Szybkie przygotowanie siatki do czasowo-rozdzielczej mikroskopii krioelektronowej

Podsumowanie

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół korzystania z urządzenia do szybkiego tworzenia siatki, zarówno do szybkiego tworzenia siatki, jak i do szybkiego mieszania i zamrażania w celu przeprowadzania eksperymentów z rozdzielczością czasową.

Streszczenie

Dziedzina mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM) szybko się rozwija dzięki nowemu sprzętowi i algorytmom przetwarzania, tworząc struktury o wyższej rozdzielczości i informacje o bardziej wymagających systemach. Przygotowanie próbek do krio-EM przechodzi podobną rewolucję, a nowe podejścia są opracowywane w celu zastąpienia tradycyjnych systemów blottingu. Należą do nich stosowanie dozowników piezoelektrycznych, drukowanie pinów i natryskiwanie bezpośrednie. W wyniku tych osiągnięć szybkość przygotowania siatki wzrasta z sekund do milisekund, co stwarza nowe możliwości, zwłaszcza w dziedzinie krio-EM o rozdzielczości czasowej, gdzie białka i substraty mogą być szybko mieszane przed zamrożeniem, zatrzymując krótkotrwałe stany pośrednie. W tym miejscu szczegółowo opisujemy standardowy protokół tworzenia siatek na naszym wewnętrznym urządzeniu EM z rozdzielczością czasową, zarówno do standardowego szybkiego przygotowania siatki, jak i do eksperymentów z rozdzielczością czasową. Protokół wymaga co najmniej około 50 μl próbki o stężeniach ≥ 2 mg/ml do przygotowania 4 siatek. Opóźnienie między nałożeniem próbki a zamrożeniem może wynosić nawet 10 ms. Jednym z ograniczeń jest zwiększona grubość lodu przy większych prędkościach i w porównaniu z metodą blottingu. Mamy nadzieję, że ten protokół pomoże innym w projektowaniu własnych urządzeń do tworzenia siatek oraz osobom zainteresowanym projektowaniem eksperymentów z rozdzielczością czasową.

Wprowadzenie

Tło
Najnowsze osiągnięcia w dziedzinie mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM) umożliwiły prowadzenie badań strukturalnych coraz bardziej złożonych układów w wysokiej rozdzielczości. Z nielicznymi wyjątkami, takie badania ograniczały się do makrocząsteczek biologicznych w stanie równowagi¹ lub stosunkowo powolnych reakcji². Wiele procesów in vivo zachodzi w szybszej skali czasowej (milisekundy) i rośnie zainteresowanie krio-elektromagnetycznym w czasie (TrEM) w tych skalach czasowych³. Jednak konwencjonalne przygotowanie próbki cryo-EM metodą blottingu jest zbyt wolne dla milisekundowego TrEM.

Metoda blottingu ma inne ograniczenia, oprócz słabej rozdzielczości czasowej. Białka i kompleksy białkowe mogą cierpieć z powodu denaturacji lub preferowanej orientacji na siatkach⁴. Wykazano, że skrócenie czasu ekspozycji na granicę faz powietrze-woda podczas przygotowywania próbki łagodzi preferowaną orientację i denaturację białek^5,6. W ten sposób szybkie przygotowanie siatki nie tylko umożliwia milisekundowe TrEM, ale może również poprawić jakość siatki.

Obecnie istnieją trzy różne podejścia do automatycznego przygotowywania sieci. Pierwsze podejście wykorzystuje szpilkę lub kapilarę, która utrzymuje niewielką ilość próbki. Po nawiązaniu kontaktu między cieczą a powierzchnią siatki, próbka jest "zapisywana" na siatce^7,8. Proces aplikacji próbki jest stosunkowo powolny i trwa kilka sekund. Alternatywne podejście wykorzystuje kontrolowane wytwarzanie kropel przez dozownik piezoelektryczny i samoodprowadzające wilgoć siatki⁹. Pozwala to na szybsze dozowanie do zamrożenia, ale nadal jest ograniczone przez prędkość kropel i odprowadzania wilgoci (obecnie sięgającą 54 ms). Najszybszym do tej pory podejściem jest podejście natryskowe bezpośrednie, w którym próbka jest rozpylana w dyszy rozpylającej, a małe (~ 10 - 20 μm) i szybkie (> 5 m/s) kropelki rozchodzą się po kontakcie z siatką krio-EM. Próbka w sprayu może być generowana na różne sposoby, takie jak rozpylacze strumienia powietrza, powierzchniowe fale akustyczne lub nawilżacze ultradźwiękowe^10,11,12,13. Z naszego doświadczenia wynika, że grubość lodu przy natryskiwaniu bezpośrednim jest większa, ale natryskiwanie bezpośrednie umożliwia dozowanie do czasu zamrażania < 10 ms.

Ten protokół opisuje krok po kroku, jak można użyć urządzenia EM o rozdzielczości czasowej (TED) wyposażonego w dyszę rozpylającą mikroprzepływowe do przygotowania siatek w szybkim tempie^14,15. Urządzenie służy do przygotowania siatek z minimalnym czasem opóźnienia wynoszącym 6 ms między nałożeniem próbki a zamrożeniem oraz do szybkiego mieszania i zamrażania dwóch próbek. Projekt TED jest oparty na poprzedniej wersji¹⁶ i jest podobny do innych urządzeń cryo-EM opartych na sprayu z rozdzielczością czasową¹⁷.

Po pierwsze, opisane są cztery główne części konfiguracji TED. Sercem TED jest jednostka obsługi cieczy, która jest odpowiedzialna za zasysanie i dozowanie próbek. Pneumatyczny tłok przesuwa siatkę przez spray do ciekłego etanu. Wytwarzanie aerozolu odbywa się za pomocą mikroprzepływowych dysz rozpylających, a zamrażanie odbywa się w pojemniku z ciekłym etanem, które są pokrótce opisane. Na koniec podkreślono dodatkowe funkcje kontrolujące środowisko sieci, zwłaszcza wilgotność. Następnie sporządzane są szczegółowe protokoły działania urządzenia i przeprowadzania eksperymentów TrEM. Reprezentatywne wyniki są podane dla szybkiego przygotowania siatki i prostego eksperymentu TrEM.

Konfiguracja eksperymentalna

Jednostka obsługi cieczy
System obsługi cieczy TED składa się z trzech pomp z napędem strzykawkowym ("pompy 1 - 3"), z których każda wyposażona jest w zawór obrotowy (Rysunek 1). Zasilacz zasila pompy 1 - 3 napięciem 24 V DC. Komunikacja z oprogramowaniem sterującym (napisanym w Visual Basic i C++) odbywa się poprzez interfejs RS232 do pompy 1. Polecenia są dystrybuowane przez szeregowe porty rozszerzeń I/O z pompy 1 do pomp 2-3. Pompy 1-3 są wyposażone w szklane strzykawki ("strzykawki 1-3", używamy tutaj strzykawek o pojemności 250 μl/zerowej objętości martwej). Każdy zawór ma dwie pozycje, "załadunek" i "dozowanie". Pozycja "obciążenia" służy do zasysania próbki do strzykawki. Krótki kawałek (~ 3 - 4 cm) rurki 1/16" OD, 0,01′′ ID FEP jest podłączony za pomocą złączek bezkołnierzowych ETFE/ETFE do pozycji "obciążenia" zaworów 1-3. Ten krótki kawałek rurki sięga do zbiornika na próbkę (zwykle jest to plastikowa rurka o pojemności 1,5 ml lub 0,5 ml). Pozycja "dozowanie" prowadzi do dyszy natryskowej. Połączenie między wylotem "dozownika" a dyszą natryskową odbywa się za pomocą rurki PE (długość ~ 20-30 cm, średnica zewnętrzna 0,043", średnica wewnętrzna 0,015"), z krótkim kawałkiem rurki tulejowej (~ 0,5 cm) i złączkami bezkołnierzowymi ETFE/ETFE.

Tłok pneumatyczny
TED wykorzystuje pneumatyczny tłok do przyspieszania siatki i przesuwania jej przez rozpyloną próbkę do pojemnika z ciekłym etanem. Pęseta podciśnieniowa przytrzymuje siatkę, wkręconą w domowy uchwyt, który jest zamontowany na siłowniku pneumatycznym z podwójnym prętem (Rysunek 2A).

Ciśnienie jest dostarczane z dużej butli z gazem azotowym (rozmiar W), wyposażonej w wielostopniowy regulator (0 - 10 bar, 'główne ciśnienie'). Elastyczna wzmocniona rurka PVC (średnica zewnętrzna 12 mm) łączy regulator z 12-portowym kolektorem, w którym azot pod ciśnieniem jest dostarczany do dyszy i tłoka pneumatycznego. Przepływ gazu przez dyszę jest stały, regulowany bezpośrednio na butli z azotem (ciśnienie główne). Podłączenie do dyszy odbywa się za pomocą rurki PU (średnica zewnętrzna 4 mm, średnica wewnętrzna 2,5 mm), krótkiego odcinka rurki PE (długość ~ 8 cm, średnica zewnętrzna 0,043 cala, średnica wewnętrzna 0,015 cala) i odpowiednich łączników. Ciśnienie na tłoku pneumatycznym jest kontrolowane przez zawór elektromagnetyczny. Rurka PU (średnica zewnętrzna 4 mm, średnica wewnętrzna 2,5 mm) łączy zawór elektromagnetyczny z regulatorem i tłokiem pneumatycznym, aby umożliwić zmniejszenie ciśnienia zanurzenia (≤ ciśnienia głównego). Zawór elektromagnetyczny jest sterowany komputerowo. Schematyczny przegląd konfiguracji znajduje się w Rysunek 2B.

Zauważ, że przy tej konfiguracji ciśnienie zanurzania jest zawsze równe lub mniejsze niż ciśnienie gazu natryskowego (ciśnienie główne). Jednak konfigurację można łatwo zmienić, dodając drugi regulator przed dyszą natryskową, aby umożliwić wyższe prędkości zanurzania przy niskim ciśnieniu rozpylanego gazu. Wysokie ciśnienie (>> 2 bar) może uszkodzić dyszę natryskową PDMS.

UWAGA: To jest system ciśnieniowy i 'główne ciśnienie' powinno zawsze wynosić < 7 barów.

Ciśnienia między 0,5 a 2 barami są zazwyczaj używane dla tłoka pneumatycznego i pokazują w przybliżeniu liniową zależność między ciśnieniem a prędkością (w pionowym położeniu strumienia). Prędkości zanurzania są mierzone za pomocą oscyloskopu, połączonego liniowo z potencjometrem suwakowym (10 kΩ) i równolegle z rezystorem 2 kΩ (Rysunek 2C). Zasilacz zasila potencjometr napięciem 9 V DC. Podczas gdy przybliżona prędkość zanurzania jest ustawiana przed eksperymentem poprzez ustawienie ciśnienia zanurzenia, potencjometr daje dokładny odczyt prędkości po eksperymencie.

Dysze rozpylające i pojemnik na ciekły etan<br /> Produkcja i działanie dynamicznych gazodynamicznych dysz wirtualnych do dostarczania próbek na bazie sprayu zostało szczegółowo opisane w innym miejscu¹⁵. Jak opisano powyżej, wyloty "dozowania" zaworów 1-3 są połączone z wlotami cieczy dyszy (Rysunek 3A). Gaz natryskiwany pod ciśnieniem jest podłączony do wlotu gazu dyszy. Wloty w dyszach natryskowych PDMS są takie, że rurki PE o średnicy zewnętrznej 0,043" mogą być używane bezpośrednio, bez konieczności stosowania złączek. Nasza konstrukcja dyszy zawiera geometrię "jet-in-jet" do mieszania dwóch próbek, podobną do urządzenia opisanego w ref.¹⁸. Schemat projektu jest pokazany w Rysunek 3B, mikroskopijny obraz dyszy jest pokazany w Rysunek 3C. Układ urządzenia mikroprzepływowego wymaga użycia trzech strzykawek do wymieszania dwóch próbek. Dysza natryskowa jest zwykle umieszczona w odległości 1-1,5 cm od siatki (podczas aplikacji próbki).

Używamy ciekłego etanu jako kriogenu, w pojemniku z ciekłym etanem/azotem, jak to jest używane w standardowej metodzie blottingu. Pionowe pozycjonowanie kubka na ciekły etan odbywa się za pomocą laboratoryjnej platformy podnoszącej.

Kontrola środowiska natryskowego i siatkowego
Tłok i dysza natryskowa znajdują się w specjalnie zbudowanym pudełku z PMMA (szkła akrylowego) z podwójnymi drzwiczkami (Rysunek 4A). Wysoka wilgotność względna wewnątrz pudełka jest osiągana przez system nawilżania powietrza z tyłu TED (Rysunek 4B). Powietrze jest dostarczane przez pompę i podawane do pierwszego 10-calowego kanistra (zwykle używanego do oczyszczania wody pod zlewem). Kanister jest wypełniony niskim (~ 5-10 cm) poziomem wody, a także mieści nawilżacz. Zasilanie sieciowe nawilżacza jest kontrolowane przez cyfrowy regulator wilgotności/temperatury oraz czujnik wilgotności/temperatury umieszczony wewnątrz skrzynki ze szkła akrylowego. Sterownik jest ustawiony tak, aby wyłączał pompę, gdy wilgotność względna osiągnie ≥ 90%. Nawilżone powietrze z pierwszego kanistra jest pompowane przez dyfuzor, zanurzane w wodzie w drugim 10-calowym kanistrze, a następnie trafia do skrzynki ze szkła akrylowego.

UWAGA: Ponieważ próbka jest aerozolowana w dyszy rozpylającej, niebezpieczne próbki biologiczne lub chemiczne nie nadają się jako próbki.

Sekwencja uruchamiania
Przycisk Uruchom skrypt w oprogramowaniu sterującym inicjuje sekwencję uruchamiania. Ta sekwencja poleceń może być wstępnie zdefiniowana w pliku skryptu i zmieniona przez oprogramowanie. Najważniejsze zmienne są wyjaśnione tutaj:

Prędkość rozpylania: Prędkość natrysku określa natężenie przepływu cieczy używane przez pompę strzykawkową. Natężenie przepływu można obliczyć w następujący sposób: Zastosowane tutaj silniki pomp strzykawkowych mają stały rozmiar kroku. Pełny zakres pompy podzielony jest na 48 000 stopni. Drugim ważnym czynnikiem jest objętość strzykawki. Zazwyczaj używamy strzykawek o pojemności 250 μl. Prędkość natrysku w oprogramowaniu sterującym jest ustawiana jako liczba kroków na sekundę. Prędkość natrysku 1000 kroków/sekundę odpowiada:

Objętość natrysku: Objętość oprysku określa całkowitą objętość do rozpylenia. W ten sposób określa również czas trwania sprayu. Objętość natrysku w oprogramowaniu sterującym jest ustawiana w kilku krokach. Objętość natrysku wynosząca 2000 kroków, przy prędkości natrysku 1000 kroków/sekundę, prowadzi do czasu rozpylania 2 s i całkowitej objętości 10,4 μl.

Czas przed natryskiem: Ta zmienna określa czas między rozpoczęciem natrysku a zanurzeniem. Ważne jest, aby wybrać czas opóźnienia tak, aby spray miał wystarczająco dużo czasu na ustabilizowanie się przed zanurzeniem siatki. Zwykle spray ma 1,5 - 4 s na ustabilizowanie się przed zanurzeniem siatki. Rozpylanie jest utrzymywane do momentu przejścia siatki. Zwykle przepływ cieczy (a tym samym rozpylanie) jest zatrzymywany od 0,5 do 1 s po zanurzeniu siatki. Przy prędkości natrysku 1000 kroków/s i objętości natrysku 2000 kroków, typowy czas natryskiwania wstępnego wynosi na przykład 1,5 s.

Przykładowa sekwencja poleceń jest pokazana w Rysunek 5A, pozycja siatki w czasie jest zilustrowana w Rysunek 5B.

Protokół

1. Przygotowanie systemu

UWAGA: Poniższy protokół opisuje, jak przygotować siatki pojedynczej próbki. Zazwyczaj dla każdej próbki lub warunku przygotowuje się co najmniej 2 siatki replik. W przypadku większych prędkości zanurzania (opóźnienie czasowe mniejsze niż ~ 20 ms) zwykle przygotowuje się 3 lub 4 siatki replikowane, aby uwzględnić zmniejszoną liczbę obszarów cienkiego lodu.

1. Rozcieńczyć próbkę białka do stężenia docelowego w żądanym buforze. Zazwyczaj końcowe stężenia ≥ 2 mg/ml dobrze sprawdzają się w przypadku przygotowania siatki za pomocą TED. Należy pamiętać, że próbka może być przechowywana na lodzie do etapu 10, począwszy od kroku 10, próbka będzie spędzać dużo czasu w temperaturze pokojowej, ponieważ przygotowanie 3-4 siatek zajmuje około 20 minut.
2. Włącz TED. Następnie włącz komputer sterujący i uruchom oprogramowanie sterujące.
3. Zainicjuj wszystkie pompy strzykawkowe, naciskając przycisk Inicjalizuj (dolny przycisk) na każdej pompie strzykawki.
4. Włącz zasilanie potencjometru, ustaw je na 9 V i uruchom oprogramowanie sterujące oscyloskopem.
5. Upewnij się, że zawór regulacyjny 2-cylindra N jest zamknięty. Otwórz zawór butli. Następnie powoli otwórz zawór regulatora, ustawiając ciśnienie wylotowe na żądaną wartość ciśnienia rozpylanego gazu (zwykle 1-2 bary). W przypadku zastosowanych tutaj dysz PDMS nie należy używać ciśnień wyższych niż ~ 2,5 bara, aby uniknąć uszkodzenia dyszy. Stale przepływający gaz zapobiega kapaniu i gromadzeniu się cieczy na końcówce dyszy, co może prowadzić do niepowtarzalnego rozpylania.
6. Upewnij się, że wszystkie zawory pompy strzykawkowej znajdują się w pozycji "obciążenie". Można to zrobić, przełączając wszystkie zawory w pozycję "dozowanie" w oprogramowaniu sterującym, a następnie z powrotem do pozycji "obciążenie". Pozostaw wszystkie zawory przełączone na "obciążenie". Ustawić wszystkie strzykawki na zero.
7. Na tym etapie należy usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza znajdujące się w systemie. W tym celu może być konieczne odkręcenie strzykawek, ręczne usunięcie pęcherzyków powietrza i ponowne zamontowanie strzykawek, gdy nie ma już pęcherzyków.
8. Elementy do obsługi cieczy są zwykle przechowywane w H₂O. Przed załadowaniem roztworu próbki należy zrównoważyć układ cieczy z buforem, przemując rurkę nadmiarem buforu. Stosować odpowiednie maksymalne natężenie przepływu cieczy, aby uniknąć nadmiernego ciśnienia na dyszy natryskowej. Natężenie przepływu cieczy > 10 μl/s może spowodować uszkodzenie opisanych tutaj dysz PDMS.
9. Umieścić probówkę o pojemności 1,5 ml zawierającą ≥ bufor o pojemności 200 μl na strzykawce 1 (górna część musi być przekłuta, aby przymocować do rurki).
   1. Upewnij się, że zawór 1 jest w pozycji "obciążenie". W razie potrzeby włączyć oprogramowanie sterujące.
   2. Odessać żądaną ilość (zwykle 50-100 μl) buforu za pomocą strzykawki 1 za pomocą oprogramowania sterującego.
   3. Przełącz zawór 1 w pozycję "dozowanie" za pomocą oprogramowania sterującego.
   4. Dozować cały płyn do strzykawki 1 za pomocą oprogramowania sterującego.
   5. Ustaw zawór zwrotny w pozycji "obciążenie", zresetuj pozycję strzykawki do "0" w programie i naciśnij przycisk inicjalizuj na strzykawce 1, aby przygotować system do następnego cyklu.
      UWAGA: Kroki 1.9.1 - 1.9.5 są zwykle powtarzane trzy razy, aby zapewnić dokładne umycie rurki.
10. Załaduj pęsetę siatką EM (nie jest wymagany żaden konkretny typ), poluzowując zacisk ramienia wgłębnego, umieszczając pęsetę w zacisku i dokręcając zacisk.
11. Ręcznie przesuń ramię wgłębne tak, aby ruszt i dysza znajdowały się na tej samej wysokości (pozycja "aplikacja próbki"). Jeśli dysza i siatka są wyrównane, płyn będzie gromadził się na siatce po natryskiwaniu przez dłuższy czas. W razie potrzeby wyreguluj położenie dyszy.
12. Wyreguluj położenie kubka z ciekłym etanem, ręcznie przesuwając ramię wgłębne z zamontowaną pęsetą do pozycji końcowej (sięgając do kubka na etan). Po prawidłowym ustawieniu siatka przytrzymywana przez pęsetę dotrze mniej więcej do środka kubka z ciekłym etanem.
13. Sprawdź, czy "uruchom skrypt" użyje żądanych natężeń przepływu, objętości i czasów. Szczegółowe informacje można znaleźć w sekcji "Sekwencja uruchamiania" powyżej.
14. Upewnij się, że nic nie zasłania drogi tłoka. Zassać do strzykawki 1 objętość buforu wymaganą do pojedynczego uruchomienia. Odbywa się to w oprogramowaniu sterującym, patrz rozdział "Sekwencja uruchamiania", aby zapoznać się z typowymi ustawieniami i głośnościami. Następnie upewnij się, że zawór 1 jest ustawiony w pozycji "dozowanie". Wykonaj przebieg testowy, naciskając Uruchom skrypt w oprogramowaniu sterującym.
    UWAGA: Trzymaj się z dala od TED, dopóki sekwencja uruchamiania nie zostanie zakończona. Ruchome części mogą spowodować obrażenia!
15. Po zakończeniu "sekwencji pracy" ustaw nacisk na ramię wgłębne na żądaną wartość (zwykle 1-2 bary). Dopiero wtedy naciśnij OK w oprogramowaniu sterującym, aby zwolnić nacisk z ramienia zanurzającego. Jeśli konieczna jest regulacja "sekwencji pracy" lub nacisku na ramię wgłębne, ustawienia te można na tym etapie zmienić i powtórzyć kroki 1.13 - 1.15.

2. Szybkie przygotowanie siatki

1. Najpierw napełnij pojemnik z ciekłym etanem/azotem ciekłym azotem. Gdy jest wystarczająco zimny i wolny od ciekłego azotu, napełnij kubek ciekłym etanem. Unikać krzepnięcia ciekłego etanu. Ten krok jest taki sam, jak w przypadku konwencjonalnego przygotowania siatki.
   UWAGA: Aby zminimalizować zanieczyszczenie etanem, upewnij się, że kroki 2.2 - 2.13 są wykonywane tak szybko, jak to możliwe
   UWAGA: Ciekły etan jest kriogeniczny i łatwopalny. Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z nim.
2. Przygotuj siatki krio-EM do wyładowania jarzeniowego. Zazwyczaj używamy dziurawych siatek węglowych i wyładowań jarzeniowych przez 90 s, przy ciśnieniu powietrza 0,1 mbar i 10 mA. Zwykle nie więcej niż 4 siatki są rozładowywane jarzeniowo jednocześnie. Kratki są używane w ciągu 30 minut od rozładowania żarzenia.
3. Zrównoważyć rurkę z próbką (postępując zgodnie z krokami 1.9.1 - 1.9.5, używając próbki zamiast bufora). Jeżeli dostępna objętość próbki jest mała, rurkę można zrównoważyć tylko 1 objętością martwą.
4. Do strzykawki 1 w oprogramowaniu sterującym należy zassać ilość próbki potrzebną do pojedynczego przebiegu (szczegółowe informacje znajdują się w rozdziale "Sekwencja przebiegu"). Następnie przełącz zawór 1 w pozycję "dozowanie".
5. Sprawdź, czy wilgotność względna osiągnęła żądaną wartość (zazwyczaj przygotowujemy kratki o wilgotności względnej 60% lub wyższej). Po osiągnięciu ≥ 60% wilgotności należy otworzyć komorę wilgotności tylko na minimalny czas, aby utrzymać wysoką wilgotność.
6. Umieść pęsetę, trzymając rozżarzoną siatkę, w tłoku pneumatycznym i zamocuj je. Przesunąć tłok do pozycji początkowej (u góry).
7. Upewnij się, że suwak potencjometru znajduje się w pozycji startowej, gotowy do pomiaru, przesuwając go ręcznie, aby zetknąć się z tłokiem. Ustaw spust na oscyloskopie w oprogramowaniu oscyloskopu.
8. Umieść pojemnik z ciekłym etanem/azotem.
9. Naciśnij Uruchom skrypt w oprogramowaniu sterującym. Po wyświetleniu monitu kliknij przycisk OK w oprogramowaniu sterującym, aby uruchomić polecenie uruchom.
   UWAGA: Trzymaj się z dala od TED, dopóki sekwencja uruchamiania nie zostanie zakończona. Ruchome części mogą spowodować obrażenia!
10. Po zakończeniu "sekwencji pracy" zwolnij nacisk na tłok pneumatyczny, klikając OK w oprogramowaniu sterującym.
11. Otwórz komorę wilgotnościową, jedną ręką poluzuj połączenie między ramieniem wgłębnym a pęsetą, a drugą zabezpiecz pęsetę. Gdy pęseta jest wolna, przesuń ramię wgłębne do góry, utrzymując siatkę w ciekłym etanie. Następnie przenieś siatkę do jej przestrzeni magazynowej w otaczającej cieczy N₂. Po zamrożeniu siatka musi być przez cały czas utrzymywana w temperaturze cieczy_N2
.
12. Zapisz pomiar oscyloskopu. Następnie ręcznie zresetuj pozycję suwaka potencjometru i tłoka.
13. Powtórz kroki 2.4-2.12, aby przygotować siatki replikacji
14. Przenieś siatki do długoterminowego przechowywania do czasu przecięcia siatki i zebrania danych.
15. Umyj układ buforem, zgodnie z krokami 1.9.1 - 1.9.5. Następnie umyj układ za pomocą_H2O, zgodnie z krokami 1.9.1 - 1.9.5.
16. Wyłącz główny regulator azotu i wyłącz zasilanie.
17. Umieścić pojemnik na etan/azot w dygestorium, aby się rozgrzał i pozwolił ciekłemu etan i N₂ odparować.

3. Krio-EM z rozdzielczością czasową

UWAGA: Gdy eksperymenty z rozdzielczością czasową są przeprowadzane za pomocą TED, istnieją dodatkowe aspekty do rozważenia, chociaż podstawowa konfiguracja i zmienne pozostają takie same. Zakłada się, że dwa roztwory miesza się w stosunku 1:1 (v/v) w celu uzyskania końcowej mieszaniny, która jest osadzana na siatce. Postępuj zgodnie z protokołem opisanym w "1. Szybkie przygotowanie siatki z TED", z następującymi zmianami:

1. Do eksperymentów z mieszaniem należy stosować wyższe stężenia zapasów niż do prostych eksperymentów z rozpylaniem. Mieszanie w stosunku 1:1 (v/v) spowoduje 2-krotne rozcieńczenie każdego składnika.
2. Aby przeprowadzić eksperyment z szybkim mieszaniem, użyj wszystkich trzech strzykawek, a nie tylko jednej.
   1. Podłączyć rurkę do pomp strzykawkowych 2-3.
   2. Podłącz rurkę z pomp strzykawkowych 2-3 do dyszy rozpylającej.
   3. Zrównoważyć wszystkie trzy strzykawki w buforze i oddzielnie próbkować. Zazwyczaj strzykawka 1 jest wypełniona próbką A, a strzykawki 2-3 są napełniane próbką B (Rysunek 3).
3. Zmień sekwencję uruchamiania. Przykład sekwencji uruchamiania z użyciem wszystkich 3 strzykawek do eksperymentu z szybkim mieszaniem znajduje się w Rysunek 6. Szczegółowe informacje można znaleźć w sekcji "Sekwencja uruchamiania".
4. Różne opóźnienia czasowe można osiągnąć na dwa sposoby:
   1. Zmienić prędkość tłoka. Regulując prędkość tłoka, opóźnienie czasowe można zmienić w stosunkowo wąskim zakresie. Na przykład, przy odległości rozpylanie/etan wynoszącej 2 cm, tłok może być przesuwany z prędkością 1 m/s lub 2 m/s, aby uzyskać opóźnienie czasowe wynoszące odpowiednio 20 ms lub 10 ms. Odbywa się to zgodnie z opisem w kroku 1.15.
   2. Zmień pozycję rozpylacza/etanu, regulując (pionową) pozycję dyszy natryskowej. Jeśli dysza jest umieszczona w odległości 5 cm od powierzchni etanu, na przykład, prędkość zanurzania 1 m/s daje opóźnienie czasowe wynoszące 50 ms. Osiągnięcie znacznie dłuższych opóźnień czasowych wymaga dalszych modyfikacji konfiguracji.
      UWAGA: Ze względu na przepływ laminarny w obszarze skupiającym przepływ dyszy, nie spodziewamy się znacznego wymieszania w tej części dyszy. Zamiast tego oczekujemy, że mieszanie następuje podczas wytwarzania oprysku, w kropelkach w drodze do siatki i podczas rozprowadzania kropel na siatce. Czas lotu, w którym krople cieczy dotrą do siatki, szacuje się ≤ 1 ms (dla prędkości kropli ≥ 10 m/s i odległości dysza-siatka 1 cm). W związku z tym za "opóźnienie czasowe" uważa się jedynie czas między lądowaniem kropli a zeszkleniem.

Wyniki

Szybkie przygotowanie siatki za pomocą TED
Jako próbkę testową do szybkiego przygotowania siatki użyliśmy apoferrytyny ze śledziony koni w stężeniu 20 μM w 30 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,5. Rekonstrukcję w rozdzielczości 3,5 A uzyskano z 690 mikrofotografii, jak opisano w ref.¹⁵ (Rysunek 7A). Zakres rozmycia został dobrany tak, aby cząstki można było łatwo zidentyfikować na surowych obrazach (Rysunek 7B). Typowa siatka przygotowana z opó...

Dyskusja

Protokoły w tej pracy mogą być wykorzystane do szybkiego przygotowania siatki poprzez bezpośrednie natryskiwanie i eksperymenty z TrEM. Szybkie przygotowanie siatki można wykorzystać do zmniejszenia interakcji cząstek z interfejsem powietrze-woda⁵. Głównymi ograniczeniami są dostępne stężenie próbki i grubość lodu na siatce. W ramach tych limitów i pod warunkiem, że jakość próbki jest dobra, protokół tworzy siatki odpowiednie dla krio-EM-u o wysokiej rozdzielczości.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
< mocne> urządzenie z rozdzielczością czasową< / mocne>
szkło akrylowe	pudełko amerykański naukowy
cyfrowy regulator wilgotności / temperatury	Cyfrowy regulator
pneumatyczny z podwójnym	prętem siłownik pneumatyczny z podwójnym prętem
FEP	Upchurch Naukowy 1/16" OD, 0,01 '' ID FEP rurki
bezkołnierzowe	Upchurch Scientific ETFE / ETFE złączki
elastyczne wzmocnione rurki PVC	12 mm OD. elastyczne wzmocnione rurki
szklane strzykawki	Kloehn 250 µ L pompa nawilżacza o zerowej objętości
Zbiornik ciekłego etanu	firmy Thermo/FEI VitrobotTM Mark IV
Wielostopniowy			GASARC klasa 3
pęseta podciśnieniowa	Pęseta podciśnieniowa
oscyloskop	Hantek 6022BE oscyloskop
PE rurki	Scientific Commodities Inc. 0.043" Średnica zewnętrzna, 0,015" Zasilacz rurkowy ID PE
	Zasilacz Mean Well GSM160A24-R7B
	Zasilacz
Rurka PU	SMC TU0425 4 mm OD, 2,5 mm ID Regulator rurek
	Norgren R72G-2GK-RMN
	Potencjometr
zawór elektromagnetyczny	SMC NVJ314M zawór
pompy strzykawkowe	Kloehn V6 48K model
Odczynniki i Materiały
apoferrytyna ze śledziony koni	Sigma-Aldrich, A3660
ATP	Sigma-Aldrich, A2383
siatki krio-EM	Quantifoil 300 mesh Cu, R 1.2/1.3
EGTA	Sigma Aldrich E3889
F-aktyna	Dostarczone przez H.D. White (procedura przygotowawcza, patrz ref. < sup>1)
wyładowczy	żarnik Cressington 208 z powlekarką węglową z agregatem
HEPES	Sigma-Aldrich, H7006
KAc	Sigma-Aldrich, P1190
MgCl2	Sigma-Aldrich, M8266
MOPS	Sigma-Aldrich, M1254
NaCl	Sigma-Aldrich, S9888
Miozyna mięśni szkieletowych S1	Dostarczone przez H.D. White (procedura przygotowania, patrz ref. 2)
Ref 1	Spudich, J. A. & Wat, S. Regulacja skurczu mięśni szkieletowych królika I. Badania biochemiczne oddziaływania kompleksu tropomiozyna-troponina z aktyną i proteolitycznymi fragmentami miozyny. Dziennik chemii biologicznej 246, 4866-4871 (1971).
Ref 2	Biały, H. & Taylor, E. Energetyka i mechanizm atonozynotrifosfatazy adenozyny. Biochemistry 15, 5818-5826 (1976).