Artykuł metodologiczny

Podwójne znakowanie immunofluorescencji przy użyciu przeciwciał tego samego gatunku do badania interakcji gospodarz-patogen

DOI:

10.3791/62219

⸱

10 lipca 2021

 ,  , 
1Laboratory of Cell and Molecular Biology of Trypanosomatids, Department of Cellular and Molecular Biology and Pathogenic Bioagents, Ribeirao Preto Medical School, University of Sao Paulo, Ribeirao Preto, SP, Brazil

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj protokół opisuje, jak przeprowadzić podwójne znakowanie immunofluorescencji przy użyciu pierwotnych przeciwciał wyhodowanych u tego samego gatunku w celu zbadania interakcji gospodarz-patogen. W tym protokole może również zawierać trzecie przeciwciało od innego gospodarza. Takie podejście można zastosować w każdym typie komórek i patogenach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecnie można znaleźć szeroki zakres narzędzi molekularnych do badania interakcji między komórkami pasożyta i gospodarza. Istnieją jednak pewne ograniczenia w uzyskiwaniu komercyjnych przeciwciał monoklonalnych lub poliklonalnych, które rozpoznają określone struktury komórkowe i białka pasożytów. Poza tym dostępnych jest niewiele komercyjnych przeciwciał do oznaczania trypanosomatydów. Zazwyczaj przeciwciała poliklonalne przeciwko pasożytom są przygotowywane we własnym zakresie i mogą być trudniejsze do użycia w połączeniu z innymi przeciwciałami wytwarzanymi u tego samego gatunku. W tym przypadku protokół pokazuje, jak wykorzystać przeciwciała poliklonalne i monoklonalne wyhodowane u tego samego gatunku do przeprowadzenia immunofluorescencji podwójnego znakowania w celu zbadania interakcji komórek gospodarza i patogenu. Aby osiągnąć immunofluorescencję podwójnego znakowania, ważne jest, aby najpierw inkubować mysie przeciwciało poliklonalne, a następnie kontynuować inkubację z wtórnym mysim przeciwciałem IgG skoniugowanym z dowolnym fluorochromem. Następnie konieczny jest dodatkowy etap blokowania, aby zapobiec rozpoznaniu jakichkolwiek śladów przeciwciała pierwszorzędowego przez następne przeciwciało drugorzędowe. Następnie mysie przeciwciało monoklonalne i jego specyficzne przeciwciało drugorzędowe podklasy IgG sprzężone z innym fluorochromem są dodawane do próbki w odpowiednim czasie. Dodatkowo możliwe jest przeprowadzenie immunofluorescencji z potrójnym znakowaniem przy użyciu trzeciego przeciwciała wyhodowanego u innego gatunku. Ponadto struktury takie jak jądra i aktyna mogą być następnie barwione ich specyficznymi związkami lub etykietami. W związku z tym przedstawione tutaj podejścia można dostosować do każdej komórki, której źródła pierwotnych przeciwciał są ograniczone.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie interakcji patogenu z komórką gospodarza na poziomie komórkowym dostarcza istotnych informacji na temat przyczyn leżących u podstaw choroby, ponieważ różne grupy, takie jak wirusy, bakterie i pierwotniaki, mogą infekować większość typów komórek gospodarza1,2,3,4. Może również pomóc w opracowaniu i identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych, które mogą spowolnić lub zahamować wzrost patogenu. W warunkach życia wytworzone przeciwciała są odpowiedzialne za rozpoznawanie własnych składników, antygenów wirusów, składników lub produktów bakteryjnych, grzybów, pasożytów i innych5.

Do tego celu, przeciwciała są powszechnie używanymi narzędziami, głównie do zrozumienia lokalizacji i funkcji struktur komórkowych i białek. Kilka badań wykorzystujących wielokrotne znakowanie przeciwciał pokazuje, że dodatkowe etapy blokowania przyczyniają się do swoistości immunolokalizacji. Ponadto większość opisanych protokołów wykorzystuje specyficzne komercyjne przeciwciała monoklonalne, w tym przeciwciała tego samego gatunku gospodarza6,7,8,9,10,11,12,13,14.

Zazwyczaj, podwójne znakowanie immunofluorescencji wykorzystuje dwa przeciwciała wyhodowane w różnych gatunkach do barwienia interesujących struktur komórkowych lub patogenów i komórek gospodarza, aby zobaczyć interakcję między nimi. Może to jednak stanowić problem, gdy nie są dostępne komercyjne przeciwciała monoklonalne lub poliklonalne specyficzne dla niektórych patogenów, które mogłyby przeprowadzić podwójne znakowanie. Istnieją również dostępne na rynku zestawy do koniugacji przeciwciał i możliwe jest koniugowanie pierwotnych przeciwciał bezpośrednio z fluoroforem za pomocą reakcji estru sukcynimidylu15. Problem polega na tym, że zestawy te są często drogie i konieczne jest posiadanie wystarczającej ilości przeciwciał, aby je oznaczyć. Wiedząc o tym, z powodzeniem opracowaliśmy metodę podwójnej immunofluorescencji przy użyciu dwóch różnych przeciwciał wyhodowanych u tego samego gatunku w celu zbadania lokalizacji białka w Trypanosoma brucei16. Jednak w przypadku pasożytów wewnątrzkomórkowych, w tym Trypanosoma cruzi, podejście to nie zostało wykazane. Tutaj pokazujemy, jak przeprowadzić immunofluorescencję podwójnego znakowania w celu zbadania wewnątrzkomórkowych pasożytów T. cruzi i komórki gospodarza przy użyciu pierwotnych przeciwciał wyhodowanych u tego samego gatunku bez reakcji krzyżowych. Oprócz tej metody ustalono potrójne znakowanie immunofluorescencyjne z dodatkiem trzeciego przeciwciała innego gatunku. Podejścia te pomagają, gdy źródło przeciwciał jest ograniczone i mogą być stosowane w każdym typie komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowle komórek i pasożytów

  1. Hoduj komórki LLC-MK2 (nabłonek nerki małpy rezus) z American Type Culture Collection (CCL-7) w kolbie do hodowli komórkowych o średnicy 25 cm2 zawierającej pożywkę RPMI uzupełnioną 10% inaktywowaną termicznie FBS (płodową surowicę bydlęcą) i antybiotykami (100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny) w temperaturze 37 °C w 5% CO2 17.
  2. Zainfekuj komórki LLC-MK2 Trypanosoma cruzi (szczep Y) zgodnie z poprzednim protokołem 18.
  3. Zebrać supernatant zakażonych komórek LLC-MK2 (5 ml) w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml do hodowli komórkowych i wirować przy 500 x g przez 10 minut w temperaturze 22 °C w celu obniżenia resztek komórek. Utrzymywać probówkę przez 10 minut w temperaturze 37 °C, aby trypomastigoty mogły dopłynąć do supernatantu.
  4. Zebrać supernatant do nowej stożkowej probówki i odwirować przy 2500 x g przez 15 minut w temperaturze 22 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad zawierający pasożyty w kompletnym podłożu RPMI w celu określenia gęstości komórek poprzez zliczenie komórek w komorze Neubauera.

2. Protokół kontroli immunofluorescencji

UWAGA: Po utrwaleniu, możliwe jest przechowywanie płytek zawierających szkiełka nakrywkowe w temperaturze 4 °C w 1x PBS (pH 7,2) przez jeden tydzień. Aby można je było przechowywać, ważne jest, aby komórki nie przeszły etapu przepuszczalności.

  1. Umieść ogniwa LLC-MK2 (2 x 104) w 24-dołkowych płytkach zawierających zaokrąglone szkiełka nakrywkowe sterylizowane promieniami UV w pożywkach RPMI przez 16 godzin.
  2. W przypadku zakażonych komórek dodać supernatant zawierający T. cruzi (pozycja 1.4) do każdej studzienki proporcjonalnie (MOI 10:1) i pozostawić na 6 godzin infekcji. Przemyć szkiełka nakrywkowe zawierające zakażone i niezakażone komórki pięciokrotnie roztworem PBS i utrwalić 2% paraformaldehydem w 1x PBS (pH 7,2) przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).
  3. Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy po 5 minut za pomocą 1x PBS (pH 7,2).
  4. Przepuszczalność szkiełek nakrywkowych za pomocą 0,2% IGEPAL CA-630 w 1x PBS (PH 7,2) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy po 5 minut za pomocą 1x PBS.
  6. Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 30 minut w temperaturze pokojowej z roztworem blokującym (2% BSA w 1x PBS, pH 7,2).
  7. Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 30 minut w temperaturze pokojowej z mysimi monoklonalnymi przeciwciałami anty-hnRNPA1 (rozcieńczenie 1:200) lub z mysimi poliklonalnymi przeciwciałami anty-TcFAZ (rozcieńczenie 1:100) rozcieńczonymi w roztworze blokującym.
  8. Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy po 5 minut za pomocą 1x PBS.
  9. Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 30 minut w temperaturze pokojowej z kozim anty-mysimi IgG F (ab')2 (H + L) sprzężonymi z Alexa Fluor 488 (1:600) wraz z falloidyną skoniugowaną z Alexa 594 (1:300) w celu wybarwienia włókien aktyny (F-aktyny) w komórce gospodarza rozcieńczonej w roztworze blokującym.
  10. Umyj trzy razy 1x PBS (pH 7,2) przez 5 minut każdy.
  11. Nanieś niewielką ilość odczynnika montażowego zapobiegającego blaknięciu ProLong Gold z podłożem DAPI na powierzchnię szkiełka.
  12. Za pomocą kleszczyków delikatnie przechyl szkiełko nakrywkowe w podłożu montażowym, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków. Po wyschnięciu w razie potrzeby uszczelnij szkiełko nakrywkowe.

3. Podwójne znakowanie protokołu immunofluorescencji przy użyciu przeciwciał monoklonalnych i poliklonalnych wyhodowanych na tym samym gospodarzu

  1. Powtórz kroki od 2.1 do 2.6 opisane powyżej.
  2. Inkubować szkiełka nakrywkowe zawierające zakażone i niezakażone komórki z własnym mysim przeciwciałem poliklonalnym anty-TcFAZ (1:100) rozcieńczonym w roztworze blokującym przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy po 5 minut za pomocą 1x PBS.
  4. Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 30 minut w temperaturze pokojowej z kozimi anty-mysimi IgG F (ab')2 (H+L) sprzężonymi z Alexa Fluor 647 (1:600) rozcieńczonymi w roztworze blokującym.
  5. Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy po 5 minut za pomocą 1x PBS.
  6. Drugi etap blokowania należy wykonać za pomocą AffiniPure króliczej przeciw mysim IgG (H+L) rozcieńczonej (0,12 mg/ml) w roztworze blokującym przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy 1x PBS (pH 7,2) przez 5 minut każde. Następnie inkubować z mysim przeciwciałem monoklonalnym anty-hnRNP A1 IgG2b (1:200) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy po 5 minut za pomocą 1x PBS.
  9. Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 30 minut z kozim przeciwciałem anty-mysim IgG2b sprzężonym z Alexa Fluor 488 (1:600) i z falloidyną sprzężoną z Alexa 594 (1:300) rozcieńczonym w roztworze blokującym.
  10. Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy po 5 minut za pomocą 1x PBS.
  11. Powtórz kroki od 2.8 do 2.10 opisane powyżej.

4. Protokół immunofluorescencji potrójnego znakowania z dodatkiem trzeciego przeciwciała poliklonalnego od różnych gatunków gospodarzy

UWAGA: Dla dodatkowego oznakowania, zwróć uwagę na podklasy IgG, izotypy przeciwciał i postępuj zgodnie z kolejnością przeciwciał: 1. mysie poliklonalne, 2. królicze poliklonalne, 3. drugi blok i 4. mysie monoklonalne. Weź pod uwagę rodzaj laserów dostępnych w mikroskopie konfokalnym, aby wybrać właściwe przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoroforem.

  1. Powtórz kroki od 2.1 do 2.6 opisane powyżej.
  2. Po krokach od 3,2 do 3,5 (etap mycia) rozpocząć nową inkubację z króliczym przeciwciałem poliklonalnym w roztworze blokującym przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy 1x PBS (pH 7,2) przez 5 minut każde.
  4. Inkubować szkiełka nakrywkowe z kozim przeciwciałem anty-króliczym IgG sprzężonym z Alexa 647 (1:600) w roztworze blokującym przez 30 minut.
  5. Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy po 5 minut za pomocą 1x PBS.
  6. Wykonać etap blokowania za pomocą AffiniPure króliczej przeciw mysim IgG (H+L) rozcieńczonej (0,12 mg/ml) w roztworze blokującym przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Przemyć szkiełka nakrywkowe trzykrotnie 1x PBS (pH 7,2) przez 5 minut każdy i inkubować z dowolnym mysim przeciwciałem monoklonalnym podklasy IgG rozcieńczonym w roztworze blokującym przez 30 minut.
  8. Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy po 5 minut za pomocą 1x PBS.
  9. Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 30 minut ze specyficzną parą kozich przeciwciał anty-mysich podklasy IgG sprzężonych z Alexa 594 (1:600) w roztworze blokującym przez 30 minut.
  10. Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy po 5 minut za pomocą 1x PBS.

5. Akwizycja obrazowania konfokalnego

  1. Analizuj próbki immunofluorescencyjne za pomocą mikroskopu konfokalnego z obiektywem zanurzeniowym 63X i wykrywaj fluorescencję za pomocą lampy fotopowielacza (PMT) i detektora hybrydowego (HyD).
    UWAGA: Użyliśmy konfiguracji z Laboratorium Mikroskopii Konfokalnej dla wielu użytkowników - LMMC, Ribeirao Preto Medical School, University of Sao Paulo.
  2. Uchwyć wszystkie obrazy konfokalne z oddzielnymi kanałami. Wykonaj przetwarzanie obrazu za pomocą programu Adobe Photoshop.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj pokazujemy, jak badać interakcje gospodarz-pasożyt za pomocą immunofluorescencji, gdy źródło przeciwciał jest ograniczone z powodu niedostępności komercyjnych przeciwciał, które rozpoznają specyficzne struktury i białka u trypanosomatydów.

Wśród trypanosomatidów, T. cruzi ma jeden z najbardziej złożonych cykli życiowych, obejmujący różne etapy rozwoju między gospodarzami kręgowców i bezkręgowców 19. Podczas cyklu życiowego T. cruzi, we wczesnym s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiamy protokół wykonywania podwójnego znakowania immunologicznego w komórkach zakażonych Trypanosoma cruzi przy użyciu dwóch różnych przeciwciał od tego samego gatunku gospodarza. Aby bardziej szczegółowo zbadać implikacje infekcji, struktury w komórce gospodarza, takie jak jądro lub organelle cytozolowe, można oznaczyć za pomocą tego protokołu. Może być również stosowany w metodzie znakowania cienkich sekcji immunogold po osadzeniu. Takie podejście pomaga przezwyciężyć przeszkodę polegając...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych lub finansowych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2010/19547-1; 2018/03677-5) do MMAB, przez Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência- FAEPA dla MMAB oraz przez Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior- Brazylia (CAPES) - kod finansowy 001. CG-C otrzymał stypendium magisterskie i doktoranckie od CAPES, a LAMT-S otrzymał stypendium doktoranckie od CNPq. Dziękujemy Elizabete R. Milani za pomoc w mikroskopii konfokalnej i dr Dario Zamboni za dostarczenie komórek LLC-MK2 (Ribeirao Preto Medical School, USP).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alexa Fluor 488 - Przeciwciało IgG2bLife technologies, USAA21141Kozioł anty-mysi
AffiniPure Rabbit anty-mysie IgG (H+L)Jackson Immunoresearch, USA315-005-003Przeciwciało anty-mysie
Alexa Fluor 488 - Przeciwciało IgG F (ab')2 (H+L)Life technologies, USAA11017Kozioł anty mysz
Alexa Fluor 594 Przeciwciało IgG1Life technologies, USAA21125Kozioł anty-mysie
Alexa Fluor 647 - Przeciwciało IgG F (ab')2 (H+L)Life technologies, USAA21237Koza anty-mysie
przeciwciało anty-hnRNPA1 IgG2bSigma-Aldrich, USAR4528Mysie przeciwciało
anty-TcFAZ (białko T. cruzi FAZ)Nasze laboratoriumWłasne przeciwciało mysie
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-Aldrich, USAA2153-10GDetergent białkowy albuminowy
Igepal CA-630Sigma-Aldrich, USAI3021Niejonowy detergent
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco, Thermo fisher scientific, USA12657-029Surowica
penicylina StreptomycynaGibco, Thermo fisher scientific, USA15140-122Antybiotyk
Phalloidin Alexa Fluor 594Life technologies, USAA12381Marker aktynowy
ProLong Gold antifade z technologiami DAPILife, USAP36935Odczynnik do podłoża montażowego
RPMI 1640 1X z L-glutaminąCorning, USA10-040-CVPożywka do hodowli komórkowych
Roztwór trypsyny-EDTASigma-Aldrich, USAT4049-100MLBioreagent

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lloyd, R. E. Nuclear proteins hijacked by mammalian cytoplasmic plus strand RNA viruses. Virology. 479-480, 457-474 (2015).
  2. Casadevall, A., Pirofski, L. A. Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease. Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).
  3. Sidik, S. M., Salsman, J., Dellaire, G., Rohde, J. R. Shigella infection interferes with SUMOylation and increases PML-NB number. PLoS One. 10 (4), 0122585(2015).
  4. Robert McMaster, W., Morrison, C. J., Kobor, M. S. Epigenetics: A New Model for Intracellular Parasite-Host Cell Regulation. Trends in Parasitology. 32 (7), 515-521 (2016).
  5. Casali, P., Schettino, E. W. Structure and function of natural antibodies. Current Topics in Microbiology and Immunology. 210, 167-179 (1996).
  6. Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohisto-chemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), e52551(2015).
  7. Tóth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multi-ple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545(2007).
  8. Ma, B., Winkelbach, S., Lindenmaier, W., Dittmar, K. E. Six-colour fluorescent imaging of lymphoid tissue based on colour addition theory. Acta Histochemica. 108 (4), 243(2006).
  9. Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting. Acta Histochemica. 107 (2), 143(2005).
  10. Nakamura, A., Uchihara, T. Dual enhancement of triple immunofluorescence using two antibodies from the same species. Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 67(2004).
  11. McCormick, J., Lim, I., Nichols, R. Neuropeptide precursor pro-cessing detected by triple immunolabeling. Cell and Tissue Research. 297 (2), 197(1999).
  12. Shindler, K. S., Roth, K. A. Double immunofluorescent staining using two unconjugated primary antisera raised in the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44 (11), 1331(1996).
  13. Wang, B. L., Larsson, L. I. Simultaneous demonstration of multiple anti-gens by indirect immunofluorescence or immunogold staining. Novel light and electron microscopical double and triple staining method employing primary antibodies from the same species. Histochemistry. 83 (1), 47(1985).
  14. Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
  15. Pranchevicius, M. C., et al. Myosin Va phosphorylated on Ser1650 is found in nuclear speckles and redistributes to nucleoli upon inhibition of transcription. Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 441-456 (2008).
  16. Moreira, B. P., de Castro, C. G., Prado, L. C. dS., da Fonseca, C. K., Baqui, M. M. A. Use of antibodies from the same host species in double labeling immunofluorescence on trypanosome cytoskeleton. Microscopy and Imaging Science: Practical Approaches to Applied Research and Education. Méndez-Vilas, A. 7, 374-378 (2016).
  17. Hull, R. N., Cherry, W. R., Tritch, O. J. Growth characteristics of monkey kidney cell strains LLC-MK1, LLC-MK2, and LLC-MK2 (NCTC-3196) and their utility in virus research. Journal of Experimental Medicine. 115, 903-918 (1962).
  18. Stecconi-Silva, R. B., Andreoli, W. K., Mortara, R. A. Parameters affecting cellular invasion and escape from the parasitophorous vacuole by different infective forms of Trypanosoma cruzi. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 98 (7), 953-958 (2003).
  19. de Souza, W., de Carvalho, T. M., Barrias, E. S. Review on Trypanosoma cruzi: Host Cell Interaction. International Journal of Cell Biology. 2010, 295394(2010).
  20. Burleigh, B. A., Woolsey, A. M. Cell signalling and Trypanosoma cruzi invasion. Cellular Microbiology. 4 (11), 701-711 (2002).
  21. Baqui, M. M. A., Takata, C. S., Milder, R. V., Pudles, J. A giant protein associated with the anterior pole of a trypanosomatid cell body skeleton. European Journal of Cell Biology. 70, 243-249 (1996).
  22. Baqui, M. M., Milder, R., Mortara, R. A., Pudles, J. In vivo and in vitro phosphorylation and subcellular localization of trypanosomatid cytoskeletal giant proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 47 (1), 25-37 (2000).
  23. Baqui, M. M., De Moraes, N., Milder, R. V., Pudles, J. A giant phosphoprotein localized at the spongiome region of Crithidia luciliae thermophila. Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (6), 532-537 (2000).
  24. Jean-Philippe, J., Paz, S., Caputi, M. hnRNP A1: the Swiss army knife of gene expression. International Journal of Molecular Sciences. 14 (9), 18999-19024 (2013).
  25. Vidarsson, G., Dekkers, G., Rispens, T. IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions. Frontiers in Immunology. 5, 520(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przeciwcia a tego samego gatunkuprzeciwcia a poliklonalneprzeciwcia a monoklonalnemikroskopia konfokalnaTrypanosoma cruzietap blokowaniabarwienie aktynybarwienie DAPI

Powiązane artykuły