To badanie przedstawia zastosowanie żywych wycinków tkanki trzustki do badania fizjologii wysp trzustkowych i interakcji między komórkami odpornościowymi wysp trzustkowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obserwacja funkcji wysp trzustkowych i interakcji między wyspami trzustkowymi a komórkami układu odpornościowego w żywych wycinkach tkanki trzustkowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Żywe wycinki tkanki trzustki pozwalają na badanie fizjologii i funkcji wysp trzustkowych w kontekście nienaruszonego mikrośrodowiska wysp trzustkowych. Plastry przygotowywane są z żywej ludzkiej i mysiej tkanki trzustki zatopionej w agarozie i krojone za pomocą wibratomu. Metoda ta pozwala na utrzymanie żywotności i funkcji tkanki, a także na zachowanie podstawowych patologii, takich jak cukrzyca typu 1 (T1D) i cukrzyca typu 2 (T2D). Metoda slice umożliwia nowe kierunki w badaniu trzustki poprzez utrzymanie złożonych struktur i różnych interakcji międzykomórkowych, które składają się na tkanki endokrynne i zewnątrzwydzielnicze trzustki. Protokół ten pokazuje, jak przeprowadzić barwienie i mikroskopię poklatkową żywych endogennych komórek odpornościowych w wycinkach trzustki wraz z oceną fizjologii wysp trzustkowych. Co więcej, podejście to można udoskonalić w celu rozpoznania populacji komórek odpornościowych specyficznych dla antygenów komórek wysp trzustkowych przy użyciu głównych odczynników kompleks-multimer zgodności tkankowej.
Wprowadzenie
Zajęcie trzustki jest patognomoniczne w stosunku do chorób takich jak zapalenie trzustki, T1D i T2D1,2,3. Badanie funkcji izolowanych wysepek zwykle polega na usuwaniu wysepek z otaczającego je środowiska4. Metoda żywego wycinka tkanki trzustki została opracowana, aby umożliwić badanie tkanki trzustki przy zachowaniu nienaruszonych mikrośrodowisk wysp trzustkowych i unikaniu stosowania stresujących procedur izolacji wysp trzustkowych5,6,7. Wycinki tkanki trzus....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGI: Wszystkie protokoły eksperymentalne z użyciem myszy zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Florydy (201808642). Ludzkie skrawki trzustki od dawców tkanek obu płci uzyskano za pośrednictwem banku tkanek Sieci Dawców Narządów Trzustki z Cukrzycą (nPOD) na Uniwersytecie Florydy. Ludzka trzustka została pobrana od zmarłych dawców narządów przez certyfikowane organizacje zajmujące się pobieraniem narządów współpracujące z nPOD zgodnie z przepisami i regulacjami dotyczącymi dawstwa narządów i sklasyfikowane jako "osoby niebędące ludźmi" przez University of Florida Institutional Review Board (IRB) (IRB nr 392-2008), zrzekając....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Niniejszy protokół pozwoli na uzyskanie żywych skrawków tkanki trzustki, odpowiednich zarówno do badań funkcjonalnych, jak i do rejestracji komórek odpornościowych. Wygląd skrawków w polu jasnym oraz w świetle odbitym przedstawiono w Rycina 1A,BJak wspomniano, wyspy można zlokalizować w skrawkach przy użyciu światła odbitego ze względu na ich zwiększoną ziarnistość, wynikającą z zawartości insuliny (Rycina 1C) i są wyraźnie widoczne w porównaniu.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Celem tego protokołu jest wyjaśnienie procesu wytwarzania wycinków trzustki oraz procedur niezbędnych do ich wykorzystania w badaniach funkcjonalnych i immunologicznych. Stosowanie żywych plastrów trzustki ma wiele zalet. Istnieje jednak kilka krytycznych etapów, które są niezbędne, aby tkanka pozostała żywotna i użyteczna podczas opisanych protokołów eksperymentu. Konieczna jest szybka praca. Czas między wstrzyknięciem trzustki a wytworzeniem plastrów na wibratomie powinien być zminimalizowany, aby utrzymać żywotność tk.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana przez granty NIH R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638 i P01 AI042288. Badania te przeprowadzono przy wsparciu Sieci Dawców Narządów Trzustki z Cukrzycą (nPOD; RRID:SCR_014641), wspólny projekt badawczy dotyczący cukrzycy typu 1 sponsorowany przez JDRF (nPOD: 5--2018-557-Q-R) oraz The Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant #2018PG-T1D053). Odpowiedzialność za wyrażone treści i poglądy spoczywa na autorach i niekoniecznie odzwierciedlają one oficjalne stanowisko nPOD. Organizacje pobierające narządy (OPO) współpracujące z nPOD w celu zapewnienia zasobów badawczych są wymienione na stronie http://www.jdrfnpod.....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| #3 Stylowy uchwyt skalpela | Fisherbrand | 12-000-163 | |
| 1 M HEPES | Fisher Scientific | BP299-100 | Bufor HEPES, 1M roztwór |
| 10 cm Nieobrobione naczynie hodowlane | Corning | 430591 | |
| 10 mL Strzykawka Luer-Lok | BD | 301029 | BD z końcówkami Luer-Lok |
| Igła 27 G | BD | BD 305109 | BD Ogólnego zastosowania i PrecisionGlide Igły podskórne |
| 35 mm szalka Petriego ze szkłem nakrywkowym | Ibidi | 81156 | µ-Dish 35 mm, wysoka |
| strzykawka 50 ml | Szkło | 309653 | |
| 8-dołkowe | Ibidi | 80826 | µ-Slide 8 Well |
| APC przeciwciało anty-mysie CD8a | Biolegend | 100712 | |
| BSA | Fisher Scientific | 199898 | |
| Chlorek wapnia | Sigma | C5670 | CaCl2 |
| Chlorek wapnia dwuwodny | Sigma | C7902 | CaCl2 (dwuwodny) |
| Kompaktowy cyfrowy rocker | Thermo Fisher Scientific | 88880020 | |
| Konfokalny laserowo-skaningowy mikroskop | Leica | SP8 | Otworek = 1,5-2 jednostki przewiewne; uzyskane z aperturą numeryczną 10x/0,40 HC PL APO CS2 dry i 20x/0,75 aperturą numeryczną HC PL APO CS2 na sucho 512 &czasy; &cienkie; Rozdzielczość 512 pikseli |
| D-(+)-Glukoza | Sigma | G7021 | C6H12O6 |
| ddiH2O | |||
| Dithizone | Sigma-Aldrich | D5130-10G | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | Etanol sulfotlenku dimetylu |
| Decon Laboratories | 2805 | ||
| Naczynie do hodowli tkankowych Falcon 35 mm | Corning | 353001 | Falcon Easy-Grip Naczynia do hodowli tkankowych |
| FBS | Gibco | 10082147 | |
| Feather No. 10 Ostrze chirurgiczne | Mikroskopia elektronowa Nauki | 7204410 | |
| fluo-4-AM | Invitrogen | F14201 | przepuszczalny dla komórek wskaźnik Ca2+ |
| Gel Control Super Glue | Loctite | 45198 | |
| Graefe Kleszcze | Narzędzia do nauki | 11049-10 | |
| Hartowane drobne nożyczki | Narzędzia do nauki precyzyjnej | 14090-09 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | Hanks Zrównoważony roztwór soli |
| HEPES | Sigma | H4034 | C8H18N2O4S |
| Wiadro na lód | Fisherbrand | 03-395-150 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-05 | |
| Johns Hopkins Bulldog | Clamp Roboz Sklep chirurgiczny | RS-7440 | Prosty; Ciśnienie 500-900 gramów; Długość 1,5 |
| cala Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34705 | Kimtech Nauka i handel; Kimwipes&handel; Delikatne wycieraczki zadaniowe, 2-warstwowe |
| ŻYWY/MARTWE Zestaw żywotności/cytotoksyczności | Invitrogen | L3224 | Ten zestaw zawiera barwnik żywych komórek kalceiny-AM. |
| DMEM o niskiej zawartości glukozy | Corning | 10-014-CV | |
| Sześciowodny chlorek magnezu | Sigma | M9272 | MgCl2 (sześciowodny) |
| Siarczan magnezu siedmiowodny | Sigma | M2773 | MgSO4 (heptahydrate) |
| Magnetyczna podgrzewana platforma | Warner Instruments | PM-1 | Platforma do komory obrazowania do dynamicznej stymulacji nagrania |
| Kuchenka mikrofalowa | GE | JES1460DSWW | |
| Nalgene Filtr strzykawkowy | Thermo Fisher Scientific | 726-2520 | |
| No.4 Pędzel | Michaels | 10269140 | |
| Open Diamond Bath Imaging Chamber Warner | Instruments | RC-26 | Komora obrazowania do nagrań stymulacji dynamicznej |
| Oregon Green 488 BAPTA-1-AM | Invitrogen | Ø6807 | przepuszczalny dla komórek wskaźnik Ca2+ |
| Nocna komora obrazowania | Okolab | H201-LG | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | Wytwarzanie agarozy do wytwarzania plastrów |
| Tetramer insuliny znakowany PE | Emory Tetramer Research | Podstawowa sekwencja YAIENYLEL | |
| Penicylina Streptomycyna | Gibco | 15140122 | |
| Chlorek potasu | Sigma | P5405 | KCl |
| Fosforan potasu jednozasadowy | Sigma | P5655 | KH2PO4 |
| Razor Blades | Mikroskopia elektronowa Sciences | 71998 | Do wibratomu; Dwukrawędziowa stal nierdzewna, niepowlekana |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| SeaPlaque niskotopliwa agaroza | Lonza | 50101 | Do produkcji agarozy do wytwarzania plastrów |
| Kotwica | Slice Warner Instruments | 64-1421 | |
| Kotwica Slice (obrazowanie dynamiczne) | Warner Instruments | 640253 | Kotwica Slice do dynamicznej komory |
| obrazowaniaWodorowęglan sodu | Sigma | S5761 | NaHCO3 |
| Chlorek sodu | Sigma | S5886 | NaCl |
| Jednowodny fosforan sodu | Sigma | S9638 | NaH2PO4 (monohydrat) |
| Inhibitor trypsyny sojowej | Sigma | T6522-1G | Inhibitor trypsyny z Glycine max (soja) |
| Etap Adapter | Warner Instruments | SA-20MW-AL | Pasuje do komory obrazowania do nagrań stymulacji dynamicznej na stoliku mikroskopowym |
| Inkubator Okolab | H201 | ||
| Stereoskop | Leica | IC90 E MSV266 | |
| SYTOX Niebieskie barwienie martwych komórek | Invitrogen | S34857 | niebiesko-fluorescencyjne barwienie kwasem nukleinowym |
| Transfer Pipet | Falcon | 357575 | Falcon™ Plastikowe jednorazowe pipety transferowe |
| System sterowania zaworami | Warner Instruments | VCS-8 | System do dynamicznych nagrań stymulacji |
| Vibratome VT1000 S | Leica | VT1000 S | |
| Kąpiel wodna | Fisher Scientific | FSGPD02 | Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Kąpiel wodna GPD 02 |
Bibliografia
- Uc, A., Fishman, D. S. Pancreatic disorders. Pediatric Clinics of North America. 64 (3), 685-706 (2017).
- Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes. Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).
- Taylor, R.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
