Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół korzystania z urządzenia do szybkiego tworzenia siatki, zarówno do szybkiego tworzenia siatki, jak i do szybkiego mieszania i zamrażania w celu przeprowadzania eksperymentów z rozdzielczością czasową.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Szybkie przygotowanie siatki do czasowo-rozdzielczej mikroskopii krioelektronowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Dziedzina mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM) szybko się rozwija dzięki nowemu sprzętowi i algorytmom przetwarzania, tworząc struktury o wyższej rozdzielczości i informacje o bardziej wymagających systemach. Przygotowanie próbek do krio-EM przechodzi podobną rewolucję, a nowe podejścia są opracowywane w celu zastąpienia tradycyjnych systemów blottingu. Należą do nich stosowanie dozowników piezoelektrycznych, drukowanie pinów i natryskiwanie bezpośrednie. W wyniku tych osiągnięć szybkość przygotowania siatki wzrasta z sekund do milisekund, co stwarza nowe możliwości, zwłaszcza w dziedzinie krio-EM o rozdzielczości czasowej, gdzie białka i substraty mogą być szybko mieszane przed zamrożeniem, zatrzymując krótkotrwałe stany pośrednie. W tym miejscu szczegółowo opisujemy standardowy protokół tworzenia siatek na naszym wewnętrznym urządzeniu EM z rozdzielczością czasową, zarówno do standardowego szybkiego przygotowania siatki, jak i do eksperymentów z rozdzielczością czasową. Protokół wymaga co najmniej około 50 μl próbki o stężeniach ≥ 2 mg/ml do przygotowania 4 siatek. Opóźnienie między nałożeniem próbki a zamrożeniem może wynosić nawet 10 ms. Jednym z ograniczeń jest zwiększona grubość lodu przy większych prędkościach i w porównaniu z metodą blottingu. Mamy nadzieję, że ten protokół pomoże innym w projektowaniu własnych urządzeń do tworzenia siatek oraz osobom zainteresowanym projektowaniem eksperymentów z rozdzielczością czasową.
Wprowadzenie
Wstęp
Ostatnie osiągnięcia w dziedzinie krio-mikroskopii elektronowej (cryo-EM) umożliwiły badania strukturalne coraz bardziej złożonych układów w wysokiej rozdzielczości. Z nielicznymi wyjątkami, badania te ograniczały się do biologicznych makrocząsteczek w stanie równowagi1 lub do reakcji przebiegających stosunkowo wolno2. Wiele procesów in vivo zachodzi w krótszej skali czasowej (milisekundowej), co budzi rosnące zainteresowanie krio-mikroskopią elektronową z rozdzielczością czasową (TrEM) w tych zakresach czasowych3. Jednak konwencjonalne przygotowanie próbek do cryo-EM metodą blottingu jest zbyt wolne dla TrEM w skali milisekundowej.
Metoda osuszania (blotting) posiada inne ograniczenia poza słabą rozdzielczością czasową. Białka oraz kompleksy białkowe mogą ulegać denaturacji lub przyjmować preferowaną orientację na siatkach4. Wykazano, że skrócenie czasu ekspozycji na granicę faz powietrze-woda podczas przygotowania próbki łagodzi zjawisko preferowanej orientacji i denaturacji białek5,6. Zatem szybkie przygotowanie siatki nie tylko umożliwia milisekundowe TrEM, ale może również poprawić jakość siatki.
Obecnie stosuje się trzy różne podejścia do zautomatyzowanego przygotowania siatek. Pierwsze podejście wykorzystuje pin lub kapilarę, w której znajduje się niewielka ilość próbki. Po nawiązaniu kontaktu między cieczą a powierzchnią siatki próbka jest „nanoszona” na siatkę7,8. Proces aplikacji próbki jest stosunkowo powolny i trwa kilka sekund. Alternatywne podejście wykorzystuje kontrolowane generowanie kropli za pomocą dozownika piezoelektrycznego oraz siatek samowsysających9. Pozwala to na skrócenie czasu od dozowania do zamrożenia, ale jest wciąż ograniczone prędkością tworzenia kropli i wsysania (obecnie osiągającą 54 ms). Najszybszym dotychczas podejściem jest metoda bezpośredniego rozpylania, w której próbka jest atomizowana w dyszy rozpylającej, a małe (~ 10 - 20 µm) i szybkie (> 5 m/s) krople rozprzestrzeniają się po kontakcie z siatką do cryo-EM. Rozpylanie próbki może być realizowane na różne sposoby, np. za pomocą atomizatorów pneumatycznych, powierzchniowych fal akustycznych lub nawilżaczy ultradźwiękowych10,11,12,13. Z naszego doświadczenia wynika, że przy zastosowaniu bezpośredniego rozpylania grubość lodu jest większa, ale metoda ta umożliwia skrócenie czasu od dozowania do zamrożenia do < 10 ms.
Niniejszy protokół opisuje krok po kroku, w jaki sposób urządzenie do czasowo rozdzielczej EM (TED) wyposażone w mikrofluidyczną dyszę rozpylającą może być wykorzystane do przygotowywania siatek w krótkich odstępach czasu14,15. Urządzenie to było stosowane do przygotowywania siatek z minimalnym czasem opóźnienia wynoszącym 6 ms pomiędzy naniesieniem próbki a mrożeniem oraz do szybkiego mieszania i mrożenia dwóch próbek. Konstrukcja TED opiera się na poprzedniej wersji16 i jest podobna do innych urządzeń do czasowo rozdzielczej kriomikroskopii elektronowej opartych na rozpylaniu17.
W pierwszej kolejności opisano cztery główne elementy układu TED. Rdzeniem TED jest jednostka do obsługi cieczy, odpowiedzialna za aspirację i dozowanie próbek. Pneumatyczny tłok przesuwa siatkę przez rozpyloną ciecz do etanu w stanie ciekłym. Generowanie rozpylenia odbywa się za pomocą mikrofluidycznych dysz rozpylających, a mrożenie w pojemniku z etanem w stanie ciekłym – oba te elementy zostały krótko opisane. Na koniec wyróżniono dodatkowe funkcje służące do kontrolowania otoczenia siatki, w szczególności wilgotności. Następnie przedstawiono szczegółowe protokoły obsługi urządzenia oraz przeprowadzania eksperymentów TrEM. Przedstawiono reprezentatywne wyniki szybkiego przygotowania siatki oraz prostego eksperymentu TrEM.
Układ eksperymentalny
Jednostka dozowania cieczy
System dozowania cieczy w urządzeniu TED składa się z trzech pomp strzykawkowych („pompy 1–3”), z których każda jest wyposażona w zawór obrotowy (Rysunek 1). Zasilacz dostarcza do pomp 1–3 napięcie 24 V DC. Komunikacja z oprogramowaniem sterującym (napisanym w językach Visual Basic i C++) odbywa się za pośrednictwem interfejsu RS232 podłączonego do pompy 1. Polecenia są przekazywane z pompy 1 do pomp 2–3 poprzez porty rozszerzeń wejścia/wyjścia szeregowego. Pompy 1–3 są wyposażone w strzykawki szklane („strzykawki 1–3”, w tym przypadku stosujemy strzykawki 250 µL o zerowej objętości martwej). Każdy zawór posiada dwie pozycje: „pobieranie” (load) i „dozowanie” (dispense). Pozycja „pobieranie” służy do aspiracji próbki do strzykawki. Krótki odcinek (~ 3–4 cm) rurki FEP o średnicy zewnętrznej 1/16" i wewnętrznej 0,01′′ jest połączony za pomocą bezkołnierzowych złączek ETFE/ETFE z pozycją „pobieranie” zaworów 1–3. Ten krótki odcinek rurki sięga do zbiornika z próbką (zazwyczaj plastikowa probówka 1,5 mL lub 0,5 mL). Pozycja „dozowanie” prowadzi do dyszy rozpylającej. Połączenie między wylotem w pozycji „dozowanie” a dyszą rozpylającą wykonane jest z rurki PE (długość ~ 20–30 cm, średnica zewnętrzna 0,043", wewnętrzna 0,015") z krótkim odcinkiem rurki osłonowej (~ 0,5 cm) i bezkołnierzowymi złączkami ETFE/ETFE.
Tłok pneumatyczny
Urządzenie TED wykorzystuje tłok pneumatyczny do przyspieszania siatki i przesuwania jej przez rozpyloną próbkę do pojemnika z ciekłym etanem. Pinceta działająca na zasadzie podciśnienia trzyma siatkę wkręconą w wykonany własnoręcznie uchwyt, który jest zamontowany do dwuprętowego cylindra pneumatycznego (Rysunek 2A).
Ciśnienie jest dostarczane z dużej butli z azotem (rozmiar W), wyposażonej w regulator wielostopniowy (0 - 10 bar, „ciśnienie główne”). Elastyczna wzmocniona rurka z PVC (średnica zewnętrzna 12 mm) łączy regulator z kolektorem 12-portowym, z którego sprężony azot jest doprowadzany do dyszy i pneumatycznego tłoka. Przepływ gazu przez dyszę jest stały i regulowany bezpośrednio przy butli z azotem (ciśnienie główne). Połączenie z dyszą wykonano za pomocą rurki z PU (średnica zewnętrzna 4 mm, wewnętrzna 2,5 mm), krótkiego odcinka rurki z PE (długość ~ 8 cm, średnica zewnętrzna 0,043", wewnętrzna 0,015") oraz odpowiednich złączy. Ciśnienie na tłok pneumatyczny jest kontrolowane za pomocą zaworu elektromagnetycznego. Rurka z PU (średnica zewnętrzna 4 mm, wewnętrzna 2,5 mm) łączy zawór elektromagnetyczny z regulatorem i tłokiem pneumatycznym, co pozwala na uzyskanie obniżonego ciśnienia tłoka (≤ ciśnienie główne). Zawór elektromagnetyczny jest sterowany komputerowo. Schematyczny przegląd układu przedstawiono na Rysunku 2B.
Należy zauważyć, że w tej konfiguracji ciśnienie tłoczenia jest zawsze równe lub niższe od ciśnienia gazu rozpylającego (ciśnienia głównego). Konfigurację tę można jednak łatwo zmienić, wprowadzając drugi regulator przed dyszą rozpylającą, aby umożliwić większe prędkości tłoczenia przy niskim ciśnieniu gazu rozpylającego. Wysokie ciśnienia (>> 2 bar) mogą uszkodzić dyszę rozpylającą z PDMS.
UWAGA: Jest to układ pod ciśnieniem, a „ciśnienie główne” powinno zawsze wynosić < 7 bar.
W przypadku pneumatycznego tłoka zazwyczaj stosuje się ciśnienia od 0,5 do 2 bar, co wykazuje w przybliżeniu liniową zależność między ciśnieniem a prędkością (w pionowej pozycji rozpylacza). Prędkości ruchu tłoka mierzy się za pomocą oscyloskopu, podłączonego szeregowo z potencjometrem suwakowym (10 kΩ) i równolegle z rezystorem 2 kΩ (Rysunek 2C). Zasilacz dostarcza do potencjometru napięcie 9 V DC. Podczas gdy przybliżoną prędkość ruchu tłoka ustawia się przed eksperymentem poprzez regulację ciśnienia tłoka, potencjometr zapewnia precyzyjny odczyt prędkości po zakończeniu doświadczenia.
Dysze rozpylające i pojemnik na ciekły etan
Konstrukcja i działanie gazodynamicznych wirtualnych dysz do dostarczania próbek metodą rozpylania zostały szczegółowo opisane w innym opracowaniu15. Jak opisano powyżej, wyloty „dispense” zaworów 1-3 są połączone z wlotami cieczy w dyszy (Rysunek 3A). Sprężony gaz rozpylający jest podłączony do wlotu gazu w dyszy. Wloty w dyszach rozpylających z PDMS są tak zaprojektowane, aby można było bezpośrednio użyć rurek PE o średnicy zewnętrznej 0,043" bez konieczności stosowania złączek. Nasza konstrukcja dyszy zawiera geometrię typu „jet-in-jet” do mieszania dwóch próbek, podobnie jak urządzenie opisane w ref.18. Schemat konstrukcji przedstawiono na Rysunku 3B, a obraz mikroskopowy dyszy na Rysunku 3C. Układ urządzenia mikrofluidycznego wymaga użycia trzech strzykawek do zmieszania dwóch próbek. Dysza rozpylająca jest zazwyczaj umieszczana w odległości 1-1,5 cm od siatki (podczas aplikacji próbki).
Jako chłodziwo stosujemy ciekły etan w pojemniku z ciekłym etanem/azotem, wykorzystywanym w standardowej metodzie blotowania. Pionowe ustawienie naczynia z ciekłym etanem realizowane jest za pomocą laboratoryjnej platformy podnośnikowej.
Kontrola środowiska natrysku i siatki
Tłok oraz dysza natryskowa znajdują się wewnątrz specjalnie wykonanej skrzynki z PMMA (szkła akrylowego) z podwójnymi drzwiami (Rycina 4A). Wysoką wilgotność względną wewnątrz skrzynki uzyskuje się za pomocą systemu nawilżania powietrza znajdującego się z tyłu urządzenia TED (Rycina 4B). Powietrze jest dostarczane przez pompę i tłoczone do pierwszego 10-calowego kanistra (typowo stosowanego do oczyszczania wody pod zlewem). Kanister jest wypełniony niewielką ilością wody (~ 5-10 cm) i mieści również moduł nawilżacza. Zasilanie sieciowe nawilżacza jest sterowane przez cyfrowy kontroler wilgotności/temperatury oraz czujnik wilgotności/temperatury umieszczony wewnątrz skrzynki z akrylu. Kontroler jest ustawiony tak, aby wyłączyć pompę, gdy wilgotność względna osiągnie ≥ 90 %. Nawilżone powietrze z pierwszego kanistra jest pompowane przez dyfuzor zanurzony w wodzie w drugim 10-calowym kanistrze, a następnie trafia do skrzynki z akrylu.
UWAGA: Ponieważ próbka jest rozpylana w dyszy natryskowej, niebezpieczne materiały biologiczne lub chemiczne nie nadają się do wykorzystania w charakterze próbek.
Sekwencja uruchamiania
Przycisk Run Script w oprogramowaniu sterującym inicjuje sekwencję uruchamiania. Ta sekwencja poleceń może być zdefiniowana w pliku skryptu i modyfikowana za pomocą oprogramowania. Poniżej wyjaśniono najważniejsze zmienne:
Prędkość rozpylania: prędkość rozpylania określa szybkość przepływu cieczy w pompie strzykawkowej. Szybkość przepływu można obliczyć w następujący sposób: silniki pompy strzykawkowej użyte w tej procedurze mają stałą wielkość kroku. Pełen zakres pompy jest podzielony na 48 000 kroków. Drugim istotnym czynnikiem jest objętość strzykawki. Zazwyczaj stosujemy strzykawki o objętości 250 µL. Prędkość rozpylania w oprogramowaniu sterującym jest ustawiana jako liczba kroków na sekundę. Prędkość rozpylania wynosząca 1000 kroków/sekundę odpowiada:
Objętość rozpylania: Objętość rozpylania określa całkowitą objętość cieczy do rozpylenia. W związku z tym determinuje ona również czas trwania rozpylania. Objętość rozpylania w oprogramowaniu sterującym jest ustawiana jako liczba kroków. Objętość rozpylania wynosząca 2000 kroków, przy prędkości rozpylania 1000 kroków/sekundę, przekłada się na czas rozpylania wynoszący 2 s i całkowitą objętość 10,4 µL.
Czas wstępnego rozpylania: Zmienna ta określa czas między rozpoczęciem rozpylania a zanurzeniem. Ważne jest, aby dobrać czas opóźnienia tak, by strumień rozpylanego materiału miał wystarczająco dużo czasu na stabilizację przed zanurzeniem siatki. Zazwyczaj na stabilizację rozpylania przeznacza się od 1,5 do 4 s przed zanurzeniem siatki. Rozpylanie jest kontynuowane aż do całkowitego przejścia siatki. Zazwyczaj przepływ cieczy (a tym samym rozpylanie) jest zatrzymywany od 0,5 do 1 s po zanurzeniu siatki. Przykładowo, przy prędkości rozpylania 1000 steps/s i objętości rozpylania 2000 steps, typowy czas wstępnego rozpylania wynosi 1,5 s.
Przykładowa sekwencja poleceń została przedstawiona na Rysunku 5A, a pozycja w siatce w funkcji czasu zilustrowano na Rysunku 5B.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie systemu
UWAGA: Poniższy protokół opisuje, jak przygotować siatki pojedynczej próbki. Zazwyczaj dla każdej próbki lub warunku przygotowuje się co najmniej 2 siatki replik. W przypadku większych prędkości zanurzania (opóźnienie czasowe mniejsze niż ~ 20 ms) zwykle przygotowuje się 3 lub 4 siatki replikowane, aby uwzględnić zmniejszoną liczbę obszarów cienkiego lodu.
- Rozcieńczyć próbkę białka do stężenia docelowego w żądanym buforze. Zazwyczaj końcowe stężenia ≥ 2 mg/ml dobrze sprawdzają się w przypadku przygotowania siatki za pomocą TED. Należy pamiętać, że próbka może być przechowywana na lodzie do etapu 10, począwszy od kroku 10, próbka będzie spędzać dużo czasu w temperaturze pokojowej, ponieważ przygotowanie 3-4 siatek zajmuje około 20 minut.
- Włącz TED. Następnie włącz komputer sterujący i uruchom oprogramowanie sterujące.
- Zainicjuj wszystkie pompy strzykawkowe, naciskając przycisk Inicjalizuj (dolny przycisk) na każdej pompie strzykawki.
- Włącz zasilanie potencjometru, ustaw je na 9 V i uruchom oprogramowanie sterujące oscyloskopem.
- Upewnij się, że zawór regulacyjny 2-cylindra N jest zamknięty. Otwórz zawór butli. Następnie powoli otwórz zawór regulatora, ustawiając ciśnienie wylotowe na żądaną wartość ciśnienia rozpylanego gazu (zwykle 1-2 bary). W przypadku zastosowanych tutaj dysz PDMS nie należy używać ciśnień wyższych niż ~ 2,5 bara, aby uniknąć uszkodzenia dyszy. Stale przepływający gaz zapobiega kapaniu i gromadzeniu się cieczy na końcówce dyszy, co może prowadzić do niepowtarzalnego rozpylania.
- Upewnij się, że wszystkie zawory pompy strzykawkowej znajdują się w pozycji "obciążenie". Można to zrobić, przełączając wszystkie zawory w pozycję "dozowanie" w oprogramowaniu sterującym, a następnie z powrotem do pozycji "obciążenie". Pozostaw wszystkie zawory przełączone na "obciążenie". Ustawić wszystkie strzykawki na zero.
- Na tym etapie należy usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza znajdujące się w systemie. W tym celu może być konieczne odkręcenie strzykawek, ręczne usunięcie pęcherzyków powietrza i ponowne zamontowanie strzykawek, gdy nie ma już pęcherzyków.
- Elementy do obsługi cieczy są zwykle przechowywane w H2O. Przed załadowaniem roztworu próbki należy zrównoważyć układ cieczy z buforem, przemując rurkę nadmiarem buforu. Stosować odpowiednie maksymalne natężenie przepływu cieczy, aby uniknąć nadmiernego ciśnienia na dyszy natryskowej. Natężenie przepływu cieczy > 10 μl/s może spowodować uszkodzenie opisanych tutaj dysz PDMS.
- Umieścić probówkę o pojemności 1,5 ml zawierającą ≥ bufor o pojemności 200 μl na strzykawce 1 (górna część musi być przekłuta, aby przymocować do rurki).
- Upewnij się, że zawór 1 jest w pozycji "obciążenie". W razie potrzeby włączyć oprogramowanie sterujące.
- Odessać żądaną ilość (zwykle 50-100 μl) buforu za pomocą strzykawki 1 za pomocą oprogramowania sterującego.
- Przełącz zawór 1 w pozycję "dozowanie" za pomocą oprogramowania sterującego.
- Dozować cały płyn do strzykawki 1 za pomocą oprogramowania sterującego.
- Ustaw zawór zwrotny w pozycji "obciążenie", zresetuj pozycję strzykawki do "0" w programie i naciśnij przycisk inicjalizuj na strzykawce 1, aby przygotować system do następnego cyklu.
UWAGA: Kroki 1.9.1 - 1.9.5 są zwykle powtarzane trzy razy, aby zapewnić dokładne umycie rurki.
- Załaduj pęsetę siatką EM (nie jest wymagany żaden konkretny typ), poluzowując zacisk ramienia wgłębnego, umieszczając pęsetę w zacisku i dokręcając zacisk.
- Ręcznie przesuń ramię wgłębne tak, aby ruszt i dysza znajdowały się na tej samej wysokości (pozycja "aplikacja próbki"). Jeśli dysza i siatka są wyrównane, płyn będzie gromadził się na siatce po natryskiwaniu przez dłuższy czas. W razie potrzeby wyreguluj położenie dyszy.
- Wyreguluj położenie kubka z ciekłym etanem, ręcznie przesuwając ramię wgłębne z zamontowaną pęsetą do pozycji końcowej (sięgając do kubka na etan). Po prawidłowym ustawieniu siatka przytrzymywana przez pęsetę dotrze mniej więcej do środka kubka z ciekłym etanem.
- Sprawdź, czy "uruchom skrypt" użyje żądanych natężeń przepływu, objętości i czasów. Szczegółowe informacje można znaleźć w sekcji "Sekwencja uruchamiania" powyżej.
- Upewnij się, że nic nie zasłania drogi tłoka. Zassać do strzykawki 1 objętość buforu wymaganą do pojedynczego uruchomienia. Odbywa się to w oprogramowaniu sterującym, patrz rozdział "Sekwencja uruchamiania", aby zapoznać się z typowymi ustawieniami i głośnościami. Następnie upewnij się, że zawór 1 jest ustawiony w pozycji "dozowanie". Wykonaj przebieg testowy, naciskając Uruchom skrypt w oprogramowaniu sterującym.
UWAGA: Trzymaj się z dala od TED, dopóki sekwencja uruchamiania nie zostanie zakończona. Ruchome części mogą spowodować obrażenia! - Po zakończeniu "sekwencji pracy" ustaw nacisk na ramię wgłębne na żądaną wartość (zwykle 1-2 bary). Dopiero wtedy naciśnij OK w oprogramowaniu sterującym, aby zwolnić nacisk z ramienia zanurzającego. Jeśli konieczna jest regulacja "sekwencji pracy" lub nacisku na ramię wgłębne, ustawienia te można na tym etapie zmienić i powtórzyć kroki 1.13 - 1.15.
2. Szybkie przygotowanie siatki
- Najpierw napełnij pojemnik z ciekłym etanem/azotem ciekłym azotem. Gdy jest wystarczająco zimny i wolny od ciekłego azotu, napełnij kubek ciekłym etanem. Unikać krzepnięcia ciekłego etanu. Ten krok jest taki sam, jak w przypadku konwencjonalnego przygotowania siatki.
UWAGA: Aby zminimalizować zanieczyszczenie etanem, upewnij się, że kroki 2.2 - 2.13 są wykonywane tak szybko, jak to możliwe
UWAGA: Ciekły etan jest kriogeniczny i łatwopalny. Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z nim. - Przygotuj siatki krio-EM do wyładowania jarzeniowego. Zazwyczaj używamy dziurawych siatek węglowych i wyładowań jarzeniowych przez 90 s, przy ciśnieniu powietrza 0,1 mbar i 10 mA. Zwykle nie więcej niż 4 siatki są rozładowywane jarzeniowo jednocześnie. Kratki są używane w ciągu 30 minut od rozładowania żarzenia.
- Zrównoważyć rurkę z próbką (postępując zgodnie z krokami 1.9.1 - 1.9.5, używając próbki zamiast bufora). Jeżeli dostępna objętość próbki jest mała, rurkę można zrównoważyć tylko 1 objętością martwą.
- Do strzykawki 1 w oprogramowaniu sterującym należy zassać ilość próbki potrzebną do pojedynczego przebiegu (szczegółowe informacje znajdują się w rozdziale "Sekwencja przebiegu"). Następnie przełącz zawór 1 w pozycję "dozowanie".
- Sprawdź, czy wilgotność względna osiągnęła żądaną wartość (zazwyczaj przygotowujemy kratki o wilgotności względnej 60% lub wyższej). Po osiągnięciu ≥ 60% wilgotności należy otworzyć komorę wilgotności tylko na minimalny czas, aby utrzymać wysoką wilgotność.
- Umieść pęsetę, trzymając rozżarzoną siatkę, w tłoku pneumatycznym i zamocuj je. Przesunąć tłok do pozycji początkowej (u góry).
- Upewnij się, że suwak potencjometru znajduje się w pozycji startowej, gotowy do pomiaru, przesuwając go ręcznie, aby zetknąć się z tłokiem. Ustaw spust na oscyloskopie w oprogramowaniu oscyloskopu.
- Umieść pojemnik z ciekłym etanem/azotem.
- Naciśnij Uruchom skrypt w oprogramowaniu sterującym. Po wyświetleniu monitu kliknij przycisk OK w oprogramowaniu sterującym, aby uruchomić polecenie uruchom.
UWAGA: Trzymaj się z dala od TED, dopóki sekwencja uruchamiania nie zostanie zakończona. Ruchome części mogą spowodować obrażenia! - Po zakończeniu "sekwencji pracy" zwolnij nacisk na tłok pneumatyczny, klikając OK w oprogramowaniu sterującym.
- Otwórz komorę wilgotnościową, jedną ręką poluzuj połączenie między ramieniem wgłębnym a pęsetą, a drugą zabezpiecz pęsetę. Gdy pęseta jest wolna, przesuń ramię wgłębne do góry, utrzymując siatkę w ciekłym etanie. Następnie przenieś siatkę do jej przestrzeni magazynowej w otaczającej cieczy N2. Po zamrożeniu siatka musi być przez cały czas utrzymywana w temperaturze cieczyN2 .
- Zapisz pomiar oscyloskopu. Następnie ręcznie zresetuj pozycję suwaka potencjometru i tłoka.
- Powtórz kroki 2.4-2.12, aby przygotować siatki replikacji
- Przenieś siatki do długoterminowego przechowywania do czasu przecięcia siatki i zebrania danych.
- Umyj układ buforem, zgodnie z krokami 1.9.1 - 1.9.5. Następnie umyj układ za pomocąH2O, zgodnie z krokami 1.9.1 - 1.9.5.
- Wyłącz główny regulator azotu i wyłącz zasilanie.
- Umieścić pojemnik na etan/azot w dygestorium, aby się rozgrzał i pozwolił ciekłemu etan i N2 odparować.
3. Krio-EM z rozdzielczością czasową
UWAGA: Gdy eksperymenty z rozdzielczością czasową są przeprowadzane za pomocą TED, istnieją dodatkowe aspekty do rozważenia, chociaż podstawowa konfiguracja i zmienne pozostają takie same. Zakłada się, że dwa roztwory miesza się w stosunku 1:1 (v/v) w celu uzyskania końcowej mieszaniny, która jest osadzana na siatce. Postępuj zgodnie z protokołem opisanym w "1. Szybkie przygotowanie siatki z TED", z następującymi zmianami:
- Do eksperymentów z mieszaniem należy stosować wyższe stężenia zapasów niż do prostych eksperymentów z rozpylaniem. Mieszanie w stosunku 1:1 (v/v) spowoduje 2-krotne rozcieńczenie każdego składnika.
- Aby przeprowadzić eksperyment z szybkim mieszaniem, użyj wszystkich trzech strzykawek, a nie tylko jednej.
- Podłączyć rurkę do pomp strzykawkowych 2-3.
- Podłącz rurkę z pomp strzykawkowych 2-3 do dyszy rozpylającej.
- Zrównoważyć wszystkie trzy strzykawki w buforze i oddzielnie próbkować. Zazwyczaj strzykawka 1 jest wypełniona próbką A, a strzykawki 2-3 są napełniane próbką B (Rysunek 3).
- Zmień sekwencję uruchamiania. Przykład sekwencji uruchamiania z użyciem wszystkich 3 strzykawek do eksperymentu z szybkim mieszaniem znajduje się w Rysunek 6. Szczegółowe informacje można znaleźć w sekcji "Sekwencja uruchamiania".
- Różne opóźnienia czasowe można osiągnąć na dwa sposoby:
- Zmienić prędkość tłoka. Regulując prędkość tłoka, opóźnienie czasowe można zmienić w stosunkowo wąskim zakresie. Na przykład, przy odległości rozpylanie/etan wynoszącej 2 cm, tłok może być przesuwany z prędkością 1 m/s lub 2 m/s, aby uzyskać opóźnienie czasowe wynoszące odpowiednio 20 ms lub 10 ms. Odbywa się to zgodnie z opisem w kroku 1.15.
- Zmień pozycję rozpylacza/etanu, regulując (pionową) pozycję dyszy natryskowej. Jeśli dysza jest umieszczona w odległości 5 cm od powierzchni etanu, na przykład, prędkość zanurzania 1 m/s daje opóźnienie czasowe wynoszące 50 ms. Osiągnięcie znacznie dłuższych opóźnień czasowych wymaga dalszych modyfikacji konfiguracji.
UWAGA: Ze względu na przepływ laminarny w obszarze skupiającym przepływ dyszy, nie spodziewamy się znacznego wymieszania w tej części dyszy. Zamiast tego oczekujemy, że mieszanie następuje podczas wytwarzania oprysku, w kropelkach w drodze do siatki i podczas rozprowadzania kropel na siatce. Czas lotu, w którym krople cieczy dotrą do siatki, szacuje się ≤ 1 ms (dla prędkości kropli ≥ 10 m/s i odległości dysza-siatka 1 cm). W związku z tym za "opóźnienie czasowe" uważa się jedynie czas między lądowaniem kropli a zeszkleniem.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Szybkie przygotowanie siatek za pomocą TED
Jako próbkę testową do szybkiego przygotowania siatek wykorzystano apoferrytynę ze śledziony konia w stężeniu 20 µM w 30 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,5. Rekonstrukcję o rozdzielczości 3,5 Å uzyskano z 690 mikrografii, zgodnie z opisem w ref.15 (Rycina 7A). Zakres defokusu dobrano tak, aby cząsteczki były łatwo identyfikowalne na surowych obrazach (Rycina 7B). Typowa siatka prz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokoły w tej pracy mogą być wykorzystane do szybkiego przygotowania siatki poprzez bezpośrednie natryskiwanie i eksperymenty z TrEM. Szybkie przygotowanie siatki można wykorzystać do zmniejszenia interakcji cząstek z interfejsem powietrze-woda5. Głównymi ograniczeniami są dostępne stężenie próbki i grubość lodu na siatce. W ramach tych limitów i pod warunkiem, że jakość próbki jest dobra, protokół tworzy siatki odpowiednie dla krio-EM-u o wysokiej rozdzielczości.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Molly S.C. Gravett za pomocne dyskusje oraz personelowi ABSL za pomoc w zbieraniu danych kriogenicznych. David P. Klebl jest doktorantem w ramach 4-letniego programu doktoranckiego Wellcome Trust w The Astbury Centre finansowanego przez Uniwersytet w Leeds. Mikroskopy FEI Titan Krios zostały ufundowane przez Uniwersytet w Leeds (nagroda UoL ABSL) i Wellcome Trust (108466/Z/15/Z). Praca ta została sfinansowana z grantu BBSRC dla Stephena P. Muencha (BB/P026397/1) i wsparta grantami badawczymi dla Howarda D. White'a z American Heart Association (AMR21-236078) oraz Howarda D. White'a i Vitolda Galkina z U.S. National Institutes of Health (171261).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| < mocne> urządzenie z rozdzielczością czasową< / mocne> | |||
| szkło akrylowe | pudełko amerykański naukowy | ||
| cyfrowy regulator wilgotności / temperatury | Cyfrowy regulator | ||
| pneumatyczny z podwójnym | prętem siłownik pneumatyczny z podwójnym prętem | ||
| FEP | Upchurch Naukowy 1/16" OD, 0,01 '' ID FEP rurki | ||
| bezkołnierzowe | Upchurch Scientific ETFE / ETFE złączki | ||
| elastyczne wzmocnione rurki PVC | 12 mm OD. elastyczne wzmocnione rurki | ||
| szklane strzykawki | Kloehn 250 µ L pompa nawilżacza o zerowej objętości | ||
| Zbiornik ciekłego etanu | firmy Thermo/FEI VitrobotTM Mark IV | ||
| Wielostopniowy | GASARC klasa 3 | ||
| pęseta podciśnieniowa | Pęseta podciśnieniowa | ||
| oscyloskop | Hantek 6022BE oscyloskop | ||
| PE rurki | Scientific Commodities Inc. 0.043" Średnica zewnętrzna, 0,015" Zasilacz rurkowy ID PE | ||
| Zasilacz Mean Well GSM160A24-R7B | |||
| Zasilacz | |||
| Rurka PU | SMC TU0425 4 mm OD, 2,5 mm ID Regulator rurek | ||
| Norgren R72G-2GK-RMN | |||
| Potencjometr | |||
| zawór elektromagnetyczny | SMC NVJ314M zawór | ||
| pompy strzykawkowe | Kloehn V6 48K model | ||
| Odczynniki i Materiały | |||
| apoferrytyna ze śledziony koni | Sigma-Aldrich, A3660 | ||
| ATP | Sigma-Aldrich, A2383 | ||
| siatki krio-EM | Quantifoil 300 mesh Cu, R 1.2/1.3 | ||
| EGTA | Sigma Aldrich E3889 | ||
| F-aktyna | Dostarczone przez H.D. White (procedura przygotowawcza, patrz ref. < sup>1) | ||
| wyładowczy | żarnik Cressington 208 z powlekarką węglową z agregatem | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich, H7006 | ||
| KAc | Sigma-Aldrich, P1190 | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, M8266 | ||
| MOPS | Sigma-Aldrich, M1254 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich, S9888 | ||
| Miozyna mięśni szkieletowych S1 | Dostarczone przez H.D. White (procedura przygotowania, patrz ref. 2) | ||
| Ref 1 | Spudich, J. A. & Wat, S. Regulacja skurczu mięśni szkieletowych królika I. Badania biochemiczne oddziaływania kompleksu tropomiozyna-troponina z aktyną i proteolitycznymi fragmentami miozyny. Dziennik chemii biologicznej 246, 4866-4871 (1971). | ||
| Ref 2 | Biały, H. & Taylor, E. Energetyka i mechanizm atonozynotrifosfatazy adenozyny. Biochemistry 15, 5818-5826 (1976). |
Bibliografia
- Murphy, B. J., et al. Rotary substates of mitochondrial ATP synthase reveal the basis of flexible F1-Fo coupling. Science. 364, (2019).
- Benton, D. J., Gamblin, S. J., Rosenthal, P. B., Skehel, J. J. Structural transitions in influenza haemagglutinin at membrane fusion pH. Nature. , 1-4 (2020).
- Dance, A. Molecular motion on ice. Nature Methods. , 1-5 (2020).
- D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747(2019).
- Noble, A. J., et al. Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM. Nature Methods. 15, 793-795 (2018).
- Klebl, D. P., et al. Need for speed: Examining protein behaviour during cryoEM grid preparation at different timescales. BioRxiv. , (2020).
- Ravelli, R. B., et al. Cryo-EM structures from sub-nl volumes using pin-printing and jet vitrification. Nature Communications. 11, 1-9 (2020).
- Arnold, S. A., et al. Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts. Journal of Structural Biology. 197, 220-226 (2017).
- Razinkov, I., et al. A new method for vitrifying samples for cryoEM. Journal of Structural Biology. 195, 190-198 (2016).
- Feng, X., et al. A fast and effective microfluidic spraying-plunging method for high-resolution single-particle cryo-EM. Structure. 25, 663-670 (2017).
- Ashtiani, D., et al. Delivery of femtolitre droplets using surface acoustic wave based atomisation for cryo-EM grid preparation. Journal of Structural Biology. 203, 94-101 (2018).
- Rubinstein, J. L., et al. Shake-it-off: a simple ultrasonic cryo-EM specimen-preparation device. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75, (2019).
- Mäeots, M. -E., et al. Modular microfluidics enables kinetic insight from time-resolved cryo-EM. Nature Communications. 11, 1-14 (2020).
- Kontziampasis, D., et al. A cryo-EM grid preparation device for time-resolved structural studies. IUCrJ. 6, (2019).
- Klebl, D. P., et al. Sample deposition onto cryo-EM grids: from sprays to jets and back. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 76, (2020).
- White, H., Thirumurugan, K., Walker, M., Trinick, J. A second generation apparatus for time-resolved electron cryo-microscopy using stepper motors and electrospray. Journal of Structural Biology. 144, 246-252 (2003).
- Kaledhonkar, S., Fu, Z., White, H., Frank, J. Protein Complex Assembly. , Springer. 59-71 (2018).
- Trebbin, M., et al. Microfluidic liquid jet system with compatibility for atmospheric and high-vacuum conditions. Lab on a Chip. 14, 1733-1745 (2014).
- Klebl, D. P., Sobott, F., White, H. D., Muench, S. P. On-grid and in-flow mixing for time-resolved Cryo-EM. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. , (2021).
- He, S., Scheres, S. H. Helical reconstruction in RELION. Journal of Structural Biology. 198, 163-176 (2017).
- Millar, N. C., Geeves, M. A. The limiting rate of the ATP-mediated dissociation of actin from rabbit skeletal muscle myosin subfragment 1. FEBS Letters. 160, 141-148 (1983).
- Kasas, S., Dumas, G., Dietler, G., Catsicas, S., Adrian, M. Vitrification of cryoelectron microscopy specimens revealed by high-speed photographic imaging. Journal of Microscopy. 211, 48-53 (2003).
- Glaeser, R. M., et al. Defocus-dependent Thon-ring fading. bioRxiv. , (2020).
- Bagshaw, C. A beginner's guide to flow kinetics. The Biochemist. 42, (2020).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
