Method Article

Obserwacja funkcji wysp trzustkowych i interakcji między wyspami trzustkowymi a komórkami układu odpornościowego w żywych wycinkach tkanki trzustkowej

DOI:

10.3791/62207

⸱

April 12th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Immunology, and Laboratory Medicine, University of Florida, 2Paul Langerhans Institute Dresden (PLID) of the Helmholtz Zentrum München at the University Clinic Carl Gustav Carus of Technische Universität Dresden, 3Institute of Physiology, Faculty of Medicine, Technische Universität Dresden, 4German Center for Diabetes Research (DZD), 5J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering, University of Florida

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie przedstawia zastosowanie żywych wycinków tkanki trzustki do badania fizjologii wysp trzustkowych i interakcji między komórkami odpornościowymi wysp trzustkowych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Żywe wycinki tkanki trzustki pozwalają na badanie fizjologii i funkcji wysp trzustkowych w kontekście nienaruszonego mikrośrodowiska wysp trzustkowych. Plastry przygotowywane są z żywej ludzkiej i mysiej tkanki trzustki zatopionej w agarozie i krojone za pomocą wibratomu. Metoda ta pozwala na utrzymanie żywotności i funkcji tkanki, a także na zachowanie podstawowych patologii, takich jak cukrzyca typu 1 (T1D) i cukrzyca typu 2 (T2D). Metoda slice umożliwia nowe kierunki w badaniu trzustki poprzez utrzymanie złożonych struktur i różnych interakcji międzykomórkowych, które składają się na tkanki endokrynne i zewnątrzwydzielnicze trzustki. Protokół ten pokazuje, jak przeprowadzić barwienie i mikroskopię poklatkową żywych endogennych komórek odpornościowych w wycinkach trzustki wraz z oceną fizjologii wysp trzustkowych. Co więcej, podejście to można udoskonalić w celu rozpoznania populacji komórek odpornościowych specyficznych dla antygenów komórek wysp trzustkowych przy użyciu głównych odczynników kompleks-multimer zgodności tkankowej.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zajęcie trzustki jest patognomoniczne w stosunku do chorób takich jak zapalenie trzustki, T1D i T2D1,2,3. Badanie funkcji izolowanych wysepek zwykle polega na usuwaniu wysepek z otaczającego je środowiska4. Metoda żywego wycinka tkanki trzustki została opracowana, aby umożliwić badanie tkanki trzustki przy zachowaniu nienaruszonych mikrośrodowisk wysp trzustkowych i unikaniu stosowania stresujących procedur izolacji wysp trzustkowych5,6,7. Wycinki tkanki trzustkowej z ludzkiej tkanki dawcy zostały z powodzeniem wykorzystane do badania cukrzycy typu 1 i wykazały procesy utraty i dysfunkcji komórek beta oprócz infiltracji komórek odpornościowych8,9,10,11,12,13. Metodę żywego wycinka tkanki trzustki można zastosować zarówno do tkanki trzustki myszy, jak i człowieka5,6,8. Wycinki ludzkiej tkanki trzustki z tkanek dawców narządów uzyskuje się we współpracy z Siecią Dawców Narządów Trzustki z Cukrzycą (nPOD). Plasterki myszy mogą być generowane z wielu różnych szczepów myszy.

Ten protokół skupi się na nieotyłych cukrzycowych rekombinacjach aktywujących gen-1-null (NOD.Rag1-/-) i transgeniczny receptor limfocytów T (AI4) (NOD.Szmata1-/-.Szczepy myszy AI4α/β). SKINIENIE. Myszy Rag1-/- nie są w stanie rozwinąć limfocytów T i B z powodu zakłócenia w genie aktywującym rekombinację 1 (Rag1)14. SKINIENIE. Szmata1-/-. Myszy AI4α/β są używane jako model przyspieszonej cukrzycy typu 1, ponieważ wytwarzają pojedynczy klon limfocytów T, który celuje w epitop insuliny, co skutkuje konsekwentną infiltracją wysp trzustkowych i szybkim rozwojem choroby15. Przedstawiony tutaj protokół opisuje procedury badań funkcjonalnych i immunologicznych z wykorzystaniem żywych ludzkich i mysich wycinków trzustki poprzez zastosowanie metod mikroskopii konfokalnej. Techniki opisane w niniejszym dokumencie obejmują ocenę żywotności, identyfikację i lokalizację wysp trzustkowych, zapisy cytozolowego Ca2 +, a także barwienie i identyfikację populacji komórek odpornościowych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGI: Wszystkie protokoły eksperymentalne z użyciem myszy zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Florydy (201808642). Ludzkie skrawki trzustki od dawców tkanek obu płci uzyskano za pośrednictwem banku tkanek Sieci Dawców Narządów Trzustki z Cukrzycą (nPOD) na Uniwersytecie Florydy. Ludzka trzustka została pobrana od zmarłych dawców narządów przez certyfikowane organizacje zajmujące się pobieraniem narządów współpracujące z nPOD zgodnie z przepisami i regulacjami dotyczącymi dawstwa narządów i sklasyfikowane jako "osoby niebędące ludźmi" przez University of Florida Institutional Review Board (IRB) (IRB nr 392-2008), zrzekając się konieczności uzyskania zgody. Tkanki nPOD użyte specjalnie w tym projekcie zostały zatwierdzone jako nieludzkie przez University of Florida IRB (IRB20140093). Celem sekcji 1-3 niniejszego protokołu jest wyjaśnienie, jak skutecznie przeprowadzić sekcję myszy, przygotować i przetworzyć trzustkę oraz wygenerować żywe wycinki tkanki trzustkowej. Roztwory należy przygotować z wyprzedzeniem, a przepisy można znaleźć w tabeli uzupełniającej 1. Czas jest najbardziej krytycznym czynnikiem podczas tych kroków protokołu. Gdy mysz zostanie złożona w ofierze, żywotność tkanek zacznie spadać. Wszystkie trzy części tego protokołu muszą zostać ukończone tak szybko, jak to możliwe, aż zostaną wygenerowane wszystkie niezbędne wycinki.

1. Przygotowanie do generowania plastrów trzustki myszy

  1. Clamp ostrze na uchwycie ostrza wibratomu, ale nie mocuj go jeszcze do wibratomu.
  2. Rozpuść 100 ml 1,25% w/v agarozy o niskiej temperaturze topnienia w kuchence mikrofalowej. Używaj kuchenki mikrofalowej w odstępach 1-minutowych i zatrzymaj kuchenkę mikrofalową na 10 sekund, jeśli roztwór agarozy zacznie wrzeć. Powtarzaj ten proces, aż agaroza się stopi i powstanie jednorodny roztwór. Umieść butelkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Niskie stężenie agarozy ma odpowiadać za mniejszą gęstość trzustki myszy.
  3. Napełnij strzykawkę Luer lock o pojemności 10 ml 3 ml ciepłej agarozy. Założyć na strzykawkę igłę 27 G 25 mm. Przechowywać strzykawkę z założoną igłą w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do czasu wstrzyknięcia roztworu.
    UWAGA: Preferowana jest igła 27 G, ponieważ bezpiecznie pasuje do wspólnego przewodu żółciowego myszy o masie ciała 10-25 g i umożliwia przepływ roztworu agarozy o dużej lepkości. Podczas gdy do użytku można wybrać igły o większych otworach, nie zaleca się igieł o mniejszej (większej grubości), ponieważ mogą one łatwiej zapychać się roztworem agarozy.
  4. Dodać 20 ml schłodzonego roztworu zewnątrzkomórkowego (ECS) do 10 cm szalki Petriego.
    UWAGA: ECS nie musi być bąbelkowany w żadnym momencie.
  5. Napełnij dwie 10 cm niepoddane obróbce szalki Petriego 15 ml buforu wodorowęglanowego Krebsa-Ringera (KRBH) zawierającego 3 mM D-glukozy i inhibitora trypsyny sojowej w stężeniu 0,1 mg/ml na talerz.
    UWAGA: W całym tym protokole ważne jest, aby wszystkie roztwory używane do utrzymywania plastrów zawierały inhibitor trypsyny sojowej, aby zapobiec uszkodzeniom tkanek spowodowanym przez proteazy trawienne trzustki.

2. Wycięcie trzustki myszy i przetwarzanie tkanek

UWAGA: Protokół wycinania trzustki, przetwarzania tkanki i generowania wycinków jest zmodyfikowany z Marciniak et al5. Aby zapewnić żywotność tkanek, zminimalizuj czas między usunięciem trzustki a wytworzeniem plastra. Cały niezbędny sprzęt powinien być przygotowany z wyprzedzeniem i zorientowany w taki sposób, aby umożliwić szybkie przejście przez poniższe kroki. Kanulacja i iniekcja przewodu żółciowego, a także wycięcie trzustki najlepiej wykonywać w stereoskopie.

  1. Mysz jest głęboko znieczulona izofluranem i uśmiercana przez zwichnięcie szyjki macicy.
    UWAGA: Izofluran jest preferowaną metodą znieczulenia. Należy stosować izofluran o stężeniu 5%. Na przykład 0,26 ml powinno być używane z 1 l komora16. Po zastosowaniu CO2 zaobserwowano zmniejszenie żywotności tkanek trzustki.
  2. Spryskaj mysz obficie etanolem 70% v/v, aby zmniejszyć zanieczyszczenie tkanek sierścią podczas sekcji i wycinania. Umieść mysz w orientacji grzbietowej w dół, brzusznie w górę, z przednią stroną po lewej stronie.
  3. Za pomocą nożyczek otwórz otrzewną i usuń klatkę piersiową, uważając, aby nie przebić serca ani sąsiednich naczyń. Użyj kleszczy, aby wciągnąć wątrobę do jamy klatki piersiowej i wysunąć jelita z jamy ciała, aby odsłonić wspólny przewód żółciowy. Użyj zacisku Johns Hopkins Bulldog, aby zakryć bańkę Vatera.
  4. Pobrać strzykawkę typu luer lock o pojemności 10 ml z 3 ml ciepłego roztworu agarozy z łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Po wyjęciu strzykawki z agarozą z łaźni wodnej, wstrzyknięcie trzustki należy wykonać szybko, zanim agaroza ostygnie i umieści się w strzykawce.
  5. Trzymając kleszcze w lewej ręce, delikatnie podeprzyj i ustabilizuj przewód żółciowy do wstrzyknięcia.
  6. Trzymać strzykawkę w prawej ręce, wbić igłę skośnie do góry do przewodu żółciowego. Powoli i równomiernie wstrzykiwać trzustkę. Po rozpoczęciu wstrzykiwania nie można zatrzymać przepływu bez stwardnienia agarozy w strzykawce i trzustce.
    UWAGA: Używana głośność będzie zależeć od wagi myszy. Na podstawie doświadczenia zaleca się stosowanie 1 ml roztworu agarozy na 10 g masy ciała myszy o maksymalnej objętości 2 ml. Trzustka powinna wyglądać na lekko napompowaną o bardziej zdecydowanej strukturze, ale nie nadmiernie rozciągniętą. Nadmierne wstrzyknięcie powoduje, że wysepki oddzielają się od tkanki zewnątrzwydzielniczej i mają "wydmuchiwany" wygląd w plasterkach.
  7. Usuń trzustkę wypełnioną agarozą z myszy. Za pomocą kleszczy i nożyczek odetnij trzustkę, zaczynając od żołądka, przechodząc do jelit, a kończąc na śledzionie. Po odcięciu delikatnie usuń wstrzykniętą trzustkę za pomocą kleszczy i umieść na 10 cm szalce Petriego wypełnionej schłodzonym ECS.
  8. Użyj nożyczek, aby usunąć tkankę tłuszczową, tkankę łączną, tkankę zwłóknieniową i części trzustki, do których nie wstrzyknięto agarozy.
    UWAGA: Części tkanki, które powinny zostać usunięte, nie będą miały silnie ugruntowanych struktur i będą wyglądać na nieco galaretowate.
  9. Po przycięciu tkanki użyj nożyczek, aby pociąć ją na mniejsze odcinki o średnicy około 5 mm, pozostawiając ją zanurzoną pod ECS. Ostrożnie przetnij tkankę, uważając, aby nie wypchnąć agarozy z tkanki.
  10. Usuń kawałki tkanki z ECS i umieść je na dwuwarstwowej wycieraczce (patrz tabela materiałów). Delikatnie zwiń je na wycieraczce za pomocą kleszczy, aby usunąć nadmiar płynu.
  11. Za pomocą kleszczy ostrożnie umieść kawałki tkanki na szalce Petriego o średnicy 35 mm, nie więcej niż 4 kawałki na płytkę. Umieść najbardziej płaską stronę bloku tkanki skierowaną w dół. Delikatnie dociśnij tkankę za pomocą kleszczyków.
    UWAGA: Upewnij się, że między kawałkami tkanki jest co najmniej kilka milimetrów odstępu i że nie dotykają one krawędzi płytki.
  12. Powoli wlewaj agarozę o temperaturze 37 °C do naczynia, uważając, aby nie wylać jej bezpośrednio na tkankę. Wlej tyle, aby kawałki tkanki były całkowicie pokryte. Upewnij się, że nad kawałkami tkanki znajduje się warstwa agarozy, ponieważ ta część zostanie przyklejona do uchwytu na próbkę.
  13. Ostrożnie przenieś naczynie z kawałkami tkanki do lodówki, aby agaroza stężała. Upewnij się, że kawałki tkanki nie przesuwają się ani nie zaczynają unosić się na wodzie. Jeśli tak, szybko je wyreguluj za pomocą kleszczy.
    UWAGA: Zastygnięcie agarozy powinno zająć tylko kilka minut.
  14. Gdy agaroza stwardnieje, użyj skalpela, aby przeciąć tkankę w liniach prostych, aby zrobić bloki agarozy, jakby tworzyły siatkę między kawałkami tkanki. Pamiętaj, aby zostawić kilka milimetrów agarozy otaczającej ze wszystkich stron tkanki.
    UWAGA: Z agarozy nie powinna wystawać żadna tkanka. Każdy blok powinien być sześcianem o wymiarach około 5 mm x 5 mm x 5 mm.
  15. Użyj skalpela, aby odwrócić puste kawałki agarozy, które zostały wycięte wokół krawędzi płytki. Usuń klocki z chusteczką z naczynia, podnosząc je ostrożnie kleszczami.

3. Generowanie wycinków trzustki myszy

  1. Za pomocą kleszczy ułóż klocki na uchwycie na próbkę; ułóż je bokiem, pamiętając, że zostaną odwrócone na super klej. Ułóż bloki tak, aby nie wystawały dalej niż szerokość ostrza. Ponieważ wibratom porusza się powoli, ułóż klocki tak, aby ostrze musiało poruszać się do przodu na jak najmniejszą odległość.
    UWAGA: Dobrze sprawdzają się dwa rzędy po trzy lub cztery bloki, każdy z kilkoma milimetrami między rzędami. Bloki w tym samym rzędzie mogą się stykać, ale gdy oba rzędy się stykają, pobieranie plasterków w miarę ich odchodzenia od bloków może być trudne.
  2. Nałóż linię super kleju na uchwyt próbki i użyj końca dozownika kleju, aby rozprowadzić klej na cienką warstwę. Odwróć bloki tkanki na klej tak, aby strona najbliższa tkance była skierowana do góry. Delikatnie dociśnij bloki i pozostaw klej do wyschnięcia na trzy minuty.
  3. Przymocuj uchwyt ostrza i płytkę do wibratomu, zwykle za pomocą lub magnesu, w zależności od modelu wibratomu. Dostosuj wysokość ostrza i przebytą odległość tak, aby ostrze poruszało się na całej długości klocków i ledwo nad nimi.
    UWAGA: Kleszcze mogą być pomocne podczas regulacji wysokości ostrza. Można je umieścić na górze bloku tkanki, aby pomóc umieścić ostrze jak najbliżej górnej części bloku bez dotykania bloku.
  4. Upewnij się, że klej wysechł, delikatnie popychając bloki kleszczami, a następnie napełnij tackę na wibratomy schłodzonym ECS, aż ostrze zostanie zakryte. Ustaw wibratom, aby tworzyć plastry o grubości 120 μm z prędkością 0,175 mm/s, częstotliwością 70 Hz i amplitudą 1 mm,
    UWAGA: Prędkość wibratomu można regulować w zależności od łatwości cięcia tkanki.
  5. Uruchom wibratomium i obserwuj, kiedy plastry zaczynają odchodzić od bloków tkanki. Użyj 10-centymetrowych kleszczyków Graefe lub małego pędzla nr 4, aby ostrożnie usunąć plastry, gdy odpłyną od bloku, i umieść je w 10 cm płytkach z KRBH zawierającym 3 mM D-glukozy i inhibitor trypsyny. Podnieś plastry, umieszczając pod nimi pędzel lub kleszcze i delikatnie podnosząc plastry. Nie inkubować więcej niż 15 plastrów razem na jednej płytce.
    UWAGA: To normalne, że wibratom ma kilka przejść nad blokami, w których nie są wykonane żadne plasterki, ale należy je zminimalizować na czas. Przygotuj nożyczki na wypadek, gdyby plastry nie oddzieliły się całkowicie od bloków tkanki. Jeśli tak się stanie, róg lub krawędź plastra zostanie przyklejona do bloku po przejściu ostrza wibratomu. Nie odrywaj plasterka ani bloku podczas usuwania zablokowanego plasterka.
  6. Umieść talerze z plastrami na bujaku w temperaturze pokojowej i przy 25 obr./min. Odstaw plastry w temperaturze pokojowej na godzinę. Jeśli mają być pozostawione na dłużej, umieść plastry w 15 ml pożywki do hodowli plastrów (patrz tabela uzupełniająca 1) w inkubatorze. Inkubować wycinki przygotowane do badań tego samego dnia w temperaturze 37 °C oraz wycinki hodowlane, które są hodowane przez noc w temperaturze 24 °C, przenosząc je do temperatury 37 °C co najmniej 1 godzinę przed eksperymentami><. UWAGA: W dłuższej perspektywie plastry mają lepszą żywotność, gdy są hodowane w temperaturze 24 °C, chociaż 37 °C jest bliższa ich rodzimemu środowisku fizjologicznemu, prawdopodobnie ze względu na niższą aktywność wydzielanych enzymów proteazy w niższej temperaturze. Plastry tkanki trzustki myszy i człowieka są hodowane w tej samej temperaturze i z maksymalnie 15 plastrami na naczynie. Jednak przepisy na podłoża różnią się w przypadku plasterków ludzi i myszy. Obie postacie są wymienione w Tabeli Uzupełniającej 1. Dodatkowo procedura jest taka sama w przypadku generowania plastrów mysich i ludzkich, z wyjątkiem trzustki myszy wymagającej wstrzyknięcia agarozy w celu stabilizacji. Ludzkie plastry są pozyskiwane za pomocą programu nPOD Pancreas Slice Program. Zarówno plastry mysie, jak i ludzkie mają grubość 120 μm. Na plastrach można przeprowadzać różne eksperymenty; Wybierz panele barwiące, które najlepiej sprawdzają się w planowanych eksperymentach.

4. Przygotowanie plastrów do zabiegów barwienia

  1. Hodować plastry w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę przed planowanymi doświadczeniami. Ciepły KRBH zawierający 3 mM D-glukozy w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Przenieś 2 ml KRBH zawierającego 3 mM D-glukozy do naczynia o średnicy 35 mm i za pomocą pędzla delikatnie umieść plasterek w naczyniu.
  2. Jeśli plasterek jest przenoszony z podłoża, umyj go dwukrotnie KRBH zawierającym 3 mM D-glukozy. Ostrożnie odessać KRBH z 3 mM D-glukozą za pomocą pipety transferowej lub pipety Pasteura, uważając, aby nie naruszyć plasterka. Trzymaj plasterek na talerzu z KRBH zawierającym 3 mM D-glukozy do czasu przygotowania paneli barwiących.

5. Barwienie ditizonem

UWAGA: Chociaż ditizon może być użyty do zabarwienia wysepek na czerwono, zabije plasterek, ponieważ stwierdzono, że jest cytotoksyczny dla wysepek17.

  1. Odmierz 12,5 mg ditizonu, dodaj go do 1,25 ml dimetylosulfotlenku i weź tę mieszaninę do strzykawki o pojemności 50 ml. Napełnić strzykawkę do objętości 25 ml za pomocą Hanks Balanced Salt Solution i przymocować filtr do końca strzykawki. Podać 2 ml KRBH z 3 mM D-glukozy i dodać 2 krople przefiltrowanego roztworu ditizonu ze strzykawki o pojemności 50 ml do naczynia o średnicy 35 mm.
  2. Za pomocą pędzla ostrożnie umieść plasterek na szalce Petriego o średnicy 35 mm. Zobrazuj wycinek z wysepkami wskazanymi przez czerwone barwienie ditizonem za pomocą mikroskopu stereoskopowego.

6. Barwienie żywotności

UWAGA: Ta sekcja protokołu opisuje, jak ocenić żywotność plastrów za pomocą kalceiny-AM i niebiesko-fluorescencyjnego SYTOX Blue (zobacz Tabelę Materiałów). Calcein-AM należy stosować w stężeniu 4 μM, a SYTOX Blue w stężeniu 1 μM.

  1. Podwielokrotność 2 ml KRBH zawierającego 3 mM D-glukozy i dodanie 2 μl barwnika kalceiny-AM i SYTOX Blue do oddzielnych podwielokrotności. Wiruj mieszaniny przez 5 sekund.
  2. Dodać 200 μl KRBH zawierającego 3 mM D-glukozy i barwnika kalceiny-AM do każdego dołka 8-dołkowego szkła nakrywkowego.
    UWAGA: Można stosować alternatywne płytki i/lub komory obrazowania inne niż szkło nakrywkowe z 8-dołkową komorą.
  3. Za pomocą pędzla ostrożnie umieść plasterek w każdym dołku płytki i przenieś płytkę z plastrami do inkubatora o temperaturze 37 °C na 20 minut. Umyj plastry dwukrotnie KRBH zawierającym 3 mM D-glukozy. Ostrożnie zassać KRBH za pomocą pipety transferowej lub pipety Pasteura, uważając, aby nie naruszyć plasterka.
  4. Umieścić plasterek na szalce Petriego o średnicy 35 mm ze szkłem nakrywkowym, zawierającej 2 ml KRBH z 3 mM D-glukozy i 2 μl SYTOX Blue w stężeniu 1 μl na 1 ml roztworu. Przykryj plasterek kotwicą do plastrów, upewniając się, że strona z harfą jest skierowana w dół. Zrób zdjęcia slice.
    UWAGA: Jeśli kotwica plastra nadal unosi się na wodzie, zwilż ją z obu stron KRBH zawierającym 3 mM D-glukozy, aby zanurzyć ją w roztworze. Bardzo ważne jest, aby zawsze utrzymywać plastry w roztworach zawierających inhibitor proteazy, nawet podczas ładowania barwnikiem. Stosowane barwienia żywotności mogą być dostosowane do konkretnego eksperymentu lub konfiguracji mikroskopu.

7. Barwienie wskaźnika Slice Ca2+

UWAGA: Ta sekcja protokołu opisuje, jak barwić plasterki dla nagrań Ca2+ przy użyciu Oregon Green 488 BAPTA-1, AM i SYTOX Blue w plastrach myszy (zobacz Tabelę Materiałów). Oregon Green 488 BAPTA-1, AM należy stosować w stężeniu 5,6 μM, a SYTOX Blue w stężeniu 1 μM. W plastrach ludzkich należy stosować Fluo-4-AM w stężeniu 6,4 μM.

  1. Podać 2 ml KRBH zawierające 3 mM D-glukozy, dodać 7 μl Oregon Green 488 BAPTA-1, AM i mieszać mieszaninę przez 5 s.
    UWAGA: W przypadku plastrów tkanek ludzkich użyj Fluo-4-AM zamiast Oregon Green 488 BAPTA-1, AM. Fluo-4-AM jest preferowany, ponieważ jest jaśniejszy, gdy wzrasta wewnątrzkomórkowe stężenie Ca2 +; Jednak nie ładuje się dobrze w tkance trzustki myszy. Protokół jest taki sam, jak opisany powyżej dla Fluo-4-AM, z wyjątkiem tego, że Fluo-4-AM musi być inkubowany tylko przez 30 minut.
  2. Dodać 200 μl KRBH zawierającego 3mM D-glukozę i barwnik do każdej studzienki 8-dołkowego szkła nakrywkowego. Za pomocą pędzla ostrożnie umieść plasterek w każdym dołku komorowego szkła nakrywkowego. Przenieść nakrycie z plastrami do inkubatora w temperaturze 37 °C na 45 minut.
  3. Umyj plastry dwukrotnie KRBH zawierającym 3 mM D-glukozy. Ostrożnie odessać KRBH z 3 mM D-glukozy za pomocą pipety transferowej lub pipety Pasteura, uważając, aby nie naruszyć plasterka.
  4. Umieść plasterek na płytce lub komorze obrazowej z KRBH zawierającym 3 mM D-glukozy i SYTOX Blue w stężeniu 1 μl na 1 ml i przykryj kotwicą do plastrów, upewniając się, że harfa jest skierowana w dół. Zrób zdjęcia slice.
    UWAGA: W tym protokole użyto 35-milimetrowej szalki wypełnionej 2 ml KRBH zawierającego 3 mM D-glukozy i 2 μL SYTOX Blue. Jeśli kotwica plastra nadal unosi się na wodzie, zwilż ją z obu stron KRBH zawierającym 3 mM D-glukozy, aby zanurzyć ją w roztworze.

8. Plasterek myszy Ca2+ nagrania

UWAGI: Poniższa sekcja opisuje, jak wykonywać zapisy Ca2+ na wycinkach tkanki trzustki myszy przy użyciu Oregon Green 488 BAPTA-1, AM i SYTOX Blue. Obrazowanie wykonano za pomocą konfokalnego mikroskopu laserowo-skaningowego (szczegóły w Tabeli Materiałów). Użyte lasery miały 405 nm dla SYTOX Blue, 488 nm dla Oregon Green 488 BAPTA-1, AM i 638 nm dla reflektancji. Detektor HyD został użyty w Oregon Green 488 BAPTA-1, AM. Do pomiaru odbicia wykorzystano detektory fotopowielacza (PMT) oraz detektory SYTOX Blue. Protokół obrazowania Ca2 + jest taki sam dla wycinków ludzkiej tkanki trzustki, z wyjątkiem tego, że jako wskaźnik użyto Fluo-4-AM. Poziomy mocy lasera, wzmocnienie i rozmiar otworu należy dostosować w oparciu o próbkę i konkretną zobrazowaną wysepkę. Zazwyczaj dobrym punktem wyjścia jest otwór na 1,5 przewiewnej jednostki i moc lasera 1%.

  1. Co najmniej 1 godzinę przed rejestracją włączyć mikroskop i wyrównać temperaturę 37 °C w inkubatorze stołowym lub klatkowym. Po zdjęciu pokrywki umieścić na stoliku płytkę Petriego o średnicy 35 mm ze szkłem nakrywkowym zawierającą plaster. Ustaw ostrość, ustawiając mikroskop w trybie obiektywu 10x i jasnego pola. Zlokalizuj wysepki za pomocą jasnego pola, szukając pomarańczowo-brązowych owali w przekroju.
  2. Po zlokalizowaniu prawdopodobnej wysepki przełącz mikroskop w tryb obrazowania konfokalnego. Aby potwierdzić wysepki na podstawie współczynnika odbicia, włącz laser 638 nm, ustaw moc lasera w zakresie od 1% do 2% i wyłącz filtr wycinający 638 nm, który normalnie usuwałby światło rozproszone wstecznie. Ustaw granice wykrywalności w detektorze PMT na szerokość pasma około 20 nm wyśrodkowaną wokół 638 nm.
    UWAGA: Zachowaj ostrożność, ponieważ używanie mikroskopu w trybie odbicia może spowodować uszkodzenie detektora. Ze względu na wysoką ziarnistość tkanki endokrynnej, światło odbite może być teraz wykorzystywane do lokalizowania wysepek. Wysepki pojawią się jako grupy jasno rozpraszających wstecznie komórek ziarnistych na tym kanale odbicia.
  3. Aby view SYTOX Blue, włącz laser 405 nm i detektor PMT i ustaw moc lasera w zakresie od 1% do 2%. Wyśrodkuj interesującą wysepkę w polu widzenia za pomocą pokręteł X i Y kontrolera stage. Gdy interesująca wysepka zostanie zlokalizowana i potwierdzona przez rozproszenie wsteczne, przełącz się na obiektyw 20x i powiększ tak, aby wysepka zajęła większość kadru.
  4. Weź stos z wysepki o rozmiarze kroku Z 1,5 μm. Znajdź najlepszy przekrój optyczny wysepki, w którym większość komórek jest żywa (ujemny dla SYTOX Blue) i dobrze obciążony za pomocą Oregon Green 488 BAPTA-1, AM lub Fluo-4-AM.
    UWAGA: Nie jest niczym niezwykłym widzieć komórki, które są przeładowane dużą ilością barwnika i które są bardzo jasne. Mogą to być umierające komórki trzustki, w których może zostać uwolniony zapas Ca2+ w retikulum endoplazmatycznym, co powoduje wysoki poziom obciążenia; Nie są to idealne komórki do nagrywania. Poszukaj komórek, które wyraźnie załadowały barwnik, ale nie przesycają detektora, tak aby widoczny był wzrost jasności, który występuje, gdy wahania poziomów cytozolowego Ca2+ są widoczne. Obciążenie barwnikiem wysepek w obrębie plastrów jest zmienne; Jednak barwnik zazwyczaj dobrze ładuje się przez ~10-15 μm wysepki. Jednak obciążenie barwnikiem może być trudne do wizualizacji, jeśli komórki znajdują się głęboko w tkance.
  5. Aby zapobiec blaknięciu barwnika podczas nagrywania, należy upewnić się, że moc lasera na kanale 488 nm nie przekracza 2%. Zwiększ otwór do 2 przewiewnych jednostek, aby zebrać więcej sygnału przy niższej mocy wzbudzenia.
  6. Ustaw mikroskop tak, aby nagrywał w trybie XYZT. Zoptymalizuj ustawienia, aby zmniejszyć liczbę klatek na sekundę do 2 s lub mniej.
    UWAGA: Zmiany ustawień, które można wprowadzić w celu zmniejszenia liczby klatek na sekundę, obejmują włączenie skanowania dwukierunkowego, zmniejszenie lub wyłączenie uśredniania linii oraz zwiększenie szybkości skanowania.
  7. Po zoptymalizowaniu ustawień zarejestruj kilka minut podstawowej aktywności.
    UWAGA: Innym dobrym wskaźnikiem żywotności tkanek jest to, że komórki wydają się aktywne i widocznie podczas tego zapisu podstawowej aktywności.
  8. Dodać 100 μL 20x skoncentrowanej glukozy i KCl w KRBH do płytki za pomocą mikropipety 200 μL w podanych punktach czasowych, aby uzyskać końcowe stężenie 16,7 mM glukozy lub 30 mM KCl.
    UWAGI: Roztwory należy dodawać ostrożnie, uważając, aby nie naruszyć plastra podczas nagrywania. Należy pamiętać, aby nie uderzać w płytkę mikropipetą. Typowe jest obserwowanie, jak tkanka kurczy się w odpowiedzi na te stymulacje. Zapisy strumienia Ca2+ zostały przetworzone i określone ilościowo w ImageJ18. Za pomocą oprogramowania ImageJ zmierzono intensywność barwienia Oregon Green 488 BAPTA-1, AM w komórkach poprzez ręczny wybór obszarów zainteresowania (ROI). Intensywność fluorescencji z tych ROI obliczono, dzieląc wartości fluorescencji w późniejszych punktach czasowych przez początkowe wartości fluorescencji komórek (F / F0). System perfuzyjny może być używany wraz ze specjalistyczną komorą obrazowania do dynamicznego podawania roztworów do plastrów, w przeciwieństwie do ich ręcznego dodawania. Zalecenia dotyczące systemu perfuzji i komory obrazowania można znaleźć w Tabeli Materiałów.

9. Barwienie mysich limfocytów T w żywych wycinkach trzustki

UWAGA: Ta sekcja protokołu opisuje, jak zabarwić komórki odpornościowe w mysich wycinkach. Używany szczep myszy to NOD. Szmata1-/-. AI4α/β ponieważ model ten konsekwentnie rozwija chorobę ze znacznym zapaleniem wyspy. Wszystkie limfocyty T CD8 + u tej myszy celują w epitop insuliny, co pozwala na użycie tetramerub b znakowanego fikoerytryną (PE) insuliny-D15. Przeciwciało CD8 należy stosować w stężeniu 1:20, a tetramer insuliny w stężeniu 1:50.

  1. Podać 100 μl KRBH zawierającego 3 mM D-glukozy, dodać 2 μl tetrameru insuliny PE i 5 μl przeciwciała CD8 allofikocyjaniny (APC) i wirować mieszaninę przez 5 s.
  2. Dodać 100 μl KRBH zawierającego 3 mM D-glukozy oraz tetramer i przeciwciało do studzienki z 8-dołkowym szkłem nakrywkowym. Za pomocą pędzla ostrożnie umieść plasterek w zagłębieniu komorowego szkła nakrywkowego. Przenieść nakrycie z plastrem do inkubatora w temperaturze 37 °C na 30 minut.
  3. Umyj plasterek dwukrotnie 2 ml KRBH zawierającego 3 mM D-glukozy. Ostrożnie odessać KRBH z 3 mM D-glukozy za pomocą pipety transferowej lub pipety Pasteura, uważając, aby nie naruszyć plasterka.
  4. Umieścić plaster na szalce Petriego o średnicy 35 mm ze szkłem nakrywkowym, zawierającej KRBH z 3 mM D-glukozy i SYTOX Blue w stężeniu 1 μl na 1 ml i przykryć kotwicą do plastrów, kładąc stronę z harfą skierowaną w dół. Zrób zdjęcia slice.
    UWAGA: Jeśli kotwica plastra nadal unosi się na wodzie, zwilż ją z obu stron KRBH zawierającym 3 mM D-glukozy, aby zanurzyć ją w roztworze. Rozcieńczone przeciwciało i tetramer można ponownie użyć jeden raz. Po zabarwieniu dwóch plasterków należy przygotować świeżą mieszaninę przeciwciał.

10. Rejestracja komórek odpornościowych myszy

UWAGA: Poniższa sekcja opisuje, jak przeprowadzić zapisy komórek odpornościowych na wycinkach tkanki trzustki myszy przy użyciu przeciwciała CD8, tetrameru insuliny PE i SYTOX Blue. Konfiguracja obrazowania jest zgodna z opisem w punkcie 8. Nagrania zostały zrealizowane w rozdzielczości 800 × 800 pikseli. Użyte lasery miały 405 nm dla SYTOX Blue, 488 nm dla tetrameru insuliny i 638 nm dla przeciwciała CD8 i reflektancji. Detektory HyD zastosowano dla przeciwciała CD8 i tetrameru insuliny PE. Do pomiaru odbicia wykorzystano detektory PMT oraz detektory SYTOX Blue. Protokół obrazowania komórek odpornościowych jest taki sam dla wycinków ludzkiej tkanki trzustki, z wyjątkiem zastosowania różnych przeciwciał i multimerów HLA skompleksowanych antygenami dla tkanki ludzkiej. Zarówno w przypadku barwienia tetramerem insuliny w tkance myszy, jak i barwienia multimerem HLA w tkance ludzkiej, należy zastosować współbarwienie komórek odpornościowych w celu sprawdzenia obecności specyficznych limfocytów T reagujących z antygenem. W tym przypadku zastosowano przeciwciało anty-CD8. Przeciwciała, takie jak anty-CD3 lub anty-CD4, mogą być również stosowane w zależności od docelowej populacji komórek.

  1. Co najmniej 1 godzinę przed rejestracją włączyć mikroskop i wyrównać temperaturę 37 °C w inkubatorze stage top. Zabezpieczyć na stoliku płytkę Petriego o średnicy 35 mm ze szkłem nakrywkowym, na której znajduje się plasterek. Ustaw ostrość mikroskopu, ustawiając obiektyw 10x w trybie jasnego pola. Zlokalizuj wysepki w trybie jasnego pola, szukając pomarańczowo-brązowych owali w przekroju.
  2. Przełącz mikroskop na obrazowanie konfokalne, naciskając przycisk CS na kontrolerze ekranu dotykowego mikroskopu. Aby wyświetlić wysepki według współczynnika odbicia, włącz laser 638 i detektor PMT, ustaw moc lasera w zakresie od 1% do 2% i wyłącz filtry wycinające.
    UWAGA: Ze względu na zwiększoną ziarnistość tkanki endokrynnej, światło odbite może być teraz wykorzystywane do lokalizowania wysepek. Wysepki pojawią się na tym kanale jako grupy jasnych, ziarnistych komórek.
  3. Aby view SYTOX Blue, przeciwciało CD8 i tetramer insuliny, sprawdź, czy moc lasera wynosi od 1% do 2%. Użyj następujących ustawień, aby view każdy z trzech: w przypadku SYTOX Blue włącz laser 405 nm i detektor PMT; w przypadku przeciwciała CD8 włączyć detektor HyD; a aby wyświetlić tetramer insuliny, włącz laser 488 nm i detektor HyD.
  4. Wyśrodkuj interesującą wysepkę w polu widzenia za pomocą pokręteł X i Y kontrolera stage. Po zlokalizowaniu interesującej Cię wysepki przełącz się na obiektyw 20x i powiększ tak, aby wysepka zajęła większość kadru. Weź stos z wysepki o rozmiarze kroku Z 1,5 μm. Znajdź najlepsze sekcje optyczne (seria od 5 do 10 sekcji) wysepki, w której większość komórek jest żywa (ujemny dla SYTOX Blue), a wszystkie otaczające komórki odpornościowe są w centrum uwagi.
    UWAGA: Spróbuj znaleźć ramki, w których znajduje się wiele komórek CD8-dodatnich i tetramerów insuliny otaczających lub infiltrujących wyspę trzustkową.
  5. Ustaw mikroskop tak, aby nagrywał w trybie XYZT. Zoptymalizuj ustawienia, aby rejestrować stos Z wybranych kroków co 20 minut przez kilka godzin.
    UWAGA: Jeśli to możliwe, najlepiej jest wykonać te zapisy w komorze obrazowania, w której można kontrolować temperaturę i poziom CO2 , szczególnie podczas nagrywania przez ponad cztery godziny. W przypadku rejestracji nocnej, nadmiar przeciwciał może zostać dodany do pożywki, aby skompensować cykle receptorów limfocytów T i blaknięcie barwnika. Dodatkowo różne fluorofory mogą być stosowane do przeciwciał limfocytów T. Z doświadczenia wynika, że przeciwciała w dalekim czerwonym zakresie działają najlepiej w przypadku limfocytów T.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół dostarczy żywe wycinki tkanki trzustki odpowiednie zarówno do badań funkcjonalnych, jak i zapisów komórek odpornościowych. Wygląd przekroju zarówno w jasnym polu, jak i w świetle odbitym jest pokazany w Rysunek 1A,B. Jak wspomniano, wysepki można znaleźć w plasterkach wykorzystujących światło odbite ze względu na ich zwiększoną ziarnistość, która występuje z powodu zawartości insuliny (Rysunek 1C) i są wyraźnie obserwowane w porównaniu z tkan...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest wyjaśnienie procesu wytwarzania wycinków trzustki oraz procedur niezbędnych do ich wykorzystania w badaniach funkcjonalnych i immunologicznych. Stosowanie żywych plastrów trzustki ma wiele zalet. Istnieje jednak kilka krytycznych etapów, które są niezbędne, aby tkanka pozostała żywotna i użyteczna podczas opisanych protokołów eksperymentu. Konieczna jest szybka praca. Czas między wstrzyknięciem trzustki a wytworzeniem plastrów na wibratomie powinien być zminimalizowany, aby utrzymać żywotność tk...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez granty NIH R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638 i P01 AI042288. Badania te przeprowadzono przy wsparciu Sieci Dawców Narządów Trzustki z Cukrzycą (nPOD; RRID:SCR_014641), wspólny projekt badawczy dotyczący cukrzycy typu 1 sponsorowany przez JDRF (nPOD: 5--2018-557-Q-R) oraz The Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant #2018PG-T1D053). Odpowiedzialność za wyrażone treści i poglądy spoczywa na autorach i niekoniecznie odzwierciedlają one oficjalne stanowisko nPOD. Organizacje pobierające narządy (OPO) współpracujące z nPOD w celu zapewnienia zasobów badawczych są wymienione na stronie http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. Dziękuję dr Kevinowi Otto z University of Florida za dostarczenie wibratomu używanego do generowania plastrów myszy.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
#3 Stylowy uchwyt skalpelaFisherbrand12-000-163
1 M HEPESFisher ScientificBP299-100Bufor HEPES, 1M roztwór
10 cm Nieobrobione naczynie hodowlaneCorning430591
10 mL Strzykawka Luer-LokBD301029BD z końcówkami Luer-Lok
Igła 27 GBDBD 305109BD Ogólnego zastosowania i PrecisionGlide Igły podskórne
35 mm szalka Petriego ze szkłem nakrywkowymIbidi81156µ-Dish 35 mm, wysoka
strzykawka 50 mlSzkło309653
8-dołkoweIbidi80826µ-Slide 8 Well
APC przeciwciało anty-mysie CD8aBiolegend100712
BSAFisher Scientific199898
Chlorek wapniaSigmaC5670CaCl2
Chlorek wapnia dwuwodnySigmaC7902CaCl2 (dwuwodny)
Kompaktowy cyfrowy rockerThermo Fisher Scientific88880020
Konfokalny laserowo-skaningowy mikroskopLeicaSP8Otworek = 1,5-2 jednostki przewiewne; uzyskane z aperturą numeryczną 10x/0,40 HC PL APO CS2 dry i 20x/0,75 aperturą numeryczną HC PL APO CS2 na sucho 512  &czasy; &cienkie; Rozdzielczość 512 pikseli
D-(+)-GlukozaSigmaG7021C6H12O6
ddiH2O
DithizoneSigma-AldrichD5130-10G
DMSOInvitrogenD12345Etanol sulfotlenku dimetylu
Decon Laboratories2805
Naczynie do hodowli tkankowych Falcon 35 mmCorning353001Falcon Easy-Grip Naczynia do hodowli tkankowych
FBSGibco10082147
Feather No. 10 Ostrze chirurgiczneMikroskopia elektronowa Nauki7204410
fluo-4-AMInvitrogenF14201przepuszczalny dla komórek wskaźnik Ca2+
Gel Control Super GlueLoctite45198
Graefe KleszczeNarzędzia do nauki11049-10
Hartowane drobne nożyczkiNarzędzia do nauki precyzyjnej14090-09
HBSSGibco14025092Hanks Zrównoważony roztwór soli
HEPESSigmaH4034C8H18N2O4S
Wiadro na lódFisherbrand03-395-150
IsofluranePatterson VeterinaryNDC 14043-704-05
Johns Hopkins BulldogClamp Roboz Sklep chirurgicznyRS-7440  Prosty; Ciśnienie 500-900 gramów; Długość 1,5
cala KimwipesKimberly-Clark Professional34705Kimtech Nauka i handel; Kimwipes&handel; Delikatne wycieraczki zadaniowe, 2-warstwowe
ŻYWY/MARTWE Zestaw żywotności/cytotoksycznościInvitrogenL3224Ten zestaw zawiera barwnik żywych komórek kalceiny-AM.
DMEM o niskiej zawartości glukozyCorning10-014-CV
Sześciowodny chlorek magnezuSigmaM9272MgCl2 (sześciowodny)
Siarczan magnezu siedmiowodnySigmaM2773MgSO4 (heptahydrate)
Magnetyczna podgrzewana platformaWarner InstrumentsPM-1Platforma do komory obrazowania do dynamicznej stymulacji nagrania
Kuchenka mikrofalowaGEJES1460DSWW
Nalgene Filtr strzykawkowyThermo Fisher Scientific726-2520
No.4 PędzelMichaels10269140
Open Diamond Bath Imaging Chamber WarnerInstrumentsRC-26Komora obrazowania do nagrań stymulacji dynamicznej
Oregon Green 488 BAPTA-1-AMInvitrogenØ6807przepuszczalny dla komórek wskaźnik Ca2+
Nocna komora obrazowaniaOkolabH201-LG
PBSThermo Fisher Scientific20012050Wytwarzanie agarozy do wytwarzania plastrów
Tetramer insuliny znakowany PEEmory Tetramer ResearchPodstawowa sekwencja YAIENYLEL
Penicylina StreptomycynaGibco15140122
Chlorek potasuSigmaP5405KCl
Fosforan potasu jednozasadowySigmaP5655KH2PO4
Razor BladesMikroskopia elektronowa Sciences71998Do wibratomu; Dwukrawędziowa stal nierdzewna, niepowlekana
RPMI 1640Gibco11875093
SeaPlaque niskotopliwa agarozaLonza50101Do produkcji agarozy do wytwarzania plastrów
KotwicaSlice Warner Instruments64-1421
Kotwica Slice (obrazowanie dynamiczne)Warner Instruments640253Kotwica Slice do dynamicznej komory
obrazowaniaWodorowęglan soduSigmaS5761NaHCO3
Chlorek soduSigmaS5886NaCl
Jednowodny fosforan soduSigmaS9638NaH2PO4 (monohydrat)
Inhibitor trypsyny sojowejSigmaT6522-1GInhibitor trypsyny z Glycine max (soja)
Etap AdapterWarner InstrumentsSA-20MW-ALPasuje do komory obrazowania do nagrań stymulacji dynamicznej na stoliku mikroskopowym
Inkubator OkolabH201
StereoskopLeicaIC90 E MSV266
SYTOX Niebieskie barwienie martwych komórekInvitrogenS34857niebiesko-fluorescencyjne barwienie kwasem nukleinowym
Transfer PipetFalcon357575Falcon™ Plastikowe jednorazowe pipety transferowe
System sterowania zaworamiWarner InstrumentsVCS-8System do dynamicznych nagrań stymulacji
Vibratome VT1000 SLeicaVT1000 S
Kąpiel wodnaFisher ScientificFSGPD02Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Kąpiel wodna GPD 02
podskórne BD

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Uc, A., Fishman, D. S. Pancreatic disorders. Pediatric Clinics of North America. 64 (3), 685-706 (2017).
  2. Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes. Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).
  3. Taylor, R. Type 2 diabetes: etiology and reversibility. Diabetes Care. 36 (4), 1047-1055 (2013).
  4. Meier, R. P., et al. Islet of Langerhans isolation from pediatric and juvenile donor pancreases. Transplant International. 27 (9), 949-955 (2014).
  5. Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
  6. Panzer, J. K., Cohrs, C. M., Speier, S. Using pancreas tissue slices for the study of islet physiology. Methods in Molecular Biology. 2128, 301-312 (2020).
  7. Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells. Pflugers Archive. 446 (5), 553-558 (2003).
  8. Panzer, J. K., et al. Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis. JCI Insight. 5 (8), 134525(2020).
  9. Dolai, S., et al. Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis. Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).
  10. Dolai, S., et al. Pancreas-specific SNAP23 depletion prevents pancreatitis by attenuating pathological basolateral exocytosis and formation of trypsin-activating autolysosomes. Autophagy. , 1-14 (2020).
  11. Qadir, M. M. F., et al. Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration. Nature Communications. 11 (1), 3265(2020).
  12. Cohrs, C. M., et al. Dysfunction of persisting β cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis. Cell Reports. 31 (1), 107469(2020).
  13. Liang, T., et al. Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology. Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).
  14. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nat Reviews. Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).
  15. Lamont, D., et al. Compensatory mechanisms allow undersized anchor-deficient class I MHC ligands to mediate pathogenic autoreactive T cell responses. Journal of Immunology. 193 (5), 2135-2146 (2014).
  16. Anesthesia and analgesia in laboratory animals. Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. , Academic Press. (2011).
  17. Clark, S. A., Borland, K. M., Sherman, S. D., Rusack, T. C., Chick, W. L. Staining and in vitro toxicity of dithizone with canine, porcine, and bovine islets. Cell Transplantation. 3 (4), 299-306 (1994).
  18. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  19. Monette, R., Small, D. L., Mealing, G., Morley, P. A fluorescence confocal assay to assess neuronal viability in brain slices. Brain Research Protocols. 2 (2), 99-108 (1998).
  20. Gál, E., et al. A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice. Frontiers in Physiology. 10, 938(2019).
  21. Stožer, A., Dolenšek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PloS One. 8 (1), 54638(2013).
  22. Stožer, A., et al. Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices. PLoS Computational Biology. 9 (2), 1002923(2013).
  23. Früh, E., Elgert, C., Eggert, F., Scherneck, S., Rustenbeck, I. Glucagonotropic and glucagonostatic effects of KATP channel closure and potassium depolarization. Endocrinology. 162 (1), 136(2021).
  24. Satin, L. S. New mechanisms for sulfonylurea control of insulin secretion. Endocrine. 4 (3), 191-198 (1996).
  25. Ren, J., et al. Slow oscillations of KATP conductance in mouse pancreatic islets provide support for electrical bursting driven by metabolic oscillations. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (7), 805-817 (2013).
  26. Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ. PLoS One. 8 (11), 78706(2013).
  27. Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. Two-photon imaging of the immune system. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 12, Unit 12.26 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Pancreatic Tissue SlicesIslet FunctionIslet Immune InteractionsConfocal MicroscopyTime Lapse MicroscopyImmune Cell StainingVibratome SlicingType 1 DiabetesInsulin Tetramer StainingCD8 Antibody Detection

Related Articles