Analiza porównawcza metod eksperymentalnych do ilościowego określania aktywności zwierząt w modelach choroby mitochondrialnej Caenorhabditis elegans

Manuela Lavorato; Neal D. Mathew; Nina Shah; Eiko Nakamaru-Ogiso; Marni J. Falk

doi:10.3791/62244

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza porównawcza metod eksperymentalnych do ilościowego określania aktywności zwierząt w modelach choroby mitochondrialnej Caenorhabditis elegans

2.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62244

⸱

4 kwietnia 2021

Manuela Lavorato^*¹ , Neal D. Mathew^*¹ , Nina Shah¹ , Eiko Nakamaru-Ogiso¹^,² , Marni J. Falk¹^,²

¹Mitochondrial Medicine Frontier Program, Division of Human Genetics, Department of Pediatrics, The Children’s Hospital of Philadelphia, ²Department of Pediatrics, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie przedstawia protokoły dla dwóch półautomatycznych metod analizy aktywności lokomotorycznej u robaków C. elegans complex I disease gas-1(fc21), a mianowicie ZebraLab (test o średniej przepustowości) i WormScan (test o wysokiej przepustowości) i dostarcza analizy porównawczej wśród szerokiego wachlarza metod badawczych do ilościowego określenia zachowania nicieni i zintegrowanej funkcji nerwowo-mięśniowej.

Streszczenie

Caenorhabditis elegans jest powszechnie rozpoznawany ze względu na swoją główną użyteczność jako translacyjny model zwierzęcy do skutecznego badania mechanizmów i terapii różnych chorób ludzkich. Robaki szczególnie dobrze nadają się do wysokoprzepustowych badań genetycznych i przesiewowych leków, aby uzyskać głębszy wgląd w cele terapeutyczne i terapie poprzez wykorzystanie ich szybkiego cyklu rozwojowego, dużej wielkości lęgu, krótkiej żywotności, mikroskopijnej przezroczystości, niskich kosztów utrzymania, solidnego zestawu narzędzi genomicznych, repozytoriów mutantów i metodologii eksperymentalnych do badania fizjologii zarówno in vivo, jak i ex vivo. Aktywność lokomotoryczna robaków stanowi szczególnie istotny fenotyp, który jest często upośledzony w chorobie mitochondrialnej, która jest wysoce niejednorodna pod względem przyczyn i objawów, ale łącznie ma upośledzoną zdolność do wytwarzania energii komórkowej. Chociaż do badania zachowania robaków można wykorzystać zestaw różnych metodologii, różnią się one znacznie pod względem kosztów eksperymentalnych, złożoności i użyteczności w przypadku wysokoprzepustowych badań przesiewowych genomu lub leków. W tym miejscu porównano względną przepustowość, zalety i ograniczenia 16 różnych metodologii analizy aktywności, które określają ilościowo lokomocję nicieni, rzucanie, pompowanie gardła i / lub chemotaksję u pojedynczych robaków lub populacji robaków C. elegans na różnych etapach, w różnym wieku i czasie trwania eksperymentu. Zademonstrowano szczegółowe protokoły dla dwóch półautomatycznych metod ilościowego oznaczania aktywności lokomotorycznej nicieni, które reprezentują nowatorskie zastosowania dostępnych narzędzi programowych, a mianowicie ZebraLab (podejście średnioprzepustowe) i WormScan (podejście wysokoprzepustowe). Dane uzyskane przy zastosowaniu tych metod wykazały, że podobny stopień zmniejszonej aktywności zwierząt wystąpił w stadium larwalnym L4 i postępował u dorosłych w dniu 1, w chorobie kompleksu mitochondrialnego I (gas-1(fc21)) zmutowane robaki w stosunku do dzikiego typu (N2 Bristol) C. elegans. Dane te potwierdzają przydatność tych nowatorskich zastosowań w wykorzystaniu narzędzi programowych ZebraLab lub WormScan do ilościowego określania aktywności lokomotorycznej robaków w sposób skuteczny i obiektywny, ze zmienną zdolnością do wspierania wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków dotyczących zachowania robaków w przedklinicznych modelach zwierzęcych choroby mitochondrialnej.

Wprowadzenie

Caenorhabiditis elegans jest powszechnie uznawany za wybitny model w neurobiologii, ponieważ posiada 302 neurony, które koordynują wszystkie zachowania robaków, w tym krycie, karmienie, składanie jaj, defekację, pływanie i poruszanie się na stałych podłożach¹. Te hermafrodytyczne nicienie są również szeroko stosowane do zrozumienia szerokiego wachlarza mechanizmów chorobowych u ludzi, co jest możliwe dzięki dobrze scharakteryzowanemu genomowi i wysokiej homologii ~80% genów między C. elegans a ludźmi²^,³^,⁴. C. elegans od dawna są używane do badania ludzkich chorób mitochondrialnych^5,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰, która jest wysoce genetycznie i fenotypowo heterogenną grupą dziedzicznych zaburzeń metabolicznych, które mają upośledzoną zdolność do generowania energii komórkowej i często klinicznie występują z Znacznie upośledzone funkcje nerwowo-mięśniowe, nietolerancja wysiłku fizycznego i zmęczenie^11,¹²^,¹³^,¹⁴. W tym celu wykorzystanie modeli C. elegans umożliwia przedkliniczne modelowanie ilościowych aspektów aktywności zwierząt i funkcji nerwowo-mięśniowych w różnych podtypach genetycznych choroby mitochondrialnej, a także ich odpowiedzi na potencjalne terapie, które mogą poprawić ich funkcję nerwowo-mięśniową i ogólną aktywność.

Aktywność nerwowo-mięśniowa u C. elegans jest obiektywnie mierzalna za pomocą szeregu metod eksperymentalnych, w tym zarówno manualnych, jak i półautomatycznych, które umożliwiają analizy funkcjonalne w pożywkach stałych lub płynnych (Tabela 1)¹^,¹⁵. Dokładna ocena ilościowa aktywności C. elegans okazała się ważna dla umożliwienia odkryć związanych z funkcją i rozwojem układu mięśniowego i nerwowego¹⁶^,¹⁷^,¹⁸. Badanie to podsumowuje i porównuje wymagania eksperymentalne, zalety i ograniczenia 17 różnych testów, które można przeprowadzić w laboratoriach badawczych w celu oceny funkcji i aktywności nerwowo-mięśniowej w odniesieniu do czterech kluczowych wyników w modelach chorób C. elegans, zarówno na początku badania na różnych etapach rozwoju i w różnym wieku, jak i w odpowiedzi na potencjalne terapie (Tabela 1). Rzeczywiście, badanie zapewnia szczegółowy przegląd zakresu dostępnych podejść eksperymentalnych w celu scharakteryzowania szybkości rzucania się C. elegans (zgięcia ciała na minutę), aktywności lokomotorycznej, pompowania gardła i chemotaksji - w każdym przypadku określając zastosowaną metodologię eksperymentalną i analityczną, zalety i ograniczenia każdej metody, sprzęt i oprogramowanie potrzebne do wykonania i analizy każdego testu, oraz przepustowość każdej metody w celu wsparcia jej wykorzystania do wysokoprzepustowych genetycznych badań przesiewowych lub badań przesiewowych leków. Przepustowość każdego testu jest opisana jako niska, średnia lub wysoka w zależności od złożoności protokołu eksperymentalnego, w tym konserwacji robaków, czasu przetwarzania, użycia płytek jedno- lub wielodołkowych i/lub czasu eksperymentatora potrzebnego do ukończenia warunków eksperymentalnych i analiz danych.

Ręczne analizy młócenia¹⁹, aktywność lomotoryczna²⁰, pompowanie gardła¹⁷^,²¹, oraz chemotaxis²²^,²³ to sprawdzone metodologie oceny aktywności robaków, które wymagają mikroskopu stereoskopowego²⁴. Podczas gdy pomiar aktywności młócącej robaków wymaga analizy w pożywkach płynnych w celu określenia częstotliwości zgięć ciała na minutę, aktywność lokomotoryczna robaków może być mierzona zarówno na podłożach stałych, jak i w pożywkach płynnych. Jednak ręczne analizy aktywności poszczególnych robaków są z natury czasochłonne i wiążą się z nieuniknionymi uprzedzeniami generowanymi przez użytkowników. Automatyzacja analiz aktywności robaków minimalizuje stronniczość generowaną przez użytkowników i może znacznie zwiększyć przepustowość eksperymentalną²⁵. Nagrania wideo aktywności robaków w płynnych mediach mogą być analizowane za pomocą wrMTrck, wtyczki ImageJ²⁶. Jednak pierwotne ustawienia eksperymentalne, które zostały opracowane dla wrMTrck, ograniczały jego użyteczność, ponieważ zbyt wiele robaków w jednej kropli płynu prowadziło do nakładania się robaków, co utrudniało dokładne śledzenie. Chociaż to eksperymentalne ograniczenie zostało rozwiązane²⁷, metoda wrMTrck nie jest w stanie obsługiwać przesiewania o wysokiej przepustowości.

Istnieje szereg metod do ilościowego określania aktywności lokomotorycznej robaków na początku badania i w odpowiedzi na potencjalne terapie w modelach chorób mitochondrialnych C. elegans. Należą do nich: ZebraLab (ViewPoint Life Sciences), Tierpsy Tracker²⁸, platforma śledzenia nicieni o szerokim polu widzenia (WF-NTP)²⁹, WormMotel, WormWatcher³⁰, WormLab³¹, Infinity Chip³² oraz WMicrotracker One³³ (Tabela 1). Metody te umożliwiają jednoczesną analizę lokomocji w wielu szczepach robaków lub warunkach, zwykle na płytkach wielodołkowych, wspierając w ten sposób zastosowania badań przesiewowych leków o wyższej przepustowości. Niektóre z tych metod mają unikalne względy, które mogą ograniczać lub zwiększać ich ogólną użyteczność, takie jak potrzeba drogiego sprzętu w porównaniu z oprogramowaniem o otwartym dostępie oraz różna łatwość wykonywania protokołów eksperymentalnych. Ogólnie rzecz biorąc, żaden pojedynczy system lub protokół eksperymentalny nie jest idealnie dopasowany do wszystkich eksperymentów aktywności lokomotorycznej C. elegans. Ważne jest raczej, aby starannie wybrać, która metoda jest najlepiej dopasowana do celów i wymagań eksperymentalnych konkretnego badacza.

Pompowanie gardła stanowi kolejny ważny wynik do oceny aktywności nerwowo-mięśniowej u C. elegans. Gardło C. elegans składa się z 20 komórek mięśniowych, 20 neuronów i 20 innych komórek, które umożliwiają spożycie Escherichia coli (E. coli) na przednim końcu przewodu pokarmowego robaka³⁴^,³⁵^,³⁶. Ustalono kilka ręcznych metod określania szybkości pompowania gardła¹⁷^,²¹^,³⁷^,³⁸. Większość metod opiera się na wykorzystaniu mikroskopu stereoskopowego i kamery do wizualizacji i rejestracji częstotliwości pompowania gardła z bezpośrednim zliczaniem przez eksperymentalnego obserwatora²¹. Zautomatyzowana analiza szybkości pompowania pokarmu gardłowego jest możliwa po wykonaniu zapisu zewnątrzkomórkowego zwanego elektrogardłowogramem (EPG), który dostarcza dodatkowych informacji na temat czasu trwania każdej pompy³⁹. Analiza szybkości pompowania gardła jest również możliwa w systemie mikroprzepływowym WormSpa, w którym poszczególne robaki są zamknięte w komorach⁴⁰^,⁴¹. Komercyjną metodą ułatwiającą analizę szybkości pompy gardłowej jest system ScreenChip (InVivo Biosystems), który mierzy, wizualizuje i analizuje nerwowo-mięśniowe aspekty zachowań żywieniowych u pojedynczego robaka, który jest unieruchomiony w niestandardowym chipie. To podejście do kwantyfikacji pompowania gardłowego może być wykorzystane do oceny zarówno neuronalnych, jak i fizjologicznych reakcji na leki, starzenie się i inne czynniki⁴²^,⁴³^,⁴⁴^,⁴⁵.

Chemotaksja opisuje ruch C. elegans w odpowiedzi na zapach umieszczony z dala od robaków w określonym obszarze płytki pożywki dla nicieni (NGM). Ocena odpowiedzi chemotaksji zapewnia zintegrowaną miarę aktywności neuronalnej i nerwowo-mięśniowej robaków, którą można określić ilościowo poprzez obserwację i pomiar fizycznej odległości przebytej przez robaki w kierunku substancji zapachowej w określonym czasie⁴⁶. Multi-Worm Tracker to automatyczna metoda, która może być wykorzystana do poprawy eksperymentalnej wydajności ilościowego określania odległości przebytej przez robaki w kierunku atraktantu lub repelentu⁴⁷.

Tutaj opisany jest szczegółowy protokół dla dwóch nowatorskich, półautomatycznych metod stworzonych do ilościowego określania aktywności robaków. Pierwsze podejście wykorzystuje ZebraLab, komercyjne oprogramowanie, które zostało pierwotnie opracowane do badania aktywności pływackiej Danio rerio (danio pręgowanego), do nowatorskiego średnioprzepustowego zastosowania do ilościowego określania ogólnej aktywności lokomotorycznej w płynnych pożywkach C. elegans na podstawie zmian pikseli podczas ruchu (Tabela 1, Rysunek 1). Dane wyjściowe są szybko uzyskiwane z dużej liczby jednoczesnych warunków i próbek analizowanych na szkiełku podstawowym, chociaż metoda ta nie jest odpowiednia dla formatu płytek wielodołkowych. Drugie podejście to nowatorska adaptacja metodologii WormScan⁴⁸^,⁴⁹ (Rysunek 2), która wykorzystuje skaner płaski do tworzenia obrazu różnicowego dwóch sekwencyjnych skanów, które mogą być różnie używane z oprogramowaniem typu open source, aby umożliwić półautomatyczną analizę ilościową zintegrowanych wyników fizjologicznych, takich jak płodność i przeżycie. W tym celu opracowano nową, wysokoprzepustową adaptację metodologii WormScan do ilościowego określania aktywności lokomotorycznej robaków w pożywkach płynnych w populacjach piętnastu robaków w stadium larwalnym 4 (L4) na studzienkę 96-dołkowej płytki o płaskim dnie. Ta półautomatyczna i tania metodologia WormScan może być łatwo dostosowana do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków, a także do analiz różnych etapów i wieku zwierząt⁴⁸^,⁴⁹.

Tutaj protokół i skuteczność analizy aktywności lokomotorycznej C. elegans przy użyciu metod półautomatycznych ZebraLab i WormScan jest pokazana w dobrze znanym modelu C. elegans dla choroby mitochondrialnego kompleksu I, gas-1(fc21). gaz-1 (gen K09A9.5) jest ortologiem ludzkiego NDUFS2 (NADH: rdzeń oksydoreduktazy ubichinonowej (białko żelazowo-siarkowe) podjednostka 2) (Rysunek 3). Zmutowany szczep C. elegans gas-1(fc21) jest nosicielem homozygotycznej mutacji missense p.R290K w ludzkim ortologu NDUFS2⁵⁰, powodując znacznie obniżoną płodność i długość życia, upośledzoną zdolność fosforylacji oksydacyjnej łańcucha oddechowego (OXPHOS)⁵¹, a także zmniejszoną masę mitochondrialną i potencjał błonowy ze zwiększonym stresem oksydacyjnym5^,⁸. Pomimo ugruntowanego zastosowania w ciągu ostatnich dwóch dekad do badania chorób mitochondrialnych, aktywność lokomotoryczna mutantów GAS-1 (fc21) nie była wcześniej zgłaszana. W tym przypadku metody ZebraLab i WormScan zostały zastosowane do niezależnego ilościowego określenia aktywności lokomotorycznej robaków gas-1(fc21) w porównaniu z robakami typu dzikiego (WT, N2 Bristol), zarówno w celu walidacji metod, jak i wykazania ich porównawczej użyteczności i skuteczności protokołów eksperymentalnych i analiz informatycznych. Oprogramowanie ZebraLab umożliwiło szybkie ilościowe określenie kilku jednoczesnych stanów aktywności lokomotorycznej robaków w modelach chorób mitochondrialnych C. elegans, co może znaleźć zastosowanie w ukierunkowanych badaniach przesiewowych leków lub badaniach walidacyjnych. Analiza WormScan, w szczególności, jest dobrze przystosowana do łatwego umożliwienia wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków w bibliotekach związków i priorytetyzacji potencjalnych klientów, które poprawiają funkcję nerwowo-mięśniową zwierząt i aktywność lokomotoryczną w przedklinicznych modelach pierwotnej choroby mitochondrialnej C. elegans.