (EndMT) jest wieloetapowym i dynamicznym zjawiskiem biologicznym, które zostało powiązane z różnymi procesami fizjologicznymi i patologicznymi1,2. Po EndMT komórki śródbłonka stopniowo tracą swoje cechy śródbłonka, jednocześnie nabywając właściwości mezenchymalne3; W ten sposób ściśle zbite i dobrze zorganizowane komórki śródbłonka różnicują się w wydłużone komórki mezenchymalne. Zmiany morfologiczne w EndMT zbiegają się ze zmianami w ekspresji niektórych genów i białek. Ogólnie rzecz biorąc, zmniejsza się ekspresja białek, które utrzymują cechy śródbłonka, w tym kadheryny śródbłonka naczyniowego (VE), cząsteczki adhezyjnej płytek krwi/EC-1 (CD31/Pecam-1). Jednocześnie gromadzą się białka związane z funkcjami mezenchymalnymi, takie jak aktyna α-mięśni gładkich (α-Sma) i białko mięśni gładkich 22α (Sm22α). Pojawiające się wyniki wykazały, że poporodowy EndMT przyczynia się do rozwoju chorób u ludzi, takich jak rak, zwłóknienie serca, tętnicze nadciśnienie płucne (PAH), miażdżyca (AS), zwłóknienie narządów itp2,4,5,6,7. Głębsze zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw EndMT oraz sposobów kierowania procesem EndMT pozwoli na opracowanie nowych metod leczenia chorób związanych z EndMT i medycyny regeneracyjnej.

TGF-β jest jednym z głównych induktorów EndMT, a inne znane czynniki to Wnt/β-katenina, Notch i niektóre cytokiny zapalne1. Ponieważ kontekst komórkowy ma kluczowe znaczenie dla odpowiedzi wyzwalanych przez TGF-β, wzajemne oddziaływanie TGF-β z innymi sygnałami promującymi EndMT jest istotne dla TGF-β w celu wywołania odpowiedzi EndMT. Po aktywacji receptorów kinazy serynowo-treoninowej TGF-β na powierzchni komórki typu I i typu II, aktywowany jest wewnątrzkomórkowy kanoniczny szlak Smad. Fosforylowany Smad2/3 za pośrednictwem receptora TGF-β tworzy heteromeryczne kompleksy z Smad4, które translokują się do jądra, gdzie zwiększają ekspresję czynników transkrypcyjnych związanych z EndMT. Podobnie jak w przypadku przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT), czynniki transkrypcyjne, takie jak Snail, Slug, Twist, Zeb1 i Zeb2, są indukowane przez sygnalizację TGF-β i przyczyniają się do przeprogramowania genów w EndMT8.

Ślimak był często identyfikowany jako kluczowy czynnik w EndMT. Ślimak wiąże się z promotorem genów kodujących białka adhezyjne komórka-komórka i hamuje ich transkrypcję, co jest równoważone przez zwiększenie ekspresji białek mezenchymalnych9. Komórki śródbłonka stanowią bardzo niejednorodną populację, a względny wpływ różnych bodźców zewnątrzkomórkowych na EndMT może się różnić w zależności od kontekstu komórkowego śródbłonka lub typu komórki10. Ze względu na podobieństwa do EMT, niektóre metodologie są przydatne do badania zarówno mechanizmów EMT, jak i EndMT8. W związku z tym Międzynarodowe Stowarzyszenie EMT (TEMTIA) zdecydowanie podkreśla potrzebę stosowania technik uzupełniających, aby ostatecznie wykazać występowanie EMT/EndMT11.

Tutaj opisujemy metodę monitorowania i wizualizacji procesu EndMT wywołanego przez TGF-β. Barwienie immunofluorescencyjne dostarcza podstawowych informacji o zmianach ekspresji docelowych białek/markerów, które są wykorzystywane jako wskaźniki tego, czy zachodzi proces EndMT. Dodatkowo barwienie immunofluorescencyjne może uwidocznić lokalizację białek/markerów i morfologię komórek. Aby zbadać potencjalną aktywność określonych TF (lub innych regulatorów wyższego lub niższego szczebla) zaangażowanych w EndMT za pośrednictwem TGF-β, opisujemy protokół wykorzystujący edycję genów z regularnie rozmieszczonymi krótkimi powtórzeniami palindromicznymi (CRISPR) / białkiem 9 (Cas9) w celu zubożenia określonych genów z komórek, na przykładzie TF Snail. Cas9 to endonukleaza DNA sterowana podwójnym RNA, która rozpoznaje i rozszczepia sekwencje komplementarne do sekwencji CRISPR w bakteriach12. System CRISPR/Cas9 jest obecnie szeroko stosowany, ponieważ ułatwia inżynierię genetyczną in vitro i in vivo13. Kierowany przez pojedynczy przewodnik RNA (sgRNA), ektopowo eksprymowany Cas9 generuje podwójne pęknięcie nici we wstępnie wybranej sekwencji docelowej w określonym locus genu. Niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) odbywa się w celu naprawy pęknięć nici wywołanych przez Cas9, poprzez losowe insercje lub delecje nukleotydów, co prowadzi do zakłócenia i inaktywacji docelowego genu. Szczegółowo opisano metody projektowania selektywnych sgRNA oraz generowania wektorów kompatybilnych z lentiwirusem zawierających zaprojektowane sgRNA. W rezultacie, stabilne, zubożone genami komórki śródbłonka mogą być generowane w wydajny i niezawodny sposób.

W tym badaniu użyliśmy mysich komórek mikronaczyniowych śródbłonka trzustki (MS-1)14 jako systemu modelowego do zbadania procesu EndMT indukowanego przez TGF-β2. Nasze poprzednie badanie wykazało, że ślimak jest głównym czynnikiem transkrypcyjnym zwiększonym przez TGF-β2, przez który EndMT jest indukowany w komórkach MS-115. Po edycji genu CRISPR/Cas9 w celu zniesienia ekspresji ślimaka w komórkach MS-1, TGF-a2 nie pośredniczył w EndMT. Ten przepływ pracy można zastosować do badania innych (podejrzewanych) genów związanych z EndMT.

Protokół

1. Indukcja EndMT przez TGF-β2

  1. Komórki MS-1 w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny w inkubatorze (5% CO2, 37 °C). Posmaruj wszystkie naczynia/talerze hodowlane 0,1% w/v żelatyny przez 10 minut przed użyciem.
  2. Delikatnie umyj komórki MS-1 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS), dodaj 2 ml roztworu trypsyny-EDTA (0,25% trypsyny i 0,02% EDTA) do 10 cm naczynia i inkubuj przez 2 minuty w temperaturze 37 °C, aby je odłączyć. Następnie dodaj 5 ml kompletnej pożywki hodowlanej, aby wygasić reakcję.
  3. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 4 ml świeżej pożywki zawierającej FBS i penicylinę/streptomycynę. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek.
  5. Nasiona 1 x 103 komórki na cm2 do dalszej hodowli. Na przykład, seed 9,5 x 103 komórki/dołek dla płytek 6-dołkowych lub 1,9 x 103 komórki/dołek dla płytek 24-dołkowych.
  6. Inkubuj komórki przez noc, aby mogły przylegać i regenerować się, a następnie stymuluj komórki MS-1 TGF-β2 przez 3 dni. Dodaj inhibitor kinazy receptora TGF-β SB431542 (5 μM) 30 minut przed stymulacją TGF-β2. Traktować inne komórki nośnikiem (DMSO).
    UWAGA: Rozpuść TGF-β2 w 4 mM HCl zawierającym 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Dodaj taką samą ilość buforu ligandowego bez TGF-β2 do grupy kontrolnej. Stężenie TGF-β2 można dostosować do poziomu 0,1-1 ng/ml dla określonych testów. Patrz wskazania na odpowiednich rysunkach.
  7. Po 3 dniach zbadaj morfologię komórki za pomocą obrazowania w jasnym polu (za pomocą mikroskopu odwróconego) i wykonaj barwienie immunofluorescencyjne (patrz krok 2) w celu oceny zmian markerowych związanych z EndMT. Wykonaj co najmniej trzy niezależne eksperymenty, aby uzyskać biologiczne potrójne próby.

2. Barwienie immunofluorescencyjne

  1. Trypsynizować hodowane komórki MS-1 (krok 1.2), a następnie ponownie zasiać 1,9 x 103 komórki na okrągłym szkle nakrywkowym o średnicy 12 mm pokrytym żelatyną o zawartości 0,1%, umieszczonym na dnie płytki 24-dołkowej.
  2. Po wyhodowaniu komórek przez noc dodaj TGF-β2 (końcowe stężenie 1 ng / ml) do komórek przez 3 dni. Użyć pożywki zawierającej bufor ligandowy jako kontroli ujemnej.
  3. Wykonaj barwienie Pecam-1 i Sm22α.
    1. Po stymulacji komórek TGF-β2 (lub Kontrola) przez 3 dni, usuń pożywkę i umyj komórki 1x PBS.
    2. Dodaj 300 μl 4% formaldehydu do każdej studzienki i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby utrwalić komórki. Przemyć 3x 1x PBS po inkubacji.
    3. Dodaj 300 μl 0,1% Triton X-100 w 1x PBS do każdej studzienki i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby przepuszczalność komórek. Po inkubacji usunąć roztwór Triton X-100 i przemyć komórki 3x 1x PBS.
    4. Zablokuj komórki 3% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w 1x PBS przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciała Pecam-1 i Sm22α, które rozpoznają białka myszy 1:500 za pomocą 1x PBS. Następnie inkubować utrwalone komórki z pierwszorzędowymi przeciwciałami przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Po umyciu 3x z 1x PBS, inkubuj komórki z 1000x rozcieńczonymi przeciwciałami drugorzędowymi, w tym anty-szczurem osła Alexa 488 i kozim anty-królikiem Alexa 594, przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Chronić próbki przed światłem podczas barwienia.
    7. Po przepłukaniu 3x 1x PBS, umieścić szkło nakrywkowe wysiane komórkami do dołu na kropli podłoża montażowego zawierającego 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) na szkiełku w celu zabarwienia jąder.
    8. Przymocować brzeg szkła nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci i przechowywać go w temperaturze 4 °C.
    9. Uzyskaj reprezentatywne obrazy za pomocą mikroskopu konfokalnego. Ustaw długości fal lasera na 405 nm, 488 nm i 552 nm, aby wykryć odpowiednio DAPI, Pecam-1 i Sm22α. Dla każdego kanału wszystkie zdjęcia zostały wykonane z tymi samymi ustawieniami i czasem naświetlania. Wykonaj co najmniej trzy niezależne eksperymenty, aby uzyskać biologiczne potrójne próby.

3. Znokautuj ślimaka za pomocą edycji CRISPR/Cas9

  1. Zaprojektuj dwa niezależne sgRNA ukierunkowane na mysiego ślimaka.
    1. Projektuj sgRNA za pomocą narzędzi online CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/) i Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/) zgodnie z docelową nazwą genu i gatunkiem.
    2. Przewiduj aktywność off-target zaprojektowanych sgRNA ukierunkowanych na ślimaka za pomocą dwóch niezależnych algorytmów, w tym Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/) i CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/).
    3. Wybierz dwa sgRNA o najniższej aktywności off-activity. Zaprojektuj dwa komplementarne oligonukleotydy sgRNA z miejscem cięcia BveI. Oligo zmysłowy zaczyna się od 5'-ACCG-3', a oligo antysensowny zaczyna się od 5'-AAAC-3'.
    4. Zamów komercyjną syntezę oligonukleotydów w celu ich dalszego wykorzystania.
  2. Sklonuj komplementarne oligonukleotydy przewodnika RNA do trawionego przez BveI AA19 pLKO.1-puro.U6.sgRNA. BveWypychacz plazmid wektorowy lentiwirusowy do generowania AA19 pLKO.1-Snail-sgRNA16.
    1. Przeciąć AA19 pLKO.1-puro.U6.sgRNA. BvePlazmid nadziewający z enzymem BveI16. Wymieszać 2 μg AA19 pLKO.1-puro.U6.sgRNA. BvePlazmid nadziewacza, 5 μl 10x buforu O i 5 μl enzymu BveI i dodać sterylną wodę, aby osiągnąć całkowitą objętość 50 μl.
    2. Odwirować i krótko odwirować mieszaninę reakcyjną. Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    3. Załaduj mieszaninę reakcyjną na 1% żel agarozowy i uruchom w 1x Tris-acetate-EDTA (TAE, 50x TAE stock: 242 g zasady Tris rozpuszczonej w wodzie, 57,1 ml lodowatego kwasu octowego, 100 ml 500 mM roztworu EDTA (pH 8,0) i dodaj wodę do łącznie 1 l) buforu, aż do uzyskania dobrego oddzielenia.
    4. Wyciąć fragment szkieletu z żelu, wyizolować go za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela Materiałów) i wymyć szkielet w 40 μl buforu elucyjnego (EB).
    5. Zmieszaj 5 μl 100 pmol/μL oligo sensownego i 5 μl 100 pmol/μL oligo antysensownego z 1 μl 1 M Tris-HCl (pH 8,0) i dodaj sterylną wodę, aby osiągnąć łącznie 100 μl do wyżarzania oligonukleotydów gRNA. Inkubować mieszaninę przez 5 minut w temperaturze 100 °C, a następnie przykryć probówki folią aluminiową. Następnie powoli schłodzić roztwór do temperatury pokojowej w celu dalszego wykorzystania jako wkładka.
    6. Aby podwiązać komplementarne oligonukleotydy gRNA i szkielet trawiony przez BveI, wymieszaj 1 μl izolowanego szkieletunadziewarki Bve I ciętego AA19 pLKO.1-puro.U6.sgRNA.BveI i 2 μl wkładki (rozcieńczonej w stosunku 1:300) z 2 μl 10x buforu ligazy DNA T4 i 1 μl ligazy DNA T4 i dodaj sterylną wodę, aby uzyskać łącznie 20 μl. Krótko obróć probówkę, i inkubować przez 4 godziny w temperaturze pokojowej do dalszego wykorzystania.
      UWAGA: Podczas wykonywania podwiązania upewnij się, że uwzględnione są dwie grupy kontrolne. Dla jednej grupy kontrolnej wymieszaj 1 μl izolowanego szkieletu, 2 μl 10x buforu ligazy DNA T4 i 1 μl ligazy DNA T4 i dodaj sterylną wodę, aby uzyskać łącznie 20 μl, ale bez oligo DNA. W przypadku drugiej grupy kontrolnej wymieszaj 1 μl izolowanego szkieletu i 2 μl 10x buforu ligazy DNA T4 i dodaj sterylną wodę, aby uzyskać łącznie 20 μl, ale bez wyżarzonych oligonukleotydów i ligazy T4. Te dwie ligacje kontrolne służą do określenia tła reakcji w następnym kroku transformacji i wskazania, jak wydajna jest ligacja.
  3. Przekształć mieszaninę reakcyjną w kompetentną TOP10 E. coli.
    1. Zebrać właściwe komórki TOP10 E. coli z zamrażarki w temperaturze -80 °C i rozmrozić je na lodzie.
    2. Dodać 2 μl mieszaniny do ligacji do 50 μl kompetentnych komórek i trzymać probówkę na lodzie przez 30 minut.
    3. Szok termiczny probówki w temperaturze 42 °C przez 30 s. Umieść probówkę na lodzie na 2 minuty.
    4. Do mieszaniny dodać 950 μl świeżego bulionu lizogenicznego (LB) i energicznie wstrząsać w temperaturze 37 °C przez 60 min.
    5. Zakręć i ułóż komórki na ciepłej płytce LB o odporności na ampicylinę (100 μg/ml). Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez noc.
  4. Sprawdź pomyślne wprowadzenie oligonukleotydów gRNA do plazmidu.
    1. Pobrać 3-5 kolonii z 1 ml ampicyliny (100 μg/ml) zawierającej pożywkę LB i wstrząsnąć przez noc w temperaturze 30 °C.
    2. Wyizolować plazmidowe DNA za pomocą zestawu plazmidowego zgodnie z protokołem producenta (tabela materiałów) i zsekwencjonować je za pomocą startera promotora U6 5'- GAGGGCCTATTTCCCATGATT -3' w celu sprawdzenia pomyślnego wprowadzenia oligonugoligugolaktykugi gRNA.

4. Generuj komórki MS-1 z nokautem ślimaka

  1. Wytwarzaj cząsteczki lentiwirusowe przenoszące gRNA Cas9 lub ślimaka.
    1. Hodowla komórek HEK 293T w DMEM zawierających 10% płodowej surowicy bydlęcej i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny na 14,5 cm szalkach (lub kolbach T75) w inkubatorze (5% CO2, 37 °C).
    2. Wymieszaj 9,9 μg plazmidu genu celującego, plazmidu AA19 pLKO.1-Snail-sgRNA lub plazmidu pLV-Cas917, razem z plazmidami pomocniczymi 3,5 μg pCMV-VSVG (kodującego białko G wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej, VSV-G), 6,6 μg plazmidu pMDLg-RRE reagującego na rev (kodującego Gag i Pol) i 5,0 μg pRSV-REV (kodującego Rev) w 500 μl wolnej pożywki surowicy. Zawiesić 50 μl polietyleniminy (PEI) (2,5 mg/ml) w 500 μl pożywki wolnej od surowicy. Delikatnie wymieszaj plazmidy i preparaty PEI, pipetując w górę i w dół. Inkubować mieszaninę przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Transfekcja komórek HEK 293T poprzez dodanie pożywki mieszaniny z kroku 4.1.2 do 80% zlewających się komórek w 14,5 cm szalkach (lub kolbach T75), które zawierają pożywkę DMEM z 10% FBS i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny. Komórki HEK293T są używane, ponieważ łatwo ulegają transfekcji i generują wysoki poziom wirusa18.
    4. Przenieść transfekowane komórki HEK 293T do bezpieczeństwa biologicznego w laboratorium mikrobiologicznym i biomedycznym (BMBL) w celu ich hodowli przez 24 godziny.
    5. W laboratorium BMBL zastąp pożywkę transfekcyjną z komórek HEK 293T 12 ml świeżego kompletnego DMEM zawierającego FBS i penicylinę/streptomycynę. Inkubować komórki przez 24 godziny.
    6. Zebrać i przefiltrować pożywkę za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml i filtra 0,45 μm. Przenieść kondycjonowane podłoże do probówki polipropylenowej o pojemności 15 ml.
    7. Dodać 12 ml świeżego kompletnego DMEM zawierającego FBS i penicylinę/streptomycynę do naczynia hodowlanego HEK 293T i hodowli przez dodatkowe 24 godziny.
    8. Zebrać i przefiltrować pożywkę za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml i filtra 0,45 μm. Przenieść kondycjonowane podłoże do probówki polipropylenowej o pojemności 15 ml. Pożywkę zawierającą cząstki lentiwirusa należy przechowywać w postaci 1 ml podwielokrotności w temperaturze -80 °C do dalszego wykorzystania.
  2. Zainfekuj komórki MS-1 wirusem pLV-Cas9.
    1. Wysiewać 1 x 105 komórek MS-1 na basenik na płytce 6-dołkowej przez 24 godziny przed zakażeniem lentiwirusem.
    2. Rozmrozić zamrożone podwielokrotności wirusa pLV-Cas9 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    3. Zmieszać 1 ml pożywki z wirusem z 1 ml świeżej pożywki DMEM zawierającej FBS i penicylinę/streptomycynę. Do pożywki dodać polibren (końcowe stężenie 10 μg/ml), aby zwiększyć skuteczność infekcji.
    4. Usunąć pożywkę z płytki 6-dołkowej i zastąpić ją pożywką mieszającą wirusa/polibren i hodować komórki w inkubatorze przez 24 godziny. 24 godziny po zakażeniu, zastąpić pożywkę świeżą pożywką i hodować komórki przez kolejne 24 godziny
      UWAGA: Zawsze utrzymuj niezainfekowaną studnię jako grupę kontrolną.
    5. Odessać pożywkę z grupy zakażonej i grupy kontrolnej i zastąpić ją pożywką DMEM z blasticydyną 4 μg/ml.
    6. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C i hodować komórki przez 1 tydzień. Niezainfekowane komórki umrą z powodu działania blasticydyny. Podziel komórki, które przeżyły, gdy osiągną 80% zbiegu komórek i kontynuuj selekcję blasticydyny.
    7. Potwierdź ekspresję Cas9 w komórkach MS-1 za pomocą western blot przy użyciu przeciwciała przeciwko Cas9 (masa cząsteczkowa Cas9 wynosi około 160 kDa).
  3. Oddzielnie infekuj komórki pLV-Cas9 MS-1 dwoma niezależnymi lentiwirusami gRNA.
    1. Wysiew 1 x 10 5 komórek pLV-Cas9 MS-1 na dołek w płytce 6-dołkowej przez 24 godziny przed zakażeniem.
    2. Postępuj zgodnie z tym samym protokołem, jak opisano w 4.2, aby oddzielnie zainfekować komórki dwoma lentiwirusami gRNA.
    3. Po 24 godzinach od zakażenia wirusem gRNA należy odświeżyć pożywkę i hodować komórki przez kolejne 24 godziny.
    4. Zastąp pożywkę DMEM na 1 μg/ml puromycyny. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C i hodować komórki przez 1 tydzień. Upewnij się, że niezainfekowane komórki są całkowicie martwe. Podziel komórki, gdy osiągną 80% konfluencji i kontynuuj selekcję puromycyny.
    5. Potwierdź nokaut ślimaka w komórkach MS-1 za pomocą western blot przy użyciu przeciwciała przeciwko ślimakowi (masa cząsteczkowa ślimaka wynosi około 35 kDa).

Wyniki

TGF-β2 indukuje EndMT i stymuluje ekspresję Snail w komórkach śródbłonka MS-1
TGF-β jest jedną z cytokin o największym potencjale indukowania EndMT. Po traktowaniu komórek MS-1 TGF-β2 (1 ng/mL) przez 3 dni, śródbłonkowe komórki MS-1 tracą swoją strukturę przypominającą brukowanie i różnicują się w wrzecionowate komórki o fenotypie mezenchymalnym (Ryc. 1A)15. Aby dalej zweryfikować rolę TGF-β2 w indukowaniu zmian fenotypowych komórek, przed stymulacją TGF-β2 poddaliśmy komórki wstępnej inkubacji z SB431542, małą cząsteczką będącą inhibitorem kinazy apoptotycznej związanej z receptorem aktywiny (ALK)4/ALK5/ALK719. SB431542 całkowicie zniosło indukowane przez TGF-β2 zmiany morfologii komórek (Ryc. 1A). Proces EndMT indukowany przez TGF-β2 zbadano dalej poprzez analizę zmian w ekspresji markerów związanych z EndMT. Jak pokazano na Ryc. 1B, ekspresja białka śródbłonkowego Pecam-1 uległa silnemu obniżeniu po stymulacji TGF-β2, podczas gdy czynnik mezenchymalny Sm22α został wyraźnie upregulowany przez TGF-β215. Dane te są zgodne z tezą, że TGF-β2 wywołało EndMT w komórkach MS-1. Następnie zbadaliśmy wpływ TGF-β2 na ekspresję Snail i Slug. Jak pokazano na Ryc. 1C, Snail został wyraźnie upregulowany przez TGF-β2, natomiast ekspresja Slug w komórkach MS-1 nie uległa wpływowi TGF-β215. Ilościowe oznaczenie ekspresji Snail z trzech niezależnych eksperymentów przedstawiono na Ryc. 1D.

Wyciszenie ekspresji Snail za pomocą CRISPR/Cas9 w komórkach śródbłonka MS-1
Ponieważ białko Snail było indukowane przez TGF-β2 i prawdopodobnie uczestniczyło w EndMT indukowanym przez TGF-β2, przeprowadziliśmy edycję genów CRISPR/Cas9 w celu genetycznego wyciszenia ekspresji Snail w komórkach MS-1. Postawiliśmy hipotezę, że wyciszenie Snail będzie wystarczające do zahamowania indukowanego przez TGF-β2 procesu EndMT. Jak pokazano na Rysunku 2A, wygenerowaliśmy komórki z nokautem Snail w dwóch etapach. Po pierwsze, zastosowano ektopową ekspresję Cas9 poprzez zakażenie komórek MS-1 lentiwirusem wyrażającym Cas9. Ze względu na obecność kasety oporności na blasticidynę w konstrukcie pLV-Cas9, sprawdzono ekspresję Cas9 za pomocą analizy Western blot w komórkach opornych na blasticidynę (Rysunek 2D). Następnie wprowadzono sgRNA specyficznie celujące w Snail, aby zakłócić ekspresję tego białka. Procedurę tę wykonano również poprzez zakażenie cząsteczkami lentiwirusowymi niosącymi konstrukt AA19 pLKO.1-Snail-sgRNA, który zawiera kasetę ekspresji puromycyny. Komórki wyrażające Cas9 ponownie zainfekowano lentiwirusem zawierającym gRNA, a następnie poddano selekcji puromycyną. Zaprojektowano dwa komplementarne oligonukleotydy sgRNA  celujące w mysi gen Snail, z przewidywaną niską aktywnością poza celową (Rysunek 2B,C). Po wprowadzeniu dwóch niezależnych sgRNA dla Snail do komórek MS-1 wyrażających Cas9, ekspresja białka Snail została zniesiona (Rysunek 2D)15.

Niedobór Snail hamuje indukowany przez TGF-β2 proces EndMT w komórkach MS-1
Aby wykazać funkcję Snail w EndMT pośredniczonej przez TGF-β2, przeprowadziliśmy test EndMT w komórkach z ubytkiem Snail i porównaliśmy go z rodzimymi komórkami MS-1. Jak pokazano na Rysunku 3A, knockout Snail był wystarczający, aby zahamować indukowaną przez TGF-β2 morfologię komórek przypominającą fibroblasty w komórkach MS-115. Ponadto, pośredniczony przez TGF-β2 spadek poziomu Pecam-1 oraz wzrost Sm22α zostały całkowicie zablokowane w komórkach MS-1 z ubytkiem Snail. Podsumowując, wykazaliśmy, że Snail jest kluczowy dla EndMT pośredniczonego przez TGF-β2 w komórkach MS-1 (Rysunek 3B)15.

figure-results-1
Rysunek 1. TGF-β2 indukuje EndMT i ekspresję Snail w komórkach MS-1. A. Wpływ TGF-β2 i/lub inhibitora kinazy receptora typu I TGF-β SB-431542 na morfologię komórek. Zdjęcia w jasnym polu komórek MS-1 po 2 dniach inkubacji z TGF-β2 (1 ng/mL) i/lub SB-431542 (SB, 5 µM, podanym 30 min przed TGF-β2). Pasek skali odpowiada 200 µm. B. Barwienie immunofluorescencyjne Pecam-1 (zielony) i Sm22α (czerwony) w komórkach MS-1 hodowanych w pożywce zawierającej TGF-β2 (1 ng/mL) przez 3 dni. Jądra komórkowe zwizualizowano w kolorze niebieskim (DAPI). Pasek skali: 50 µm. C. Western blot lizatów całych komórek MS-1 stymulowanych TGF-β2. Ekspresja Snail, ale nie Slug, została zwiększona przez stymulację TGF-β2, co zgadza się z wynikami opisanymi wcześniej przez Ma et al15. D. Ilościowe oznaczenie ekspresji Snail poprzez integrację wyników z trzech niezależnych eksperymentów western blot. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2. Wyciszenie Snail za pomocą edycji genów CRISPR-Cas9. A. Schemat przedstawiający sposób generowania komórek z nokautem Snail. Bsd: blastycydyna. Puro: puromycyna. B. Oligonukleotydy dwóch niezależnych sgRNA celujących w Snail, zaprojektowane przy użyciu CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) oraz Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/). C. Przewidywana aktywność off-target dwóch gRNA dla Snail wyznaczona za pomocą Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/). D. Ekspresja Cas9 i Snail w komórkach typu dzikiego (WT) oraz komórkach MS-1 z nadekspresją Cas9, zmierzona za pomocą analizy Western blot. E. Nokaut Snail przy użyciu dwóch niezależnych gRNA w komórkach MS-1, zmierzony za pomocą analizy Western blot. Podobne wyniki opisaliśmy w pracy Ma et al15. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rycina 3. Genetyczna deplekcja Snail hamuje indukowaną przez TGF-β2 EndMT w komórkach MS-1. A. Obrazy w jasnym polu komórek MS-1 po 3-dniowej inkubacji z TGF-β2 (0,1 ng/mL) w komórkach typu dzikiego (WT, górny panel) oraz w komórkach z nokautem Snail (dolny panel). Pasek skali oznacza 200 µm. B. Barwienie immunofluorescencyjne dla Pecam-1 (zielony), Sm22α (czerwony) oraz jąder komórkowych (niebieski) w komórkach MS-1 hodowanych w medium zawierającym TGF-β2 (1 ng/mL) przez 3 dni. Deplekcja Snail zniosła indukowany przez TGF-β2 spadek ekspresji Pecam-1 oraz wzrost ekspresji Sm22α. Pasek skali oznacza 50 µm. C. Schematyczne przedstawienie wpływu nokautu Snail na indukowaną przez TGF-β EndMT w komórkach MS-1. TGF-β stymuluje ekspresję Snail poprzez szlak Smad poprzez fosforylację Smad2/3, co następnie napędza EndMT. Nokaut Snail przy użyciu edycji genów opartej na CRISPR/Cas9 zniesion EndMT pośredniczoną przez TGF-β. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Zrozumienie mechanizmu EndMT ma kluczowe znaczenie dla modulowania tego procesu i zwalczania chorób związanych z EndMT. Tutaj opisaliśmy metody wykonywania testu EndMT indukowanego przez TGF-β i badania roli ślimaka EndMT-TF w EndMT wywołanym przez TGF-β, poprzez wykonanie stabilnego zubożenia genu ślimaka z komórek za pośrednictwem CRISPR / Cas9. Zubożenie Ślimaka przy użyciu podejścia CRISPR / Cas9 z powodzeniem zniosło EndMT napędzany przez TGF-β2 w komórkach MS-1 (Figura 3C). Aby zbadać wpływ jakichkolwiek cytokin, takich jak TGF-β, na EndMT, EC poddano działaniu cytokin, a następnie oceniono występowanie EndMT na podstawie zmian morfologicznych oraz zmian ekspresji markerów śródbłonka i mezenchymów w komórkach. TGF-β2 silnie indukował EndMT w komórkach MS-1, czemu towarzyszył silny wzrost ekspresji czynnika transkrypcyjnego Ślimaka. EndMT-TF indukowane przez TGF-β mogą się różnić w zależności od gatunku lub typu komórki śródbłonka specyficznej dla tkanki. Na przykład zaobserwowaliśmy, że ślimak, ale nie ślimak, był znacznie podwyższony przez TGF-β w komórkach MS-1, podczas gdy w ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) zarówno ślimak, jak i ślimak są zwiększone po ekspozycji na TGF-β20.

Oceniliśmy zakres procesu EndMT na dwa sposoby, badając zmiany morfologii komórek, a następnie badając zmiany w ekspresji markerów związanych z EndMT. Po ekspozycji na TGF-β przez 3 dni komórki przeszły EndMT ze spójnymi zmianami morfologicznymi i zmianami w ekspresji markerów związanych z EndMT. Oprócz barwienia immunofluorescencyjnego, które tutaj przeprowadziliśmy, zmiany markerów można również monitorować za pomocą western blot na poziomie ekspresji białka lub za pomocą qRT-PCR (Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR) na poziomie genów21. Oprócz tych dwóch metod oszczędzania czasu i kosztów, które pokazaliśmy w tym protokole, istnieją inne metody badania EndMT. Na przykład przeprowadzenie analizy transkryptomu (za pomocą sekwencjonowania RNA lub qPCR) w celu porównania poziomów ekspresji genów związanych ze śródbłonkiem i mezenchymalnymi między komórkami leczonymi i kontrolnymi może precyzyjnie ocenić EndMT22,23. Ponadto EndMT często wiąże się ze stabilną utratą funkcji bariery, którą można ocenić za pomocą spektroskopii impedancyjnej24. Ponadto mogą zostać przeprowadzone dodatkowe dowody na nabywanie przez komórki pochodzące z EndMT właściwości podobnych do komórek macierzystych. Na przykład w określonych warunkach hodowli komórki mezenchymalne EndMT mogą być dalej różnicowane w osteoblasty, chondrocyty, adipocyty lub (mio)fibroblasty. Dlatego dodatkowa analiza w celu potwierdzenia różnicowania się na różne typy komórek należących do linii mezodermy (tj. ekspresja genów i barwienie macierzy) jest przydatna do wykazania multipotencjalnej natury komórek pochodzących z EndMT. Wreszcie, metody oceny EndMT nie ograniczają się do badań in vitro, ale mogą być ekstrapolowane w celu zbadania związku między EndMT a niektórymi chorobami narządów in vivo lub ex vivo. W tym sensie zastosowanie specyficznych dla śródbłonka strategii śledzenia linii jest szeroko rozszerzone na badania związane z EndMT25.

Aby zbadać rolę ślimaka podczas EndMT, w tym badaniu wykorzystano edycję genu CRISPR/Cas9 w celu wyeliminowania tego genu. Dane wykazały, że TGF-β2 nie pośredniczył w EndMT w komórkach MS-1 z niedoborem ślimaka. Obserwacja ta wykazała, że ślimak jest niezbędny dla indukowanego przez TGF-β2 EndMT w komórkach MS-1. Użyliśmy niezależnej kasety ekspresji sgRNA sterowanej przez U6, aby wprowadzić specyficzne sgRNA dla Cas9 do docelowego ślimaka. Oprócz tej metody, Ran i wsp.26 opisali inną strategię klonowania sekwencji oligonukleotydów sgRNA do rusztowania Cas9 w celu wygenerowania konstruktu zawierającego zarówno Cas9, jak i gRNA. Pojawiające się nowatorskie podejścia pozwalają CRISPR/Cas na włączenie dodatkowych funkcji. Na przykład podwójne lub potrójne nokauty można osiągnąć poprzez dostarczenie większej ilości sgRNA do komórek wykazujących ekspresję Cas927. Zmodyfikowane białko Cas13 celuje i trawi cząsteczki RNA bez zakłócania endogennego DNA28. Oprócz eliminowania genów za pomocą CRISPR/Cas, krótkie RNA spinki do włosów (shRNA) mogą być stosowane jako alternatywa dla stabilnego obniżania docelowej ekspresji genów29. W przypadku wszystkich metod edycji genów CRISPR/Cas należy zawsze brać pod uwagę rozszczepienie poza celem. Ponadto małe interferujące RNA (siRNA) przejściowo wyciszają ekspresję genów, a stężenie siRNA jest rozcieńczane podziałem komórki30. Obie te metody częściowo hamują docelową ekspresję genów. W przeciwieństwie do tego, ektopowa ekspresja genu jest również wykorzystywana do weryfikacji funkcji genu podczas EndMT / EMT31. Takie podejście może określić, czy regulacja w górę genu jest wystarczająca do wywołania odpowiedzi EndMT. W związku z tym obecnie istnieje wiele strategii technicznych, które można wykorzystać do identyfikacji i weryfikacji potencjalnych regulatorów EndMT. Poza tym analiza transkryptomiczna może być dobrym rozwiązaniem w identyfikacji i kompleksowej analizie regulatorów związanych z EndMT. Zalecamy stosowanie różnych uzupełniających się podejść do badania modulacji EndMT.

Podsumowując, wprowadziliśmy przepływ pracy w celu identyfikacji czynników, które mogą odgrywać rolę funkcjonalną podczas EndMT wywołanego przez TGF-β. Metoda ta może być również wykorzystana do zbadania, czy inne bodźce (tj. cytokiny, czynniki wzrostu, bodźce mechaniczne, interakcje komórka-komórka) mogą modulować EndMT oraz wzajemne oddziaływanie TGF-β z innymi bodźcami. Ponadto zwróciliśmy uwagę na podejście wykorzystujące edycję genów CRIPSR/Cas w celu wyjaśnienia, czy dany gen jest wymagany dla EndMT indukowanego przez TGF-β. Aby zilustrować tę metodologię, użyliśmy silnego induktora EndMT TGF-β2 w komórkach MS-1, ale protokoły można dostosować do innych cytokin i innych typów komórek. Oczekujemy, że ten szczegółowo opisany protokół posłuży jako kamień milowy dla przyszłych badań związanych z EndMT.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badania były wspierane przez CGC.NL oraz Holenderską Inicjatywę Badań Sercowo-Naczyniowych: Holenderską Fundację Kardiologiczną, Holenderską Federację Uniwersyteckich Centrów Medycznych, Holenderską Organizację Badań i Rozwoju Zdrowia oraz Królewską Holenderską Akademię Nauk Grant przyznany Phaedra-Impact (http://www.phaedraresearch.nl). JM jest wspierany przez Chińską Radę Stypendialną. GSD jest wspierane przez grant na trampolinę od AFM-Telethon [22379], FOP Italia oraz grant od La Fundació La Marató de TV3 (#202038).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,45 μ m filtrPall Corporation, USA4614
10 i razy; Bufor ligazy DNA T4Thermofisher Scientific, USAB69
12 mm okrągły szklany plasterekKnittel Glass, NiemcyVD10012Y1A.01
Strzykawka 20 mlBD Eclipse, USA300629
4&,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)Vector Laboratories, USAH-1200VECTASHIELD Antifade  Nośnik montażowy
AA19_PLKO wektorDr. M Gonç alves, Centrum Medyczne Uniwersytetu w Lejdzie, HolandiaPrezent
AmpicylinaServa Elektroforeza, USA1339903
Anty-mysia IgGGE Healthcare, USANA931
Sygnalizacja komórkowa anty-królicza IgG, USA7074
AgarozaRoche, Szwajcaria11388991001
BlasticidinInvitrogen, USAR21001
Bufor O (10X)Thermofisher Scientific, USABO5
BveI (Bspm1)Thermofisher Scientific, USAER 1741
Mikroskop konfokalnyLeica Microsystems, NiemcySP8
DMEM  Thermo Fisher Scientific, USA11965092
Osioł antyszczurzy Alexa 488  Invitrogen, StanyZjednoczone A21208
FBS  Thermo Fisher Scientific, Stany Zjednoczone16000044
Formaldehyd  Thermo Fisher Scientific, USA28908
Mikroskop odwróconyLeica Microsystems, NiemcyDMi8
Koza anty-królik Alexa 594  Invitrogen,USAA11012
Zestaw plazmidówLabNed LabNed, USALN2400004
Linia komórkowa MS-1American Type Culture Collection (ATCC)
Lakier do paznokciHEMA, HolandiaPrzezroczyste
przeciwciało Pecam-1  Becton Dickinson, Stany Zjednoczone553370
PEIPolysciences, Stany Zjednoczone23966-1
PLV-Cas9 plazmidSigma-Aldrich, Stany ZjednoczoneCas9BST-1EA
PuromycynaSigma-Aldrich, USAP9620
Zestaw do ekstrakcji żelu QIAquickQiagen, Niemcy28706
Przeciwciało Sm22a  Abcam, Wielka Brytaniaab14106
Sygnalizacja komórkowa ślimaka, USA3879
Ligaza DNA T4Thermofisher Scientific, USAEL 0014
TC20 automatyczny licznik komórekBio-Rad, USA1450102
Ludzki TGF-β 2Joachim Nickel, Uniwersytet w WürzburguPrezentInne rekomendacje handlowe: 302-B2, R& Systemy D
Triton X-100Merck, Stany Zjednoczone1086031000
SB431542Tocris Bioscience, Wielka Brytania1614
TrisRoche, Szwajcaria11814273001

Bibliografia

  1. Ma, J., Sanchez-Duffhues, G., Goumans, M. -J., Ten Dijke, P. TGF-β-induced endothelial to mesenchymal transition in disease and tissue engineering. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
  2. Piera-Velazquez, S., Jimenez, S. A. Endothelial to mesenchymal transition: role in physiology and in the pathogenesis of human diseases. Physiological Reviews. 99 (2), 1281-1324 (2019).
  3. Sánchez-Duffhues, G., de Vinuesa, G. A., ten Dijke, P. Endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases: developmental signaling pathways gone awry. Developmental Dynamics. 247 (3), 492-508 (2018).
  4. Evrard, S. M., et al. Endothelial to mesenchymal transition is common in atherosclerotic lesions and is associated with plaque instability. Nature Communications. 7 (1), 1-16 (2016).
  5. Qiao, L., et al. Endothelial fate mapping in mice with pulmonary hypertension. Circulation. 129 (6), 692-703 (2014).
  6. Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
  7. Clere, N., Renault, S., Corre, I. Endothelial-to-mesenchymal transition in cancer. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
  8. Saito, A. EMT and EndMT: regulated in similar ways. The Journal of Biochemistry. 153 (6), 493-495 (2013).
  9. Bolós, V., et al. The transcription factor Slug represses E-cadherin expression and induces epithelial to mesenchymal transitions: a comparison with Snail and E47 repressors. Journal of Cell Science. 116 (3), 499-511 (2003).
  10. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), 006429(2012).
  11. Yang, J., et al. Guidelines and definitions for research on epithelial-mesenchymal transition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , 1-12 (2020).
  12. Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), (2014).
  13. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  14. Arbiser, J. L., et al. Oncogenic H-ras stimulates tumor angiogenesis by two distinct pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 94 (3), 861-866 (1997).
  15. MA, J., et al. TGF-?-induced endothelial to mesenchymal transition results from a balance between SNAIL and ID factors. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 182 (9), (2021).
  16. Chen, X., et al. Probing the impact of chromatin conformation on genome editing tools. Nucleic Acids Research. 44 (13), 6482-6492 (2016).
  17. Hunter, F. W., et al. Functional CRISPR and shRNA screens identify involvement of mitochondrial electron transport in the activation of evofosfamide. Molecular Pharmacology. 95 (6), 638-651 (2019).
  18. Mao, Y., et al. Lentiviral vectors mediate long-term and high efficiency transgene expression in HEK 293T cells. International Journal of Medical Sciences. 12 (5), 407(2015).
  19. Liu, S., et al. Deubiquitinase activity profiling identifies UCHL1 as a candidate oncoprotein that promotes TGFβ-induced breast cancer metastasis. Clinical Cancer Research. 26 (6), 1460-1473 (2020).
  20. Medici, D., et al. Conversion of vascular endothelial cells into multipotent stem-like cells. Nature Medicine. 16 (12), 1400(2010).
  21. Kokudo, T., et al. Snail is required for TGFβ-induced endothelial-mesenchymal transition of embryonic stem cell-derived endothelial cells. Journal of Cell Science. 121 (20), 3317-3324 (2008).
  22. Dong, J., et al. Single-cell RNA-seq analysis unveils a prevalent epithelial/mesenchymal hybrid state during mouse organogenesis. Genome Biology. 19 (1), 1-20 (2018).
  23. Oatley, M., et al. Single-cell transcriptomics identifies CD44 as a marker and regulator of endothelial to haematopoietic transition. Nature communications. 11 (1), 1-18 (2020).
  24. Halaidych, V., et al. Inflammatory responses and barrier function of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 10 (5), 1642-1656 (2018).
  25. Li, Y., Lui, K. O., Zhou, B. Reassessing endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases. Nature Reviews Cardiology. 15 (8), 445-456 (2018).
  26. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  27. Grav, L. M., et al. One-step generation of triple knockout CHO cell lines using CRISPR/Cas9 and fluorescent enrichment. Biotechnology Journal. 10 (9), 1446-1456 (2015).
  28. Abudayyeh, O. O., et al. RNA targeting with CRISPR-Cas13. Nature. 550 (7675), 280-284 (2017).
  29. Paddison, P. J., et al. Cloning of short hairpin RNAs for gene knockdown in mammalian cells. Nature Methods. 1 (2), 163-167 (2004).
  30. Reynolds, A., et al. Rational siRNA design for RNA interference. Nature Biotechnology. 22 (3), 326-330 (2004).
  31. Lourenço, A. R., et al. C/EBPɑ is crucial determinant of epithelial maintenance by preventing epithelial-to-mesenchymal transition. Nature Communications. 11 (1), 1-18 (2020).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przej cie r db onkowo mezenchymalnesygnalizacja TGF betaedycja CRISPR Cas9barwienie immunofluorescencyjnemarker PECAM 1marker SM22 alfaknockout genu Snailmikroskopia konfokalnar nicowanie mezenchymalne

Powiązane artykuły