Poprawiono zbieranie danych szeregowych celu w Diamond Light Source

Summary

Prezentujemy obszerny przewodnik po przygotowywaniu próbek do stałego celu, zbieraniu danych i przetwarzaniu danych dla szeregowej krystalografii synchrotronowej na linii badawczej Diamond I24.

Abstract

Szeregowe zbieranie danych to stosunkowo nowa technika dla użytkowników synchrotronów. Instrukcja obsługi do zbierania danych o stałych celach w I24, Diamond Light Source zawiera szczegółowe instrukcje krok po kroku, rysunki i filmy w celu płynnego zbierania danych.

Introduction

Szeregowa krystalografia synchrotronowa (SSX) to nowa metoda zbierania danych, która została zainspirowana laserami na swobodnych elektronach rentgenowskich (XFEL)^1,2,3. W XFEL pojedynczy wzór dyfrakcyjny jest rejestrowany z zwykle bardzo małego kryształu białka, zanim kryształ zostanie zniszczony przez niezwykle jasny impuls promieniowania rentgenowskiego. Oznacza to, zazwyczaj, że nowy kryształ musi zostać wprowadzony do wiązki promieniowania rentgenowskiego, aby uzyskać kolejny wzór dyfrakcyjny⁴. Ta potrzeba ciągłego uzupełniania kryształów doprowadziła do rozwoju wielu technik seryjnego dostarczania próbek⁵.

W synchrotronach powszechnie stosowane są klasyczne (nieszeregowe) metody krystalografii rotacyjnej, wykorzystujące pojedynczy duży kryształ, który jest obracany w wiązce promieniowania rentgenowskiego za pomocą goniometru w celu zebrania kompletnego zestawu danych dla rozwiązania strukturalnego⁶. W celu wydłużenia czasu życia kryształów, tak aby można było zebrać kompletny zestaw danych^7,8, a także w celu ułatwienia wysyłki i automatycznego transferu próbek, kryształy są chłodzione kriogenicznie do ~100 K w celu zebrania danych. Przy intensywnych liniach mikrofokusowych często stosuje się strategie wielokryształowe, ponieważ uszkodzenia spowodowane promieniowaniem mogą uniemożliwić zebranie kompletnego zestawu danych z pojedynczego kryształu^9,10,11. Pomimo ograniczeń narzuconych przez uszkodzenia spowodowane promieniowaniem, liczba użytych kryształów pozostaje stosunkowo skromna, a zastosowane podejście jest zasadniczo identyczne jak w eksperymencie z monokryształami.

SSX, z drugiej strony, wykorzystuje seryjne dostarczanie próbek do uzyskania pojedynczych, nieruchomych wzorów dyfrakcyjnych z tysięcy losowo rozmieszczonych kryształów w celu wygenerowania kompletnego zestawu danych. Zauważono, że techniki szeregowe wykorzystujące rotację kryształów są w trakcie opracowywania^12,13, chociaż skupiamy się na zbliżaniu się do zera. Istnieje wiele różnych systemów dostarczania próbek o różnych zaletach i wadach¹⁴, począwszy od dostarczania strumienia kryształów w strumieniu skoncentrowanym na przepływie/lepkim^15,16,17, mikroprzepływowy chip^18,19, lub kryształy na stałym celu, takim jak wytrawiony układ krzemowy^20,21. Zazwyczaj kryształy są utrzymywane w temperaturze pokojowej, co pozwala na zaobserwowanie większej różnorodności konformacyjnej i zapewnia bardziej fizjologicznie odpowiednie środowisko²². SSX umożliwia gromadzenie zestawów danych o bardzo niskich dawkach²³, ponieważ całkowita dawka zestawu danych jest równoważna pojedynczej krótkiej ekspozycji na promieniowanie rentgenowskie jednego kryształu. Kolejną ważną zaletą SSX jest badanie dynamiki białek za pomocą metod czasowo-rozdzielczych, z reakcjami wyzwalanymi przez ekspozycję na światło lasera^24,25,26,27lub przez mieszanie kryształów i ligandu/substratu^28,29. Użycie mniejszych kryształów oznacza, że światło laserowe może przenikać przez cały kryształ, równomiernie inicjując reakcję bez absorpcji wielofotonowej, aby zapewnić dobrze zdefiniowane produkty pośrednie reakcji dla danych dyfrakcyjnych pobranych w różnych punktach czasowych²⁷. Stosowanie większych kryształów i metod gromadzenia danych opartych na rotacji wiąże się z ograniczoną głębokością penetracji lasera, niejednorodną lub wielofotonową aktywacją, uszkodzeniem promieniowania i czasem mechanicznego narzutu w trakcie przemiatania danych, co skutkuje mieszanką produktów pośrednich reakcji, które mogą okazać się trudne lub niemożliwe do zinterpretowania przy większych prędkościach reakcji. Mniejsze kryształy zapewniają podobną przewagę w eksperymentach mieszania, ponieważ ligandy mogą szybko i bardziej równomiernie dyfundować w krysztale, co ponownie pozwala na rejestrowanie zdefiniowanych produktów pośrednich reakcji z różnymi opóźnieniami czasowymi^30,31,32.

Na linii badawczej I24 firmy Diamond można przeprowadzać zarówno konwencjonalne eksperymenty obrotowe, jak i SSX. W tym miejscu przedstawiono kompleksowy protokół przygotowania próbek SSX i zbierania danych przy użyciu stałych celów w I24 oraz protokoły do analizy danych szeregowych w Diamond. Podczas gdy manuskrypt i towarzyszące mu filmy powinny pozwolić użytkownikom na przeprowadzenie udanego eksperymentu SSX w I24, należy zauważyć, że jest to szybko rozwijająca się dziedzina, a podejścia stale ewoluują. Należy również zauważyć, że metody szeregowe są dostępne w innych źródłach synchrotronowych, w tym między innymi w Petra III (P14-TREXX), MAX IV (BioMAX)³³, SLS (PXI i PXII)³⁴ i NSLS (FMX)³⁵. Chociaż specyfika szeregowego gromadzenia i przetwarzania danych będzie się różnić w zależności od źródła, podstawowe zasady pozostaną takie same. Poniższe protokoły powinny być postrzegane jako punkt wyjścia i ścieżka do bazy, a nie szczyt tego, co można osiągnąć.

Ten protokół zakłada, że użytkownicy mają białkowy lub małocząsteczkowy system kryształowy, z którego wyprodukowano mikrokrystaliczną zawiesinę rzędu 0,5-2,0 ml o dobrej gęstości mikrokryształów na ml. Protokoły otrzymywania zawiesin kryształów zostały opisane wcześniej ³⁶. Dostępnych jest wiele różnych typów stałych celów, z których najczęściej używane w I24 wykorzystują precyzyjnie zdefiniowany układ krzemowy. W celu odróżnienia od innych układów chipów, poniżej i w interfejsie linii badawczej jest on określany jako "chip Oxford". Jak opisano wcześniej, układ chipowy Oxford składa się z 8×8 "bloków miejskich", z których każdy zawiera 20×20 otworów, co daje łącznie 25 600 otworów^20,21.

Protocol

1. Przygotowanie i ładowanie chipa

UWAGA: Proces zachodzi w środowisku o kontrolowanej wilgotności (Rysunek 1), zazwyczaj między 80% a 90% lub wyższą wilgotnością względną, aby zapobiec wysychaniu kryształów białka. Po załadowaniu i zapieczętowaniu kryształy mogą przetrwać nawet 24 godziny. Może się to jednak znacznie różnić w zależności od systemu kryształowego. W komorze wymagana jest pompa próżniowa o małej mocy podłączona do stopnia ładowania, w której znajduje się chip krzemowy (Rysunek 1), chip krzemowy, uchwyt na wióry z folią poliestrową (Rysunek 2), pipeta p200, końcówki do pipet 200 μl, pęseta, bibuła filtracyjna i zawiesina kryształów białka.

1. Przygotuj uchwyt na wióry.
   1. Pokrój dwa arkusze folii poliestrowej na kwadraty o wymiarach około 6 cm x 6 cm.
   2. Połóż arkusze poliestru na dwóch płytach podstawy (dużej i małej).
   3. Zamocuj arkusze poliestrowe na miejscu za pomocą metalowych pierścieni uszczelniających.
   4. Ostrożnie pociągnij za nadmiar folii poliestrowej, aby usunąć wszelkie zagniecenia i ułatwić późniejszą wizualizację i wyśrodkowanie próbek.
2. Wybierz chip krzemowy z aperturami o odpowiedniej wielkości (7-30 μm) w stosunku do wielkości kryształów.
3. Żar rozładowuje chip przez 25 sekund pod ciśnieniem 0,39 mBar i przy użyciu prądu 15 mA, aby umożliwić łatwe rozprowadzanie mikrokryształów na chipie.
4. Umieść chip silikonowy na etapie ładowania chipa za pomocą pęsety z podniesionymi prętami skierowanymi w dół.
5. Nanieść 200 μl zawiesiny mikrokrystalicznej na płaską stronę chipa za pomocą pipety.
6. Rozprowadź krystaliczną zawiesinę, aby pokryć wszystkie "bloki miejskie" chipa.
7. Jeśli chip jest uszkodzony, zakryj wszystkie otwory małym kawałkiem folii poliestrowej lub końcówką pipety filtrującej, aby zapewnić równomierne podciśnienie.
8. Zastosuj delikatne odkurzanie, aż cały nadmiar płynu zostanie zaessany przez chip.
9. Usuń wiór ze sceny ładowania wiórów za pomocą pęsety.
10. Ostrożnie osusz spód chipa bibułą filtracyjną, aby usunąć nadmiar płynu.
11. Umieść załadowany wiór na większej połowie uchwytu na wióry między znacznikami prowadzącymi płaską stroną do dołu.
12. Uszczelnij chip, umieszczając małą połowę uchwytu na wióry na górze.
    1. Dwie połówki uchwytu na wióry zatrzasną się na swoim miejscu. Jeśli druga połowa nie jest równo osadzona, obróć uchwyt o 180°, aby prawidłowo ustawić magnesy.
13. Przykręć uchwyt wióra sześciokątnymi, aby bezpiecznie zamocować wiór na miejscu.
    UWAGA: Alternatywnie, "bezwiórowy" chip może być załadowany w podobny sposób, z mniejszą objętością krystalicznej zawiesiny (~15 μL) umieszczoną między dwiema warstwami folii poliestrowej w uchwycie na wióry 37, lub mniejszą objętość można załadować za pomocą dwustronnego dystansu samoprzylepnego o grubości 50 μm nałożonego bezpośrednio na folię poliestrową, jak opisano wcześniej 38. Zastosowanie przekładek samoprzylepnych pozwala również na załadowanie wielu próbek (lub wariantów próbek, takich jak nasączenia ligandami) na każdy chip bez wiórów. Komplementarne podejście do ładowania wykorzystujące akustyczny wyrzut kropli (ADE) do ładowania chipów krzemowych może być również stosowane w Diamond³⁹. ADE umożliwia ładowanie wiórów przy użyciu mniejszych objętości zawiesiny krystalicznej niż ładowanie pipet. Jest to szczególnie przydatna technika, gdy próbki są rzadkie, chociaż należy wziąć pod uwagę skład chemiczny i lepkość gnojowicy.

2. GUI i ustawienia na linii badawczej

1. Wykonaj wszystkie wyrównania i ustawienia chipów w celu zbierania danych za pomocą prostego graficznego interfejsu użytkownika (GUI) EPICS Display Manager (edm) (Rysunek 3a). Zapewnia to interfejs typu "wskaż i kliknij" do oprzyrządowania linii badawczej i zapewnia parametry wejściowe do zbierania danych w oparciu o język Python. Okna podrzędne zapewniają dodatkową kontrolę nad pobieraniem próbek z podregionów uchwytu próbki (Rysunek 3b) lub eksperymentów z laserową/diodową sondą LED ( Rysunek 3c).

3. Wyrównywanie układu scalonego

1. Umieść załadowany chip na stoliku XYZ na linii badawczej (pokazanej na Rysunek 4a) za pomocą mocowań kinematycznych.
   1. Uważaj, aby nie ciągnąć stopni zgodnie z ich kierunkiem jazdy. Magnesy w mocowaniach kinematycznych są dość mocne, więc można to dość łatwo zrobić przez przypadek.
   2. Zbliżając się do uchwytu, uchwyt na wióry powinien być trzymany pod niewielkim kątem (±30°). Gdy magnesy się zetkną, pozwól uchwytowi na wióry obrócić się równolegle do podłogi (0°), a uchwyt na wióry zatrzaśnie się na swoim miejscu (Rysunek 4b).
   3. Podczas rozładowywania wióra postępuj zgodnie z odwrotną ścieżką. Obróć i odchyl wiór od stolików przed odciągnięciem uchwytu na wióry.
2. Korzystając z systemu podglądu na osi linii badawczej i graficznego interfejsu użytkownika wyrównania chipa, zlokalizuj lewy górny punkt odniesienia chipa. Fiducials to trzy kwadraty, dwa małe i jeden duży, ustawione względem siebie pod kątem prostym (Rysunek 5a). Chip jest podświetlany z tyłu, więc chip będzie wyglądał na ciemny, a otwory będą wyglądały na białe kwadraty.
3. Wyśrodkuj się na zerze odniesienia w X, Y i Z (Rysunek 5b). Wyrównaj X i Y, przesuwając odpowiednio w lewo/w prawo i w górę/w dół. Wyrównaj Z, przesuwając chip do wewnątrz i na zewnątrz ostrości.
4. Kliknij opcję Ustaw zero odniesienia.
5. Powtórz krok 3.2 dla pierwszego odniesienia (u góry po prawej, Rysunek 5c) i drugiego odniesienia (u dołu po lewej, Rysunek 5d), aby wyrównać wszystkie powierniki z wiązką promieniowania rentgenowskiego.
6. Wygeneruj macierz współrzędnych, naciskając przycisk make coordinate system, który oblicza przesunięcie, nachylenie, przechylenie i odchylenie chipa względem stopni, umożliwiając wykonanie wszystkich kolejnych ruchów w układzie współrzędnych chipa.
7. Kliknij przycisk Block Check (Sprawdzanie bloków), aby przesunąć stolik XYZ do pierwszej studni w każdym bloku miejskim w celu wizualnego potwierdzenia, że układ scalony jest dobrze wyrównany.
8. Jeśli celownik rentgenowski pokrywa się z otworami, chip jest wyrównany. Jeśli nie, powtórz kroki 3.2-3.3.
   UWAGI: W przypadku trudności z wyrównaniem (uszkodzone wzorce), różne otwory na chipie mogą być użyte do wyrównania za pomocą menu rozwijanego "typ wyrównania". Dostępnych jest wiele różnych typów chipów do zbierania danych o stałych celach. Różne typy żetonów są obsługiwane za pomocą menu rozwijanego "typ żetonu". Najpopularniejszymi typami chipów używanymi w I24 są chipy "Oxford" i "custom". Liczba i odstępy między otworami i powiernikami na chipie są odczytywane ze słownika chipów zdefiniowanego za pomocą menu rozwijanego. Niestandardowy chip umożliwia definiowanie odstępów między otworami w locie, co jest szczególnie przydatne w przypadku cienkowarstwowych chipów typu arkusz na arkuszu lub innych "bezwiórowych" chipów, w których kryształy są losowo rozmieszczone w poprzek uchwytu³⁷. Nowy graficzny interfejs użytkownika w Pythonie, oferujący funkcję "przesuń po kliknięciu" i automatyczne wyrównywanie chipów, jest obecnie w fazie rozwoju, ale nie jest jeszcze gotowy do rutynowego użycia w momencie pisania tego manuskryptu.

4. Konfiguracja zbierania danych

UWAGA: Konfiguracja zbierania danych będzie zależała od badanego systemu i eksperymentu, który ma być przeprowadzony. Może to być zarówno najprostszy eksperyment SSX, zbierający strukturę o niskiej dawce, jak i eksperyment z rozdzielczością czasową przy użyciu laserów lub szybkiego mieszania w celu zainicjowania reakcji, która będzie wymagała wielu kompletnych zestawów danych w różnych opóźnieniach czasowych. Aby skonfigurować zbieranie danych, należy zdefiniować następujące parametry.

1. Zmienne eksperymentalne: Wypełnij odpowiednio folder, nazwę pliku, czas ekspozycji, transmisję, odległość detektora i liczbę zdjęć na przysłonę.
2. Typ chipa: Jak opisano powyżej, dopasuj typ chipa do używanego chipa.
   1. Jeśli używany jest chip cienkowarstwowy lub "bezwiórowy", ustaw typ chipa na Brak.
   2. Zdefiniuj liczbę kroków i rozmiar kroku zarówno w x, jak i y w graficznym interfejsie użytkownika.
3. Ustaw typ mapy: pozwala to na wybranie podsekcji chipa do zbierania danych (Rysunek 3b). "Brak" oznacza, że dane są zbierane z każdej apertury chipa. "Lite" oznacza, że dane są zbierane z wybranych bloków miejskich na chipie (Rysunek 3b). Może to być przydatne, jeśli na przykład wiadomo, że obszar chipa jest słabo załadowany lub pusty. "Pełny" umożliwia wybór poszczególnych przysłon do zbierania danych. W takim przypadku należy dostarczyć poprawnie sformatowany plik tekstowy. Szczegóły oraz wzór można uzyskać od pracowników linii badawczej.
4. Pompa-sonda: Wybierz typ eksperymentu z sondą pompy i żądane opóźnienie czasowe. Wyzwolenie pompy (zwykle diody LED lub lasera) jest często specyficzne dla konkretnego eksperymentu, więc nie zostanie tutaj szczegółowo opisane.
   1. "Krótkie" opóźnienia odnoszą się do eksperymentów, w których na każdym otworze między pompą a sondą występuje przerwa (tj. pompa, sonda, "przejście do następnej próbki"). Opóźnienia są zwykle rzędu 1 sekundy lub kilkudziesięciu milisekund.
   2. Długie opóźnienia odnoszą się do strategii excite and visit again (EAVA), w której otwory są odwiedzane dwukrotnie, z określonym opóźnieniem czasowym między wizytami (tj. pompa, ruch, pompa, ruch, ruch, sonda, sonda, sonda itp.). Opóźnienie czasowe jest obliczane i czasy ekspozycji na promieniowanie rentgenowskie (Rysunek 3c) i zwykle wynosi ~1 sekundę lub więcej.

5. Typowe metody zbierania danych

UWAGA: Poniżej znajdują się kluczowe parametry, które definiują rodzaj przeprowadzanego eksperymentu. W tej sekcji założono, że inne ustawienia z protokołu 3 "Konfiguracja zbierania danych" zostały zdefiniowane.

1. Scenariusz 1: Gromadzenie danych dotyczących niskich dawek. Zbieranie pojedynczego obrazu dyfrakcyjnego z każdego wybranego otworu na uchwycie próbki.
   1. Ustaw liczbę zdjęć na przysłonę na 1.
   2. Ustaw sondę pompy na Brak.
2. Scenariusz 2: Seria dawek, zbierająca kolejno n obrazów z każdej wybranej apertury na uchwycie próbki. Chip jest nieruchomy na każdej aperturze, podczas gdy każdy zestaw n obrazów jest zbierany.
   1. Ustaw liczbę zdjęć na przysłonę na "n". Należy pamiętać, że przetwarzanie jest uproszczone, jeśli n = 5, 10, 20 lub inna wielokrotność 10. Trudno jest ustalić trendy, jeśli n < 5. Warto wziąć pod uwagę całkowity czas potrzebny na pokrycie chipa i liczbę plików graficznych tworzonych po zwiększeniu n.
   2. Ustaw sondę pompy na Brak.
3. Scenariusz 3: Metody pompa-sonda
   1. Wybierz metodę z menu rozwijanego Pump Probe (Sonda pompy), aby otworzyć Centrum Sterowania Wzbudzeniem Laserowym.
   2. W przypadku eksperymentu z sondą pompy wypełnij pole Laser Dwell przy każdej opcji przysłony.
   3. W przypadku EAVA wypełnij pole Zatrzymanie lasera przy każdej przysłonie i ekspozycji na promieniowanie rentgenowskie, a następnie kliknij przycisk Oblicz.
   4. Wybierz odpowiednią opcję Powtórz w menu rozwijanym sondy pompy z graficznym interfejsem użytkownika edm dla żądanego czasu opóźnienia.
   5. Jeśli eksperyment wymaga etapu wstępnego oświetlenia, wypełnij sekcję Laser 2 Dwell.
   6. Po zdefiniowaniu wszystkich zmiennych eksperymentalnych naciśnij Ustaw parametry i utwórz krótką listę. Spowoduje to załadowanie zmiennych eksperymentalnych do kontrolera geobrick. Po wykonaniu tej czynności naciśnięcie przycisku Start spowoduje wsunięcie czujnika, wyłączenie podświetlenia i rozpoczęcie zbierania danych. Na wszystkich etapach konfigurowania zbierania danych przydatne jest otwarte okno terminala, w którym drukowane są informacje zwrotne na temat stanu i wyniku każdego z kroków.

6. Przetwarzanie danych

UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, przetwarzanie danych można podzielić na trzy grupy w zależności od pilności, z jaką wymagana jest informacja zwrotna. Szybka informacja zwrotna jest potrzebna, aby pokazać, czy kryształy są obecne i ulegają dyfrakcji, a jeśli tak, to w jakiej liczbie. Powinno to nadążyć za gromadzeniem danych. Wykonywanie indeksowania i integracji danych, które może być wolniejsze, ale nadal powinno być wykonywane w porównywalnych skalach czasowych z gromadzeniem danych. Scalanie i skalowanie intensywności odbicia do pliku mtz w celu rozwiązania struktury i generowania map gęstości elektronów stanowi ostatni krok i może być jeszcze wolniejsze. Tutaj omówione zostaną początkowe potoki w I24 tylko dla pierwszych dwóch etapów, ponieważ są one wymagane do informacji zwrotnej w czasie rzeczywistym, aby pokierować eksperymentem, chociaż należy pamiętać, że metryki takie jak wskaźniki trafień i statystyki skalowania nie zastępują kontroli gęstości elektronów, która może stanowić jedyne potwierdzenie, że ligand się związał lub zaszła reakcja. w Crystallo.

1. Szybka informacja zwrotna
   1. W celu załadowania modułów przetwarzania danych należy załadować i24-ssx do terminala na dowolnej stacji roboczej beamline.
   2. Aby uruchomić analizę typu hit-finding wpisz i24-ssx /path/to/visit/directory/ do terminala: i24-ssx /dls/i24/data/2020/mx12345-6/
      UWAGA: Spowoduje to otwarcie trzech okien terminala, a po zapisaniu danych na dysku, graficznej reprezentacji wyników wyszukiwania punktów z integracji dyfrakcyjnej dla zaawansowanych źródeł światła (DIALS) ^40,41(Rysunek 6a).
      1. Ustawienia domyślne oceniają co 10^obraz i odświeżają się co kilka sekund, aby zminimalizować obciążenie obliczeniowe.
      2. Zmień wartość domyślną, dodając argument na końcu powyższego polecenia. Na przykład "i24-ssx /dls/i24/data/2020/mx12345-6 2" i24-ssx uruchomi wyszukiwanie trafień na co drugim obrazie. Może to jednak nadmiernie obciążyć klaster (zasób współdzielony!) i spowolnić czas przetwarzania. Wykres jest oznaczony kolorem na podstawie prawdopodobieństwa pomyślnego indeksowania, czerwony pokazuje, że znaleziono co najmniej 15 plamek Bragga (duża szansa na indeksowanie), niebieski pokazuje niewielką lub żadną użyteczną dyfrakcję.
      3. Przeglądaj interesujące obrazy dyfrakcyjne w przeglądarce obrazów DIALS, klikając miejsca w interfejsie wyszukiwarki miejsc.
2. Informacje zwrotne dotyczące indeksowania i integracji
   UWAGA: Indeksowanie i integracja danych dyfrakcyjnych odbywa się za pomocą DIALS za pomocą funkcji dials.still_process ^40,41. W związku z tym szczegółowe informacje dotyczące twojego kryształu (oczekiwana grupa przestrzeni kryształów, komórka elementarna i geometria eksperymentu) powinny być umieszczone w pliku tekstowym .phil.
   1. Załaduj moduły POKRĘTŁA, wpisując moduły ładowania diali w terminalu.
   2. Aby rozpocząć przetwarzanie zestawu danych, wpisz dials.still_process /path/to/images/ /pathto/phil- file.phil. Postęp wszystkich nadal przetwarzanych zbiorów danych można monitorować, uruchamiając skrypt stills_monitor, wpisując monitor_stills_process.py (po wykonaniu obciążenia modułu i24-ssx i zmianie katalogu na bieżącą wizytę) (Rysunek 6b).
   3. Rozkład komórek elementarnych indeksowanych danych dyfrakcyjnych (Rysunek 7a) można monitorować za pomocą polecenia ctbx.xfel.plot_uc_cloud_from_experiments/path/to/dials/output/*refined.expt combine_all_input=true Jest to szczególnie przydatne do identyfikowania i rozpoznawania polimorfów komórek elementarnych, jak omówiono wcześniej ⁴².
   4. 'Visualzie' czy i w jaki sposób ten rozkład zmienia się w ustalonym celu, tworząc wykres 2D (Rysunek 7b) za pomocą polecenia python pacman.py /visit/processing/_hit_finding/chip.out.
   5. Utwórz projekcje stereograficzne wszystkich indeksowanych danych dyfrakcyjnych (Rysunek 7c) za pomocą polecenia DIALS dials.stereographic_projection hkl= 0,0,1 expand_to_P 1 =True /path/to/dials/output/*refined.expt.
      UWAGA: Jest to powszechna patologia podczas przetwarzania danych nieruchomych z kryształów, w których symetria sieci Bravaisa jest wyższa niż symetria grupy przestrzennej, które łączą dane wyglądają jak idealne bliźniaki. Algorytmy przetwarzania danych ewoluowały, aby rozwiązać tę patologię ^43,44,45,46, ale użytkownicy powinni o tym pamiętać podczas przetwarzania swoich danych.

Results

Zbieranie danych o niskiej dawce i seria
Dane dotyczące niskiej dawki (Krok 5.1: Scenariusz 1) i serii dawek (Krok 5.2: Scenariusz 2) zostały zebrane na mikrokryształach reduktazy azotynu miedzi w I24 i zostały opublikowane wcześniej ⁴². Wszystkie próbki przygotowano zgodnie z opisem w kroku 1, dane zebrano zgodnie z krokami 3, 4 i 5 i przetworzono przy użyciu metod opisanych w kroku 6. W tej pracy zebrano serię szybkich dawek z 20 obrazami dyfrakcyjnymi wykonanymi przy każdej aperturze (tj. n = 20 w graficznym interfejsie użytkownika do zbierania danych pokazanym powyżej) przed przejściem do świeżej próbki. Na podstawie tych danych zidentyfikowano bimodalny rozkład komórek elementarnych w grupie przestrzennej P2₁3 (a = b = c = 97,25 A i a = b = c = 96,38 A). Identyfikacja i oddzielenie tych polimorfów komórek elementarnych do przetwarzania wykazało wyraźną poprawę wskaźników jakości danych i ujawniło dwie różne struktury w elastycznej pętli między pozostałościami 189-193 zamiast stanu mieszanego obserwowanego podczas przetwarzania wszystkich danych razem. Identyfikacja takich polimorfów może mieć ogromne znaczenie w delikatnym badaniu strukturalnym z rozdzielczością czasową, w którym spodziewane są tylko niewielkie zmiany strukturalne. Co więcej, zebrane serie dawek ujawniły zależną od dawki zmianę komórki elementarnej w krysztale, ze zwiększoną dawką przesuwającą populację na korzyść większej komórki elementarnej.

Podobną pracę wykonali Ebrahim et al (2019)⁴⁷, gdzie seria dawek (Krok 5.2: Scenariusz 2) została pobrana z barwnikowej peroksydazy hemowej ze Streptomyces lividans (DtpAa) w celu porównania struktur o niskiej dawce z SSX (Krok 5.1: Scenariusz 1) z tymi zmierzonymi w tym samym systemie stałego celu przy użyciu SFX. Dane SFX zostały zebrane na linii badawczej SACLA BL2 EH3 o długości impulsu 10 femtosekund i częstotliwości powtarzania 30 Hz. Czas trwania impulsu wynoszący 10 femtosekund zapewnia, że efekty zależne od dawki nie są obecne w danych SFX. Dane SFX porównano z danymi SSX zebranymi na linii badawczej I24, gdzie zmierzono 10 sekwencyjnych ekspozycji po 10 milisekund w każdej pozycji próbki (tj. n=10). Zaobserwowano zależną od dawki migrację cząsteczki wody skoordynowanej z żelazem hemowym od żelaza, a także zmianę konformacyjną w jednej z grup propionianu hemu w serii dawek SSX. Chociaż nie jest wolna od uszkodzeń, jak struktura SFX, seria dawek pozwoliła na ekstrapolację długości wiązania Fe-O w zestawie danych o zerowej dawce (hem żelazowy), przy czym zgadzało się to w granicach błędu eksperymentalnego z wartością uzyskaną z SFX.

Opisane tutaj metody zbierania danych krystalografii szeregowej mogą być również łatwo dostosowane do dostarczania nowych środowisk próbek, na przykład do badania beztlenowych struktur białkowych w temperaturze pokojowej. Jak opisano w Rabe i in. 2020 ⁴⁸, ładowanie próbki "arkusz po arkuszu" lub "chipa bez wiórów" z różnymi foliami uszczelniającymi w komorze beztlenowej umożliwia zbieranie danych strukturalnych w temperaturze pokojowej z próbek wrażliwych na dwutlen

.

Sonda pompy
Chociaż poniższe reprezentatywne wyniki nie zostały zebrane na linii badawczej Diamond Beamline I24, metody te zostały opracowane w ścisłej współpracy między placówkami uczestniczącymi w programie iNEXT w celu pracy nad standardowymi metodami rozwoju metod krystalografii szeregowej. Linia I24 oferuje lub wkrótce będzie oferować metody pobierania próbek równoważne do opisanych poniżej w celu wykonywania takich eksperymentów metodami opisanymi w powyższych protokołach.

Sonda pompy: Szybkie mieszanie
Szybkie mieszanie SSX zostało przeprowadzone na linii badawczej T-REXX w PETRA III przez Mehrabi i in. (2019) ²⁸ przy użyciu wtryskiwacza kropelkowego napędzanego piezoelektrycznie w celu zainicjowania reakcji na ustalonych celach. W niniejszej pracy przedstawiono dowód słuszności zasady eksperymentu z mieszaniem chipów wiążącego GlcNac₃z mikrokryształami lizozymu, przy czym wiązanie zachodzi w ciągu 50 ms od nałożenia kropli o stężeniu 75 pL na próbkę. Badanie to kontynuowano serią aktywności izomerazy ksylozy o 7 strukturach rozdzielczych, wykazując wiązanie glukozy w ciągu 15 ms i tworzenie konformacji otwartego pierścienia w cząsteczce glukozy po 60-sekundowym opóźnieniu. Równoważna konfiguracja do wstrzykiwania kropelek jest obecnie opracowywana do użytku w I24.

Sonda pompy: Aktywacja światła
Eksperyment szeregowy pompa-sonda aktywowana światłem została przedstawiona w Schulz et al (2018) ⁴⁹. Dehydrogenazę fluorooctanową nasączono fotoklatowanym fluorooctanem i przepompowano światłem laserowym o długości fali 320-360 nm w celu wytworzenia struktur w 4 punktach czasowych (t = 0, 30, 752 i 2 052 ms). Struktura stanu spoczynku (0 ms) pokazuje puste miejsce aktywne, z wyjątkiem kilku cząsteczek wody, i równoważną gęstość między domenami czapu obu podjednostek białkowych. Po 30 ms i 752 ms od aktywacji światłem można zaobserwować znaczne zmniejszenie gęstości elektronów w domenie czapu podjednostki B w stosunku do podjednostki A. Zmniejszenie gęstości elektronów w domenie kapu podjednostki B zbiega się z pojawieniem się fluorooctanu w miejscu aktywnym podjednostki A po 752 ms. Końcowy zestaw danych po 2052 ms pokazuje dalsze strukturalne przegrupowanie liganda, co do którego podejrzewa się, że ułatwia prawidłową geometrię dla ataku S_N2 i potencjalne tworzenie się stanu pośredniego w reakcji. W I24 przenośny system laserowy Pharos, który jest przestrajany w zakresie 210-2500 nm, zapewniając impulsy femtosekundowe, może być używany do aktywacji światła. Wstępne eksperymenty wykazały udaną aktywację fotoklatki za pomocą wzbudzenia 308 nm z wiązaniem uwolnionego liganda z obserwowanym białkiem docelowym. W chwili pisania tego tekstu integracja z systemem bezpieczeństwa personelu linii badawczej jest w toku, a rutynowe eksperymenty z użytkownikami planowane są na początek 2021 roku. W przypadku eksperymentów, w których wymagane są mniej intensywne impulsy światła, z powodzeniem przeprowadzono aktywację światła za pomocą diod LED sterowanych TTL.

Rysunek 1: Sprzęt do ładowania próbek w Diamond Light Source. Konfiguracja składa się z pompy próżniowej (a), schowka podręcznego (b) i nawilżacza (c). W komorze rękawicowej podciśnienie jest wykorzystywane do oddziaływania na wiór załadowany zawiesiną krystaliczną przechowywaną w bloku próbki (d) przymocowanym do kolby Büchnera (e, zielona strzałka), za pomocą regulatora ciśnienia (f, żółta strzałka) przymocowanego do kranu (g, niebieska strzałka). Wilgotne powietrze jest pompowane do namiotu przez plastikową rurkę dołączoną do nawilżacza (h) i mierzone za pomocą higrometru (i). Elementy są utrzymywane na miejscu za pomocą stojaków zaciskowych (j). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Uchwyty na próbki. Wykorzystują metalowy O-ring (a) do mocowania folii poliestrowej na górnej (b) i dolnej (c) połowie, przy czym dolna połowa ma mocowania magnetyczne (d), które służą do mocowania uchwytu próbki do stolików na próbki. Folia poliestrowa (6 μm (e) lub 3 μm (f)) oraz gumowe pierścienie uszczelniające o przekroju okrągłym (białe strzałki) zapobiegają szybkiemu wysychaniu wióra obciążonego kryształami w uchwycie na próbkę, który jest szczelnie zamknięty sześciokątnymi (g). Wióry są czyszczone za pomocą sekwencyjnych 15-minutowych kąpieli w dH₂O, 1 M HCl i dH₂O (h). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Graficzny interfejs użytkownika do zbierania danych o stałym celu w I24. (a) Pokazuje główny interfejs używany do wyrównywania układów scalonych i definiowania parametrów zbierania danych, (b) jest interfejsem mapowania używanym do definiowania podregionów chipa do zbierania danych i (c) jest interfejsem do definiowania parametrów oświetlenia laserowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Proces montażu uchwytu na żetony na stopniach opisany w Kroku 3, punkt 1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Wyrównanie wiórów. Żeton jest wyrównywany poprzez kliknięcie na trzy znaczniki odniesienia na żetonie pokazane w lit. a). Widoki powierników 0, 1 i 2 przez system podglądu na osi linii badawczej przedstawiono w punktach (b), (c) i (d). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Automatyczne przetwarzanie wyników jest uruchamiane zgodnie z opisem w kroku 6.1. Wyświetlany jest aktualizowany wykres współczynnika trafień (a, wstawka). Jeśli kliknie się na "trafienie", odpowiedni obraz dyfrakcyjny zostanie wyświetlony w przeglądarce obrazów tarcz. Pokazany jest współczynnik trafień dla bieżącego zbioru danych (29,6% w tym przykładzie). Panel (b) przedstawia przykładowe okno pokazujące aktualne wskaźniki indeksowania i integracji dla danych zebranych do tej pory podczas wizyty, które aktualizują się w czasie rzeczywistym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Bardziej szczegółowa analiza danych. Wizualizacja parametrów komórki elementarnej może ujawnić polimorfy (a). Obliczane są średnie parametry komórki elementarnej; Nie dotyczy to jednak jeszcze indywidualnych średnich dla polimorfów. Wizualizacja niewielkiego podzbioru danych (pokazane dane to podzbiór 793 kryształów reduktazy azotynu miedzi z danych opisanych w Ebrahim i in. 2019) jest często wystarczająca do ujawnienia trendów. Można również tworzyć wykresy 2D użytecznych parametrów, aby ujawnić zmiany powstające w wyniku efektów obciążenia lub odwodnienia, które można rozwiązać w nadchodzących zbiorach danych (b). Projekcje stereograficzne mogą ujawnić obecność lub brak preferowanych orientacji przekazywanych z powrotem do protokołu ładowania (c). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Szeregowe zbieranie danych synchrotronowych jest stosunkowo nową techniką na liniach badawczych MX, wypełniającą lukę między ultraszybkimi zbieraniami danych wykonywanymi obecnie na XFEL a tradycyjnymi synchrotronami MX. Niniejszy manuskrypt ma na celu przedstawienie przeglądu tego, jak skutecznie zbierać dane szeregowe o ustalonym celu na linii badawczej I24, Diamond Light Source dla niskich dawek, serii dawek i eksperymentów z rozdzielczością czasową. Podobnie jak w przypadku standardowej krystalografii, przygotowanie próbki jest głównym wąskim gardłem w roztworze strukturalnym. Nie inaczej jest w przypadku SSX, a przygotowanie jednorodnej zawiesiny kryształów w wystarczających ilościach nie skorzystało jeszcze z kilkudziesięciu lat badań i udoskonaleń, tak jak wzrost pojedynczych dużych kryształów białkowych. Przygotowanie tych gnojowic wykracza jednak poza zakres niniejszego artykułu i zostało podsumowane w innym miejscu³⁶. Krytyczny krok w opisanym tutaj podejściu polega na starannym wykorzystaniu dostępnej próbki przy użyciu łatwych w użyciu interfejsów GUI (krok 3) i zautomatyzowanych potoków przetwarzania danych (krok 6) w celu poinformowania o ładowaniu chipów (krok 1) i o tym, jak powinien przebiegać eksperyment.

Szybki potok informacji zwrotnych to potężne narzędzie, które pozwala użytkownikom ocenić początkowe wskaźniki trafień podczas zbierania danych w celu poinformowania o kolejnych protokołach ładowania chipów w celu pomyślnego gromadzenia danych. W obliczu niskiego współczynnika trafień (<5%) użytkownicy ryzykują zbieranie niekompletnych danych i/lub marnowanie czasu na dodatkowe kolekcje. W takim przypadku próbkę można połączyć, zagęścić przez delikatne odwirowanie i/lub załadować większe objętości w kroku 1.5. Wyższy współczynnik trafień jest ogólnie korzystny, jednak istnieje punkt malejącego zwrotu, w którym przeciążenie prowadzi do wielu kryształów w tej samej studni. DIALS jest w stanie poradzić sobie z danymi dyfrakcji wielosieciowej⁵⁰, ale większym problemem niż indeksowanie i integracja jest szkodliwy wpływ, jaki grupowanie kryształów może mieć na równomierną aktywację kryształów przez światło laserowe lub szybkie mieszanie w celu precyzyjnych eksperymentów z rozdzielczością czasową. W związku z tym należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć przeciążenia ustalonych celów dla eksperymentów z rozdzielczością czasową.

Etap przetwarzania indeksowania i całkowania tworzy wykres, na którym środkowy krzyż reprezentuje kierunek belki, każdy punkt reprezentuje kierunek odbicia poszczególnych sieci hkl 001, a zewnętrzny pierścień okręgu reprezentuje obrót o 90° od osi belki. Pokaże to, czy twoje kryształy mają preferowaną orientację, co może mieć wpływ na kompletność danych i wskazywać na potrzebę zebrania większej ilości danych lub zmiany protokołu ładowania. W lewym panelu rysunku 7c pokazano efekt przeciążenia układu scalonego kryształami HEWL. Gdy otwory wypełniają się większą liczbą kryształów, przylegają one do kątowych ścianek otworów, zamiast klinować się u podstawy w losowej orientacji. Dwie ortogonalne elipsy są wynikiem kryształów leżących na wewnętrznych ściankach chipa, które znajdują się pod kątem ~35° w kierunku wiązki. Zmniejsza to objętość ładowanych kryształów, zmniejsza współczynnik trafień i radykalnie zmniejsza frakcję kryształów leżących w tych preferowanych płaszczyznach.

Należy zauważyć, że w I24 dostępne są inne podejścia seryjne, takie jak wytłaczarki LCP i chipy mikroprzepływowe. Używają one podobnych graficznych interfejsów użytkownika i tych samych potoków przetwarzania, więc wiele z powyższych będzie miało zastosowanie, nawet jeśli zostanie użyta inna technika. Istnieje wiele podejść szeregowych zarówno dla SSX, jak i SFX, poza opisanym tutaj podejściem do stałego celu, każde z nich ma pewne zalety w zależności od eksperymentu, który ma być przeprowadzony, i linii badawczej użytej w eksperymencie. Ponieważ podejścia seryjne szybko się rozwijają, zaleca się sprawdzanie najnowszych aktualizacji na stronach internetowych linii badawczych (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/I24.html) i rozmowę z personelem linii badawczej na jak najwcześniejszym etapie planowania czasu badania. Dostęp do I24 dla eksperymentów standardowych i seryjnych jest bezpłatny w miejscu użytkowania. W przypadku użytkowników z Wielkiej Brytanii i UE koszty podróży i zakwaterowania są częściowo pokrywane przez iNEXT Discovery.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Uchwyty na chipy	Wykonane na zamówienie	Nie dotyczy	Własna, niestandardowa metalowa podstawa składająca się z 2 magnetycznych płyt podstawy, 2 metalowych pierścieni i mocowania kinematycznego.
Bezwiórowe przekładki dystansowe	SWISCII	N/A	LCP arkusze samoprzylepne dostępne w asortymencie modułowym LCP
Geobrick LV-IMS-II	Delta Tau	N/A	A  wieloosiowy kontroler/wzmacniacz z niestandardową konfiguracją sprzętową Diamond Light
Source Kinematic Mounts	ThorLabs	KB25/M	Kwadratowe podstawy z 3 magnesami ułożonymi w trójkąt przymocowanymi do uchwytów na chipy.
Pompa próżniowa KNF Laboport Merck		Z262285-1EA	Pompa próżniowa ze stałego PTFE, prędkość pompowania 10 l/min.
Arkusze Mylar 6 i mikro; m	Fisher Scientific	15360562	300 ft rolka 6 &; Folia XRF z mylaru o grubości m firmy SPEX SamplePrep
Mylar Sheets 3 i mikro; m	Fisher Scientific	04-675-4	300 ft rolka 3 & mikro; m gruba mylarowa folia XRF firmy SPEX SamplePrep
Pelco easiGlow Glow Discharge System	Ted Pella, INC.	91000	Kompaktowy, samodzielny system wyładowań jarzeniowych używany do produkcji powierzchni hydrofilowych
Chipy krzemowe	University of Southampton	N/A	Niestandardowe wytrawione chipy silikonowe z otworami 25,6000 dostępne w różnych rozmiarach.
Etapy translacji	Smaract	N/A	XYZ to wspólny projekt Diamond Light Source i SmarAct, zbudowany na zamówienie przez SmarAct, wykorzystujący trzy liniowe stopnie przesuwu 50 mm, precyzyjne skrzyżowane prowadnice rolkowe i zintegrowany czujnik o rozdzielczości do 1 nm
Nawilżacz 1byOne (701UK-0003 )	1byOne	B01DENO0EQ	Dostępny w handlu nawilżacz ultradźwiękowy o pojemności 1,3 litra