Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wspólna hodowla komórek macierzystych podobnych do glejaka na neuronach wzorcowych w celu zbadania migracji i interakcji komórkowych

6.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62213

⸱

24 lutego 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1University Bordeaux, INSERM, LAMC, U1029, 33600, Pessac, France, 2Univ. Bordeaux, CNRS, Interdisciplinary Institute for Neuroscience, IINS, UMR 5297, Bordeaux, France, 3Alvéole, Bordeaux, France, 4University Bordeaux, CNRS, IBGC, UMR5095, 33000, Bordeaux, France

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy łatwy w użyciu test do analizy migracji glejaka (GBM) na neuronach o wzorcach. Opracowaliśmy makro w oprogramowaniu FiJi do łatwego ilościowego określania migracji komórek GBM na neuronach i zaobserwowaliśmy, że neurony modyfikują zdolność inwazyjną komórek GBM.

Streszczenie

Glejaki (GBM), glejaki złośliwe IV stopnia, są jednym z najbardziej śmiertelnych typów raka u ludzi ze względu na ich agresywne cechy. Pomimo znacznych postępów w genetyce tych nowotworów, sposób, w jaki komórki GBM atakują zdrowy miąższ mózgu, nie jest dobrze poznany. W szczególności wykazano, że komórki GBM atakują przestrzeń okołonowotworową różnymi drogami; Głównym przedmiotem zainteresowania niniejszej pracy jest trasa wzdłuż szlaków istoty białej (WMT). Interakcje komórek nowotworowych ze składnikami okołonowotworowych komórek nerwowych nie są dobrze scharakteryzowane. W niniejszym artykule opisano metodę, która ocenia wpływ neuronów na inwazję komórek GBM. W artykule przedstawiono zaawansowany test kohodowli in vitro, który naśladuje inwazję WMT, analizując migrację komórek macierzystych GBM na neurony. Zachowanie komórek GBM w obecności neuronów jest monitorowane za pomocą zautomatyzowanej procedury śledzenia za pomocą oprogramowania o otwartym kodzie źródłowym i bezpłatnym dostępie. Metoda ta jest przydatna w wielu zastosowaniach, w szczególności w badaniach funkcjonalnych i mechanistycznych, a także do analizy wpływu środków farmakologicznych, które mogą blokować migrację komórek GBM na neurony.

Wprowadzenie

Pierwotne złośliwe glejaki, w tym GBM, są wyniszczającymi nowotworami, ze średnim wskaźnikiem przeżycia od 12 do 15 miesięcy zgłaszanym u pacjentów z GBM. Obecna terapia opiera się na resekcji dużej masy guza i chemioterapii w połączeniu z radioterapią, co wydłuża wskaźnik przeżycia tylko o kilka miesięcy. Niepowodzenia terapeutyczne są ściśle związane ze słabym dostarczaniem leków przez barierę krew-mózg (BBB) oraz z inwazyjnym wzrostem w przestrzeniach okołonaczyniowych, oponach mózgowych i wzdłuż WMTs1. Inwazja okołonaczyniowa, zwana również kooptacją naczyniową, jest dobrze zbadanym procesem, a mechanizmy molekularne zaczynają być wyjaśniane; jednak proces inwazji komórek GBM wzdłuż WMT nie jest dobrze poznany. Komórki nowotworowe migrują do zdrowego mózgu wzdłuż drugorzędowych struktur Scherera2. Rzeczywiście, prawie sto lat temu Hans-Joachim Scherer opisał inwazyjne drogi GBM, które są obecnie określane jako satellitoza okołoneuronalna, satelltoza okołonaczyniowa, rozprzestrzenianie się subpialne i inwazja wzdłuż WMT (ryc. 1A).

Niektóre chemokiny i ich receptory, takie jak czynnik 1α pochodzenia komórek zrębu (SDF1α) i receptor chemokiny z motywem C-X-C 4 (CXCR4), ale nie czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), wydają się być związane z inwazją WMT3. Ostatnio wykazano, że transkomórkowa oś NOTCH1-SOX2 jest ważną ścieżką w inwazji WMT na komórki GBM4. Autorzy opisali, w jaki sposób komórki macierzyste GBM atakują miąższ mózgu na częściowo niezmielinizowanych neuronach, co sugeruje niszczenie osłonek mielinowych przez komórki GBM. Kamień milowy został osiągnięty w 2019 roku, kiedy to w czasopiśmie Nature opublikowano kolejno trzy artykuły, podkreślające rolę aktywności elektrycznej w rozwoju glejaka5,6. Przełomowe prace Monje i współpracowników rzucają światło na kluczową rolę aktywności elektrycznej w wydzielaniu neuroliginy-3, która sprzyja rozwojowi glejaka.

Winkler i współpracownicy opisali połączenia między komórkami GBM (mikrorurkami) jako kluczowe w etapach inwazyjnych, a ostatnio interakcje między komórkami GBM a neuronami za pośrednictwem nowo opisanych synaps glejaka. Struktury te sprzyjają glutaminergicznemu stymulowaniu receptorów kwasu α-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-izoksazolopropionowego (AMPA) zlokalizowanych na błonie komórkowej GBM, co sprzyja rozwojowi i inwazji guza. Inwazja komórek nowotworowych jest centralnym procesem w rozprzestrzenianiu się przerzutów lub odległych ognisk wtórnych, obserwowanych u pacjentów z GBM. Zidentyfikowano kilka czynników ważnych w inwazji GBM, takich jak trombospondyna-1, transformujący czynnik wzrostu beta (białko matrikomórkowe regulowane przez TGFβ lub receptor chemokiny CXCR3)7,8.

Tutaj opisano uproszczony model biomimetyczny do badania inwazji GBM, w którym neurony są wzorowane na ścieżkach lamininy, a komórki GBM są na niej zasiewane, jako pojedyncze komórki lub jako sferoidy (Rysunek 1B). Dwa eksperymentalne ustawienia mają na celu rekapitulację inwazji na neurony, którą obserwuje się w GBM9,10,11. Takie modele zostały opracowane w przeszłości jako wyrównane biomateriały z nanowłókien (elektroprzędzenie rdzeń-powłoka), które umożliwiają badanie migracji komórek poprzez modulację właściwości mechanicznych lub chemicznych12. Model kokultury opisany w tym artykule pozwala lepiej zrozumieć, w jaki sposób komórki GBM uciekają z neuronów, definiując nowe szlaki molekularne zaangażowane w ten proces.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uzyskano świadomą pisemną zgodę od wszystkich pacjentów (ze Szpitala Haukeland, Bergen, Norwegia, zgodnie z lokalnymi przepisami komisji etyki). Protokół ten jest zgodny z wytycznymi komisji etycznych ds. badań na ludziach i zwierzętach Uniwersytetu w Bordeaux. Ciężarne szczury były trzymane i leczone w ośrodku dla zwierząt Uniwersytetu w Bordeaux. Eutanazja ciężarnej szczurzy, której podano dawkę E18, przeprowadzono przy użyciu CO2 . Wszystkie procedury na zwierzętach zostały wykonane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną. Wszystkie produkty komercyjne są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Przygotowanie wzorzystych slajdów

  1. Przygotowanie podłoża do mikromodelowania
    1. Szkiełka nakrywkowe o średnicy 18 mm należy poddawać aktywacji powietrzem/plazmą przez 5 minut. Umieścić szkiełka nakrywkowe w zamkniętej komorze ze 100 μl (3-aminopropylo)trietoksysilanu w eksykatorze na 1 godzinę.
    2. Inkubować ze 100 mg/ml walerianianu poli(glikolu etylenowego)-sukcynimidylu (masa cząsteczkowa 5 000 (Peg-SVA)) w 10 mM buforze węglanowym o pH > 8 przez 1 godzinę. Dokładnie spłukać ultraczystą wodą i wysuszyć pod kapturem chemicznym.
      UWAGA: Na tym etapie próbka może być przechowywana w temperaturze 4 °C w ciemności do dalszego wykorzystania.
    3. Dodać fotoinicjator, chlorek 4-benzoilobenzylo-trimetyloamoniowy (PLPP), w stężeniu 14,7 mg/ml w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS).
      UWAGA: Można również stosować skoncentrowaną formę PLPP, żel PLPP. Powoduje to krótszy czas oświetlenia ultrafioletowego (UV) wymagany do degradacji szczotki PEG (100 mJ/mm2).
  2. Osadzanie żelu fotoinicjatora
    1. Przygotuj mieszaninę 3 μl żelu PLPP i 50 μl absolutnego etanolu do osadzenia na środku szkiełka. Umieścić próbkę pod osłoną chemiczną aż do całkowitego odparowania absolutnego etanolu.
      UWAGA: Na tym etapie próbka może być przechowywana w temperaturze 4 °C w ciemności do dalszego wykorzystania.
  3. Mikrowzory szkiełek szklanych
    1. Zamontuj szkiełko nakrywkowe w komorze Ludina i umieść je na zmotoryzowanym stoliku mikroskopu wyposażonym w system automatycznego ustawiania ostrości.
    2. Załaduj do oprogramowania obrazy odpowiadające przewidywanym mikrowzorcom. Zastosuj następujące parametry: replikacja 4 x 4 razy, odstęp 200 μm, dawka UV 1 000 mJ/mm2. Po automatycznej sekwencji oświetlenia UV spłucz PLPP wieloma płukaniami PBS.
      UWAGA: Jeśli użyto żelu PLPP, usuń go przez obfite płukanie wodą dejonizowaną, wysusz w strumieniu N2 i przechowuj w temperaturze 4 °C.
    3. Inkubować z lamininą (50 μg/ml w PBS) przez 30 min. Dokładnie przemyć PBS.
      UWAGA: Fluorescencyjny roztwór oczyszczonego białka zielonej fluorescencji (GFP, 10 μg/ml w PBS) można zmieszać z lamininą w celu wizualizacji mikrowzorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

2. Przygotowanie neuronów i komórek GBM do wspólnej hodowli

  1. Hodowla embrionalnych neuronów hipokampa szczura
    1. Rozciąć hipokamp zarodków (E18) szczurów i przenieść tkankę do roztworu soli Hanka (HBSS)/1 mM roztworu kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES)/penicyliny-streptomycyny w probówce o pojemności 15 ml. Usuń nadmiar roztworu bez wysuszania hipokampa.
    2. Dodać 5 ml trypsyny-etylenodiaminy, kwasu tetraoctowego (EDTA) uzupełnionego penicyliną (10 000 jednostek/ml)/streptomycyną (10 000 μg/ml) i 1 mM HEPS i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Przemyć 2x roztworem HBSS/HEPES/penicylina-streptomycyna i pozostawić tkankę w tym roztworze przez 2-3 minuty.
    3. Oddziel tkankę za pomocą dwóch wypolerowanych płomieniowo pipet Pasteura, pipetując w górę i w dół 10 razy każdą tkanką, uważając, aby zminimalizować pienienie. Policz komórki i oceń żywotność zawiesiny komórek. Umieść neurony na mikrowzorzystych szkiełkach nakrywkowych, jak pokazano poniżej.
      UWAGA: Wskaźnik żywotności komórek wynosi 85-90% po ekstrakcji.
  2. Hodowla komórkowa neuronów na mikrowzorzystych szkiełkach nakrywkowych
    1. Ponownie uwodnić szkiełka z mikrowzorem za pomocą PBS i inkubować kompletną pożywkę do hodowli komórek neuronalnych.
    2. Wysiewaj neurony hipokampa uzyskane od szczurów E18 Sprague-Dawley bezpośrednio nad szkiełkiem nakrywkowym z mikrowzorem o gęstości 50 000 komórek nacm2 w podłożu neurobazalnym (NBM) wzbogaconym o 3% surowicę końską. Umieść neurony z mikrowzorem w inkubatorze (37 °C, 5% CO2) przez 48 godzin
      UWAGA: Po ~6 godzinach można zauważyć pierwotne neurony hipokampa przylegające do mikrowzorów lamininy.
  3. Wspólna hodowla ludzkich komórek macierzystych podobnych do GBM na neuronach
    UWAGA: W tym badaniu błonowe komórki GBM GFP-dodatnie i pochodzące od pacjentów z pomidorami jądrowymi były hodowane zgodnie z poprzednio opublikowanymi protokołami10.
    1. Gdy komórki w kształcie sferoidy rosną w zawiesinie, odwirować zawiesinę przez 5 minut w temperaturze 200 × g. Przemyć sferoidy 5 ml PBS i inkubować komórki z 0,5 ml odczynnika do dysocjacji komórek (patrz Tabela Materiałów) przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
    2. Dodaj 4,5 ml kompletnego NBM (uzupełnionego suplementem witaminy B27, heparyną, czynnikiem wzrostu fibroblastów 2, penicyliną i streptomycyną, jak opisano wcześniej8) i policz komórki za pomocą techniki automatycznego liczenia.
    3. Wysiewaj 1,000 komórek GBM na mikrowzorzystej kulturze neuronalnej w NBM wzbogaconym o 3% surowicę końską. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95%.

3. Obrazowanie żywych komórek

  1. Bezpośrednio po wysianiu komórek GBM należy umieścić próbkę na stoliku mikroskopu odwróconego wyposażonego w komorę termostatyczną. Wykonuj obrazowanie żywych komórek na mikroskopie wyposażonym w zmotoryzowany stolik do rejestrowania wielu pozycji za pomocą wielowymiarowego zestawu narzędzi do akwizycji w oprogramowaniu. Wykonuj obrazy w jasnym polu i epifluorescencji GFP/Tomato co 5 minut przez 12 godzin za pomocą obiektywu 20x w środowisku o kontrolowanej temperaturze (37 °C) i gazie (5%CO2).

4. Analiza obrazu

UWAGA: Korzystając z Fidżi, dwuwymiarowy (2D) stos obrazów został półautomatycznie przetworzony lub przetworzony za pomocą domowego i przyjaznego dla użytkownika narzędzia (dostępnego pod tym adresem: https://github.com/Guyon-J/Coculture_Gliomas-Neurons/blob/main/README.md), które jest napisane w języku makr IJ1 (Rysunek 2A). Zautomatyzowany przepływ pracy i procedury są podsumowane w Rysunek 2B.

  1. Analiza sieci neuronalnych (Rysunek 2Bi)
    1. Zaznacz jeden obraz stosu. Kliknij prawym przyciskiem myszy narzędzie Sieć, aby otworzyć odpowiednie okno dialogowe Opcje i dostosować ustawienia (np. Próg = Trójkąt, Li, Huang..., Rozmycie gaussowskie i Mediana filtrów = 1, 2, 3...), aby uzyskać precyzyjną segmentację obrazów. Następnie kliknij OK.
    2. Kliknij lewym przyciskiem myszy narzędzie Sieć, aby automatycznie aktywować następującą procedurę.
      1. Zduplikuj zaznaczony obraz i podziel go na trzy kanały kolorów (czerwony-szary-zielony).
      2. Wybierz kanał szarości (jasne pole) i wykonaj wzmocnienie rozciągnięcia kontrastu (CSE), aby zwiększyć separację między różnymi obszarami. Użyj detektora krawędzi Sobel (SED), aby wykonać operację przetwarzania sygnału 2D konwolucji, która jest już zgrupowana w poleceniu Znajdź krawędź.
      3. W przypadku podwójnego filtrowania (F) zastosuj filtr rozmycia gaussowskiego i mediany, aby zredukować szum i wygładzić sygnał obiektu. Konwertuj na maskę (CM), wykonując dostosowane algorytmy progowe, aby uzyskać obraz binarny (BIN-szary) z czarnymi pikselami (obszar komórki) i białymi pikselami (tło). Szkieletyzuj (Sk) obszar komórki w prostą sieć (NET) i filtruj cząstki (EP) w obrazie NET, usuwając małe, niepołączone w sieć cząstki.
      4. W przypadku kanałów czerwonych i zielonych (jądro i błona) wykonaj podwójne filtrowanie, przekonwertuj na Maskę przy użyciu dostosowanej metody progowania i pozwól BIN-green określić morfologię komórki za pomocą polecenia Analizuj cząstki.
      5. Scal wszystkie kanały, używając ich obszaru zainteresowania (ROI) z operatorem OR (połącz) i ponownie dostosuj ich początkowy kolor do prostego obrazu RGB.
  2. Analiza ruchliwości pojedynczej komórki (Rysunek 2Bii)
    1. Kliknij prawym przyciskiem myszy narzędzie Śledzenie pojedynczej komórki, aby otworzyć odpowiednie okno dialogowe Opcje i dostosuj ustawienia (np. Typ ścieżki = Jądro lub Membrana, Próg = Trójkąt, Li, Huang..., Projekcja Z = Maksymalna intensywność, Suma wycinków..., Rozmycie gaussowskie i Filtry mediany = 1, 2, 3...), aby uzyskać precyzyjną segmentację obrazów. Następnie kliknij OK.
    2. Kliknij lewym przyciskiem myszy narzędzie do śledzenia pojedynczych komórek, aby automatycznie aktywować następującą procedurę.
      1. Usuń szary kanał. Zastosuj rzut Z na stosie, który wygeneruje obraz odpowiadający stosowi obrazów zgodnie z czasem (T-stack). Dwukrotnie przefiltruj i przekonwertuj na Maskuj ślady pozostawione przez komórki. Usuń małe cząstki z czerwonego/zielonego obrazu BIN.
      2. Korzystając z ROI, zaznacz każdy kontur śladu komórki i zaznacz pole wyboru Pomiń wykrywanie krawędzi w oknie dialogowym Opcje, aby pominąć ten krok przetwarzania wstępnego dla kolejnych kroków.
      3. Wyizoluj kanał czerwony (typ śladu = jądro) na oryginalnym stosie. Wybierz jeden zwrot z inwestycji i usuń obszar zewnętrzny. Dwukrotnie przefiltruj wszystkie obrazy i przekonwertuj je na maskę (BIN-czerwony). Określ położenie środka ciężkości X/Y każdego binaryzowanego jądra.
    3. Korzystając z już opublikowanego makra dla arkusza kalkulacyjnego software13, oblicz średnie przemieszczenie kwadratowe, współczynnik kierunkowości i średnią prędkość dla tej komórki.
  3. Analiza śledzenia wielu komórek (Rysunek 2Biii)
    1. Kliknij prawym przyciskiem myszy narzędzie Śledzenie, aby otworzyć odpowiednie okno dialogowe Opcje i dostosować ustawienia (np. Próg = Trójkąt, Li, Huang..., Rozmycie gaussowskie i Mediana filtrów = 1, 2, 3...), aby uzyskać precyzyjną segmentację obrazów. Następnie kliknij OK.
    2. Kliknij lewym przyciskiem myszy narzędzie do śledzenia, aby automatycznie aktywować następującą procedurę.
      1. Usuń szary kanał.
      2. Podziel kanały czerwony i zielony, podwójnie przefiltruj i przekonwertuj na maskę.
      3. Połącz kanały za pomocą polecenia Image Calculator... z operatorem AND, pozostawiając tylko sygnał jądra znajdujący się w membranach.
        UWAGA: Kilka wtyczek na Fidżi może być używanych do określania pozycji X/Y kilku komórek w tym binarnym, wstępnie przetworzonym obrazie w tym samym czasie (patrz Tabela materiałów).
    3. Korzystając z wcześniej opisanego makro13, oblicz wykres trajektorii, średnie przemieszczenie kwadratowe, współczynnik kierunkowości i średnią prędkość dla tych komórek.
  4. Migracja sferoidów na macie neuronowej (Rysunek 2Biv)
    1. Kliknij prawym przyciskiem myszy narzędzie Migracja, aby otworzyć odpowiednie okno dialogowe Opcje i dostosować ustawienia (np. Próg = Trójkąt, Li, Huang..., Rozmycie gaussowskie i Mediana filtrów = 1, 2, 3...), aby uzyskać precyzyjną segmentację obrazów. Następnie kliknij OK.
    2. Kliknij lewym przyciskiem myszy narzędzie do migracji, aby automatycznie aktywować następującą procedurę.
      1. Usuń czerwony kanał.
      2. Podziel kanały zielony i szary.
      3. W przypadku kanału szarego narysuj ręcznie kontur maty neuronalnej i zmierz jej powierzchnię.
      4. W przypadku kanału zielonego przefiltruj stos dwukrotnie i przekonwertuj go na maskę. Usuń obszar poza wzorcem (BIN) i określ binaryzowany obszar komórki dla każdego obrazu.
        UWAGA: Parametry opisane powyżej kalibruje się poprzez zmianę ich wartości poprzez kliknięcie lewym przyciskiem myszy na interesującą nas ikonę. To przetwarzanie można wykonać ręcznie. Jednak w przypadku dużej liczby obrazów (około stu na akwizycję), kanałów (zwykle 3 kanały) i etapów przetwarzania preferowane byłoby narzędzie zautomatyzowane lub półautomatyczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Uzorowane neurony współhodowane z fluorescencyjnymi komórkami GBM przygotowano zgodnie z opisem w sekcji protokołu, a następnie przeprowadzono eksperymenty z monitorowaniem ruchu. Komórki GBM szybko zmieniały swój kształt podczas migracji na neuronach (Rycina 1B: panel 6 oraz Wideo 1). Komórki migrowały wzdłuż wypustek neuronalnych w ruchu chaotycznym (Wideo 1). Fluorescencyjne komórki GBM i niefluorescencyjne neurony można łatwo od siebie o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Glejaki intensywnie atakują miąższ za pomocą różnych trybów: kooptacji otaczających naczyń krwionośnych, inwazji śródmiąższowej lub inwazji na WMT18. Ten ostatni tryb nie jest dobrze scharakteryzowany w literaturze ze względu na trudności w znalezieniu odpowiednich modeli in vitro lub in vivo związanych z inwazją WMT. W tym przypadku zaproponowano uproszczony model, w którym hodowane neurony gryzoni wzorowano na powierzchniach pokrytych lamininą, a fluorescencyjne komórki macierz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Fondation ARC 2020, Ligue Contre le Cancer (Comité de la Gironde), ARTC, Plan Cancer 2021, INCA PLBIO. Alveole jest wspierany przez Agence Nationale de la Recherche (Grant Labex BRAIN ANR-10-LABX-43). Joris Guyon jest stypendystą Szpitala Uniwersyteckiego w Tuluzie (CHU Toulouse).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(3-aminopropylo)trietoksysilanSigma440140-100MLGrupa aminowa jest przydatna do biokoniugacji mPEG-SVA
96-dołkowej płytki okrągłodennejSarstedt2582624Służy do przygotowania sferoid
AccutaseGibcoA11105-01Przechowywany w temperaturze -20 ° C (długoterminowe) lub 4 ° C (krótkotrwały), enzym dysocjacji sferycznej
B27Gibco12587Przechowywany w temperaturze -20 & deg; C, rozmrozić przed użyciem
Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastówPeprotech100-18BPrzechowywany w temperaturze -20 & deg; C, rozmrozić przed użyciem
Countess Cell Counting ChamberSlidesInvitrogenC10283Służy do liczenia komórek
Szkiełka nakrywkoweMarienfeld111580Podłoże do hodowli komórkowych
Wkłady eksykatoraSigmaZ363456-6EASłuży do redukcji mchusty podczas obróbki (3-aminopropylo) trietoksysilanu
DPBS 10xPan BiotechP04-53-500Przechowywany w 4 ° C
Oprogramowanie Fidżi, MTrack2 makroImageJSłuży do analizy zdjęć
Kolba 75 cm²Falcon10497302
HBSSSigmaH8264-500ML
Heparyna sodowaSigmaH3149-100KUPrzechowywany w temperaturze 4 stopni; C
Laminin114956-81-9Wspomaga adhezję neuronów
Oprogramowanieładowanie przewidywanych mikrowzorów
Oprogramowanie MetaMorph Molecular Devices LLCNA Oprogramowaniedo automatyzacji mikroskopii
MetylocelulozaSigmaM0512Rozcieńczony w NBM dla 2% stężenia końcowego
Pożywka neurobazalnaGibco21103-049Przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C
Nikon TiE (S Fluor, 20x/0,75 NA)odwrócony wyposażony w zmotoryzowany stolik 
Penicylina - StreptomycynaGibco15140-122Przechowywany w temperaturze 4 stopni; C
PLPPAlveolePLPPclassic_1mlFotoinicjator stosowany do degradacji szczotki PEG
Poli(glikol etylenowy)-Walerianian sukcynimidylu (mPEG-SVA)Laysan BioVA-PEG-VA-5000-5gStosowany jako powłoka przeciwporostowa
PRIMOAlveolePRIMO1Cyfrowy aparat projekcyjny UV na bazie mikrolustra (DMD)
Trypan niebieski 0,4%ThermoFisherT10282Służy do liczenia komórek
Trypsin-EDTASigmaT4049-100MLSłuży do odłączania przylegających komórek
Leonardo mikroskop

Bibliografia

  1. Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. Current challenges and opportunities in treating glioblastoma. Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).
  2. Scherer, H. J. The forms of growth in gliomas and their practical significance. Brain. 63, 1-35 (1940).
  3. Zagzag, D., et al. Hypoxia- and vascular endothelial growth factor-induced stromal cell-derived factor-1α/CXCR4 expression in glioblastomas. American Journal of Pathology. 173, 545-560 (2008).
  4. Wang, J., et al. Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop. Nature Neurosciences. 22, 91-105 (2019).
  5. Venkataramani, V., et al. Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression. Nature. 573, 532-538 (2019).
  6. Venkatesh, H. S., et al. Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits. Nature. 573, 539-545 (2019).
  7. Boyé, K., et al. The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors. Nature Communications. 8, 1571(2017).
  8. Daubon, T., et al. Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development. Nature Communications. 10, 1146(2019).
  9. Gritsenko, P. G., et al. p120-catenin-dependent collective brain infiltration by glioma cell networks. Nature Cell Biology. 22, 97-107 (2020).
  10. Guyon, J., et al. A 3D spheroid model for glioblastoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (158), (2020).
  11. Strale, P. O., et al. Multiprotein Printing by Light?Induced Molecular Adsorption. Advanced Materials. , (2015).
  12. Rao, S. S., et al. Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors. Biomaterials. 34, 5181-5190 (2013).
  13. Visweshwaran, S. P., Maritzen, T. A simple 3D cellular chemotaxis assay and analysis workflow suitable for a wide range of migrating cells. MethodsX. 6, 2807-2821 (2019).
  14. Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems. Biophysics Journal. 60, 910-921 (1991).
  15. Pasturel, A., Strale, P. -O., Studer, V. Tailoring common hydrogels into 3D cell culture templates. Advance Healthcare Materials. 9, 2000519(2020).
  16. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145, 831-834 (2011).
  17. Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140, 898-913 (2017).
  18. Linkous, A., et al. Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids. Cell Reports. 26, 3203-3211 (2019).
  19. Han, M., et al. Interfering with long non-coding RNA MIR22HG processing inhibits glioblastoma progression through suppression of Wnt/β-catenin signalling. Brain. 143, 512-530 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Komórki macierzyste glejakakokultura z neuronamimigracja komórekszlaki istoty białejobrazowanie żywych komórekśledzenie pojedynczych komórekmikroskopia konfokalnaanaliza sieci neuronalnychruchliwość komórek
Wspólna hodowla komórek macierzystych podobnych do glejaka na neuronach wzorcowych w celu zbadania migracji i interakcji komórkowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.