Artykuł metodologiczny

Przygotowanie na dużą skalę egzosomów pochodzących z mezenchymalnych komórek macierzystych płynu maziowego za pomocą hodowli bioreaktora 3D

DOI:

10.3791/62221

⸱

26 lipca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, The First affiliated hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 2Guangdong Provincial Research Center for Artificial Intelligence and Digital Orthopedic Technology, Shenzhen Second People's Hospital, 3Department of Child and Adolescent Psychiatry, Shenzhen Kangning Hospital, Shenzhen Mental Health Center, Shenzhen Key Laboratory for Psychological Healthcare & Shenzhen Institute of Mental Health

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół produkcji dużej liczby egzosomów klasy GMP z mezenchymalnych komórek macierzystych płynu maziowego za pomocą bioreaktora 3D.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Egzosomy wydzielane przez mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) zostały zasugerowane jako obiecujący kandydaci do leczenia urazów chrząstek i choroby zwyrodnieniowej stawów. Egzosomy do zastosowań klinicznych wymagają produkcji na dużą skalę. W tym celu MSC ludzkiego płynu maziowego (hSF-MSC) wyhodowano na kulkach mikronośnika, a następnie wyhodowano w dynamicznym trójwymiarowym (3D) systemie hodowli. Dzięki wykorzystaniu dynamicznej hodowli 3D, w ramach tego protokołu udało się uzyskać egzosomy na dużą skalę z supernatantów hodowli SF-MSC. Egzosomy zebrano przez ultrawirowanie i zweryfikowano za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego, testu transmisji nanocząstek i western blot. Wykryto również bezpieczeństwo mikrobiologiczne egzosomów. Wyniki wykrywania egzosomów sugerują, że takie podejście może doprowadzić do powstania dużej liczby egzosomów klasy zgodnej z dobrymi praktykami produkcyjnymi (GMP). Te egzosomy mogą być wykorzystywane w badaniach nad biologią egzosomów i klinicznym leczeniu choroby zwyrodnieniowej stawów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba zwyrodnieniowa stawów (OA), wynikająca z uszkodzenia chrząstki stawowej i leżącej pod nią kości, pozostaje poważnym wyzwaniem prowadzącym do niepełnosprawności1,2. Bez dopływu krwi i nerwów zdolność chrząstki do samoleczenia jest minimalna po zranieniu3,4. W ciągu ostatnich dziesięcioleci terapie oparte na autologicznej implantacji chondrocytów (ACI) poczyniły pewne postępy w leczeniu choroby zwyrodnieniowej stawów5. W celu izolacji i ekspansji chondrocytów konieczne jest pobranie małej chrząstki z obszaru nienośnego stawu zwyrodnieniowego stawów, co powoduje uszkodzenia chrząstki. Ponadto procedura będzie wymagała drugiej operacji w celu wszczepienia rozszerzonych chondrocytów6. W związku z tym jednoetapowe terapie leczenia choroby zwyrodnieniowej stawów bez uszkodzeń chrząstki są szeroko badane.

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) zostały zasugerowane jako obiecujące alternatywy dla leczenia choroby zwyrodnieniowej stawów7,8. Pochodzące z wielu tkanek MSCs mogą różnicować się w chondrocyty przy określonej stymulacji. Co ważne, MSCs mogą modulować odpowiedzi immunologiczne poprzez anti-inflammation9. W związku z tym MSCs mają znaczące zalety w leczeniu choroby zwyrodnieniowej stawów poprzez naprawę ubytków chrząstki i modulację odpowiedzi immunologicznej, zwłaszcza w środowisku zapalnym. W leczeniu choroby zwyrodnieniowej stawów MSCs z mazi stawowej (SF-MSC) przyciągnęły ostatnio wiele uwagi ze względu na ich silniejszą zdolność różnicowania chondrocytów niż inne źródła MSC10,11. Warto zauważyć, że w klinice ortopedycznej ekstrakcja zapalnego SF z jamy stawowej jest rutynową terapią mającą na celu złagodzenie objawów bólowych u pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów. Wyekstrahowany zapalny SF jest zwykle utylizowany jako odpad medyczny. Zarówno pacjenci, jak i lekarze są gotowi uznać autologiczne MSCs wyizolowane z zapalnej SF za leczenie choroby zwyrodnieniowej stawów przy bardzo niewielu konfliktach etycznych. Jednak terapia SF-MSC jest zagrożona ze względu na ryzyko rakotwórcze, długotrwałe przechowywanie i odległe bariery transportowe.

Egzosomy, wydzielane przez wiele typów komórek, w tym MSC, przenoszą większość informacji biologicznej komórki macierzystej. Został dogłębnie zbadany jako terapia bezkomórkowa12,13. Zgodnie ze zaktualizowanymi zasobami dostępnymi na stronie internetowej rządu badań klinicznych (ClinicalTrials.gov), w dziedzinie raka, nadciśnienia tętniczego i chorób neurodegeneracyjnych inicjowane są i podejmowane bardziej rozległe badania kliniczne egzosomów. Leczenie egzosomami SF-MSC może być ekscytującym i wymagającym badaniem w walce z chorobą zwyrodnieniową stawów. Klasa dobrej praktyki wytwarzania (GMP) i produkcja egzosomów na dużą skalę są niezbędne do translacji klinicznej. Izolacja egzosomów na małą skalę jest szeroko stosowana w oparciu o dwuwymiarową (2D) hodowlę komórek. Jednak strategie produkcji egzosomów na dużą skalę wymagają optymalizacji. W ramach tego badania opracowano metodę produkcji egzosomów na dużą skalę, opartą na masowej hodowli SF-MSC w warunkach wolnych od ksenoizolacji. Po ultraodwirowaniu z supernatantów do hodowli komórkowych potwierdzono bezpieczeństwo i działanie egzosomów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Człowieka Drugiego Szpitala Ludowego w Shenzhen. Schemat ideowy egzosomów wyizolowanych z hSF-MSCs w protokole in vitro pokazano na Rysunek 1.

1. Kultura i identyfikacja ludzi SF-MSCs

  1. Zbierz 20 ml SF za pomocą strzykawki i igły od pacjentów z kliniczną chorobą zwyrodnieniową stawów.
    1. Zdezynfekować staw kolanowy pacjenta z chorobą zwyrodnieniową stawów. Nakłucie od ścięgna mięśnia czworogłowego uda na zewnątrz rzepki do jamy stawowej za pomocą igły 7#.
    2. Wyciągnij 10 ml płynu stawowego. Przykryj miejsce wkłucia patyczkiem do transfuzji i dociskaj przez 5 minut.
  2. Odrzucić supernatant SF po odwirowaniu w stężeniu 1 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Zawiesić osad komórkowy w 10 ml soli fizjologicznej z 1x buforem fosforanowym (PBS), odwirować przy 1 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i wyrzucić PBS.
  4. Zawiesić osad z 10 ml ludzkiej pożywki hodowlanej MSC o gęstości komórek 5 x 104 komórek/ml (patrz Tabela Materiałów), a następnie umieścić zawiesinę w naczyniu o średnicy 100 mm.
  5. Inkubować naczynie w temperaturze 37 °C w atmosferze zawierającej 5% CO2 .
  6. Po 48 godzinach usuń nieprzylegające komórki, zmieniając pożywkę i przemyj 1x PBS. Wymieniaj pożywkę co 3 dni przez 2 tygodnie.
  7. Zebrać supernatanty z kultur komórkowych.
  8. Identyfikacja SF-MSC za pomocą cytometrii przepływowej.
    1. Roztrawić trzecią generację (P3) SF-MSC, odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i zebrać osad komórek.
      UWAGA: Przejście jest rozpoznawane jako subkultura komórek do innej płytki hodowlanej. Pierwotne komórki wyizolowane z SF i wysiane na szalkach są oznaczone jako przejście zero (P0). Przy około 75% konfluencji komórki są trawione i odłączane od naczyń, wysiewane na innych szalkach i oznaczane jako P1.
    2. Dodać 400 μl buforu blokującego (1% BSA w 1x PBS) do osadu komórkowego (5 x 104) i odstawić na 15 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    3. Wirować przy 1.000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 μl 1x PBS.
    4. Dodać 1 μl przeciwciała monoklonalnego fluorescencyjnego CD105, CD73, CD90, CD45, CD34, HLA-DR (stosunek rozcieńczenia 1:100) (patrz tabela materiałów) na probówkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    5. Przemyć dwukrotnie 1x PBS i wyrzucić supernatant. Zebrać osad komórkowy i ponownie zawiesić w 100 μl 1x PBS.
    6. Wykryj na cytometrze przepływowym do 10 000 komórek za pomocą filtrów 525/50 i 585/40 w celu wykrycia fluoroforów.

2. 3D hodowla komórkowa w bioreaktorze

  1. Przygotowanie mikronośnika
    1. Spęcznić suche 0,75 g mikronośników (patrz Tabela Materiałów) i uwodnić w 1x Sul fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco (50 ml / g mikronośników) przez co najmniej 3 godziny w temperaturze pokojowej.
    2. Zdekantować supernatant i myć mikronośniki przez 5 minut w świeżym DPBS (50 ml/g mikronośników). Wyrzuć PBS i zastąp go świeżym 1x DPBS (50 ml/g mikronośników).
    3. Wysterylizować mikronośniki w autoklawie (121 °C, 15 min, 15 psi). Pozostawić wysterylizowane mikronośniki do osiadania, zdekantować supernatant.
    4. Krótko przepłukać mikronośniki w pożywce hodowlanej (50 ml/g mikronośników) w temperaturze pokojowej. Pozostawić mikronośniki do osiadania, odrzucić supernatant.
  2. Bioreaktor perfuzyjny
    1. Wysterylizować bioreaktor w autoklawie (121 °C, 15 min, 15 psi).
    2. Policz liczbę SF-MSC i przydziel 2,5 x 107 SF-MSC i mikronośników do bioreaktora wypełnionego pożywką hodowlaną MSC klasy GMP (250 ml).
    3. Umieścić bioreaktor w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Obrócić bioreaktor z prędkością 15 obr./min. Zmieniaj pożywkę co 6 dni.
    4. Zebrać supernatanty i mikronośniki do hodowli komórkowej do dalszej analizy po hodowli przez 14 dni.

3. Identyfikacja egzosomów i wykrywanie bezpieczeństwa

  1. Ultrawirowanie
    1. Odwirować supernatant hodowli komórkowej w temperaturze 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant; wyrzucić resztki komórkowe.
    2. Odwirować supernatanty w stężeniu 2 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant; wyrzucić większe pęcherzyki (ciała apoptotyczne i niektóre większe mikropęcherzyki).
    3. Ponownie odwirować supernatant przy 10 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia większych pęcherzyków; zebrać granulki i ponownie zawiesić w 40 ml 1x PBS.
    4. Odwirować zawieszone granulki o sile 120 000 x g przez 70 minut w temperaturze 4 °C, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki zawierające egzosomy w 500 μl 1x PBS.
  2. Analiza śledzenia nanocząstek (NTA)
    UWAGA: W każdym cyklu do komory wstrzykiwano 500 μl próbki przy natężeniu przepływu 30 μl/min. Przeprowadzić analizę w temperaturze 24,4 °C-24,5 °C.
    1. Rozcieńczyć świeżo wyizolowane próbki egzosomów sterylnym 1x PBS do 1 ml zawierającego 10 7-109 /ml cząstek i wstrzyknąć je do systemu analizy śledzenia nanocząstek (patrz tabela materiałów).
    2. Ręcznie ustaw system przechwytywania i analizy zgodnie z protokołem producenta. Wizualizuj cząstki poprzez rozpraszanie światła laserowego i uchwyć ich ruchy Browna na cyfrowym wideo.
    3. Analizuj nagrane taśmy wideo za pomocą oprogramowania (patrz tabela materiałów) w oparciu o śledzenie co najmniej 200 pojedynczych cząstek na serię.
  3. Transmisyjna mikroskopia elektronowa
    1. Utrwal egzosomy w 4% paraformaldehydzie (na zimno 1x DPBS) na 5 min.
    2. Zamontuj 5 μl egzosomów na miedzianych siatkach. W tym eksperymencie stężenie egzosomów wynosi 1 mg/ml oznaczone ilościowo za pomocą zestawu do oznaczania białek (patrz tabela materiałów).
    3. Osadź egzosomy w 3% kwasie fosfowolframowym na 10 minut na lodzie. Usunąć nadmiar kwasu i wysuszyć próbki w temperaturze pokojowej.
    4. Zobrazuj próbki egzosomów za pomocą TEM przy napięciu przyspieszenia 100 kV.
  4. Western blotting (zachodnia plama)
    1. Do egzosomów dodać 300 μl buforu do lizy (1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,1 M Tris HCl, pH 7) i koktajlu inhibitorów proteazy (patrz tabela materiałów).
    2. Wymieszaj egzosomy w buforze do lizy, pipetując w górę i w dół, i odstaw na lód na 20 minut.
    3. Odwirować mieszaninę przy 9,391 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i zebrać sklarowany nad osadem. Zmierzyć stężenie białka za pomocą zestawu do oznaczania białek (patrz tabela materiałów).
    4. Dodaj 100 μL 4x buforu ładującego białko i podgrzewaj w temperaturze 100 °C przez 10 min.
    5. Załadować 15 μl białek o stężeniu 10 mg/ml i przeprowadzić przez elektroforezę żelową (120 V, 70 min) i elektroblot przy 100 V, 60 min w temperaturze 4 °C.
    6. Wykryj markery niespecyficzne dla egzosomów (kalneksyna) i biomarkery egzosomalne (CD9, CD63 i CD81) za pomocą fluorescencyjnego western blot (patrz tabela materiałów).
  5. Test bezpieczeństwa
    1. W przypadku wykrywania bakterii, grzybów i Mycobacterium tuberculosis należy postępować zgodnie z krokami 3.5.2-3.5.5.
    2. Pobrać 100 μl roztworu egzosomu (1 mg/ml) na płytkę do hodowli agaru z krwią (patrz tabela materiałów) i inkubować płytkę hodowlaną w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
    3. Wysiewać 100 μl roztworu egzosomu (1 mg/ml) na pożywce sabourauda (patrz tabela materiałów) i inkubować w temperaturze 35 °C przez 48 godzin.
    4. Wysiewać 100 μl roztworu egzosomu (1 mg/ml) na pożywce Lowensteina-Jensena (patrz tabela materiałów) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 tygodnie.
    5. Wykrywanie pojawiania się bakterii, grzybów i kolonii Mycobacterium tuberculosis za pomocą obserwacji makroskopowej.
      UWAGA: Kryteriami oceny bezpieczeństwa egzosomów jest brak mikroorganizmów na płytce hodowlanej.
    6. Aby wykryć mykoplazmę, wykonaj kroki 3.5.7-3.5.9.
    7. Zawiesić egzosomy w 50 μl roztworu buforowego dołączonego do zestawu i podgrzewać w temperaturze 95 °C przez 3 minuty.
    8. Amplifikować Mykoplazmę w roztworze egzosomu za pomocą zestawu do wykrywania Mykoplazmy PCR (patrz Tabela materiałów).
    9. Wykryj produkty PCR na 1,5% elektroforezie w żelu agarozowym (30 min, 120 V).

4. Wykrywanie funkcji egzosomów in vitro

  1. Znakowanie egzosomów
    1. Oznaczyć 100 μl egzosomów (1 mg/ml) za pomocą 1 mM Dil (1000x) (patrz tabela materiałów) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    2. Odzyskaj egzosomy przez ultrawirowanie przy 100 000 x g przez 70 min. Ponownie zawiesić osad w 500 μl 1x PBS.
  2. Ładowanie naśladowców Cy3-miR-140 do egzosomów
    1. Zmieszać 1 μg/μL białka egzosomalnego i 5 μmol/ml Cy3-miR-140 w końcowej objętości 400 μL buforu do elektroporacji (1,15 mM fosforanu potasu (pH 7,2), 25 mM chlorku potasu i 21% (v/v) (patrz tabela materiałów).
    2. Przenieść mieszaninę do zimnych kuwet do elektroporacji o średnicy 0,4 cm i nasycić elektroporacją przy pojemności 300 V/100 μF za pomocą systemu transfekcji genów (patrz tabela materiałów).
    3. Bezpośrednio po elektroporacji utrzymuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby upewnić się, że membrana egzosomu została w pełni przywrócona.
    4. Mieszaniny należy traktować jedną jednostką RNazy A (patrz tabela materiałów) przez 20 minut, aby wyeliminować mimiki miRNA poza egzosomami.
    5. Ultraodwirować mieszaninę egzosomów przy 120 000 x g przez 90 minut, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić egzosomy w 500 μl 1x PBS.
  3. Test wychwytu egzosomów
    1. Wysiewaj chondrocyty (1 x 107) w 35-milimetrowych szalkach konfokalnych z 1 ml DMEM/F12 zawierającego 10% FBS.
    2. Po 24 godzinach traktuj chondrocyty egzosomami znakowanymi DiI (100 ng / ml) lub egzosomami załadowanymi cy3-miR-140 (100 ng / ml) przez 1 godzinę.
    3. Umyć trzykrotnie 1x PBS, a następnie oznaczyć DAPI (10 ng / ml) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Zarejestrować sygnał fluorescencji w konfokalnej laserowej skaningowej mikroskopii fluorescencyjnej (CLSM) przy użyciu odpowiednich filtrów (patrz tabela materiałów).

5. Analiza statystyczna

  1. Przeprowadzanie analiz statystycznych przy użyciu odpowiedniego oprogramowania statystycznego.
    UWAGA: Dane reprezentatywne na każdym rysunku zostały wyrażone jako średnia ± SD. Test t-Studenta został wykorzystany do porównania dwóch grup za pomocą oprogramowania statystycznego. Jednoczynnikową ANOVA, po której następuje wielokrotność Tukeya, przeprowadzono w przypadku porównań między wieloma grupami. Wartości P <0,05 (*), <0,01 (**) lub <0,001 ().

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cytometria przepływowa została użyta do identyfikacji markerów powierzchniowych SF-MSC, zgodnie z minimalnymi kryteriami definiowania ludzkich MSCs zalecanymi przez Międzynarodowe Towarzystwo Terapii Komórkowej14,15. Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że SF-MSCs hodowane w tym badaniu spełniały kryteria identyfikacji MSC. Były one ujemne dla CD34, CD45 i HLA-DR (poniżej 3%) oraz dodatnie dla CD73, CD90 i CD105 (powyżej 95%) (Rysunek 2)....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenchymalne komórki macierzyste są szeroko stosowane w medycynie regeneracyjnej ze względu na ich samoodnawianie, różnicowanie się w komórki tkankowe o wyspecjalizowanych funkcjach i działaniu parakrynnym16,17. Warto zauważyć, że efekty parakrynne wywierane przez egzosomy przyciągnęły wiele uwagi18. Egzosomy przenoszą bioinformację MSC i pełnią swoją funkcję biologiczną oraz eliminują niedociągnięcia MSC, takie jak kłopotliwe przechowywa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (nr 81972116, nr 81972085, nr 81772394); Kluczowy Program Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Guangdong (nr 2018B0303110003); Projekt współpracy międzynarodowej w Guangdong (nr 2021A0505030011); Projekty naukowo-technologiczne w Shenzhen (nr GJHZ20200731095606019, nie. JCYJ20170817172023838, nie. JCYJ20170306092215436, Nie. JCYJ20170413161649437); Chińska Fundacja Nauk Podoktoranckich (nr 2020M682907); Fundacja Podstawowych i Stosowanych Badań Podstawowych i Stosowanych w Guangdong (nr 2021A1515010985); Projekt Medyczny Sanming w Shenzhen (SZSM201612079); Specjalne fundusze na budowę szpitali wysokiego szczebla w prowincji Guangdong.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do oznaczania BCAThermoFisher23227Test stężenia białka
Płytka z agarem do krwiNanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.P0903Kultura bakterii
Przeciwciało CD105ElabscienceE-AB-F1243CCytometria przepływowa
Przeciwciało CD34ElabscienceE-AB-F1143CCytometria przepływowa
Przeciwciało CD45BD Bioscience555483Cytometria przepływowa
Przeciwciało CD63Abclonal  A5271Western blot
Przeciwciało CD73ElabscienceE-AB-F1242CCytometria przepływowa
CD81 przeciwciałoABklonalne  A5270Western blot
CD9 przeciwciałoAbclonal  A1703Western blotting
Przeciwciało CD90ElabscienceE-AB-F1167CWirówka do cytometrii przepływowej
Wirówka Eppendorf5810R
Inkubator CO2Hodowla ThermoCell
Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna ze skaningiem laserowymZEISSLSM 800
CytodexGE HealthcareMicrocarrier
DilThermoFisherD1556Etykieta egzosomu
EZ-PCR Zestaw do wykrywania mykoplazmyBI20-700-20Wykrywanie mykoplazmy
Cytometriaprzepływowa BeckmanIdentyfikacja MSC
System Gene Pulser IIBio-Rad Laboratories1652660Transfekcja genów
GraphPad Prism 8.0.2GraphPad Software, Inc.Wersja 8.0.2
Przeciwciało HLA-DRElabscience E-AB-F1111CCytometria przepływowa
Pożywka hodowlana Lowenstein-JensenNanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.T0573Kultura prątków gruźlicy
MesenGroStemRDMGro-500Hodowla MSC
Nanosight NS300MalvernNanosight NS300Analiza śledzenia nanocząstek
Oprogramowanie NTA 2.3MalvernAnaliza danych
Odyssey FCGene Company LimitedFluorescencyjny western blotting
OptiPrep bufor elektroporacyjnySigmaD3911Transfekcja genów
Koktajl inhibitorów proteazySigmaP8340Inhibitor proteinazy
RNaza AQiagen158924Usuwanie RNA
Sabouraud Płytka agarowaNanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.P0919Kultura grzybów
TEMJEM-1200EX
Rotacyjny system hodowli komórkowych (RCCS)SyntheconRCCS-4HDUltrawirówka do hodowli 3D
BeckmanOptima XPN-100Wirówka egzosomowa

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cross, M., et al. The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).
  2. Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis & Rheumatology. 64 (6), 1697-1707 (2012).
  3. Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. Unlike bone, cartilage regeneration remains elusive. Science. 338 (6109), 917-921 (2012).
  4. Lu, J., et al. Increased recruitment of endogenous stem cells and chondrogenic differentiation by a composite scaffold containing bone marrow homing peptide for cartilage regeneration. Theranostics. 8 (18), 5039-5058 (2018).
  5. Ogura, T., Bryant, T., Merkely, G., Mosier, B. A., Minas, T. Survival analysis of revision autologous chondrocyte implantation for failed ACI. American Journal of Sports Medicine. 47 (13), 3212-3220 (2019).
  6. Welch, T., Mandelbaum, B., Tom, M. Autologous chondrocyte implantation: past, present, and future. Sports Medicine and Arthroscopy Review. 24 (2), 85-91 (2016).
  7. McGonagle, D., Baboolal, T. G., Jones, E. Native joint-resident mesenchymal stem cells for cartilage repair in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 13 (12), 719-730 (2017).
  8. Jo, C. H., et al. Intra-articular injection of mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis of the knee: a proof-of-concept clinical trial. Stem Cells. 32 (5), 1254-1266 (2014).
  9. Pers, Y. M., Ruiz, M., Noël, D., Jorgensen, C. Mesenchymal stem cells for the management of inflammation in osteoarthritis: state of the art and perspectives. Osteoarthritis Cartilage. 23 (11), 2027-2035 (2015).
  10. Neybecker, P., et al. In vitro and in vivo potentialities for cartilage repair from human advanced knee osteoarthritis synovial fluid-derived mesenchymal stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 329(2018).
  11. Jia, Z., et al. Magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and purify synovial fluid-derived mesenchymal stem cells from a rabbit model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).
  12. Phinney, D. G., Pittenger, M. F. Concise review: MSC-derived exosomes for cell-free therapy. Stem Cells. 35 (4), 851-858 (2017).
  13. Phan, J., et al. Engineering mesenchymal stem cells to improve their exosome efficacy and yield for cell-free therapy. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1522236(2018).
  14. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  15. Lv, F. -J., et al. Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32 (6), 1408-1419 (2014).
  16. Samsonraj, R. M., et al. Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine. Stem Cells Translational Medicine. 6 (12), 2173-2185 (2017).
  17. Han, Y., et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine. Cells. 8 (8), (2019).
  18. Zhang, G., et al. Exosomes derived from human neural stem cells stimulated by interferon gamma improve therapeutic ability in ischemic stroke model. Journal of Advanced Research. 24, 435-445 (2020).
  19. Zhou, P., et al. Migration ability and Toll-like receptor expression of human mesenchymal stem cells improves significantly after three-dimensional culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 491 (2), 323-328 (2017).
  20. Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
  21. Guo, L., Zhou, Y., Wang, S., Wu, Y. Epigenetic changes of mesenchymal stem cells in three-dimensional (3D) spheroids. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (10), 2009-2019 (2014).
  22. Zhang, Y., et al. Systemic administration of cell-free exosomes generated by human bone marrow derived mesenchymal stem cells cultured under 2D and 3D conditions improves functional recovery in rats after traumatic brain injury. Neurochemistry International. 111, 69-81 (2017).
  23. Cao, J., et al. Three-dimensional culture of MSCs produces exosomes with improved yield and enhanced therapeutic efficacy for cisplatin-induced acute kidney injury. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 206(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Egzosomy z p ynu stawowegomezenchymalne kom rki macierzystehodowla w bioreaktorze 3Dizolacja egzosom wmikrono nikiultrawirowanieledzenie nanocz stekWestern blottingcytometria przep ywowamarkery egzosom w

Powiązane artykuły