Korzenie i ich ryzosfery są dynamiczne, niejednorodne i niezwykle ważne dla zrozumienia, w jaki sposób rośliny pozyskują mineralne składniki odżywcze i zanieczyszczenia1,2,3. Korzenie są główną drogą, za pomocą której składniki odżywcze (np. fosfor) i zanieczyszczenia (np. arsen) przemieszczają się z gleby do roślin, a zatem zrozumienie tego procesu ma wpływ na ilość i jakość żywności, funkcjonowanie ekosystemu i fitoremediację. Jednak korzenie są dynamiczne w przestrzeni i czasie, rosnąc w odpowiedzi na potrzeby pozyskiwania składników odżywczych i często różnią się funkcją, średnicą i strukturą (np. korzenie boczne, korzenie przybyszowe, włośniki)2. Niejednorodność systemów korzeniowych można badać w skalach przestrzennych od poziomu komórkowego do ekosystemu oraz w skalach czasowych od godzinowych do dziesiętnych. W związku z tym dynamiczna i niejednorodna natura korzeni i otaczającej je gleby lub ryzosfery stanowi wyzwanie dla uchwycenia chemii ryzosfery w czasie. Pomimo tego wyzwania, konieczne jest zbadanie korzeni w ich środowisku glebowym, aby scharakteryzować tę krytyczną relację roślina-gleba.
Chemia ryzosfery roślin mokradeł jest szczególnie trudna do zbadania ze względu na strome gradienty tlenu, które występują od gleby do korzeni, które zmieniają się w czasie i przestrzeni. Ponieważ korzenie potrzebują tlenu do oddychania, rośliny podmokłe przystosowały się do warunków niskiego poziomu tlenu panujących w glebach podmokłych, tworząc aerenchymę4, 5. Aerenchyma to wydrążone tkanki korowe, które rozciągają się od pędów do korzeni, umożliwiając dyfuzję powietrza przez roślinę do korzeni. Jednak część tego powietrza przedostaje się do ryzosfery w mniej skorkowaciałych częściach korzeni, szczególnie w pobliżu bocznych połączeń korzeniowych, mniej dojrzałych wierzchołków korzeni i stref wydłużenia6,7,8,9. Ta promienista utrata tlenu tworzy utlenioną strefę w ryzosferze roślin podmokłych, która wpływa na biochemię ryzosfery (bio-geo)i różni się od zmniejszonej objętości gleby10,11,12. Aby zrozumieć los i transport składników odżywczych i zanieczyszczeń w ryzosferach i korzeniach terenów podmokłych, kluczowe znaczenie ma zachowanie chemicznie zredukowanej gleby objętościowej, utlenionej ryzosfery i korzeni roślin podmokłych do analizy. Ponieważ jednak gleba luzem zawiera zredukowane składniki gleby, które są wrażliwe na tlen, metody konserwacji korzeni i gleby muszą chronić struktury korzeniowe i minimalizować reakcje wrażliwe na tlen.
Istnieją metody naprawiania tkanek roślinnych i zachowywania ultrastruktury do obrazowania, ale te metody nie mogą być stosowane do chemicznej ochrony korzeni rosnących w glebie podmokłej. W przypadku badań, w których pożądany jest tylko rozkład pierwiastków w komórkach roślinnych, rośliny są zwykle uprawiane hydroponicznie, a korzenie można łatwo usunąć z roztworu, utrwalić pod wysokim ciśnieniem zamrażania i substytucji przez zamrożenie i podzielić na sekcje do różnych zastosowań obrazowania, w tym spektrometrii mas jonów wtórnych o wysokiej rozdzielczości (nanoSIMS), mikroskopii elektronowej i analizy synchrotronowej fluorescencji rentgenowskiej (S-XRF)13, 14,15. Aby zbadać płytkę Fe na zewnątrz korzeni mokradeł, te badania hydroponiczne muszą sztucznie indukować tworzenie się płytki Fe w roztworze16, co nie odzwierciedla dokładnie niejednorodności rozmieszczenia i składu mineralnego tworzenia się płytki Fe i powiązanych elementów in situ17,18,19,20. Istnieją metody ochrony gleby podmokłej i związanych z nią mikroorganizmów za pomocą zamrażającego rdzenia21, ale trudno jest uzyskać korzenie za pomocą tej techniki. Obecne metody wizualizacji korzeni rosnących w glebie i ich chemii ryzosferycznej składają się z dwóch podstawowych typów pomiarów: strumieni pierwiastków i całkowitego stężenia pierwiastków (i specjacji). Ten pierwszy jest zwykle mierzony za pomocą gradientów dyfuzyjnych w cienkich warstwach (DGT)22,23,24, w którym gleba jest umieszczana w kłączach, aby wspomóc wzrost roślin w warunkach laboratoryjnych, a labilne elementy w glebie dyfundują przez żel do warstwy wiążącej. Ta warstwa wiążąca może być następnie zobrazowana w celu ilościowego określenia labilnych elementów będących przedmiotem zainteresowania. Ta technika może z powodzeniem zilustrować relacje między korzeniami a ryzosferą24,25,26,27, ale artefakty z granic korzeni mogą istnieć przez uprawę roślin w ryzoboxach, a informacje o wnętrzu korzenia nie są przechwytywane przez DGT. Ta ostatnia polega na pobraniu próbek korzeni i ryzosfery, zabezpieczeniu próbki i bezpośredniej analizie rozkładu pierwiastków na przekroju próbki. W przypadku pobierania próbek środowiskowych korzeni roślin podmokłych i otaczającej je ryzosfery wymagane jest ostrożne obchodzenie się z próbką, aby uniknąć artefaktów związanych z przygotowaniem próbki.
Tutaj opisany jest protokół, który skutecznie chroni struktury korzeniowe i chemię ryzosfery roślin mokradłowych poprzez zamrażanie i liofilizację. Błyskawiczne zamrażanie może drastycznie spowolnić przemiany wrażliwych na tlen substancji rozpuszczonych, ale może uszkodzić korzenie i spowodować mobilizację, gdy próbki wyschną. Jednak zamrażanie trzaskowe, w którym próbka jest zamrażana między blokami miedzi wstępnie schłodzonymi ciekłym azotem, minimalizuje uszkodzenia korzeni i zniekształcenia próbki28. Zachowane próbki są następnie zatapiane w żywicy epoksydowej, która zachowuje As specjation20, 29 i mogą być cięte i polerowane w celu zobrazowania korzeni w ich ryzosferze glebowej. Próbki w tym raporcie zostały przeanalizowane za pomocą obrazowania specjacji chemicznej S-XRF po cienkim przekroju. Można jednak również zastosować inne techniki obrazowania, w tym spektrometrię mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie z ablacją laserową (LA-ICP-MS), emisję promieniowania rentgenowskiego indukowaną cząstkami (PIXE), spektrometrię mas jonów wtórnych (SIMS) oraz obrazowanie spektroskopii rozpadu indukowanego laserem (LIBS).