Artykuł metodologiczny

Skuteczna dyssekcja i hodowla pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki myszy

DOI:

10.3791/62228

⸱

10 lutego 2021

 ,  , 
1Ocular Genomics Institute of Massachusetts Eye and Ear, Harvard Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół, który pierwotnie został zgłoszony przez Fernandez-Godino et al. w 2016 roku1, opisuje metodę efektywnego izolowania i hodowli mysich komórek RPE, które tworzą funkcjonalną i spolaryzowaną monowarstwę RPE w ciągu jednego tygodnia na płytkach Transwell. Zabieg trwa około 3 godzin.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroby oczu dotykają miliony ludzi na całym świecie, ale ograniczona dostępność tkanek ludzkich utrudnia ich badanie. Modele mysie są potężnymi narzędziami do zrozumienia patofizjologii chorób oczu ze względu na ich podobieństwa do ludzkiej anatomii i fizjologii. Zmiany w nabłonku barwnikowym siatkówki (RPE), w tym zmiany w morfologii i funkcji, są wspólnymi cechami wielu chorób oczu. Jednak udana izolacja i hodowla pierwotnych mysich komórek RPE jest bardzo trudna. Niniejszy artykuł jest zaktualizowaną audiowizualną wersją protokołu opublikowanego wcześniej przez Fernandeza-Godino i in. w 2016 r. w celu skutecznego izolowania i hodowli pierwotnych mysich komórek RPE. Metoda ta jest wysoce powtarzalna i pozwala uzyskać solidne kultury wysoce spolaryzowanych i pigmentowanych monowarstw RPE, które mogą być utrzymywane przez kilka tygodni na Transwells. Model ten otwiera nowe możliwości w badaniach nad molekularnymi i komórkowymi mechanizmami leżącymi u podstaw chorób oczu. Ponadto stanowi platformę do testowania podejść terapeutycznych, które można zastosować w leczeniu ważnych chorób oczu o niezaspokojonych potrzebach medycznych, w tym dziedzicznych zaburzeń siatkówki i zwyrodnień plamki żółtej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół, który został pierwotnie zgłoszony przez Fernandez-Godino et al. w 2016 roku1, opisuje metodę efektywnej izolacji i hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki myszy (RPE), które tworzą funkcjonalną i spolaryzowaną monowarstwę RPE w ciągu jednego tygodnia na płytkach Transwell. RPE to monowarstwa znajdująca się w oku między siatkówką nerwową a błoną Brucha. Ta pojedyncza warstwa składa się z wysoce spolaryzowanych i pigmentowanych komórek nabłonka połączonych ścisłymi połączeniami, wykazujących sześciokątny kształt, który przypomina plaster miodu2. Pomimo tej pozornej prostoty histologicznej, RPE pełni szeroką gamę funkcji krytycznych dla siatkówki i normalnego cyklu widzenia2,3,4. Do głównych funkcji monowarstwy RPE należą: absorpcja światła, odżywianie i odnawianie fotoreceptorów, usuwanie końcowych produktów przemiany materii, kontrola homeostazy jonów w przestrzeni podsiatkówkowej oraz utrzymanie bariery krew-siatkówka2,3. RPE odgrywa również ważną rolę w lokalnej modulacji układu odpornościowego w oku5,6,7,8,9,10,11. Zwyrodnienie i/lub dysfunkcja RPE są wspólnymi cechami wielu chorób oczu, takich jak barwnikowe zwyrodnienie siatkówki, wrodzona ślepota Lebera, albinizm, retinopatia cukrzycowa i zwyrodnienie plamki żółtej12,13,14,15. Niestety, dostępność tkanek ludzkich jest ograniczona. Biorąc pod uwagę ich wysoce konserwatywną homologię genetyczną z ludźmi, modele myszy stanowią odpowiednie i użyteczne narzędzie do badania zaburzeń oczu16,17,18,19. Co więcej, wykorzystanie hodowanych pierwotnych komórek RPE zapewnia korzyści, takie jak manipulacje genetyczne i testy leków, które mogą przyspieszyć rozwój nowych terapii tych zagrażających widzeniu zaburzeń9,11.

Istniejące metody izolacji i hodowli RPE u myszy nie są powtarzalne i nie podsumowują cech RPE in vivo z wystarczającą wiarygodnością. Komórki mają tendencję do utraty pigmentacji, sześciokątnego kształtu i transnabłonkowej odporności elektrycznej (TER) w ciągu kilku dni w culture13, 20. Ponieważ ustalenie tych pierwotnych hodowli komórek RPE od myszy jest trudnym procesem, ten zoptymalizowany protokół został stworzony w oparciu o inne protokoły izolowania komórek RPE od oczu szczurów i ludzi21,22,23 do analizy oczu myszy, zebrania RPE i hodowli mysich komórek RPE in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wytyczne Oświadczenia ARVO dotyczące wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych były przestrzegane.

UWAGA: Ta metoda okazała się skuteczna na myszach o różnym pochodzeniu genetycznym, w tym C57BL/6J, B10. D2-Hco H2d H2-T18c/oSnJ i myszy albinosy, w różnym wieku. Najlepiej użyć myszy w wieku od 8 do 12 tygodni, aby uzyskać komórki RPE. Komórki RPE od starszych myszy rozmnażają się mniej w hodowli, a młodsze myszy mają mniej i mniejsze komórki, co wymaga połączenia oczu od różnych zwierząt, aby mieć żywotne kultury.

1. Przygotowanie odczynników i wkładów membranowych

  1. Przygotuj następujące odczynniki.
    1. Przygotować HBSS-H− (HBSS bez wapnia, bez buforu magnezowego + 10 mM HEPES): Dodać 1 ml 1 M HEPES do 99 ml buforu HBSS (bez Ca/Mg). Przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.
    2. Przygotować HBSS-H+ (HBSS z wapniem, z buforem magnezowym + 10 mM HEPES): Dodaj 1 ml 1 M HEPES do 99 ml buforu HBSS+ (z Ca/Mg). Przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.
    3. Przygotować roztwór hialuronidazy (1 mg/ml): Dodać 10 mg hialuronidazy do 10 ml HBSS-H− i przefiltrować za pomocą sterylnego filtra strzykawkowego 0,4 μm za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml. Przygotuj świeże przed użyciem i pozostaw w temperaturze pokojowej (RT; 20-25 °C).
    4. Przygotuj roztwór FBS: Wymieszaj 20% FBS z HBSS-H+. Dodaj 2 ml FBS do 8 ml HBSS-H+. Przygotuj świeże przed użyciem.
    5. Przygotuj pożywkę RPE: N1 Medium Supplement 1/100 (v/v), glutamina 1/100 (v/v), penicylina-streptomycyna 1/100 (v/v) i roztwór aminokwasów endogennych 1/100 (v/v), hydrokortyzon (20 μg/L), tauryna (250 mg/L) i trójjodo-tyronina (0,013 μg/L) w alfa MEM + 5% FBS lub bez FBS1,23,24. W razie potrzeby FBS może być inaktywowany termicznie; Nie zaobserwowano żadnych różnic. Przygotuj się na świeżo do izolacji RPE. W celu utrzymania hodowli komórkowych przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.
    6. Przygotuj trypsynę-EDTA: Przygotuj małe jednorazowe porcje (~8 ml) świeżej trypsyny-EDTA (0,25%) i zamroź je w temperaturze -20 oC. Rozmroź je w temperaturze pokojowej przed każdym użyciem. Unikaj cykli zamrażania i rozmrażania.
  2. Przygotuj wkładki membranowe (np. wkładki Transwell).
    1. Zrównoważyć wkładki membranowe o średnicy 6,5 mm z pożywką RPE przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze napowietrzonym 5% CO2. Użyj jednej wkładki membranowej, aby wysiać komórki RPE z dwóch oczu myszy.
    2. Po inkubacji zastąpić pożywkę z dolnej komory 700 μl PBS.
    3. Usunąć pożywkę z górnej komory i pokryć wkładkę membranową 100 μl 10 μg/ml mysiej lamininy (w PBS) przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej (krótsza inkubacja może prowadzić do słabego przylegania komórek do wkładki).
    4. Pokryj dodatkową wkładkę membranową, która będzie używana jako półfabrykat do pomiarów TER.

2. Preparacja i enukleacja oczu myszy

  1. Poddaj myszy eutanazji przez uduszenie CO2 , umieszczając je w komorze CO2 i powoli uwalniając CO2 z szybkością napełniania 30-70% objętości komory na minutę.
  2. Umieść skośne, ząbkowane końcówki mikrokleszczyków po obu stronach oka myszy i delikatnie dociśnij, aby podeprzeć gałkę oczną (enukleacja).
  3. Zamknij kleszcze umieszczone wokół gałki ocznej. Następnie delikatnie pociągnij, poruszając się do przodu i do tyłu, aby odłączyć całe oko z nerwem wzrokowym od mięśni oka, upewniając się, że żadna tkanka łączna nie pozostaje przyczepiona do twardówki.
  4. Przepłukać wyłuszczoną gałkę oczną w 70% etanolu przed umieszczeniem ich w jednym dołku sześciodołkowej płytki z 3 ml HBSS-H− na lodzie.
  5. Powtórz kroki od 2.2 do 2.4, aby usunąć drugie oko myszy. Wykonaj kolejne kroki w ciągu 30 min.
    UWAGA: Zaleca się enukleację/preparację tylko dwojga oczu na raz, aż do zdobycia pewnego doświadczenia.

3. Kolekcja RPE

UWAGA: Wykonaj następujące kroki w sterylnych warunkach w okapie z przepływem laminarnym. Aby uniknąć długotrwałych inkubacji na lodzie, które mogą spowodować śmierć komórek RPE, nie należy pobierać więcej niż dwoje oczu na raz.

  1. Użyj stereoskopowego mikroskopu preparacyjnego, kleszczy Dumont #5 i kątowych nożyczek, aby ostrożnie oczyścić całą tkankę łączną, krew i mięśnie pozostałe przyczepione do gałki ocznej, nie wykonując żadnych nacięć w twardówce. W razie potrzeby należy regularnie zmieniać 3 ml buforu HBSS-H−, aby oko było świeże i czyste oraz aby uniknąć zanieczyszczenia kultur RPE.
  2. Użyj nerwu wzrokowego jako uchwytu do przytrzymania gałki ocznej i zrób otwór w środku rogówki za pomocą ostrego ostrza ze stali węglowej #11.
  3. Użyj nożyczek Dumont #5, aby wykonać trzy nacięcia w rogówce przez wyżej wymieniony otwór, upewniając się, że jest wystarczająco dużo miejsca na wyjęcie soczewki.
  4. Przytrzymaj nerw wzrokowy i lekko dociśnij ora serrata podstawą kątowych nożyczek, aż soczewka całkowicie wyjdzie. Pozostaw nabłonek tęczówki na miejscu, aby zapobiec odwarstwieniu siatkówki nerwowej i RPE podczas inkubacji. Umieść oko w buforze HBSS-H.
  5. Powtórz kroki 3.1-3.4, aby przeanalizować drugie oko.
  6. Inkubować oczy bez soczewek w roztworze hialuronidazy na 12-dołkowej płytce w temperaturze 37 °C przez 45 minut w inkubatorze napowietrzonym 5% CO2 (1,5 ml / dołek) w celu odłączenia siatkówki nerwowej od RPE.
  7. Umieść każde oko w nowej studzience i inkubuj je na lodzie przez 30 minut z 1,5 ml zimnego buforu HBSS-H+ na studzienkę, aby zatrzymać aktywność hialuronidazy. Nie przedłużać inkubacji na dłużej niż 45 minut.
  8. Umyj i umieść każde oko w 35-milimetrowym naczyniu hodowlanym ze świeżym buforem HBSS-H+ i przetnij rogówkę przez pierwotne nacięcia, aż do osiągnięcia ora serrata za pomocą 8-centymetrowych nożyczek Vannas. Następnie przetnij poniżej ora serrata, aby usunąć nabłonek tęczówki i rogówkę.
  9. Przytrzymaj krawędź muszli ocznej/lub ząbkowaną pęsetę i za pomocą kątowych mikrokleszczyków odciągnij siatkówkę nerwową, upewniając się, że warstwa RPE nie została przecięta. Następnie odetnij wewnętrzne przyczep do nerwu wzrokowego. Jeśli niektóre komórki RPE pozostają przyczepione do siatkówki nerwowej, wydłuż czas inkubacji, ale nie przekraczaj łącznie 45 minut.
  10. Przeciąć nerw wzrokowy i przenieść każdą muszlę oczną na inną 12-dołkową płytkę zawierającą 1,5 ml świeżej trypsyny-EDTA na dołek. Upewnij się, że muszle oczne pozostają otwarte i całkowicie zanurzone w trypszynie. Inkubować muszle oczne w temperaturze 37 °C przez 45 minut w inkubatorze o stężeniu 5%CO2
    11. .
  11. Zebrać każdą muszlę oczną razem z wszelkimi arkuszami RPE oderwanymi podczas inkubacji trypsyny i przenieść je na 12-dołkową płytkę zawierającą 1,5 ml roztworu FBS na studzienkę. Jeśli arkusze RPE pozostaną w roztworze trypsyny, użyj mikropipety, aby przenieść je do studzienki z roztworem FBS.

4. Izolacja pierwotnych komórek RPE myszy

  1. Chwyć każdą muszlę oczną za nerw wzrokowy i potrząśnij nią twarzą w dół na 12-dołkowej płytce zawierającej 1,5 ml 20% FBS w HBSS-H+, aż do całkowitego oderwania arkuszy RPE.
  2. Za pomocą mikropipety należy zebrać wszystkie arkusze RPE i klastry RPE i umieścić je w probówce o pojemności 15 ml. Unikaj wszelkich białych kawałków twardówki lub naczyniówki, które mogą zanieczyścić kultury. Zbierz dwoje oczu z tej samej myszy w jednej tubie.
  3. Odwirować mieszaninę przy 340 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
  4. Delikatnie zawiesić osad RPE w 1 ml trypsyny-EDTA (0,25%) i inkubować mieszaninę przez 1 minutę w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C w celu rozłożenia arkuszy RPE na pojedyncze komórki. Po inkubacji delikatnie pipetować w górę i w dół 10 razy za pomocą mikropipety, unikając tworzenia się pęcherzyków podczas pipetowania.
  5. Dodać 9 ml świeżo przygotowanej pożywki RPE w celu rozcieńczenia i dezaktywacji trypsyny, a następnie odwirować mieszaninę przy 340 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
  6. Odessać supernatant i ostrożnie ponownie zawiesić osad komórek w 150 μl pożywki RPE z 5% FBS za pomocą mikropipety, upewniając się, że komórki są jednorodnie ponownie zawieszone i unikając tworzenia się pęcherzyków podczas pipetowania.
  7. Weź wkładkę membranową pokrytą lamininą z kroku 1.2, wyjmij PBS z dolnej komory i dodaj 700 μl pożywki RPE.
  8. Usuń lamininę z górnej komory wkładu membranowego i rozprowadź zawiesinę komórek RPE kroplowo i równomiernie do środka komory, unikając tworzenia się pęcherzyków podczas pipetowania.
  9. Umieścić wkład membranowy w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C i pozostawić w spokoju na co najmniej 24 godziny.
  10. Po 24 godzinach sprawdź wkładkę membranową pod mikroskopem, aby upewnić się, że większość komórek RPE jest podłączona do wkładki, a zbieg wynosi co najmniej 50% (Rysunek 1A). Bardzo ważne jest, aby nie zmieniać mediów w ciągu pierwszych 72 godzin.

5. Kultura spolaryzowanych monowarstw RPE

  1. Utrzymuj wyizolowane komórki RPE w hodowli przez co najmniej 72 godziny przed odświeżeniem pożywki RPE, aby umożliwić przyłączenie komórek. Zbieżność komórek wynosząca 50% lub więcej podczas wysiewu ma zasadnicze znaczenie dla utworzenia odpowiedniej spolaryzowanej monowarstwy RPE.
  2. Zmieniaj pożywkę hodowlaną dwa razy w tygodniu, używając świeżej i wstępnie podgrzanej pożywki RPE (krok 1.1.5) po połączeniu komórek. Surowicę można usunąć z pożywki hodowlanej po pierwszych 72 godzinach
    UWAGA: Po tygodniu w hodowli komórki powinny być zlewające się, sześciokątne, dwujądrowe, pigmentowane i spolaryzowane (Rysunek 1B), przy oczekiwanej liczbie komórek wynoszącej około 50 000 komórek na wkładkę Transwell 6,5 mm. Po dwóch tygodniach w hodowli obserwuje się monowarstwy RPE składające się ze zdrowych komórek. Hodowle RPE wykazują mikrokosmki wierzchołkowe, fałdy podstawy i ścisłe połączenia (Rysunek 1C).

6. Pomiar TER

UWAGA: Wykonaj pomiary TER komórek RPE po minimum 4 dniach w hodowli, aby zapewnić dobrą integralność i polaryzację monowarstwy RPE.

  1. Oczyść elektrody woltoomomierza 70% etanolem i dokładnie je wysusz.
  2. Wyjmij transwelle z inkubatora i wykonaj pomiar TER w ciągu 3 minut, aby uniknąć zmian spowodowanych wahaniami temperatury. Aby zmierzyć TER, zanurz krótką elektrodę woltoomomierza w górnej komorze, a długą elektrodę w dolnej komorze wkładu membranowego. Unikaj kontaktu z monowarstwą RPE, aby zapobiec odłączeniu komórek.
  3. Aby obliczyć TER, należy odjąć wartość ślepej próby (wkładki membranowej pokrytej lamininą bez komórek) od próbki. Następnie należy pomnożyć uzyskaną wartość (w omach) przez pole powierzchni wkładu membranowego (0,33cm2 w przypadku wkładu membranowego 6,5 mm). Produkt powinien mieć co najmniej 200 Ω xcm2 po 72 godzinach w kulturze. Wartości TER powinny wynosić powyżej 400 Ω xcm2 po dwóch tygodniach. Odrzuć kultury RPE o niskich wartościach TER.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół został użyty do izolacji i hodowli komórek RPE od genetycznie zmodyfikowanych myszy1. Nie zaobserwowano różnic między szczepami myszy ani płcią. Wyniki pomogły zrozumieć niektóre ważne aspekty mechanizmu leżącego u podstaw chorób oczu, takich jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem, które jest najczęstszą przyczyną utraty wzroku wśród osób starszych9. Komórki RPE wyizolowane zgodnie z tym protokołem zostały całkowicie przyłączone do wkładki membranowe...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas gdy kilka metod izolacji i hodowli mysich komórek RPE zostało opracowanych przed 1,13,20,22,26,27, metoda Fernandeza-Godino po raz pierwszy wykorzystała wstawki błonowe, które pozwoliły na wydajny wzrost komórek RPE w hodowli przez tygodnie 1,9. Kolejną ważną ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Instytut Genomiki Oczu w Massachusetts Eye and Ear.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka z końcówką 10 ml BD Luer-Lok, jednorazowaBD Biosciences309604
15 mlVWR International21008-103
Probówka wirówkowa 50 mlVWR International21008-951
Alpha Minimum Essential MediumSigma-AldrichM4526-500ML
Mikrokleszcze kątoweWPI501727
Wirówka stołowadowolny
inkubator CO2ThermoHERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V
Mikroskop preparacyjnyDowolny
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanem bez wapnia, bez magnezuGibco14190144
Dumont #5 45° Pęseta do biologii medycznej, końcówka 0,05 x 0,01 mm, długość 11 cmWPI14101
EtanolSigma-AldrichE7023-500ML
Przezroczyste naczynie do hodowli komórek polistyrenowych Falcon Easy-Grip, 35 mmBD Biosciences353001
Hyklon surowicy bydlęcejpłodu SH30071.03Inaktywowany termicznie.
Hank' s Zrównoważony roztwór soli plus wapń i magnez, bez Phenol RedLife Technologies14175095
Hank' s Zrównoważony roztwór soli plus wapń i magnez, bez czerwieni fenolowej B6Life Technologies14025092
HEPES 1MGibco15630106
HialuronidazaSigma-AldrichH-3506 1G
HydrokortyzonSigma-AldrichH-0396
Okap z przepływem laminarnymThermoKLASA II A2 4 115V PAKIETCLA
Laminin 1mg/ mlSigma-AldrichL2020-1 MGRozcieńczony w PBS w temperaturze 37C do 1mg/ml
McPherson-Vannas Micro Nożyczki o długości 8 cmWPI503216
Aminokwasy endogenne 100XSuplement Gibco11140050
N1 100XSigma-AldrichN6530-5ML
Penicylina-StreptomycynaGibco15140-148
Sterylne ostrze chirurgiczne Bard-Parker ze stali węglowej rozmiar 11Fisher-Scientific08-914B
TaurynaSigma-AldrichT-0625
Płytki 12-dołkowe poddane hodowli tkankowejFisher-Scientific08-772-29
Płytki 6-dołkowe poddane hodowli tkankowejFisher-Scientific14-832-11
Wsporniki Transwell 6,5 mmSigma-AldrichCLS3470-48EA
Trijodo-tyroninaSigma-AldrichT-5516
Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowaGibco25200056
Pęseta, Dumont #5 Biologia medyczna 11 cm, zakrzywiona, stal nierdzewna 0,02 x 0,06 mm Końcówki modoweWPI500232
Vannas Nożyczki o długości 8 cm, stal nierdzewnaWPI501790
Whatman Puradisc 25mm Filtry strzykawkowe 0,45μ m wielkość porówFisher-Scientific6780-2504
probówka wirówkowa

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  2. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  3. Konari, K., et al. Development of the blood-retinal barrier in vitro: Formation of tight junctions as revealed by occludin and ZO-1 correlates with the barrier function of chick retinal pigment epithelial cells. Experimental Eye Research. 61 (1), 99-108 (1995).
  4. Kay, P., Yang, Y. C., Paraoan, L. Directional protein secretion by the retinal pigment epithelium: Roles in retinal health and the development of age-related macular degeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 833-843 (2013).
  5. Johnson, L. V., Leitner, W. P., Staples, M. K., Anderson, D. H. Complement activation and inflammatory processes in drusen formation and age related macular degeneration. Experimental Eye Research. 73 (6), 887-896 (2001).
  6. Hageman, G. S., et al. An integrated hypothesis that considers drusen as biomarkers of immune-mediated processes at the RPE-Bruch's membrane interface in aging and age-related macular degeneration. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (6), 705-732 (2001).
  7. Lommatzsch, A., et al. Are low inflammatory reactions involved in exudative age-related macular degeneration. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (6), 803-810 (2008).
  8. Bandyopadhyay, M., Rohrer, B. Matrix metalloproteinase activity creates pro-angiogenic environment in primary human retinal pigment epithelial cells exposed to complement. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (4), 1953-1961 (2012).
  9. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. A local complement response by RPE causes early-stage macular degeneration. Human Molecular Genetics. 24 (19), 5555-5569 (2015).
  10. Fernandez-Godino, R., Bujakowska, K. M., Pierce, E. A. Changes in extracellular matrix cause RPE cells to make basal deposits and activate the alternative complement pathway. Human Molecular Genetics. 27 (1), 147-159 (2018).
  11. Fernandez-Godino, R., Pierce, E. A. C3a triggers formation of sub-retinal pigment epithelium deposits via the ubiquitin proteasome pathway. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
  12. Farkas, M. H., et al. Mutations in Pre-mRNA processing factors 3, 8, and 31 cause dysfunction of the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184 (10), 2641-2652 (2014).
  13. Geisen, P., Mccolm, J. R., King, B. M., Hartnett, E. Characterization of Barrier Properties and Inducible VEGF Expression of Several Types of Retinal Pigment Epithelium in Medium-Term Culture. Current Eye Research. 31, 739(2006).
  14. Schütze, C., et al. Retinal pigment epithelium findings in patients with albinism using wide-field polarization-sensitive optical coherence tomography. Retina. 34 (11), 2208-2217 (2014).
  15. Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
  16. Garland, D. L., et al. Mouse genetics and proteomic analyses demonstrate a critical role for complement in a model of DHRD/ML, an inherited macular degeneration. Human Molecular Genetics. 23 (1), 52-68 (2014).
  17. Fu, L., et al. The R345W mutation in EFEMP1 is pathogenic and causes AMD-like deposits in mice. Human Molecular Genetics. 16 (20), 2411-2422 (2007).
  18. Greenwald, S. H., et al. Mouse Models of NMNAT1-Leber Congenital Amaurosis (LCA9) Recapitulate Key Features of the Human Disease. American Journal of Pathology. 186 (7), 1925-1938 (2016).
  19. Gupta, P. R., et al. Ift172 conditional knock-out mice exhibit rapid retinal degeneration and protein trafficking defects. Human Molecular Genetics. 27 (11), 2012-2024 (2018).
  20. Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).
  21. Bonilha, V. L., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. Ezrin promotes morphogenesis of apical microvilli and basal infoldings in retinal pigment epithelium. Journal of Cell Biology. 147 (7), 1533-1547 (1999).
  22. Nandrot, E. F., et al. Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking αvβ5 integrin. Journal of Experimental Medicine. 200 (12), 1539-1545 (2004).
  23. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).
  24. Maminishkis, A., Miller, S. S. Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
  25. Brydon, E. M., et al. AAV-Mediated Gene Augmentation Therapy Restores Critical Functions in Mutant PRPF31+/− iPSC-Derived RPE Cells. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 15, 392-402 (2019).
  26. Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. 2018 (133), (2018).
  27. Bonilha, V. Age and disease-related structural changes in the retinal pigment epithelium. Clinical Ophthalmology. 2 (2), 413(2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

nab onek pigmentowy siatk wkikom rki RPE myszyhodowla kom rek RPEizolacja pierwotnych kom rek RPEsekcja okatrawienie trypsyninserty powlekane laminintest fagocytozymodel zwyrodnienia plamki tejbadania nad chorobami ocznymi

Powiązane artykuły