Produkcja nanokropelek dekafluorobutanu z filtrem membranowym z przesunięciem fazowym z wstępnie uformowanych mikropęcherzyków

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę generowania dużych ilości mikropęcherzyków dekafluorobutanu zamkniętych w lipidach za pomocą sonikacji końcówki sondy, a następnie kondensacji ich w nanokropelki z przesunięciem fazowym za pomocą wytłaczania wysokociśnieniowego i filtracji mechanicznej.

Streszczenie

Istnieje wiele metod, które mogą być użyte do produkcji parowalnych kropelek przesunięcia fazowego do obrazowania i terapii. Każda metoda wykorzystuje różne techniki i różni się ceną, materiałami i przeznaczeniem. Wiele z tych metod wytwarzania prowadzi do powstania populacji polidyspersyjnych o niejednorodnych progach aktywacji. Ponadto kontrolowanie wielkości kropel zazwyczaj wymaga stabilnych cieczy perfluorowęglowodorowych o wysokich progach aktywacji, które nie są praktyczne in vivo. Wytwarzanie jednolitych rozmiarów kropel przy użyciu gazów o niskiej temperaturze wrzenia byłoby korzystne dla eksperymentów z obrazowaniem i terapią in vivo. W artykule opisano prostą i ekonomiczną metodę tworzenia filtrowanych pod względem wielkości, stabilizowanych lipidowo nanokropel przesunięcia fazowego z dekafluorobutanem o niskiej temperaturze wrzenia (DFB). Opisano powszechną metodę generowania mikropęcherzyków lipidowych, a także nowatorską metodę ich kondensacji za pomocą wytłaczania pod wysokim ciśnieniem w jednym kroku. Metoda ta ma na celu zaoszczędzenie czasu, maksymalizację wydajności i generowanie większych objętości roztworów mikropęcherzyków i nanokropel do szerokiej gamy zastosowań przy użyciu powszechnego sprzętu laboratoryjnego znajdującego się w wielu laboratoriach biologicznych.

Wprowadzenie

Ultradźwiękowe środki kontrastowe (UCA) szybko zyskują na popularności w zastosowaniach obrazowych i terapeutycznych. Mikropęcherzyki, pierwotne UCA, są obecnie głównymi środkami stosowanymi w klinicznych zastosowaniach diagnostycznych. Mikropęcherzyki to wypełnione gazem kule, zwykle o średnicy 1-10 μm, otoczone otoczkami lipidowymi, białkowymi lub polimerowymi¹. Jednak ich rozmiar i stabilność in vivo mogą ograniczać ich funkcjonalność w wielu zastosowaniach. Nanokropelki z przesunięciem fazowym, które zawierają przegrzany płynny rdzeń, mogą przezwyciężyć niektóre z tych ograniczeń ze względu na ich mniejszy rozmiar i lepszą żywotność krążenia². Pod wpływem ciepła lub energii akustycznej przegrzany rdzeń cieczy odparowuje, tworząc mikropęcherzyk gazu^2,3,4,5. Ponieważ próg parowania jest bezpośrednio związany z rozmiarem kropli^5,6, formułowanie zawiesin kropel o jednolitej wielkości byłoby wysoce pożądane dla osiągnięcia spójnych progów aktywacji. Metody formulacji, które dają jednolite rozmiary kropel, są często skomplikowane i kosztowne, podczas gdy bardziej opłacalne podejścia prowadzą do roztworów polidyspersyjnych⁷. Kolejnym ograniczeniem jest zdolność do generowania stabilnych kropel z przesunięciem fazowym za pomocą gazów perfluorowęglowodorowych (PFC) o niskiej temperaturze wrzenia, co ma kluczowe znaczenie dla efektywnej aktywacji in vivo⁸. W tym manuskrypcie opisano protokół generowania stabilnych, filtrowanych, odparowujących kropel o niskiej temperaturze wrzenia, z przesunięciem fazowym, do zastosowań w obrazowaniu in vivo i terapii.

Istnieje wiele metod wytwarzania monorozproszonych submikronowych kropel z przesunięciem fazowym⁷. Jedną z najbardziej niezawodnych metod kontrolowania wielkości jest użycie urządzeń mikroprzepływowych. Urządzenia te mogą być kosztowne, mają powolne tempo produkcji kropel (~10^{4-10 6} kropli/s)⁷ i wymagają intensywnego szkolenia. Urządzenia mikroprzepływowe zazwyczaj wymagają również gazów o wysokiej temperaturze wrzenia, aby uniknąć spontanicznego parowania i zatykania systemu⁷. Jednak niedawne badanie przeprowadzone przez de Gracia Lux i wsp.^{9 pokazuje,} w jaki sposób chłodzenie mikrofluidyzatora może być wykorzystane do generowania wysokich stężeń submikronowego przesunięcia fazowego (10^{10-10 12}/ml) przy użyciu dekafluorobutanu o niskiej temperaturze wrzenia (DFB) lub oktafluoropropanu (OFP).

Ogólnie rzecz biorąc, gazy o niskiej temperaturze wrzenia, takie jak DFB lub OFP, są łatwiejsze w obsłudze przy użyciu wstępnie uformowanych pęcherzyków gazu. Kropelki do odparowania mogą być wytwarzane z prekursorów stabilizowanych lipidami pęcherzyków poprzez kondensację gazu przy użyciu niskich temperatur i podwyższonego ciśnienia^5,10. Stężenie kropelek wytwarzanych tą metodą zależy od stężenia mikropęcherzyków prekursora i skuteczności konwersji pęcherzyków w kropelki. Skoncentrowane mikropęcherzyki zostały zgłoszone z sonikacji końcówki zbliżającej się do >^{10 10} MB/mL¹¹, podczas gdy inne badanie wykazało stężenia kropelek w zakresie od ~1-3 x10¹¹ kropel/ml ze skondensowanych pęcherzyków OFP i DFP¹². Gdy monorozproszone kropelki nie stanowią problemu, metody kondensacji są najprostszymi i najtańszymi metodami generowania stabilizowanych lipidami kropel przesunięcia fazowego przy użyciu niskowrzących PFC. Metody generowania pęcherzyków o jednolitej wielkości przed kondensacją mogą pomóc w tworzeniu bardziej monodyspersyjnych populacji kropel. Jednak generowanie monodyspersyjnych pęcherzyków prekursorowych jest również trudne, co wymaga bardziej kosztownych podejść, takich jak mikrofluidyka lub techniki wielokrotnego wirowania różnicowego¹¹. Alternatywne podejście do wytwarzania nanokropel DFB i OFB zostało niedawno opublikowane przy użyciu spontanicznego zarodkowania kropel w liposomach¹³. Ta metoda, wykorzystująca efekt "Ouzo", jest prostym sposobem na generowanie kropelek PFC o niskiej temperaturze wrzenia bez konieczności kondensacji pęcherzyków. Rozkład wielkości kropelek PFC można kontrolować za pomocą delikatnego miareczkowania i mieszania składników PFC, lipidów i etanolu stosowanych do inicjacji zarodkowania kropel. Warto również zauważyć, że mieszanie perfluorowęglowodorów może być stosowane do kontrolowania stabilności i progów aktywacji nanokropel^14,15. Nowsze prace Shakya i in. pokazują, w jaki sposób można dostroić aktywację nanokropel poprzez emulgowanie PFC o wysokiej temperaturze wrzenia w endoszkielecie węglowodorowym, aby ułatwić heterogeniczne zarodkowanie w rdzeniu kropli¹⁶, co jest podejściem, które można rozważyć wraz z innymi formami filtracji wielkości kropel.

Po uformowaniu, krople przesunięcia fazowego mogą być wytłaczane po utworzeniu, aby stworzyć więcej monorozproszonych populacji. W rzeczywistości podobny protokół do opisanej tutaj metody został wcześniej opublikowany przez Kopechek et al.¹⁷ przy użyciu dodekofluorpentanu o wysokiej temperaturze wrzenia (DDFP) jako rdzenia kropli. Czytelnicy chcący użyć kropel z przesunięciem fazowym z perfluorowęglowodorami o wysokiej temperaturze wrzenia (stabilnymi w temperaturze pokojowej) powinni zamiast tego zapoznać się z powyższym artykułem. Wytwarzanie i wytłaczanie kropel z gazami o niskiej temperaturze wrzenia, takimi jak DFB i OFP, jest bardziej skomplikowane i najlepiej podejść do niego poprzez kondensację wstępnie uformowanych pęcherzyków gazu.

W tym protokole opisana jest powszechna metoda generowania wstępnie uformowanych mikropęcherzyków lipidowych z rdzeniem gazowym DFB za pomocą sonikacji końcówki sondy. Następnie komercyjna wytłaczarka jest używana do kondensacji wstępnie uformowanych mikropęcherzyków w submikronowe nanokropelki z przesunięciem fazowym (Rysunek 1). Powstałe kropelki są następnie aktywowane przez ciepło i ultradźwięki. Metoda ta może wytwarzać większe objętości roztworu nanokropel niż konwencjonalne metody kondensacji z węższymi rozkładami wielkości bez konieczności stosowania drogich urządzeń mikroprzepływowych. Produkcja roztworów nanokropel o wąskim rozkładzie wielkości może prawdopodobnie generować bardziej jednolite progi parowania. Pozwoli to zmaksymalizować ich potencjał w wielu zastosowaniach, takich jak obrazowanie, ablacja, dostarczanie leków i embolizacja^1,3,4,6.

Rysunek 1: Schemat konfiguracji wytłaczania pod wysokim ciśnieniem do kondensacji wstępnie uformowanych mikropęcherzyków w nanokropelki z przesunięciem fazowym. Roztwór mikropęcherzyków jest dodawany i przechowywany w komorze wytłaczarki, a 250 psi ze zbiornika azotu jest podawane przez zawór wlotowy komory. Gazowy azot przepchnie roztwór mikropęcherzyków przez filtr u podstawy komory, kondensując próbkę do nanokropel. Roztwór jest ostatecznie wypychany z ekstrudera przez rurkę wylotową próbki i zbierany. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

1. Tworzenie filmów lipidowych

1. Przygotuj folie lipidowe do generowania mikropęcherzyków przy użyciu 90% DSPC i 10% DSPE-PEG2K, mieszając lipidy w odpowiednich proporcjach, postępując zgodnie z poniższymi wskazówkami:
   1. Zrób lipidy zapasowe DSPC i DSPE-PEG2K w chloroformie. Odważyć 50 mg każdego proszku lipidowego w oddzielnych fiolkach. Dodać 1 ml chloroformu do każdej fiolki za pomocą szklanej strzykawki o pojemności 1 ml.
   2. Dodać 287 μl bulionu DSPC i 113 μl bulionu DSPE-PEG2K (oba 50 mg/ml) do 20 ml fiolki scyntylacyjnej za pomocą szklanej strzykawki.
   3. Wysuszyć zmieszane lipidy, aby usunąć chloroform za pomocą azotu. Używając odpowiedniej długości rurki podłączonej do azotu w domu, delikatnie przelej azot gazowy przez przestrzeń nad fiolką podczas mieszania. Kontynuuj, aż nie zaobserwuje się chloroformu, a pozostały film lipidowy zacznie zmieniać kolor na biały. Użyć polipropylenowych zakrętek, przykryć próbkę, wprowadzając azot do przestrzeni nad roztworem.
   4. Umieścić fiolki w próżni na noc za pomocą eksykatora próżniowego w celu usunięcia pozostałości chloroformu. Pozostanie cienka półprzezroczysta warstwa, która pokryje dno fiolki.
   5. Przechowywać fiolki w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą potrzebne.

2. Generowanie mikropęcherzyków z filmów lipidowych

1. Aby uzyskać mikropęcherzyki, dodaj 10 ml 1x buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS) zawierającego 20% v/v glikolu propylenowego i 20% v/v glicerolu (końcowe pH 7,2-7,4) do suchego filmu lipidowego.
2. Ponownie zamknąć próbkę i ogrzać ją do temperatury 65 °C przez 30 minut na bloku grzewczym (lub podgrzewanej łaźni wodnej).
3. Podczas podgrzewania próbki należy przygotować sonograf do kąpieli, zwiększając temperaturę kąpieli do 65 °C.
   UWAGA: Proces ten jest szybszy, jeśli woda jest wstępnie podgrzana w kuchence mikrofalowej lub płycie grzejnej przed umieszczeniem w sonikatorze kąpielowym.
4. Umieścić fiolkę scyntylacyjną zawierającą podgrzaną próbkę w sonikatorze kąpielowym tak, aby tylko część fiolki zawierająca roztwór lipidów była zanurzona w łaźni wodnej.
5. Roztworu lipidów należy poddać sonizacji przez co najmniej 15 minut. Upewnij się, że temperatura wody utrzymuje się na poziomie 65 °C. Kontynuuj sonikację w odstępach 10-15 minut, aż roztwór będzie całkowicie klarowny (Rysunek 2).
   UWAGA: Jeśli sonograf do kąpieli nie jest dostępny, roztwór można poddać sonikacji końcówką z mocą 10%, aż do uzyskania czystości. Jednak mikrokońcówka zużywa się szybciej i jest droższa w wymianie.

Rysunek 2: Przykład uwodnionych warstw lipidowych. Przykład uwodnionego filmu lipidowego (A) przed i (B) po sonikacji w kąpieli w celu utworzenia jednopłytkowych pęcherzyków. Po sonikacji w kąpieli roztwór lipidowy powinien zmienić się z bardziej nieprzezroczystego na półprzezroczysty. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Gdy jest jeszcze ciepły, zdejmij nakrętkę i zaciśnij fiolkę w dźwiękoszczelnej obudowie sonikatora, tak aby nasadka mikrokońcówki sonitora była zanurzona tuż pod interfejsem powietrze/ciecz (Rysunek 3).
7. Umieść zbiornik z dekafluorobutanem obok dźwiękoszczelnej obudowy sonikatora.
8. Przygotuj łaźnię lodową i umieść ją obok dźwiękoszczelnej obudowy. Zostanie to użyte w dalszej części kroku 2.14.
9. Włącz wyłącznik zasilania sonikatora.
10. Po uruchomieniu systemu ustaw poziom mocy na 70%. Nie przekraczaj 70% amplituda z nasadką do mikrokońcówek. Nie uruchamiaj sonikatora w tym czasie.
11. Podłącz rurkę o odpowiedniej długości, aby poprowadzić gaz z wylotu zbiornika DFB do ciepłego roztworu lipidowego znajdującego się w obudowie. Rurkę należy umieścić tuż w szyjce fiolki, aby umożliwić przepływ gazu do przestrzeni nad głową podczas sonikacji (Rysunek 3).
12. Powoli otwieraj zawór zbiornika, aż będzie można zobaczyć, jak gaz przepływa przez roztwór lipidów. Spowoduje to lekkie zmarszczki na powierzchni cieczy. Jeśli przepływ gazu jest zbyt duży, roztwór przeleje się podczas formułowania mikropęcherzyków.
13. Uruchom sonikator i pracuj przez 10 sekund w sposób ciągły, aby wytworzyć mikropęcherzyki. Jeśli roztwór bąbelkowy zacznie się przelewać podczas sonikacji, natychmiast zatrzymaj sonikator.
14. Wyłącz sonikator i natychmiast zamknij zawór zbiornika DFB.
15. Szybko zakryć roztwór mikropęcherzyków i zanurzyć fiolkę w łaźni lodowej, aby schłodzić próbkę poniżej 55 °C (temperatura zeszklenia DSPC)
16. Pozostawić próbki mikropęcherzyków w łaźni lodowej do czasu, gdy będą potrzebne.

Rysunek 3: Umieszczenie końcówki sondy w roztworze lipidowym w celu optymalizacji tworzenia mikropęcherzyków. Uważaj, aby końcówka sondy nie dotykała szkła. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Przygotowanie ekstrudera do kondensacji mikropęcherzyków

1. Zamontuj wytłaczarkę wysokociśnieniową zgodnie z instrukcją obsługi za pomocą filtra ceramicznego 200 nm (dostarczonego przez producenta).
2. Umieść ekstruder na środku wodoszczelnego pojemnika, tak aby rurka wylotowa próbki nie była dociśnięta do boku ani zaciśnięta.
3. Podłącz ekstruder do zbiornika azotu za pomocą adaptera dostarczonego przez producenta.
4. Przygotować soloną kąpiel lodową o temperaturze -2 °C w wodoszczelnym pojemniku wokół wytłaczarki, używając 400 ml wody i 10 g chlorku sodu.
5. Umieścić koniec rurki wylotowej w fiolce scyntylacyjnej, aby pobrać wytłaczaną próbkę.
   UWAGA: Przymocować probówkę do pojemnika za pomocą taśmy, jeśli nie leży płasko lub nie pozostaje w fiolce.

4. Przygotowanie ekstrudera do kondensacji mikropęcherzyków

1. Otwórz i zamknij zawór spustowy, aby upewnić się, że w ekstruderze nie ma ciśnienia.
2. Zdejmij pokrywę komory i dodaj 5 ml 1x PBS do komory ekstrudera.
3. Załóż pokrywę, upewniając się, że zatrzasnęła się z powrotem na swoim miejscu.
4. Otwórz zbiornik azotu tak, aby manometr wskazywał 250 psi. Upewnij się, że zawór regulacji ciśnienia jest w pozycji zamkniętej.
5. Zamknij zbiornik gazu i otwórz zawór wlotowy komory ekstrudera. Roztwór PBS zostanie przepchnięty przez system i wyjściowy z rurki wylotowej próbki do fiolki scyntylacyjnej.
6. Gdy z rurki wydostaje się tylko gaz, otwórz zawór spustowy i pozwól, aby ciśnienie spadło do 0 psi.
7. Wyjąć fiolkę scyntylacyjną.

5. Wstępne chłodzenie mikropęcherzyków do wytłaczania

1. Otwórz i zamknij zawór spustowy, aby upewnić się, że w ekstruderze nie ma ciśnienia. Umieścić nową fiolkę scyntylacyjną na końcu rurki wylotowej.
2. Napełnij stalowy pojemnik 2-metylobutanem i dodaj suchy lód, aby obniżyć temperaturę do -18 °C.
3. Wprowadzić roztwór mikropęcherzyków do schłodzonego 2-metylobutanu tak, aby próbka była zanurzona na 2 minuty. Przesuwaj fiolkę scyntylacyjną przez 2 minuty, aby delikatnie wymieszać pęcherzyki. W razie potrzeby dodać suchy lód, aby utrzymać temperaturę w zakresie od -15 do -18 °C. Należy uważać, aby nie przekroczyć -20 °C, w przeciwnym razie roztwór substancji pomocniczej zamarznie i zniszczy próbkę pęcherzyków.
   UWAGA: Kroki 5.2 i 5.3 można również wykonać, schładzając próbkę bąbelkową w zamrażarce laboratoryjnej przez dłuższy czas. Należy jednak zachować ostrożność w celu dokładnego monitorowania temperatury zamrażarki i unikania zamrażania próbki.
4. Po 2 minutach usuń mikropęcherzyki ze schłodzonego 2-metylobutanu, delikatnie potrząśnij fiolką, aby wymieszać mikropęcherzyki i użyj schłodzonej strzykawki o pojemności 10 ml, aby przenieść roztwór do wytłaczarki.
5. Zdejmij pokrywę komory ekstrudera i dodaj roztwór mikropęcherzyków do komory, powoli naciskając tłok na strzykawkę. Załóż nasadkę ekstrudera, upewniając się, że zatrzasnęła się z powrotem na swoim miejscu.
6. Sprawdź, czy zawór regulacji ciśnienia i zawór spustowy ekstrudera są w pozycji zamkniętej.
7. Otwórz zbiornik azotu gazowego, aż manometr wskaże 250 psi, zamknij zbiornik gazu i przekręć zawór regulacji ciśnienia do pozycji otwartej.
8. Gdy roztwór napełni fiolkę scyntylacyjną na rurki wyjściowej, a z rurki wydostaje się tylko gaz, powoli otwórz zawór spustowy ciśnienia i pozwól, aby ciśnienie spadło do 0 psi.
9. Umieścić fiolkę scyntylacyjną w łaźni lodowej lub lodówce w celu przechowywania.
10. W celu długotrwałego przechowywania i zminimalizowania spontanicznej parowania próbkę należy przechowywać w standardowej zamrażarce. Upewnij się, że temperatura wynosi -20 °C lub więcej, aby uniknąć zamrożenia próbki (roztwór substancji pomocniczej składający się z 20% PPG i 20% glicerolu zapobiegnie zamarznięciu próbki w większości zamrażarek laboratoryjnych).

6. Oddzielanie kropelek od liposomów przez wirowanie

1. Przenieść 10 ml wyciśniętego roztworu kropelki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
2. Odwirować wytłaczaną próbkę o masie 1 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Na dnie rurki widoczny będzie granulat składający się z nanokropelek DFB (Rysunek 4). Spontanicznie odparowane kropelki pojawią się na górze roztworu i należy je wyrzucić.

Rysunek 4: Przykład granulowania kropelek DFB z przesunięciem fazowym po odwirowaniu. Nanokropelki DFB są gęstsze niż liposomy i zbierają się na dnie probówki wirówkowej w postaci osadu (czerwone pole). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 2 ml 1x PBS z 20% glicerolem i 20% glikolem propylenowym.
4. Delikatnie wymieszaj probówkę do uzyskania jednorodnego roztworu i przenieś kropelki do mniejszej probówki wirówkowej o pojemności 2 ml.
5. Przemyć próbkę jeszcze dwa razy w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml.
6. Po ostatnim praniu ponownie zawieś granulat w 100 μl 1x PBS z 20% glicerolem i 20% glikolem propylenowym i przechowuj na lodzie lub w zamrażarce do czasu, aż będzie potrzebny.

7. Mikroskopowa weryfikacja parowania kropelek

1. Przygotować rozcieńczony roztwór kropel, dodając 2,5 μl skoncentrowanych kropelek do 7,5 μl 1x PBS.
2. Przygotować szkiełko mikroskopowe z 10 μl rozcieńczonej próbki. Korzystając z obiektywu 40x, obserwuj próbkę i zapisuj obrazy.
3. Wyjmij szkiełko z mikroskopu i umieść je na płycie grzewczej o temperaturze 65 °C na 1 minutę, aby odparować nanokropelki do mikropęcherzyków.
4. Użyj tego samego 40-krotnego obiektywu, aby obserwować próbkę po podgrzaniu, aby zweryfikować parowanie kropelk.

Wyniki

Reprezentatywne wyniki rozkładu wielkości są dołączone za pomocą analizy dynamicznego rozpraszania światła (DLS) i przestrajalnego czujnika impulsów rezystancyjnych (TRSP). Rysunek 5 pokazuje rozkład wielkości skondensowanych roztworów bąbelkowych z ekstruzją i bez ekstruzji. Bez wytłaczania protokół kończy się na kroku 5.3. Schłodzone pęcherzyki są zagęszczane przez odpowietrzenie próbki do ciśnienia atmosferycznego, gdy jest zimna. Tylko skondensowana próbka ma znacznie szerszy rozkład wyś...

Dyskusja

Dostępna jest obszerna literatura, która omawia formułę, fizykę i potencjalne zastosowania mikropęcherzyków i kropel z przesunięciem fazowym w obrazowaniu i terapii in vivo. Dyskusja ta dotyczy wyraźnie generowania mikropęcherzyków lipidowych i przekształcania ich w submikronowe kropelki przesunięcia fazowego przy użyciu gazu DFB o niskiej temperaturze wrzenia i wytłaczania pod wysokim ciśnieniem. Opisana tutaj metoda ma na celu zapewnienie stosunkowo prostej metody wytwarzania dużych ilości mikropęcherzyków lipidowych i...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
15 ml Probówki wirówkowe	Falcon	352095	Zbieranie i odwirowywanie kropel
Filtr poliwęglanowy 200 nm	Whatman	110606	Filtry do wytłaczarki
2-metylobutan	Fisher Chemical	03551-4	Szybkie wstępne chłodzenie roztworu mikropęcherzyków przed wytłaczaniem
3-bolcowe zaciski X2	Fisher	02-217-002	Utrzymywanie fiolek do scyntylacji na miejscu do sonikacji końcówki sondy
400W Analogowy sonator końcówki sondy z klaksonem	Branson	101-063-198R	Służy do generowania mikropęcherzyków lipidowych z roztworu lipidowego
Sonicator do kąpieli	Fisher Scientific	15337402	Służy do pomocy w rozkładzie liposomów na pęcherzyki jednowarstwowe
Bioresole Fisher	Chloroform C298-4	Służy do wytwarzania filmu lipidowego do przygotowania mikropęcherzyków
Dekafluorobutan (perfluorobutan) Gaz	FluoroMed L.P.	1 kg	generujący mikropęcherzyki za pomocą sonikacji końcówki sondy
Suchy lód	-		szybkie wstępne chłodzenie roztworu mikropęcherzyków przed wytłaczaniem
DSPC Lipid Powder	NOF America	COATSOME MC-8080	Składnik filmu lipidowego
DSPE-PEG-2K Lipid Powder	NOF America	SUNBRIGHT DSPE-020CN	Składnik filmu lipidowego
Termometr ogólny	-	-	Służy do pomiaru temperatury łaźni lodowej i temperatury 2-metylobutanu (musi dostosować się do temperatur -20C)
Szklane strzykawki	Hamilton	81139	Służy do mieszania lipidów w chloroformie
Glicerol	Fisher Bioreagents	BP229-1	Obniża temperaturę zamarzania roztworu PBS
Blok grzewczy	VWR Scientific Products		Podgrzewanie filmów lipidowych i parowanie kropelek
Lipex 10 wytłaczarka ml	Evonik		Komercyjny system wytłaczania wysokociśnieniowego
Mini Vortex Mixer	Marka Fisher	14-955-151	Służy do usuwania nadmiaru chloroformu z folii lipidowych
Zbiornik azotu	-		Używany do obsługi wytłaczarki
Bufor fosforanowy Saline	Fisher Scientific		Hydrate folie lipidowe i kropelki do prania
Poliestrowy dysk	spustowyWhatman	230600	Zapewnia wsparcie dla filtra poliwęglanowego
Nasadki polipropylenowe	Fisher Scientific	298417	Służy do przechowywania roztworu
Glikol propylenowy	Fisher Chemical	P355-1	Obniża temperaturę zamarzania roztworu PBS
Fiolki do scyntylacji	DWK Nauki Przyrodnicze Wheaton	986532	Służy do tworzenia filmów lipidowych i generowania mikropęcherzyków
Mały młotek	-		służy do rozbijania suchego lodu do chłodzenia metylobutanu
Sonicator Nasadka do mikrokońcówek	Branson	101148070	Służy do generowania mikropęcherzyków z roztworu lipidów
Pojemnik stalowy	Medegen	79310	Szybkie wstępne chłodzenie roztworu mikropęcherzyków przed wytłaczaniem (będzie działał dowolny pojemnik o temperaturze -20C)
Eksykator próżniowy	Bel-Art SP Scienceware	08-648-100	Usuwa nadmiar chloroformu z filmów lipidowych
2 ml probówka wirówkowa	Fisher	02682004	Służy do zagęszczania nanokropel