Artykuł metodologiczny

Supramolekularne hydrożele polimerowo-nanocząsteczkowe do wstrzykiwań do zastosowań w dostarczaniu komórek i leków

DOI:

10.3791/62234

⸱

7 lutego 2021

 ,  ,  , 
1Department of Materials Science & Engineering, Stanford University, 2Department of Chemical Engineering, Stanford University, 3Department of Bioengineering, Stanford University, 4Department of Pediatrics - Endocrinology, Stanford University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje syntezę i formułowanie wstrzykiwalnych, supramolekularnych biomateriałów hydrożelowych polimerowo-nanocząsteczkowych (PNP). Przedstawiono zastosowania tych materiałów do dostarczania leków, stabilizacji biofarmaceutycznej oraz enkapsulacji i dostarczania komórek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te metody opisują, jak formułować wstrzykiwalne, supramolekularne hydrożele polimerowo-nanocząsteczkowe (PNP) do wykorzystania jako biomateriały. Hydrożele PNP składają się z dwóch składników: hydrofobowo modyfikowanej celulozy jako polimeru sieciowego oraz samoorganizujących się nanocząstek typu rdzeń-powłoka, które działają jako niekowalencyjne środki sieciujące poprzez dynamiczne, wielowartościowe oddziaływania. Metody te opisują zarówno tworzenie tych samoorganizujących się nanocząstek poprzez nanowytrącanie, jak i formułowanie i mieszanie dwóch składników w celu wytworzenia hydrożeli o regulowanych właściwościach mechanicznych. Szczegółowo omówiono również zastosowanie dynamicznego rozpraszania światła (DLS) i reologii w celu scharakteryzowania jakości syntetyzowanych materiałów. Wreszcie, użyteczność tych hydrożeli do dostarczania leków, stabilizacji biofarmaceutycznej oraz enkapsulacji i dostarczania komórek wykazano w eksperymentach in vitro w celu scharakteryzowania uwalniania leku, stabilności termicznej oraz osiadania i żywotności komórek. Ze względu na swoją biokompatybilność, możliwość wstrzykiwania i łagodne warunki tworzenia żelu, ten system hydrożelowy jest łatwo dostrajaną platformą odpowiednią do wielu zastosowań biomedycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hydrożele do wstrzykiwań to nowe narzędzie do dostarczania komórek terapeutycznych i leków do organizmu w kontrolowany sposób1. Materiały te mogą być wypełnione lekami lub komórkami i mogą być podawane w sposób minimalnie inwazyjny poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie do tkanek powierzchownych lub przez cewnik do tkanek głębokich. Ogólnie rzecz biorąc, hydrożele do wstrzykiwań składają się z nabrzmiałych wodą sieci polimerowych, które są usieciowane ze sobą przez przejściowe, fizyczne interakcje. W spoczynku te usieciowania zapewniają żelom strukturę podobną do ciała stałego, ale po przyłożeniu wystarczającej siły mechanicznej te wiązania są tymczasowo przerywane, przekształcając materiał w stan podobny do cieczy, który może łatwo przepływać2. To właśnie te właściwości reologiczne pozwalają fizycznym hydrożelom rozrzedzać się jak ścinanie i przepływać przez małe średnice igieł podczas iniekcji3. Po wstrzyknięciu sieć polimerowa materiału przekształca się, umożliwiając mu samoregenerację i szybkie tworzenie stałego żelu in situ4,5. Struktury te mogą pełnić rolę magazynów o powolnym uwalnianiu dla leków lub rusztowań do regeneracji tkanek6,7. Materiały te były wykorzystywane w różnych zastosowaniach, w tym w technologii dostarczania leków, medycynie regeneracyjnej i immunoinżynierii1,8,9,10,11,12.

Zarówno naturalne materiały (np. alginian i kolagen), jak i syntetyczne (np. poli(glikol etylenowy) (PEG) lub podobne hydrofilowe polimery) zostały opracowane jako biokompatybilne materiały hydrożelowe do wstrzykiwań13,14,15. Wiele naturalnych materiałów wykazuje zmienność między partiami, co wpływa na odtwarzalność4,16. Materiały te są często wrażliwe na temperaturę, utwardzają się po osiągnięciu temperatury fizjologicznej; W związku z tym obchodzenie się z tymi materiałami stwarza dodatkowe wyzwania techniczne i logistyczne17. Materiały syntetyczne pozwalają na bardziej precyzyjną kontrolę chemiczną i doskonałą odtwarzalność, ale materiały te mogą czasami podlegać niekorzystnym reakcjom immunologicznym, które ograniczają ich biokompatybilność, co ma kluczowe znaczenie dla zastosowań terapeutycznych in vivo6,18,19. Ostatnie wysiłki wykazały, że istnieje wiele złożonych kryteriów projektowych związanych z inżynierią iniekcyjnego materiału hydrożelowego, w tym optymalizacja właściwości mechanicznych, rozmiar siatki sieci polimerowej, bioaktywne wskazówki molekularne, biodegradowalność i immunogenność materiału20,21,22,23,24,25,26. Wszystkie te czynniki muszą być brane pod uwagę w zależności od zastosowania, które Cię interesuje, co oznacza, że modułowa, chemicznie przestrajana platforma jest idealna do zaspokojenia szerokiego zakresu zastosowań.

Obecne metody opisują formułowanie i stosowanie platformy hydrożelowej polimerowo-nanocząsteczkowej (PNP) do wstrzykiwania, która wykazuje regulowane właściwości mechaniczne, wysoki stopień biokompatybilności i niską immunogenność, a także przedstawia miejsca do koniugacji bioaktywnych wskazówek molekularnych27,28,29,30,31,32,33. Te hydrożele PNP składają się z hydrofobowo modyfikowanych polimerów celulozy i samoorganizujących się nanocząstek typu rdzeń-powłoka składających się z poli(glikolu etylenowego)-bloku-poli(kwasu mlekowego) (PEG-PLA)27,34, które oddziałują ze sobą, tworząc sieć supramolekularną. Mówiąc dokładniej, modyfikowane dodecylo polimery hydroksypropylometylocelulozy (HPMC-C12) dynamicznie oddziałują z powierzchnią nanocząstek PEG-PLA i łączą się między tymi nanocząstkami, tworząc tę sieć polimerową27,34. Te dynamiczne, wielowartościowe interakcje pozwalają materiałom rozrzedzać się jak ścinanie podczas wstrzykiwania i szybko samoregenerować się po podaniu. Składniki hydrożelu PNP można łatwo wytworzyć w prostych reakcjach jednoetapowych, a hydrożel PNP powstaje w łagodnych warunkach przez proste zmieszanie dwóch składników35. Ze względu na łatwość wytwarzania, ta platforma hydrożelowa jest wysoce podatna na tłumaczenie na dużą skalę. Właściwości mechaniczne i wielkość oczek hydrożeli PNP są kontrolowane poprzez zmianę procentowej zawartości wagowej składników polimerowych i nanocząstek w preparacie. Wcześniejsze badania z wykorzystaniem tej platformy wskazują, że hydrożele PNP są wysoce biokompatybilne, biodegradowalne i nieimmunogenne28,30,31. Ogólnie rzecz biorąc, hydrożele te mają szerokie zastosowanie w zastosowaniach biomedycznych, obejmujących zapobieganie zrostom pooperacyjnym, inżynierię tkankową i regenerację, trwałe dostarczanie leków i immunoinżynierię.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przed rozpoczęciem tego protokołu konieczne jest zsyntetyzowanie HPMC-C12 i PEG-PLA przy użyciu wcześniej opublikowanych metod27,28,29,30,31,36,37,38.

1. Synteza nanocząstek (NP) przez nanoprecypitację

UWAGA: Ta sekcja opisuje syntezę pojedynczej partii NPs, wytwarzającej 250 μL z 20% wagowych NPs w roztworze buforowym (50 mg suchego polimeru PEG-PLA na partię). Uwagi dotyczące zwiększania liczby partii znajdują się na odpowiednich etapach.

  1. Odmierzyć 50 mg polimeru PEG-PLA do szklanej fiolki scyntylacyjnej o pojemności 8 ml i dodać 1 ml acetonitrylu. Wir do całkowitego rozpuszczenia.
    UWAGA: Aby zwiększyć liczbę partii, należy liniowo skalować ten krok i dodać całkowitą ilość potrzebnego polimeru i rozpuszczalnika do jednej fiolki.
  2. Dodaj 10 ml ultraczystej wody do szklanej fiolki scyntylacyjnej o pojemności 20 ml z małym mieszadłem. Umieść na talerzu mieszającym ustawionym na 600 obr./min.
    UWAGA: Jeśli krok 1.1 został skalowany, nadal konieczne jest posiadanie indywidualnej fiolki scyntylacyjnej do wytrącania dla każdej równoważnej partii. Na przykład dla 200 mg polimeru rozpuszczonego w 4 ml acetonitrylu należy przygotować 4 fiolki scyntylacyjne po 20 ml.
  3. Aby utworzyć nanocząsteczki przez nanostrącanie, dodaj kroplami 1 ml roztworu rozpuszczalnika polimerowego do wody za pomocą pipety o pojemności 200 μl. Mieszaj przez 2 minuty. Blok PLA PEG-PLA nie jest rozpuszczalny w wodzie, w wyniku czego NP typu core-shell będą się samoorganizować z hydrofobowymi blokami PLA jako rdzeniem i hydrofilowymi blokami PEG jako powłoką.
  4. Sprawdź wielkość cząstek za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS).
    UWAGA: Ta procedura została opracowana specjalnie dla dostępnego na rynku czytnika płytek z powiązanym pakietem oprogramowania (patrz tabela materiałów). W przypadku korzystania z alternatywnych przyrządów należy zapoznać się z metodami przygotowania próbki opisanymi przez producenta przyrządu.
    1. Rozcieńczyć 20 μl roztworu NP w 80 μl ultraczystej wody (stężenie analityczne: 1 mg/mL PEG-PLA N.S). Dodać 30 μl na dołek do przezroczystej czarnej płytki 384-dołkowej o przezroczystym dnie (analizować w trzech częściach).
    2. Zmierz promień hydrodynamiczny i polidyspersyjność każdej próbki za pomocą czytnika płytek DLS, korzystając z wstępnie ustawionych opcji protokołu w pakiecie oprogramowania. Jako przykład typowego protokołu należy ustawić parametry zbierania danych tak, aby uzyskać 5-10 pomiarów DLS trwających 2-5 s na akwizycję, a następnie podać średnią wielkość i rozkład cząstek na studzienkę, obliczoną na podstawie modelu białek globularnych. Aby utworzyć hydrożele o stałych właściwościach reologicznych, otrzymane cząstki powinny mieć średnicę hydrodynamiczną 30-50 nm i polidyspersyjność (PD) < 0,2,
      UWAGA: Jeśli NP są mniejsze niż pożądane, użyj roztworu 75% acetonitrylu / 25% dimetylosulfotlenku (DMSO) w kroku 1.1. Zwiększenie procentowej zawartości DMSO w roztworze rozpuszczalnika na ogół zwiększa wielkość cząstek.
  5. Przenieść roztwór NP z fiolki scyntylacyjnej o pojemności 20 ml do filtra odśrodkowego. Wirować przy 4500 x g przez 1 godzinę w celu zagęszczenia roztworu NP do <250 μl.
  6. Zawiesić w żądanym buforze, takim jak sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), do 20% wag. Zawartość filtra odśrodkowego należy odpipetować do wytarowanej probówki do mikrowirówki lub szklanej fiolki scyntylacyjnej na wadze masy. Użyj niewielkiej ilości (50-100 μl) buforu do przepłukania filtra i upewnij się, że wszystkie NP są zebrane. Dodaj bufor, aby osiągnąć całkowitą masę 250 mg.
    UWAGA: Partie można łączyć podczas ponownego zawieszania. Roztwory podstawowe NP można przechowywać w temperaturze 4 °C przez około 1 miesiąc. Nie zamrażać. W przypadku dłuższego przechowywania przed użyciem należy sprawdzić rozmiar i polidyspersyjność za pomocą DLS.

2. Preparat hydrożelowy i kapsułkowanie leków lub komórek

UWAGA: Ta sekcja opisuje przygotowanie 1 ml preparatu hydrożelowego PNP w proporcji 2:10, gdzie 2:10 oznacza 2% wag. HPMC-C12 i 10% wag. NPs (12% wag. całkowitego stałego polimeru) i 88% wag. roztworu buforowego, roztworu ładunku leku lub zawiesiny komórkowej. Procentowe składniki preparatu można zmieniać, aby uzyskać hydrożele o różnych właściwościach mechanicznych. Na przykład hydrożele PNP w proporcji 1:5 użyto do osiadania komórek i wyników eksperymentów, które wykazały.

  1. Przygotować roztwór podstawowy 6% wag. HPMC-C12 w PBS (lub innym wybranym buforze). Rozpuścić przez 48 godzin, aby upewnić się, że polimer jest w pełni zdyspergowany.
    UWAGA: Roztwór podstawowy HPMC-C12 jest stabilny przez miesiące w temperaturze pokojowej. Zaleca się jednak przechowywanie w temperaturze 4 °C w celu zahamowania rozwoju drobnoustrojów.
  2. Dodać 333 mg 6% wag. roztworu podstawowego HPMC-C12 do 1 ml strzykawki Luer lock.
  3. Dodać 500 μl 20% wag. roztworu podstawowego NP do probówki mikrowirówkowej. Dodać 167 μl PBS i odpipetować do mieszania. Za pomocą igły napełnić kolejną strzykawkę Luer lock o pojemności 1 ml rozcieńczonym roztworem NP.
    UWAGA: Aby załadować ładunek leku, należy obliczyć pożądane końcowe stężenie leku w hydrożelu i załadować odpowiednią ilość do 167 μl PBS, który jest zmieszany z NPs. Jeśli sonda molekularna jest niezbędna do testu in situ, takiego jak monitorowanie stabilności leku, należy załadować sondę w podobny sposób, jak opisano powyżej, w celu załadunku ładunku leku. Aby załadować komórki, należy obliczyć pożądane końcowe stężenie komórek w hydrożelu i załadować odpowiednią liczbę komórek do 167 μl PBS, który jest zmieszany z NPs.
  4. Wymieszaj dwa składniki hydrożelu (HPMC-C12 i NPs) za pomocą metody mieszania kolankowego35.
    1. Przymocuj złącze kolankowe Luer do strzykawki zawierającej roztwór NP (opcjonalnie zawierającej również ładunek leku lub komórki). Przepchnij roztwór NP przez łokieć, aż łąkotka będzie widoczna na otwartym końcu. Odciągnąć lekko i podłączyć strzykawkę zawierającą roztwór HPMC-C12.
      UWAGA: Ważne jest, aby zminimalizować ilość powietrza w połączeniu kolankowym, aby zapobiec tworzeniu się i rozpraszaniu pęcherzyków w całym hydrożelu podczas procesu mieszania. Podczas mieszania komórek za pomocą mieszalnika kolankowego należy uważać, aby mieszać delikatniej, ponieważ zbyt szybkie mieszanie może narazić komórki na działanie dużych sił ścinających, prowadząc do śmierci komórki.
    2. Pompuj oba roztwory tam iz powrotem przez mieszalnik kolankowy przez około 60 cykli, aż utworzy się jednorodny, nieprzezroczysty biały materiał hydrożelowy.
    3. Wepchnąć całą objętość hydrożelu do jednej strzykawki. Wyjąć pustą strzykawkę i wciągnąć tłok z powrotem na strzykawkę z żelem, aby odzyskać materiał ze złącza kolankowego. Nakrętka z igłą lub zatyczką.
      UWAGA: Konieczne jest uwzględnienie ~300 μL utraconej objętości hydrożelu z powodu martwej przestrzeni w procesie mieszania. Na przykład, jeśli pożądane jest 700 μl końcowej objętości hydrożelu, należy przygotować 1 ml hydrożelu. Proces formulacji hydrożelu można zwiększyć za pomocą większych strzykawek. Jednak w przypadku sztywnych preparatów hydrożelowych, takich jak 2:10, mieszanie i wstrzykiwanie ze strzykawek o objętości większej niż 3 ml może być trudne ze względu na rosnący stosunek cylindra strzykawki do średnicy łokcia lub igły.
    4. Przechowywać hydrożel w strzykawce w temperaturze pokojowej. Jeżeli jednak leki są zamknięte w kapsułkach, zaleca się przechowywanie w temperaturze 4 °C, chyba że producent leku określi inaczej. Nie zamrażaj materiału.

3. Pomiar właściwości reologicznych preparatów hydrożelowych

UWAGA: Ten protokół jest specjalnie używany z komercyjnym reometrem wymienionym w Tabeli Materiałów z 20 mm ząbkowaną geometrią płytki. W przypadku korzystania z innych przyrządów należy zapoznać się z instrukcjami producenta dotyczącymi przygotowania próbki.

  1. Sformułować co najmniej 700 μl hydrożelu PNP w celu charakterystyki reologicznej.
  2. Wstrzyknąć materiał w środek ząbkowanej płytki reometru. Ilość będzie się różnić w zależności od wybranej szczeliny geometrycznej. Dla porównania, szczelina 700 μm wymaga ~400-500 μL materiału.
  3. Opuść reometr do szczeliny przycinania (500-1000 μm) i powoli obracaj górną płytkę reometru, gdy styka się z hydrożelem PNP, aby zapewnić równomierne i całkowite wypełnienie szczeliny.
  4. Sprawdź obciążenie hydrożelu PNP tak, aby pokrywało całą powierzchnię płytki reometru. Użyj szpatułki lub plastikowego trymera, aby delikatnie przyciąć i usunąć nadmiar materiału, tak aby miał bardzo lekkie wybrzuszenie z talerza.
  5. Opuść reometr do końcowej szczeliny geometrii i sprawdź, czy próbka jest czysto załadowana.
  6. Zmierz właściwości mechaniczne próbki za pomocą testów oscylacyjnych, takich jak przemiatanie amplitudy lub częstotliwości, lub testów przepływu, takich jak przemiatanie przepływu lub testy krokowe.
    UWAGA: W przedstawionych reprezentatywnych danych testy amplitudy oscylacyjnej są przeprowadzane ze stałą częstotliwością 10 rad/s. Przemiatanie częstotliwości oscylacyjnej odbywa się przy stałym odkształceniu 1%, w liniowym reżimie lepkosprężystym przemiatania amplitudy. Przemiatanie przepływu przeprowadzono od wysokich do niskich szybkości ścinania39. Wszystkie testy są wykonywane z 10 punktami na dekadę zebranych danych i w temperaturze pokojowej. Parametry testu mogą wymagać dostosowania w zależności od właściwości preparatu. Poddawanie sztywniejszych materiałów PNP, takich jak preparaty 2:10, wysokim szybkościom ścinania może spowodować wyrzucenie materiału z płytek reometru, co skutkuje niedokładną charakterystyką mechaniczną i wymaga ponownego załadowania próbki między kolejnymi testami. Reprezentatywne dane przedstawione poniżej mogą być wykorzystane do porównania podczas testów kontroli jakości.

4. Charakterystyka uwalniania leków in vitro

  1. Przygotuj rurki kapilarne, przycinając szklane rurki kapilarne na żądaną długość. Uszczelnij jeden koniec każdej probówki za pomocą jednorazowej szpatułki lub końcówki pipety, aby wepchnąć niewielką ilość żywicy epoksydowej do końca tubki, aby utworzyć zatyczkę. Poczekaj, aż żywica epoksydowa zastygnie zgodnie z czasem zalecanym przez producenta.
    UWAGA: Rurka musi być krótsza niż długość igły do wstrzykiwań. Zalecane są rurki o średnicy wewnętrznej 2-3 μm, tak aby długość 2,5 cala zawierała co najmniej 300 μl całkowitej objętości.
  2. Sporządzić co najmniej 500 μl materiału hydrożelowego PNP w strzykawce zawierającej lek będący przedmiotem zainteresowania. Przygotować każdą grupę próbek w osobnej strzykawce.
  3. Wstrzyknąć 100-200 μl hydrożelu PNP na dno każdej rurki kapilarnej za pomocą długiej igły podskórnej (22G, 4 cale). Przygotować co najmniej trzy probówki (trzykrotnie) na każdą grupę próbek.
  4. (Opcjonalnie) Umieść napełnione rurki kapilarne w stożkowej probówce wirówkowej i wiruj przez 1 minutę przy 1000 x g, aby zapewnić jednolitą powierzchnię hydrożelu. Ten krok może wymagać powtórzenia, zmieniając czas i prędkość w razie potrzeby, aby wygładzić powierzchnię materiału.
    UWAGA: Upewnij się, że wirówka jest dobrze wyważona.
  5. Ostrożnie napełnij 200-300 μl PBS hydrożelem w rurki kapilarnej za pomocą strzykawki i igły lub pipety. Nie dotykać ani nie naruszać powierzchni hydrożelu. Uszczelnij rurkę nakrętką lub zatyczką lub przykryj co najmniej dwiema warstwami folii parafinowej.
  6. (Opcjonalnie) Próbki należy inkubować w temperaturze 37 °C w celu symulacji warunków in vivo.
  7. Ostrożnie całkowicie usunąć PBS z każdej kapilary, nie naruszając powierzchni hydrożelu, za pomocą strzykawki i igły w wybranych punktach czasowych w zależności od przewidywanej skali czasowej uwalniania leku. Zastąp usunięty wolumin nowym PBS. Przechowuj porcje w odpowiednich warunkach.
    UWAGA: Zalecane objętości i punkty czasowe w krokach 4.3, 4.5 i 4.7 można zoptymalizować w celu uchwycenia uwalniania leku in vitro w różnych skalach czasowych, w zależności od ilości leku załadowanego do materiału i szybkości uwalniania się do supernatantu. Próbka wybranych punktów czasowych może wynosić 6 godzin, 1 dzień, 3 dni, 1 tydzień i 2 tygodnie dla leku o powolnym uwalnianiu. Podwielokrotności mogą być również analizowane w miarę ich pozyskiwania, a nie przechowywania.
  8. Po zakończeniu badania przeanalizuj podwielokrotności za pomocą odpowiedniej metody, takiej jak ELISA, HPLC lub test fluorescencyjny, aby określić ilościowo ilość leku uwalnianego w każdym punkcie czasowym40,41,42. Odpowiednia metoda wykrywania będzie się różnić w zależności od interesującego narkotyku.
    UWAGA: Badania uwalniania in vitro są przydatne do porównywania uwalniania między różnymi preparatami hydrożelowymi lub ładunkiem leku. Skala czasowa uwalniania in vitro często nie wskazuje bezpośrednio oczekiwanej skali czasowej uwalniania in vivo.

5. Charakterystyka stabilności termicznej insuliny w żelu

  1. Sformułować co najmniej 1,2 ml hydrożelu PNP na grupę próbek. Postępując zgodnie z procedurą opisaną w punkcie 2.3, do hydro><żelu PNP należy załadować zarówno insulinę (ładunek leku), jak i tioflawinę T (ThT) (sondę molekularną). UWAGA: Podstawowym mechanizmem agregacji, a tym samym inaktywacji insuliny, jest tworzenie włókienek amyloidowych. ThT jest odpowiednią sondą molekularną, ponieważ wytwarza silny sygnał fluorescencyjny w obecności włókienek amyloidowych, co pozwala na monitorowanie agregacji insuliny in situ. W zależności od ładunku narkotyków, agregacja może być monitorowana za pomocą różnych metod. Dla reprezentatywnych danych pokazanych, insulina została obciążona do końcowego stężenia 6,7 lub 10 mg/ml, a ThT do końcowego stężenia 25 μM.
  2. Za pomocą igły 21 G wstrzyknąć 200 μl hydrożelu PNP na dołek do czarnej płytki 96-dołkowej. Każda grupa próbek powinna być mierzona co najmniej trzykrotnie. Płyta uszczelniająca z optycznie przezroczystą uszczelką samoprzylepną, aby zapobiec parowaniu.
  3. Włóż płytkę do czytnika płytek wyposażonego w kontrolę temperatury, wytrząsanie i programowanie odczytu kinetycznego i rozpocznij odczyt protokołu. Reprezentatywne dane uzyskano za pomocą dostępnego na rynku czytnika płytek (patrz tabela materiałów) przy użyciu następujących warunków:
    1. Warunki starzenia pod wpływem stresu: ciągłe wytrząsanie liniowe (410 cpm, 5 mm) w temperaturze 37 °C.
    2. Akwizycja danych: wzbudzenie/emisja 450 nm/482 nm w odstępach 20 min
      UWAGA: Jeśli czytnik płytek z możliwością kontroli temperatury, wytrząsania i odczytu kinetycznego nie jest dostępny, płytkę można umieścić na płytce wytrząsającej w inkubatorze i odczytać ręcznie na wyższych długościach fal w wybranych punktach czasowych.
  4. Wykreśl dane jako średni sygnał fluorescencji w czasie dla każdej grupy. Czas do agregacji można określić ilościowo, definiując dowolny próg sygnału43.
    UWAGA: W przypadku reprezentatywnych danych pokazanych poniżej próg został zdefiniowany jako 750 000 arbitralnych jednostek fluorescencyjnych (AFU). Wartość ta została wybrana tak, aby była wyższa od zmierzonej linii bazowej, a jednocześnie w wystarczającym stopniu oddawała początek agregacji wskazywany przez gwałtowny wzrost sygnału fluorescencyjnego.
  5. Zakończyć oznaczanie, gdy próbki agregują się lub wizualnie zaczynają się odwadniać.

6. Ocena żywotności komórek

  1. Sformułować co najmniej 2 ml hydrożelu PNP zawierającego pożądane stężenie komórek zgodnie z powyższymi protokołami (zwykle 1 - 5 x 106 komórek/ml). Przygotować każdą grupę próbek w osobnej strzykawce.
  2. Za pomocą igły 21G wstrzyknąć 150 μl hydrożelu PNP do każdej studzienki na przezroczystej 96-dołkowej płytce; każda studzienka to jedna kontrpróba. Każda grupa próbek powinna mieć od 3 do 5 powtórzeń na punkt czasowy. Odwirować płytkę o masie 50 x g przez 2 minuty, aby równomiernie rozprowadzić hydrożel w studzience.
  3. Dodać 100 μl odpowiedniej pożywki komórkowej na wierzch hydrożelu. Usuwaj tę pożywkę każdego dnia i dodawaj 100 μl nowej pożywki.
  4. W dniu 1 usunąć pożywkę z wierzchu hydrożelu dla wyznaczonych kontrprób dla tego punktu czasowego dla każdej grupy próbek. Dodać 50 μl 2 mM roztworu kalceiny AM na wierzch hydrożeli. Inkubować przez 30 min.
    UWAGA: Calcein AM może być używany do identyfikacji i oznaczania żywych komórek. W żywych komórkach niefluorescencyjna kalceina AM jest przekształcana w kalceinę o zielonej fluorescencji przez wewnątrzkomórkowe esterazy po hydrolizie estru acetoksymetylowego.
  5. Wyobraź sobie środek każdej studzienki na 96-dołkowej płytce za pomocą mikroskopu konfokalnego. Zbadaj obszar o wielkości co najmniej 300 μm2 ze stosem z o rozpiętości co najmniej 150 μm. Użyj ustawień konfokalnej długości fali, aby uchwycić fluorescencję kalceiny (wzbudzenie/emisja: 495 nm/515 nm).
  6. Powtórz kroki 6.4 i 6.5 dla każdego kolejnego punktu czasowego zgodnie z potrzebami.
  7. Aby przeanalizować każdy obraz, zwiń wszystkie obrazy z-stack w jedną płaszczyznę obrazu o maksymalnej intensywności za pomocą FIJI lub podobnego oprogramowania. Określ ilościowo liczbę komórek fluorescencyjnych na każdym obrazie. Stosunek liczby komórek fluorescencyjnych w każdym punkcie czasowym w porównaniu z liczbą komórek fluorescencyjnych w dniu 1 to względna żywotność komórek w hydrożelach PNP.

7. Ocena osiadania komórek

  1. Obliczyć liczbę komórek potrzebnych do sformułowania 500-700 μl hydrożelu PNP przy końcowym stężeniu 5 x 106 komórek/ml. Zawiesić komórki w 1 ml PBS w stężeniu 1 x 106 komórek/ml. Wybarwić komórki, dodając 50 μl 2 mM kalceiny AM. Inkubować komórki z barwnikiem przez 10 minut.
  2. Odwirować komórki w odpowiednich warunkach, usunąć PBS i ponownie zawiesić komórki w objętości PBS potrzebnej do wytworzenia 500-700 μL pożądanego hydrożelu PNP.
    UWAGA: Zalecana prędkość i czas wirowania każdego konkretnego typu komórek są zwykle podane w dokumentacji produktu.
  3. Sformułować 500-700 μl hydrożelu PNP z barwionymi komórkami (5 x 106 komórek/ml) zgodnie z sekcją 2 protokołu.
  4. Za pomocą igły 21G wstrzyknąć 100-200 μl hydrożelu PNP zawierającego wybarwione komórki na dnie kuwety. Dla każdej próbki należy przeprowadzić trzy kontrpróby. Podczas wstrzykiwania należy przesuwać igłę w przód i w tył w kuwecie, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków.
  5. Natychmiast (czas t=0) wyobraź sobie kuwety leżące na boku na całym płaskim obszarze prostokąta kuwety u podstawy kuwety. Skorzystaj z możliwości skanowania płytek konfokalnych, aby zobrazować cały obszar studni i zobrazować stos z w 3D na głębokości 100 μm. W celu późniejszej wizualizacji użyj oprogramowania mikroskopu konfokalnego, aby zszyć wszystkie poszczególne płytki i wykonaj projekcję o maksymalnej intensywności, aby utworzyć pojedynczy obraz dużego obszaru, lub użyj oprogramowania FIJI na komputerze osobistym44,45.
  6. Po obrazowaniu ustaw kuwety w pozycji pionowej.
  7. Obraz po 1 i 4 godzinach, aby zaobserwować, czy komórki osiadły w hydrożelu, czy też pozostają zawieszone.
    UWAGA: Te punkty czasowe są sugestiami i mogą być modyfikowane zgodnie z potrzebami.
  8. Aby przeanalizować każdy obraz, zwiń wszystkie obrazy ze stosu z w jedną płaszczyznę obrazu o maksymalnej intensywności. Korzystając z FIJI lub podobnego oprogramowania, określ ilościowo rozmieszczenie komórek, mierząc intensywność fluorescencji w dół środkowego profilu pionowego kuwety, aby określić stopień osiadania.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Produkcja i charakterystyka hydrożelu PNP
Hydrożele PNP powstają w wyniku zmieszania dwóch podstawowych składników - hydrofobowo modyfikowanych polimerów HPMC i nanocząstek PEG-PLA (Rysunek 1a). Ładunek terapeutyczny najłatwiej jest włączyć do dodatkowego buforu używanego do rozcieńczania składnika nanocząsteczkowego przed przygotowaniem hydrożelu. Do dalszej charakterystyki biomedycznej wygodnie jest zastosować metodę mieszania łokciowego, która umożliwia proste i powtarzalne mieszanie dwóch składników ( Rysunek 1b). Po odpowiednim wymieszaniu hydrożel powinien być twardy w strzykawce, ale uginać się pod ciśnieniem i wytłaczać ze standardowej igły (pokazano 21G) (Rysunek 1c). Po wstrzyknięciu hydrożel powinien szybko zastygnąć w materiale podobnym do ciała stałego, który jest odporny na przepływ grawitacyjny. Aby w pełni scharakteryzować hydrożel i zapewnić spójność produktów z każdej partii, próbki powinny być analizowane przy użyciu kilku różnych eksperymentów na reometrze. Zdolności żelu do rozrzedzania i samonaprawy można łatwo zaobserwować za pomocą protokołu przemiatania przepływu i protokołu stopniowego ścinania (Rysunek 2a,b). W przypadku sztywniejszych żeli, takich jak preparat 2:10, użytkownik powinien zwrócić uwagę na to, czy lepkość zmniejszy się o co najmniej dwa rzędy wielkości podczas przemiatania przepływu, ponieważ szybkość ścinania wzrasta z 0,1 do 100 s-1, co symuluje warunki mechaniczne podczas wtrysku. Protokół stopniowego ścinania powinien ujawnić spadek lepkości o rzędy wielkości przy stopniach wysokiego ścinania oraz szybki powrót (czas powrotu <5 s) do lepkości wyjściowej podczas niskich stopni ścinania. Charakterystyka modułów magazynowania i strat przy użyciu eksperymentu oscylacyjnego przemiatania częstotliwości ścinania w liniowym reżimie lepkosprężystym powinna ujawnić właściwości podobne do ciał stałych w zakresach częstotliwości od 0,1 do 100 rad s-1 (Rysunek 2c). W szczególności zazwyczaj nie powinno dochodzić do krzyżowania modułów magazynowania i strat przy ścinaniu, które można zaobserwować przy niskich częstotliwościach w przypadku sztywniejszych preparatów, takich jak hydrożele 2:10. Takie zdarzenie krzyżowania się może wskazywać na problemy z jakością materiałów wyjściowych, zarówno zmodyfikowanego polimeru HPMC lub PEG-PLA, jak i rozmiaru i dyspersji nanocząstek PEG-PLA. Należy zauważyć, że w przypadku słabszych preparatów hydrożelowych, takich jak hydrożel 1:5, można spodziewać się zdarzenia krzyżowania. Oscylacyjne przemiatanie amplitudy ścinania na hydrożelach PNP ujawnia, że materiały nie uginają się, dopóki nie zostaną przyłożone wysokie wartości naprężeń, co wskazuje, że materiały te mają granicę plastyczności, progową wielkość naprężenia wymaganą do przepływu materiału.

Charakterystyka kinetyki uwalniania hydrożeli PNP
Niezbędnym krokiem w projektowaniu żeli PNP do dostarczania leków jest charakterystyka kinetyki uwalniania leku z wybranego preparatu. Istnieje kilka technik w tym zakresie, ale prosta metodologia in vitro dostarcza użytecznych danych podczas wczesnego opracowywania preparatu (Rysunek 3a). Różnicowanie zawartości polimeru w hydrożelach PNP poprzez modulowanie ilości HPMC-C12 lub NP jest najprostszym sposobem dostrojenia właściwości mechanicznych i rozmiaru oczek tych hydrożeli, co może mieć bezpośredni wpływ na dyfuzję ładunku przez sieć polimerową i szybkość uwalniania z materiałów (Rysunek 3b). W przypadku ładunku, który jest większy niż dynamiczny rozmiar oczek (tj. o dużej masie cząsteczkowej lub dużym promieniu hydrodynamicznym), naukowcy powinni spodziewać się powolnego, zależnego od rozpuszczania uwalniania ładunku z magazynu hydrożelu. Preparaty o dynamicznych rozmiarach oczek większych lub równych rozmiarowi ładunku pozwolą na uwolnienie za pośrednictwem dyfuzji, które można opisać za pomocą tradycyjnych modeli dyfuzji i uwalniania ładunku46,47,48,49. Opierając się na kształcie krzywej uwalniania, naukowcy mogą przeformułować hydrożel, aby dostroić go do wolniejszego (np. zwiększenie zawartości polimeru) lub szybszego (np. zmniejszenie zawartości polimeru) uwalniania.

Ocena stabilności ładunku terapeutycznego
Określenie stabilności ładunku terapeutycznego w preparacie hydrożelowym ma kluczowe znaczenie przed rozpoczęciem badań przedklinicznych lub komórkowych. W porównaniu z innymi syntetycznymi metodami kapsułkowania leków, hydrożele PNP wprowadzają ładunek w delikatny sposób, mieszając się z materiałem sypkim i jest mało prawdopodobne, aby enkapsulacja uszkodziła ładunek. Badania te wskazują, że hydrożele PNP mogą również stabilizować ładunki podatne na niestabilność termiczną, takie jak insulina, znacznie wydłużając okres przydatności do spożycia i zmniejszając zależność od przechowywania i dystrybucji w chłodni (Rysunek 4). Ważne jest, aby ocenić stan ładunku natychmiast po kapsułkowaniu w hydrożelu, a także po dłuższym okresie przechowywania. Dane te pokazują, że insulina pozostaje stabilna w hydrożelach po 28 dniach przechowywania w ciągłym obciążeniu termicznym i mechanicznym, przy użyciu prostego testu fluorescencyjnego do pomiaru agregacji insuliny. Alternatywną techniką w przypadkach, gdy odpowiedni test płytkowy nie jest dostępny, byłoby wykonanie pomiarów dichroizmu kołowego ładunku, co jest szczególnie przydatne do określania drugorzędowej struktury leków białkowych.

Określanie żywotności i dyspersji komórek w hydrożelach PNP
Wiele komórek terapeutycznych wymaga motywów adhezyjnych, aby zachować żywotność, a zatem włączenie motywów integrynowych, takich jak peptydy arginina-glicyna-kwas asparaginowy (RGD), jest ważnym krokiem w adaptacji hydrożeli PNP do terapii komórkowych50. Modułowy polimer PEG-PLA składający się z nanocząsteczek umożliwia chemiczną funkcjonalizację korony PEG za pomocą prostych "klik" chemii28,51. W tym przykładzie peptydy RGD adhezyjne zostały przyłączone do polimeru PEG-PLA, aby promować zaangażowanie komórek w strukturę hydrożelu PNP. Preparaty pozbawione miejsc adhezji będą miały niską żywotność komórek, ponieważ komórki otorbione nie proliferują w porównaniu z komórkami zamkniętymi w preparatach z tymi motywami adhezyjnymi (Rysunek 5a,b). Zamknięte komórki można znakować kalceiną AM lub innym odpowiednim barwnikiem fluorescencyjnym (np. CFSE), aby ułatwić liczenie komórek za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Podczas optymalizacji należy porównać żywotność z niemodyfikowanymi hydrożelami PNP, aby upewnić się, że preparaty funkcjonalizowane integryną zapewniają zwiększoną żywotność i proliferację. Jeśli preparaty funkcjonalizowane integryną zapewniają podobną skuteczność jak niemodyfikowane hydrożele, może to wskazywać na niepowodzenie w chemii koniugacji używanej do włączania motywów adhezyjnych.

Badacze powinni oczekiwać, że zamknięte komórki będą równomiernie rozproszone w pożywce hydrożelowej przy użyciu odpowiedniej formuły hydrożelowej. Pozwoli to na spójne i przewidywalne dawkowanie komórek podczas podawania hydrożelu i powinno przełożyć się na miejscowe zatrzymanie komórek w hydrożelu po podaniu. Rozmieszczenie komórek można łatwo określić za pomocą technik mikroskopii fluorescencyjnej. Komórki można znakować odpowiednim barwnikiem, a następnie obrazować za pomocą mikroskopii konfokalnej. Obrazy mogą być oceniane wizualnie (Rysunek 5c), a także ilościowo (Rysunek 5d) za pomocą oprogramowania ImageJ do pomiaru średniej intensywności fluorescencji wzdłuż osi pionowej obrazu (lub wzdłuż dowolnej osi, na której spodziewane jest osiadanie komórek pod wpływem grawitacji). Jeśli preparat hydrożelowy jest zbyt słaby, aby utrzymać komórki w zawiesinie przez dłuższy czas, nastąpi osiadanie komórek, jak zaobserwowano w preparacie 1:1 w Rysunek 5. Zwiększenie zawartości polimeru może rozwiązać problemy z niejednorodną dyspersją komórek spowodowaną osiadaniem.

figure-results-1
Rysunek 1: Hydrożele polimerowo-nanocząsteczkowe (PNP) łatwo powstają przez zmieszanie dwóch składników. (a) Pierwszy składnik to roztwór modyfikowanej dodecylo hydroksypropylometylocelulozy (HPMC-C12), a drugi składnik to roztwór nanocząstek poli(glikolu etylenowego)-bloku-poli(kwasu mlekowego) (PEG-PLA) wraz z dowolnym ładunkiem terapeutycznym. Delikatne zmieszanie tych dwóch składników daje hydrożel do wstrzykiwań, w którym polimery HPMC-C12 są fizycznie usieciowane przez dynamiczne, wielowartościowe interakcje z nanocząstkami PEG-PLA. b) Fotografia przedstawiająca postać żelu przez zmieszanie z dwiema strzykawkami, z których każda zawiera jeden składnik hydrożelu PNP. Łącząc obie strzykawki za pomocą złącza kolankowego Luer-lock, oba składniki można łatwo wymieszać w sterylnych warunkach, aby uzyskać hydrożel bez pęcherzyków powietrza, wstępnie załadowany do strzykawki do natychmiastowego użycia. Roztwór NP jest barwiony na niebiesko w celu demonstracji. c) Wykazanie wstrzykiwania hydrożeli PNP i ich ponownego zestalania. (i) Hydrożel PNP w strzykawce z dołączoną igłą 21G. (ii) Wstrzyknięcie umieszcza hydrożel pod ścinaniem, które tymczasowo przerywa interakcje między polimerem a nanocząstkami, tworząc płynną konsystencję. (iii) Po wstrzyknięciu dynamiczne interakcje polimer-nanocząstki szybko się reformują, umożliwiając hydrożelowi samouzdrowienie do ciała stałego. (iv) Stały hydrożel nie przepływa pod wpływem sił słabszych niż jego granica plastyczności, takich jak grawitacja. Hydrożel PNP jest barwiony na niebiesko w celu demonstracji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Charakterystyka reologiczna dwóch preparatów hydrożelowych PNP. Preparaty są oznaczone jako polimer (% wag.). (a) Stały przepływ ścinający omiata od niskiej do wysokiej szybkości ścinania hydrożeli PNP. Lepkość w funkcji szybkości ścinania charakteryzuje właściwości rozrzedzania przy ścinaniu. (b) Lepkość w funkcji oscylacyjnych szybkości ścinania od niskich szybkości ścinania (białe tło; 0,1 s−1) do wysokich szybkości ścinania (czerwone tło; 10 s−1) wykazująca właściwości samoregenerujące hydrożeli PNP. Prędkości ścinania są nakładane na 30 s każde. (c) Moduł zachowania sprężystości G′ i moduł utraty lepkości G" w funkcji częstotliwości przy stałym odkształceniu 1% dla różnych preparatów hydrożelowych PNP. (d) Przemiatanie amplitudy ze stałą częstotliwością 10 rad/s w celu scharakteryzowania modułu akumulacji sprężystości G′ i modułu utraty lepkości G" hydrożeli PNP w funkcji naprężenia. Ta charakterystyka reologiczna może być wykorzystana jako porównanie do kontroli jakości. Ten rysunek został zaadaptowany z Grosskopf et al.28 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Uwalnianie in vitro albuminy surowicy bydlęcej (BSA) z hydrożeli PNP. Preparaty są oznaczone jako polimer (% wag.). a) Schemat opisujący protokół eksperymentalnego uwalniania in vitro. Podwielokrotności są z czasem usuwane z kapilar wypełnionych hydrożelem PNP. b) Uwolnienie BSA in vitro z 1:10 PNP, 2:5 PNP i 2:10 PNP podane jako masa zebrana w określonym punkcie czasowym podzielona przez całkowitą masę pobraną podczas badania (dane przedstawione jako średnia ± SD; n = 3). BSA wykryto za pomocą pomiarów absorbancji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Stabilność termiczna insuliny zamkniętej w hydrożelach PNP za pomocą testu ThT. Preparaty są oznaczone jako polimer (% wag.). Insulina zamknięta zarówno w hydrożelu PNP w proporcji 1:5, jak i 2:10 pozostawała niezagregowana przez ponad 28 dni w warunkach starzenia w temperaturze 37 °C i ciągłym pobudzeniu. Czas do agregacji dla insuliny sformułowanej w PBS wynosił 20 ± 4 h (średnia ± SD, próg agregacji 750 000 AFU). Dane przedstawione jako średnia n = 4 kontrprób eksperymentalnych (AFU, dowolne jednostki fluorescencji). Ten rysunek został zaadaptowany z Meis et al.38 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Żywotność komórek i osadzanie się komórek w hydrożelach PNP. (a,b) Badania żywotności komórek w hydrożelach PNP z ludzkimi mezenchymalnymi komórkami macierzystymi (hMSC). (a) Reprezentatywne obrazy żywotnych hMSC w hydrożelach PNP w proporcji 1:5 z motywem adhezji argininy, glicyny i kwasu asparaginowego (RGD) sprzężonym z NP PEG-PLA i bez niego. hMSC były barwione kalceiną przez 30 minut przed obrazowaniem konfokalnym. Podziałka skali odpowiada 100 μm. b) Żywotność komórek w dniu 6 zdefiniowana jako liczba komórek fluorescencyjnych na obrazie w stosunku do liczby komórek fluorescencyjnych w dniu 1 (dane przedstawione jako średnia ± SD; n = 3). (c,d) Eksperymenty z enkapsulacją i osadzaniem komórek za pomocą hMSC. (c) Obrazy o maksymalnej intensywności hMSC barwionych kalceiną AM zamkniętych w hydrożelu PNP w proporcji 1:1 (górny rząd) i hydrożelu PNP w proporcji 1:5 (w dolnym rzędzie) przez 4 godziny w celu ilościowego określenia osiadania komórek. Podziałka liniowa odpowiada 1 mm. (d) Średnia pozioma intensywność pikseli hMSC wzdłuż pionowego profilu hydrożelu. Ten rysunek został zaadaptowany z Grosskopf et al.28 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hydrożele polimerowo-nanocząsteczkowe (PNP) są łatwe w wytwarzaniu i umożliwiają długotrwałe miejscowe dostarczanie komórek terapeutycznych i leków poprzez minimalnie inwazyjne podawanie przez bezpośrednie wstrzyknięcie lub cewnik. Protokoły te opisują formułowanie hydrożeli PNP oraz metody charakterystyki w celu zapewnienia jakości otrzymanych materiałów. Supramolekularne hydrożele PNP są skalowalne do produkcji i powstają w wyniku prostego mieszania modyfikowanych polimerów celulozy i polimerowych nanocząstek typu rdzeń-powłoka. Obecne metody opisują łatwe procedury tworzenia żeli wstępnie załadowanych do strzykawek za pomocą prostych protokołów mieszania łokciowego. Dzięki wskaźnikom kontroli jakości każdej z części składowych, takim jak DLS do monitorowania wielkości i dystrybucji NP, można w powtarzalny sposób formułować materiały hydrożelowe PNP o stałych właściwościach reologicznych. Zmieniając ilość HPMC-C12 lub NPs, można modulować rozmiar oczek i sztywność powstałego hydrożelu PNP. Właściwości te można dostroić tak, aby jak najlepiej odpowiadały konkretnemu zastosowaniu biomedycznemu, a dzięki opisanym tutaj metodom reologicznym naukowcy mogą scharakteryzować właściwości hydrożeli PNP w zakresie rozrzedzania ścinaniem i samonaprawy, optymalizując platformę pod kątem ich konkretnych zastosowań. Opisano również metody badań uwalniania in vitro; Naukowcy mogą wykorzystać te badania do scharakteryzowania względnej skali czasowej uwalniania leków będących przedmiotem zainteresowania, dostarczając informacji na potrzeby przyszłych badań in vivo. Korzystając z badań stabilności, naukowcy mogą również ocenić zdolność tych materiałów do zachowania struktury biologicznej i stabilności wrażliwych bioterapeutyków w czasie i ekstremalnych temperaturach, z przekonującymi potencjalnymi zastosowaniami w celu zmniejszenia zależności bioterapeutyków od łańcucha chłodniczego. Wreszcie, za pomocą prostych testów żywotności komórek, można ocenić wzrost i migrację komórek w materiałach PNP, co może znaleźć zastosowanie w terapiach komórkowych i rusztowaniach.

Nasza grupa znalazła wiele przekonujących zastosowań dla platformy hydrożelowej PNP27. Hydrożele PNP były używane do powolnego dostarczania szczepionek podjednostkowych, umożliwiając dopasowane profile uwalniania kinetycznego antygenów i adiuwantów w celu zwiększenia wielkości, czasu trwania i jakości humoralnej odpowiedzi immunologicznej31. Stwierdzono, że hydrożele PNP mają mniejszy rozmiar oczek niż większość powszechnie stosowanych hydrożeli, dzięki czemu skutecznie spowalniają dyfuzję i powoli uwalniają ładunek molekularny. Unikalne właściwości przylegania do tkanek i właściwości mechaniczne hydrożeli PNP zostały również wykorzystane do tworzenia fizycznych barier zapobiegających zrostom powstającym w wyniku operacji poprzez rozpylanie hydrożeli na dużych powierzchniach narządów po operacji30. Wykazano również, że hydrożele PNP są skutecznymi nośnikami dostarczania komórek, a właściwości mechaniczne faktycznie chronią komórki przed siłami mechanicznymi występującymi w igle strzykawki podczas wstrzykiwania,poprawiając żywotność komórek. Kiedy NP są sprzężone z peptydem adhezyjnym komórkowym, komórki mogą przyłączać się i angażować w matrycę PNP, aby zachować żywotność. Stosując to podejście, wykazano, że hydrożele PNP poprawiają miejscową retencję wstrzykniętych komórek macierzystych w porównaniu z metodami wykorzystującymi nośniki płynne28. Ponadto wykazano, że hydrożele PNP zapobiegają indukowanej termicznie agregacji kapsułkowanej insuliny, nawet w trudnych warunkach starzenia, co sugeruje, że materiały te mogą być w stanie zmniejszyć potrzebę przechowywania w lodówce leków wrażliwych na temperaturę38.

Ogólnie rzecz biorąc, opisane tutaj metodologie pozwolą grupom badawczym na wytwarzanie i badanie hydrożeli PNP jako biomateriału. Protokoły te zapewniają techniki syntezy na skalę laboratoryjną w celu wytworzenia wystarczającej ilości materiału hydrożelowego do prowadzenia badań zarówno in vitro, jak i in vivo. Opisane powyżej badania wskazują, że dynamiczne powiązania krzyżowe tych materiałów sprawiają, że nadaje się on do szeregu zastosowań biomedycznych, umożliwiając aktywną ruchliwość uwięzionych komórek przy jednoczesnym ograniczeniu biernej dyfuzji ładunku molekularnego. Oczekuje się, że platforma PNP stanie się dostępnym i skutecznym narzędziem do poprawy wyników klinicznych dzięki kontrolowanemu dostarczaniu leków oraz do badania podstawowych mechanizmów biologicznych, takich jak rekrutacja komórek i mechanobiologia.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy ci nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane finansowo przez Center for Human Systems Immunology z Fundacją Billa i Melindy Gatesów (OPP1113682) oraz Fundacją Billa i Melindy Gatesów (OPP1211043). C.M.M. było wspierane przez Stanford Graduate Fellowship oraz Stanford Bio-X William and Lynda Steere Fellowship. A.K.G. jest wdzięczny za stypendium National Science Foundation Graduate Research Fellowship oraz stypendium Gabilan w ramach Stanford Graduate Fellowship in Science oraz Inżynieria. S.C. otrzymał wsparcie od National Cancer Institute of the National Institutes of Health w ramach nagrody numer F32CA247352. Autorzy chcieliby również gorąco podziękować członkom Appel Lab, w tym dr Gillie Roth, dr Anthony'emu Yu, dr Lyndsay Stapleton, dr Hectorowi Lopezowi Hernandezowi, dr Andrei d'Aquino, dr Julie Baillet, Celine Liong, Ben Ou, Emily Meany, Emily Gale i dr Antonowi Smithowi za ich wysiłek i czas włożony w pomoc Appel Lab w opracowaniu tych protokołów na przestrzeni lat.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Igły 21GBD305165PNP hydrożel do wstrzykiwań
22G, 4 w igłach podskórnychAir-TiteN224Badania uwalniania in vitro
Płytki 384-dołkowe, czarne, przezroczyste dnoCorning3540Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS)
Płytki 96-dołkowe, czarneFisher Scientific07-200-627Badania biostabilności
Płytki 96-dołkowe, przezroczysteCorning3599Badania żywotności i osiadania komórek
Calcein AMThermo Fisher ScientificC3100MPBadania żywotności i osiadania komórek
Rurki kapilarneMcMaster-Carr8729K66Badania uwalniania in vitro
Filtry odśrodkoweFisher ScientificUFC901024
KuwetyMillipore SigmaBR759015-100EABadania żywotności i osiadania komórek
Czytnik płytek DLSTechnologia WyattCzytnik płytek DynaPro IIDynamiczne rozpraszanie światła (DLS)
Żywica epoksydowaVWR International300007-392 (EA)Badania uwalniania in vitro
Igły podskórneAir-Tite8300015027Badania uwalniania in vitro
Złącze łokcyjne LuerCole-ParmerEW-30800-12Preparat hydrożelowy PNP
Strzykawka Luer lockFisher Scientific14-955-456Preparat hydrożelowy PNP
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1x)Fisher Scientific10010049Preparat hydrożelowy PNP
Plastikowa szpatułkaThomas Scientific1229F13Charakterystyka reologiczna
Czytnik płytekBioTekSynergy H1 Hybrid Wielomodowy czytnik płytekBadania biostabilności
Uszczelki płytoweExcel ScientificTS-RT2-100Badania biostabilności
Rekombinowana insulina ludzkaGibcoA11382IIBadania biostabilności
ReometrTA InstrumentyDHR-2 ReometrCharakterystyka reologiczna
Tioflawina TSigma-AldrichT3516-5GBiostabilność studia
stężenia NP

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mandal, A., Clegg, J. R., Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Hydrogels in the clinic. Bioengineering Translational Medicine. 5 (2), 10158(2020).
  2. Appel, E. A., del Barrio, J., Loh, X. J., Scherman, O. A. Supramolecular polymeric hydrogels. Chemical Society Reviews. 41 (18), 6195-6214 (2012).
  3. Mann, J. L., Yu, A. C., Agmon, G., Appel, E. A. Supramolecular polymeric biomaterials. Biomaterials Science. 6 (1), 10-37 (2018).
  4. Foster, A. A., Marquardt, L. M., Heilshorn, S. C. The diverse roles of hydrogel mechanics in injectable stem cell transplantation. Current Opinion in Chemical Engineering. 15, 15-23 (2017).
  5. Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. Tissue Engineering Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).
  6. Marquardt, L. M., Heilshorn, S. C. Design of injectable materials to improve stem cell transplantation. Current Stem Cell Reports. 2 (3), 207-220 (2016).
  7. Guvendiren, M., Burdick, J. A. Engineering synthetic hydrogel microenvironments to instruct stem cells. Current Opinion in Biotechnology. 24 (5), 841-846 (2013).
  8. Marquardt, L. M., et al. Designer, injectable gels to prevent transplanted Schwann cell loss during spinal cord injury therapy. Science Advances. 6 (14), 1039(2020).
  9. Stephan, S. B., et al. Biopolymer implants enhance the efficacy of adoptive T-cell therapy. Nature Biotechnology. 33 (1), 97-101 (2015).
  10. Tuladhar, A., et al. Injectable hydrogel enables local and sustained co-delivery to the brain: two clinically approved biomolecules, cyclosporine and erythropoietin, accelerate functional recovery in rat model of stroke. Biomaterials. 235, 119794(2020).
  11. Pakulska, M. M., Miersch, S., Shoichet, M. S. Designer protein delivery: From natural to engineered affinity-controlled release systems. Science. 351 (6279), (2016).
  12. Gupta, D., Tator, C. H., Shoichet, M. S. Fast-gelling injectable blend of hyaluronan and methylcellulose for intrathecal, localized delivery to the injured spinal cord. Biomaterials. 27 (11), 2370-2379 (2006).
  13. Verbeke, C. S., Mooney, D. J. Injectable, pore-forming hydrogels for in vivo enrichment of immature dendritic cells. Advanced Healthcare Materials. 4 (17), 2677-2687 (2015).
  14. Tous, E., Purcell, B., Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. Injectable acellular hydrogels for cardiac repair. Journal of Cardiovascular Translational Research. 4 (5), 528-542 (2011).
  15. Zhao, X., et al. Antibacterial anti-oxidant electroactive injectable hydrogel as self-healing wound dressing with hemostasis and adhesiveness for cutaneous wound healing. Biomaterials. 122, 34-47 (2017).
  16. Johnson, T. D., Christman, K. L. Injectable hydrogel therapies and their delivery strategies for treating myocardial infarction. Expert Opinion on Drug Delivery. 10 (1), 59-72 (2013).
  17. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Seminars in Cancer Biology. , Elsevier. 378-386 (2005).
  18. Hickey, J. W., et al. Engineering an artificial T-cell stimulating matrix for immunotherapy. Advanced Materials. 31 (23), 1807359(2019).
  19. Baumann, M. D., et al. An injectable drug delivery platform for sustained combination therapy. Journal of Controlled Release. 138 (3), 205-213 (2009).
  20. Trappmann, B., et al. Matrix degradability controls multicellularity of 3D cell migration. Nature Communications. 8 (1), 1-8 (2017).
  21. Figueiredo, L., et al. Assessing glucose and oxygen diffusion in hydrogels for the rational design of 3D stem cell scaffolds in regenerative medicine. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (5), 1238-1246 (2018).
  22. Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. , 1-24 (2019).
  23. Chaudhuri, O., et al. Substrate stress relaxation regulates cell spreading. Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).
  24. Cai, L., Dewi, R. E., Heilshorn, S. C. Injectable hydrogels with in situ double network formation enhance retention of transplanted stem cells. Advanced Functional Materials. 25 (9), 1344-1351 (2015).
  25. Fisher, S. A., Baker, A. E., Shoichet, M. S. Designing peptide and protein modified hydrogels: selecting the optimal conjugation strategy. Journal of the American Chemical Society. 139 (22), 7416-7427 (2017).
  26. Li, R. H., Altreuter, D. H., Gentile, F. T. Transport characterization of hydrogel matrices for cell encapsulation. Biotechnology and Bioengineering. 50 (4), 365-373 (1996).
  27. Appel, E. A., et al. Self-assembled hydrogels utilizing polymer-nanoparticle interactions. Nature Communications. 6 (6295), (2015).
  28. Grosskopf, A. K., et al. Injectable supramolecular polymer-nanoparticle hydrogels enhance human mesenchymal stem cell delivery. Bioengineering and Translational Medicine. 5 (1), 10147(2020).
  29. Lopez Hernandez, H., Grosskopf, A. K., Stapleton, L. M., Agmon, G., Appel, E. A. Non-newtonian polymer-nanoparticle hydrogels enhance cell viability during injection. Macromolecular Bioscience. 19 (1), (2019).
  30. Stapleton, L. M., et al. Use of a supramolecular polymeric hydrogel as an effective post-operative pericardial adhesion barrier. Nature Biomedical Engineering. 3 (8), 611-620 (2019).
  31. Roth, G. A., et al. Injectable hydrogels for sustained codelivery of subunit vaccines enhance humoral immunity. ACS Central Science. , (2020).
  32. Steele, A. N., et al. A biocompatible therapeutic catheter-deliverable hydrogel for in situ tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 8 (5), 1801147(2019).
  33. Fenton, O. S., et al. Injectable polymer-nanoparticle hydrogels for local immune cell recruitment. Biomacromolecules. 20 (12), 4430-4436 (2019).
  34. Yu, A. C., Smith, A. A., Appel, E. A. Structural considerations for physical hydrogels based on polymer-nanoparticle interactions. Molecular Systems Design & Engineering. 5 (1), 401-407 (2020).
  35. Wisdom, K., Chaudhuri, O. 3D Cell Culture: Methods and Protocols. Koledova, Z. , Springer. New York. 29-37 (2017).
  36. Lohmeijer, B. G., et al. Guanidine and amidine organocatalysts for ring-opening polymerization of cyclic esters. Macromolecules. 39 (25), 8574-8583 (2006).
  37. Cheng, J., et al. Formulation of functionalized PLGA-PEG nanoparticles for in vivo targeted drug delivery. Biomaterials. 28 (5), 869-876 (2007).
  38. Meis, C. M., et al. Self-assembled, dilution-responsive hydrogels for enhanced thermal stability of insulin biopharmaceuticals. ACS Biomaterials Science & Engineering. , (2020).
  39. Franck, A., Germany, T. Viscoelasticity and dynamic mechanical testing. TA Instruments. , New Castle, DE, USA. AN004 (1993).
  40. Appel, E. A., et al. Self-assembled hydrogels utilizing polymer-nanoparticle interactions. Nature Communications. 6, 6295(2015).
  41. Gallastegui, A., et al. Controlled release of antibiotics from photopolymerized hydrogels: kinetics and microbiological studies. Materials Science and Engineering: C. 102, 896-905 (2019).
  42. Qiao, M., Chen, D., Ma, X., Liu, Y. Injectable biodegradable temperature-responsive PLGA-PEG-PLGA copolymers: synthesis and effect of copolymer composition on the drug release from the copolymer-based hydrogels. International Journal of Pharmaceutics. 294 (1-2), 103-112 (2005).
  43. Schlein, M. Insulin Formulation Characterization-The Thioflavin T Assays. The AAPS Journal. 19 (2), 397-408 (2017).
  44. Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
  45. Sakas, G., Grimm, M., Savopoulos, A. EUROGRAPHICS workshop on Rendering Techniques. , Springer. 51-63 (1995).
  46. Axpe, E., et al. A multiscale model for solute diffusion in hydrogels. Macromolecules. 52 (18), 6889-6897 (2019).
  47. Peppas, N., Bures, P., Leobandung, W., Ichikawa, H. Hydrogels in pharmaceutical formulations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 50 (1), 27-46 (2000).
  48. Ritger, P. L., Peppas, N. A. A simple equation for description of solute release I. Fickian and non-fickian release from non-swellable devices in the form of slabs, spheres, cylinders or discs. Journal of Controlled Release. 5 (1), 23-36 (1987).
  49. Reinhart, C. T., Peppas, N. A. Solute diffusion in swollen membranes. Part II. Influence of crosslinking on diffusive properties. Journal of Membrane Science. 18, 227-239 (1984).
  50. Salinas, C. N., Anseth, K. S. The influence of the RGD peptide motif and its contextual presentation in PEG gels on human mesenchymal stem cell viability. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 2 (5), 296-304 (2008).
  51. Smith, A. A., et al. Nanoparticles presenting potent TLR7/8 agonists enhance anti-PD-L1 immunotherapy in cancer treatment. Biomacromolecules. 21 (9), 3704-3712 (2020).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wstrzykiwalne hydro eleenkapsulacja kom rekhydro ele supramolekularnedynamiczne rozpraszanie wiat acharakterystyka reologicznametoda nanoprecypitacjimikroskopia konfokalnakontrolowane uwalnianie lek w

Powiązane artykuły