Ten protokół opisuje metodę generowania dużych ilości mikropęcherzyków dekafluorobutanu zamkniętych w lipidach za pomocą sonikacji końcówki sondy, a następnie kondensacji ich w nanokropelki z przesunięciem fazowym za pomocą wytłaczania wysokociśnieniowego i filtracji mechanicznej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Produkcja nanokropelek dekafluorobutanu z filtrem membranowym z przesunięciem fazowym z wstępnie uformowanych mikropęcherzyków
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Istnieje wiele metod, które mogą być użyte do produkcji parowalnych kropelek przesunięcia fazowego do obrazowania i terapii. Każda metoda wykorzystuje różne techniki i różni się ceną, materiałami i przeznaczeniem. Wiele z tych metod wytwarzania prowadzi do powstania populacji polidyspersyjnych o niejednorodnych progach aktywacji. Ponadto kontrolowanie wielkości kropel zazwyczaj wymaga stabilnych cieczy perfluorowęglowodorowych o wysokich progach aktywacji, które nie są praktyczne in vivo. Wytwarzanie jednolitych rozmiarów kropel przy użyciu gazów o niskiej temperaturze wrzenia byłoby korzystne dla eksperymentów z obrazowaniem i terapią in vivo. W artykule opisano prostą i ekonomiczną metodę tworzenia filtrowanych pod względem wielkości, stabilizowanych lipidowo nanokropel przesunięcia fazowego z dekafluorobutanem o niskiej temperaturze wrzenia (DFB). Opisano powszechną metodę generowania mikropęcherzyków lipidowych, a także nowatorską metodę ich kondensacji za pomocą wytłaczania pod wysokim ciśnieniem w jednym kroku. Metoda ta ma na celu zaoszczędzenie czasu, maksymalizację wydajności i generowanie większych objętości roztworów mikropęcherzyków i nanokropel do szerokiej gamy zastosowań przy użyciu powszechnego sprzętu laboratoryjnego znajdującego się w wielu laboratoriach biologicznych.
Wprowadzenie
Środki kontrastowe do badań ultrasonograficznych (UCA) zyskują na popularności w zastosowaniach obrazowych i terapeutycznych. Mikropęcherzyki, pierwotne UCA, są obecnie głównymi środkami stosowanymi w diagnostyce klinicznej. Mikropęcherzyki to wypełnione gazem sfery, zazwyczaj o średnicy 1-10 µm, otoczone powłokami lipidowymi, białkowymi lub polimerowymi1. Jednak ich rozmiar i stabilność in vivo mogą ograniczać ich funkcjonalność w wielu zastosowaniach. Nanokrople przesunięcia fazowego, zawierające rdzeń z przegrzanej cieczy, mogą przezwyciężyć niektóre z tych ograniczeń dzięki mniejszym rozmiarom i wydłużonemu czasowi krążenia
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie filmów lipidowych
- Przygotuj filmy lipidowe do generowania mikropęcherzyków, używając 90% DSPC i 10% DSPE-PEG2K, mieszając lipidy w odpowiednim stosunku zgodnie z poniższymi instrukcjami:
- Przygotuj roztwory zapasowe lipidów DSPC i DSPE-PEG2K w chloroformie. Odważ 50 mg każdego z proszków lipidowych do oddzielnych fiolek. Do każdej fiolki dodaj 1 mL chloroformu, używając szklanej strzykawki o pojemności 1 mL.
- Za pomocą szklanej strzykawki dodaj 287 µL roztworu zapasowego DSPC oraz 113 µL roztworu zapasowego DSPE-PEG2K (oba o stężeniu 50 mg/mL) do 20 mL fiolki scyntylacyjnej.
- Wysusz zmieszane lipidy w celu us....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Reprezentatywne wyniki rozkładu wielkości uzyskano przy użyciu dynamicznego rozpraszania światła (DLS) oraz analizy pomiaru impulsu rezystancyjnego z regulowaną aperturą (TRPS). Rysunek 5 przedstawia rozkład wielkości kondensowanych roztworów bąbelków z ekstruzją i bez niej. W przypadku braku ekstruzji protokół kończy się na kroku 5.3. Schłodzone bąbelki kondensuje się poprzez wystawienie próbki na ciśnienie atmosferyczne w niskiej temperaturze. Próbka poddana jedynie kondensacji wykazuje zn.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Dostępna jest obszerna literatura, która omawia formułę, fizykę i potencjalne zastosowania mikropęcherzyków i kropel z przesunięciem fazowym w obrazowaniu i terapii in vivo. Dyskusja ta dotyczy wyraźnie generowania mikropęcherzyków lipidowych i przekształcania ich w submikronowe kropelki przesunięcia fazowego przy użyciu gazu DFB o niskiej temperaturze wrzenia i wytłaczania pod wysokim ciśnieniem. Opisana tutaj metoda ma na celu zapewnienie stosunkowo prostej metody wytwarzania dużych ilości mikropęcherzyków lipidowych i.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Dominique James z laboratorium dr Kena Hoyta za dostarczenie analizy TRSP waporyzowalnych nanokropel z przesunięciem fazowym
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 15 ml Probówki wirówkowe | Falcon | 352095 | Zbieranie i odwirowywanie kropel |
| Filtr poliwęglanowy 200 nm | Whatman | 110606 | Filtry do wytłaczarki |
| 2-metylobutan | Fisher Chemical | 03551-4 | Szybkie wstępne chłodzenie roztworu mikropęcherzyków przed wytłaczaniem |
| 3-bolcowe zaciski X2 | Fisher | 02-217-002 | Utrzymywanie fiolek do scyntylacji na miejscu do sonikacji końcówki sondy |
| 400W Analogowy sonator końcówki sondy z klaksonem | Branson | 101-063-198R | Służy do generowania mikropęcherzyków lipidowych z roztworu lipidowego |
| Sonicator do kąpieli | Fisher Scientific | 15337402 | Służy do pomocy w rozkładzie liposomów na pęcherzyki jednowarstwowe |
| Bioresole Fisher | Chloroform C298-4 | Służy do wytwarzania filmu lipidowego do przygotowania mikropęcherzyków | |
| Dekafluorobutan (perfluorobutan) Gaz | FluoroMed L.P. | 1 kg | generujący mikropęcherzyki za pomocą sonikacji końcówki sondy |
| Suchy lód | - | szybkie wstępne chłodzenie roztworu mikropęcherzyków przed wytłaczaniem | |
| DSPC Lipid Powder | NOF America | COATSOME MC-8080 | Składnik filmu lipidowego |
| DSPE-PEG-2K Lipid Powder | NOF America | SUNBRIGHT DSPE-020CN | Składnik filmu lipidowego |
| Termometr ogólny | - | - | Służy do pomiaru temperatury łaźni lodowej i temperatury 2-metylobutanu (musi dostosować się do temperatur -20C) |
| Szklane strzykawki | Hamilton | 81139 | Służy do mieszania lipidów w chloroformie |
| Glicerol | Fisher Bioreagents | BP229-1 | Obniża temperaturę zamarzania roztworu PBS |
| Blok grzewczy | VWR Scientific Products | Podgrzewanie filmów lipidowych i parowanie kropelek | |
| Lipex 10 wytłaczarka ml | Evonik | Komercyjny system wytłaczania wysokociśnieniowego | |
| Mini Vortex Mixer | Marka Fisher | 14-955-151 | Służy do usuwania nadmiaru chloroformu z folii lipidowych |
| Zbiornik azotu | - | Używany do obsługi wytłaczarki | |
| Bufor fosforanowy Saline | Fisher Scientific | Hydrate folie lipidowe i kropelki do prania | |
| Poliestrowy dysk | spustowyWhatman | 230600 | Zapewnia wsparcie dla filtra poliwęglanowego |
| Nasadki polipropylenowe | Fisher Scientific | 298417 | Służy do przechowywania roztworu |
| Glikol propylenowy | Fisher Chemical | P355-1 | Obniża temperaturę zamarzania roztworu PBS |
| Fiolki do scyntylacji | DWK Nauki Przyrodnicze Wheaton | 986532 | Służy do tworzenia filmów lipidowych i generowania mikropęcherzyków |
| Mały młotek | - | służy do rozbijania suchego lodu do chłodzenia metylobutanu | |
| Sonicator Nasadka do mikrokońcówek | Branson | 101148070 | Służy do generowania mikropęcherzyków z roztworu lipidów |
| Pojemnik stalowy | Medegen | 79310 | Szybkie wstępne chłodzenie roztworu mikropęcherzyków przed wytłaczaniem (będzie działał dowolny pojemnik o temperaturze -20C) |
| Eksykator próżniowy | Bel-Art SP Scienceware | 08-648-100 | Usuwa nadmiar chloroformu z filmów lipidowych |
| 2 ml probówka wirówkowa | Fisher | 02682004 | Służy do zagęszczania nanokropel |
Bibliografia
- Sirsi, S., Borden, M. Microbubble compositions, properties and biomedical applications. Bubble Science Engineering and Technology. 1 (1-2), 3-17 (2009).
- Sheeran, P. S., Dayton, P. A. Phase-change contrast agents for imaging and therapy. Current ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
