Testy kropelek wody w oleju są przydatne do chemii analitycznej, ewolucji enzymów i analizy pojedynczych komórek, ale zazwyczaj wymagają mikrofluidyki do formowania kropel. W tym miejscu opisujemy emulgację z szablonami cząstek, bezprzepływowe podejście do wykonywania testów kropelkowych.
Artykuł metodologiczny
Emulgacja szablonowa cząstek umożliwia oznaczanie kropel bez mikroprzepływowości
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Reakcje przeprowadzane w monorozproszonych kropelkach zapewniają większą dokładność i czułość w porównaniu do równoważnych reakcji przeprowadzanych masowo. Jednak wymóg, aby mikrofluidyki tworzyły kontrolowane kropelki, stanowi barierę dla osób niebędących ekspertami, ograniczając ich stosowanie. W tym miejscu opisujemy emulgację szablonową cząstek, podejście do generowania kropel monodyspersyjnych bez mikrofluidyki. Za pomocą kulek hydrożelowych do tworzenia szablonów zamykamy próbki w monorozproszonych kropelkach za pomocą prostego wirowania. Demonstrujemy to podejście, używając go do wykonywania cyfrowej reakcji PCR bez użycia mikroprzepływów.
Wprowadzenie
Mikrofluidyka kropelkowa wykorzystuje kompartmentyzację w kropelkach o objętości pikolitrowej w celu zwiększenia czułości i dokładności analiz w porównaniu z reakcjami w objętościach masowych, i znajduje liczne zastosowania w przesiewaniu chemicznym, inżynierii białek oraz sekwencjonowaniu następnej generacji1,2,3. Na przykład cyfrowa kropelkowa reakcja łańcuchowa polimerazy (ddPCR) zapewnia większą dokładność w porównaniu z ilościową reakcją łańcuchową polimerazy (qPCR) w objętościach masowych, znajdując zastosowanie w badaniu zmienności genetycznej w nowotworach, wykrywaniu mutacji wywołujących choroby oraz w diagnostyce prenatalnej4,5,6. Wyzwaniem w mikrofluidyce kropelkowej jest jednak konieczność stosowania urządzeń mikrofluidycznych do rozdziału próbek; choć mikrofluidyka zapewnia doskonałą kontrolę nad właściwościami kropel, ich budowa i obsługa wymagają specjalistycznej wiedzy7,8. W konsekwencji metody oparte na kropelkach są w dużej mierze ograniczone do wyspecjalizowanych laboratoriów lub, w rzadkich przypadkach, do zastosowań, w których dostępny jest komercyjny instrument9,10. Aby poszerzyć zakres stosowania analiz kropelkowych, konieczne jest pokonanie bariery w postaci zapotrzebowania na specjalistyczną aparaturę mikrofluidyczną.
W niniejszym artykule opisujemy metodę emulgacji matrycowej z użyciem cząsteczek (Particle Templated Emulsification, PTE), która jest metodą niezależną od mikroprzepływów, służącą do przeprowadzania reakcji w monodyspersyjnych kroplach. W metodzie PTE cząsteczki matrycowe włączają próbkę do kropli w oleju nośnym poprzez zwykłe mieszanie w wortexerze (Rycina 1). W miarę mieszania systemu faza wodna rozpada się na krople o malejącej wielkości, aż krople będą zawierać pojedyncze cząsteczki, w którym momencie dalsza fragmentacja staje się niemożliwa, ponieważ wymagałaby rozbicia cząsteczek. Włączona próbka otacza cząsteczki w formie powłoki wewnątrz kropli, enkapsulując tym samym wszelkie zdyspergowane komórki, odczynniki lub grupy funkcyjne (Rycina 1D). W konsekwencji PTE nie wymaga żadnego specjalistycznego sprzętu ani wiedzy do przeprowadzania reakcji w kroplach, poza powszechnie dostępnym wortexerem. Ponadto generowanie kropli trwa sekundy, w porównaniu do minut lub godzin w przypadku mikroprzepływów, a ilość otrzymanego produktu jest proporcjonalna do objętości naczynia, a nie czasu pracy urządzenia, co czyni tę metodę niezwykle skalowalną. Zalety te sprawiają, że PTE jest idealna do przeprowadzania analiz kroplowych w różnych warunkach, w których zastosowanie mikroprzepływów jest niepraktyczne. Poniżej demonstrujemy metodę PTE i wykorzystujemy ją do przeprowadzenia ddPCR.
Rysunek 1. Przegląd procesu emulsyfikacji z wykorzystaniem cząstek szablonowych. (A) Cząstki szablonowe są mieszane z odczynnikami. (B) Nadmiar odczynników jest usuwany po wirowaniu. (C) Dodanie cząsteczek szablonu następuje przed dodaniem oleju. (D) Wirowanie w wstrząsarze (vortexing) powoduje powstanie kropli zawierających pojedynczą cząsteczkę szablonu. (E) Następująca po tym termocykling i obrazowanie umożliwiają cyfrową analizę kropelkową docelowego szablonu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Protokół
1. Przygotowanie cząsteczek hydrożelu do emulgowania z wykorzystaniem matrycy cząsteczkowej.
Cząstki hydrożelu stosowane do emulgowania z użyciem szablonu cząsteczkowego można przygotować dwiema różnymi metodami.
- Przygotowanie z wykorzystaniem komercyjnie dostępnych cząstek
- Do 30 mL sterylnej wody w 50 mL probówce stożkowej dodać 0,5 g wysuszonych cząstek poliakryloamidu kompatybilnych z PTE (np. Bio-Gel P-60 Gel (Bio-Rad), średnica 45-90 µm) i dokładnie wymieszać. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min.
- Przygotowanie z wykorzystaniem mikrofluidalnego wytwarzania cząstek
UWAGA: Cząstki poliakryloamidu kompatybilne z PTE można przygotować za pomocą komercyjnie dostępnych generatorów kropel (np. QX200 Drop Generator (Bio-Rad), RayDrop (Fluigent) itp.) lub za pomocą niestandardowego projektu mikrofluidalnego.- Wytwarzanie niestandardowej formy (mastera)
- Zaprojektować maskę do miękkiej fotolitografii przy użyciu oprogramowania do wspomaganego komputerowo projektowania (CAD). Wydrukować fotomaskę z rozdzielczością 10 µm na folii do płytek obwodowych.
- Wylać 1 mL fotorezystu na środek 3-calowego wafla krzemowego. Użyć powlekarki wirówkowej, aby utworzyć 50 µm warstwę fotorezystu, wirując z prędkością 500 rpm przez 30 s, a następnie 1250 rpm przez 30 s. Umieścić wafel na płycie grzejnej ustawionej na 95 °C na 15 min w celu odparowania rozpuszczalnika.
- Przymocować fotomaskę do wafla krzemowego za pomocą szkiełka podstawowego i naświetlać wafel pod kolimowaną diodą UV o mocy 190 mW i długości fali 365 µm przez 2,5 min. Umieścić wafel na płycie grzejnej ustawionej na 95 °C przez 5 min w celu wygrzania po naświetlaniu.
- Wywołać wafel krzemowy z fotorezystem poprzez zanurzenie go w kąpieli z 100% octanu monometylu eteru glikolu propylenowego (PGMEA) do 15 min. Przepłukać wafel świeżym 100% PGMEA, a następnie 100% izopropanolem. Wysuszyć wafel na powietrzu.
- Usunąć pozostałości izopropanolu, susząc wafel na płycie grzejnej ustawionej na 95 °C przez 1 min. Umieścić wafel w czystej 3-calowej szalce Petriego.
- Wytwarzanie niestandardowego urządzenia mikrofluidalnego
- Wymieszać bazę krzemową polidimetylosiloksanu (PDMS) i czynnik sieciujący w stosunku masowym 10:1. Odgazować zmieszany PDMS w eksyكاتهrze pod próżnią laboratoryjną do momentu, aż pęcherzyki powietrza nie będą widoczne.
- Wylać odgazowany PDMS na formę w szalce Petriego, upewniając się, że wafel krzemowy jest całkowicie zanurzony. Odgazować wafel krzemowy i PDMS, aby usunąć pęcherzyki powietrza, które mogły powstać podczas wylewania.
- Utwardzić PDMS, umieszczając wafel krzemowy i PDMS w piekarniku ustawionym na 65 °C przez co najmniej 60 min. Wyciąć skalpelem z szalki Petriego blok PDMS zawierający struktury mikrofluidalne. Zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić żadnych struktur znajdujących się na krzemowej formie.
- Wybić w bloku PDMS wloty i wyloty odpowiadające wlotom i wylotom w urządzeniu mikrofluidalnym, używając wycinaka do biopsji o średnicy 0,75 mm. Usunąć kurz i cząsteczki poprzez wielokrotne przyklejanie i odklejanie taśmy pakowej do powierzchni bloku PDMS.
- Oczyścić szkiełko przedmiotowe o wymiarach 50 mm x 75 mm, płucząc je 100% izopropanolem, a następnie susząc powierzchnię na powietrzu. Poddać obróbce plazmowej szkiełko oraz PDMS (strukturami do góry) przy użyciu plazmy O2 o ciśnieniu 1 mbar przez 1 min za pomocą bondera plazmowego.
- Przymocować PDMS do szkiełka, kładąc potraktowany plazmą PDMS strukturami do dołu na szkiełko, stroną potraktowaną plazmą do góry. Umieścić szkiełko w piekarniku ustawionym na 65 °C przez co najmniej 30 min, aby zakończyć proces wiązania.
- Potraktować wszystkie kanały mikrofluidalne fluorowanym preparatem do powierzchni w celu zapewnienia hydrofobowości powierzchni i zapobiegania zwilżaniu. Wypiec urządzenie w temperaturze 65 °C przez co najmniej 10 min.
- Wytwarzanie cząstek szablonowych
- Przygotować roztwór poliakryloamidu (PAA) składający się z 6,2% akryloamidu, 0,18% N,N′-metylenobis(akryloamidu) i 0,3% persiarczanu amonu. Napełnić ten roztwór do strzykawki 1 mL z igłą 28G.
- Przygotować nierozpuszczalną fazę ciągłą składającą się z 5% (w/w) surfaktantu fluorowego i 1% N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) w oleju hydrofluoroetrowym (HFE) do generowania i stabilizacji kropel. Napełnić roztworem nową strzykawkę 1 mL.
- Umieścić strzykawki z roztworami PAA i HFE w pompach strzykawkowych (np. NE-501). Połączyć obie strzykawki z urządzeniem mikrofluidalnym za pomocą rurek polietylenowych nasuniętych na strzykawki i wprowadzonych do urządzenia. Przed połączeniem przepłukać pompy, aby usunąć powietrze z rurek.
UWAGA: W zależności od modelu pompy strzykawkowe mogą być sterowane za pomocą wbudowanego panelu wejściowego, oprogramowania producenta lub niestandardowego skryptu (dostępnego pod adresem https://github.com/AbateLab/Pump-Control-Program). - Uruchomić urządzenie do generowania kropel z dopływem PAA i oleju HFE z prędkością odpowiednio 300 µL/h i 500 µL/h. Zebrać 1 mL kropel do 15 mL probówki zbiorczej i inkubować przez 3 h w temperaturze pokojowej w celu polimeryzacji. Po inkubacji usunąć dolną warstwę oleju za pomocą pipety.
- Dodać 1 mL 20% (v/v) perfluoro-1-oktanolu (PFO) w oleju HFE do 15 mL probówki zbiorczej jako chemiczny demulgator. Po wymieszaniu wirować probówkę z prędkością 2000 x g przez 2 min. Usunąć nadsącz PFO/HFE za pomocą pipety. Powtórzyć 1x.
- Dodać 2 mL 2% monooleinianu sorbitanu w heksanie do 15 mL probówki zbiorczej i wymieszać w wirówce typu vortex. Wirować probówkę z prędkością 3000 x g przez 3 min. Usunąć nadsącz za pomocą pipety, aby usunąć roztwór surfaktantu/heksanu. Powtórzyć 2x.
- Dodać 5 mL buforu TEBST (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 274 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 20 mM EDTA, 0,2% Triton X-100) i dokładnie wymieszać. Wirować z prędkością 3000 x g przez 3 min. Usunąć nadsącz za pomocą pipety. Powtórzyć 3x.
- Resuspendować w 5 mL TEBST. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4 °C w nieskończoność.
- Wytwarzanie niestandardowej formy (mastera)
2. Emulsyfikacja z zastosowaniem matrycy cząsteczkowej.
Po przygotowaniu cząsteczek matrycowych, PTE jest wykorzystywane do enkapsulacji próbki i odczynników w kropelkach.
- Przygotować cząstki poliakrylamidowe do emulsyfikacji z użyciem matrycy cząsteczkowej, wirując je przy 6000 x g przez 1 min w celu osadzenia cząstek, a następnie usuwając nadsącz za pomocą pipety i resuspendując w sterylnej wodzie. Powtórzyć 3x, aby zapewnić usunięcie wszelkich pozostałości TEBST.
- Wyznaczyć stężenie i średnicę cząstek matrycowych przy użyciu komory licznej (lub urządzenia równoważnego). Obliczyć średnicę pojedynczej cząstki, mierząc średnice w pikselach i przeliczając je na mikrony. Przelicznik pikseli na mikrony można wyznaczyć, używając komory licznej (lub urządzenia równoważnego) jako preparatu kalibracyjnego i mierząc znaną odległość siatki w pikselach.
- Przygotować fazę dyspersyjną w nowej probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL, używając mieszaniny PCR master mix, odpowiednich starterów oraz sondy hydrolizy fluoresceinowej zgodnie z Tabelą 1. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min przy łagodnym mieszaniu (10 rpm) za pomocą rotatora do probówek, aby zapewnić jednorodne rozmieszczenie składników.
UWAGA: Objętość i docelowe stężenie cząstek opierają się na rozkładzie Poissona. Jako ogólną zasadę, liczba cząstek powinna być o rząd wielkości większa niż liczba próbek do enkapsulacji. W przypadku próbek o nieznanym stężeniu konieczne jest sporządzenie serii rozcieńczeń, aby zapewnić ładowanie zgodnie z rozkładem Poissona.
| Objętość | Odczynnik |
| 100 μL | Cząsteczki (450 cząsteczek / μL) |
| 200 μL | 2x mieszanina PCR master mix |
| 18 μL | 10 μM starter bezpośredni |
| 18 μL | 10 μM starter odwrotny |
| 18 μL | 10 μM sonda |
| 0.8 μL | Triton X100 |
| 45.2 μL | Woda wolna od nukleaz |
Tabela 1. Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej (master mix) do PCR stosowanej z PTE w cyfrowym PCR kropelkowym (ddPCR).
- Odwiruj fazę dyspersyjną z prędkością 6000 x g przez 1 min i usuń nadfiltr. Zapisz objętość odessanego nadfiltru i na podstawie całkowitej objętości fazy dyspersyjnej obliczonej w punkcie 2.3 wyznacz objętość osadu.
UWAGA: Ilość odessanego nadfiltru będzie się różnić w zależności od upakowania, średnicy i stężenia cząsteczek, przy czym minimalna oczekiwana objętość wynosi 300 µL. - Do osadu z punktu 2.4 dodaj 1 µL genomicznego DNA Saccharomyces cerevisiae o stężeniu 1,62 pg/µL i wymieszaj dokładnie poprzez pipetowanie lub energiczne stukanie.
UWAGA: Obecność nadmiaru treści wodnej może obniżyć wydajność enkapsulacji. Jeśli objętość próbki przekracza 1% objętości osadu, należy skoncentrować próbkę. Jeśli próbki nie można skoncentrować, należy przeskalować mieszaninę PCR (master mix) i wynikową objętość osadu zgodnie z objętością próbki. Metoda PTE pozwala na emulgowanie małych (10 µL) i dużych (2 mL) objętości cząsteczek matrycowych. Mieszaninę PCR (2.3) oraz olej (2.6) można przeskalować odpowiednio zgodnie z docelową (2.3) i zmierzoną (2.4) objętością osadu cząsteczek. - Do probówki dodaj 200 µL 2% fluorosurfaktanta w oleju HFE jako nierozpuszczalną fazę ciągłą do emulgowania. Upewnij się, że osad został rozbity poprzez pipetowanie lub stukanie/potrząsanie probówką. Następnie wymieszaj w wortexie z prędkością 3000 rpm przez 30 s.
UWAGA: Ustawienie odpowiadające 3000 rpm może się różnić w zależności od marki i modelu urządzenia. - Pozostaw emulsje do ustabilizowania na 1 min. Usuń 100 µL dolnej fazy olejowej i zastąp tę objętość świeżym 2% fluorosurfaktantem w oleju HFE. Delikatnie odwróć probówkę kilka razy, aby wymieszać. Powtórz czynność 3-5 razy lub aż do usunięcia małych kropel satelitarnych.
3. Cyfrowy PCR kropelkowy i analiza.
- Po 2–5 min sedymentacji usuń dolną fazę olejową. Zastąp tę objętość 5% fluorosurfaktantem w oleju fluorowęglowym (np. FC-40).
- Używając końcówki do pipety o szerokim otworze, ostrożnie przenieś 100 µL próbki do probówek PCR o pojemności 200 µL. Umieść probówki PCR w termocyklerze i przeprowadź reakcję zgodnie z Tabelą 2.
| Krok | Temperatura | Czas trwania | Uwagi |
| 1 | 95 °C | 2 min | |
| 2 | 95 °C | 30 s | |
| 3 | 50 °C | 90 s | |
| 4 | 72 °C | 60 s | |
| 5 | Powtórz kroki 2–4 34 razy | ||
| 6 | 72 °C | 2 min | |
| 7 | 4 °C | przytrzymać |
Tabela 2. Warunki termocyklingu dla cyfrowego PCR kropelkowego z użyciem emulsji PTE.
- Nanieś próbkę na slajd do zliczania za pomocą końcówki do pipety o szerokim otworze w celu obrazowania fluorescencyjnego. Wykonaj obrazowanie próbki przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego z długością fali wzbudzenia 490 nm i detekcji emisji 525 nm.
- Zlicz fluorescencyjne krople pozytywne (Np) oraz całkowitą liczbę kropli (NT), aby potwierdzić obecność i obliczyć liczbę cząsteczek matrycy (λ), wykorzystując ułamek kropli pozytywnych (Np/NT) oraz statystykę Poissona:
- Oblicz 95% przedział ufności (zc = 1.96) zgodnie z wzorem:
- Oblicz stężenie próbki (cząsteczki/µL), korzystając z objętości (ν w µL) próbki dodanej w kroku 2.5, zgodnie z poniższym równaniem. Wyznacz średnią i odchylenie standardowe stężenia próbki na podstawie powtórzeń technicznych.
Wyniki
Rycina 2. Enkapsulacja próbki w kroplach przy użyciu emulgacji z matrycą cząsteczkową. (A) Cząstki matrycowe stosowane w emulgacji z matrycą cząsteczkową. (B) Oddzielenie osadu z cząstek matrycowych od supernatantu po wirowaniu. (C) Krople powstałe w wyniku emulgacji z matrycą cząsteczkową z (D) możliwą do zidentyfikowania otoczką wodną. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
W procesie PTE monodispersyjność emulsji jest zdeterminowana przez monodispersyjność cząstek matrycowych, ponieważ krople mają średnicę nieco większą od średnicy cząstek. Zatem jednorodne cząstki są kluczowe dla kontrolowanej enkapsulacji w PTE11. Istnieje wiele metod wytwarzania jednorodnych cząstek matrycowych, w tym metody chemiczne (sol-gel, polimeryzacja emulsyjna), hydrodynamiczne (emulsyfikacja membranowa, homogenizacja) oraz metody filtracyjne. Podejścia mikroprzepływowe w szczególności zapewniają doskonałą monodispersyjność (Ryc. 2A) i umożliwiają dodatkową inżynierię cząstek w celu zwiększenia ich funkcjonalności w PTE12. Alternatywnie można zakupić gotowe cząstki matrycowe, choć ich jednorodność, mimo że wystarczająca, jest zazwyczaj mniejsza niż w przypadku generowania metodą mikroprzepływową11.
Aby przeprowadzić PTE, cząstki miesza się z próbką do enkapsulacji (Rysunek 1A), a nadmiar nadsączu usuwa się poprzez wirowanie i pipetowanie (Rysunek 1B), co zostało zilustrowane na zdjęciu osadu cząstek na dnie probówki PCR (Rysunek 2B). Następnie dodaje się olej enkapsulujący zawierający stabilizujący surfaktant (Rysunek 1C), a próbkę delikatnie pipetuje się przed mieszaniem w wstrząsarze wierzchowym (vortex) przez 30 sekund (Rysunek 1D), aby wytworzyć emulsję (Rysunek 2C). Powstałe kropelki zawierają rdzeń z cząstki oraz wodną otoczkę składającą się z początkowej próbki, w której znajdują się odczynniki, cząsteczki docelowe i komórki niezbędne do reakcji (Rysunek 2D). Podobnie jak w enkapsulacji mikrofluidycznej w kropelkach, dyskretne jednostki, takie jak małe koraliki lub komórki, są enkapsulowane losowo i zgodnie z rozkładem Poissona, choć ze względu na fizykę procesu PTE niemal wszystkie kropelki zawierają cząstkę szablonującą.
Rysunek 3. Identyfikacja i oczyszczanie kropelek powstałych w procesie emulsyfikacji z matrycą cząsteczkową. (A) Przykład niejednorodnego generowania kropelek z wieloma cząsteczkami na kropelkę w wyniku niewystarczającego mieszania wirowego. (B) Przewidywana obecność satelitów i kropelek po emulsyfikacji z matrycą cząsteczkową oraz (C) frakcjonowanie w układzie woda-w-oleju. (D) Powstała emulsja po płukaniu olejem. (E) Nadmierne generowanie satelitów w wyniku obecności resztkowego supernatantu podczas emulsyfikacji z matrycą cząsteczkową. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Nawet w przypadku udanego PTE występują krople z podwójnym lub potrójnym rdzeniem, choć zazwyczaj mają one pomijalny wpływ na reakcję, o ile występują rzadko. Osiągnięcie niskiej częstotliwości kropel wielordzeniowych przy jednoczesnym zachowaniu odpowiednich otoczek wymaga optymalizacji parametrów procesu, w tym napięcia powierzchniowego, sił adhezji między cząstkami, lepkości próbki, rozmiaru naczynia oraz mocy i czasu wirowania. Na przykład słabo zoptymalizowana emulsyfikacja może zawierać polydispersyjne krople z wieloma cząstkami matrycowymi (Rysunek 3A), co wskazuje na niewystarczającą moc wirowania do pełnej emulsyfikacji próbki. W takich przypadkach można dodać detergenty w celu zmniejszenia adhezji między cząstkami i obniżenia napięcia powierzchniowego lub zwiększyć moc bądź czas wirowania. Innym częstym problemem jest powstawanie nadmiernej liczby satelitów, czyli małych pustych kropel (Rysunek 3B). Satelity w emulsjach PTE mogą być nieuniknione w zależności od napięcia międzyfazowego i właściwości reologicznych próbki oraz oleju nośnika. Często wynikają one jednak z niewystarczającego usunięcia nadmiaru próbki przed emulsyfikacją (Rysunek 2B) lub wirowania ze zbyt dużą mocą, co prowadzi do odrywania otoczek od kropel. W przypadku udanej emulsyfikacji PTE satelity nie powinny stanowić więcej niż ~10% całkowitej objętości inkapsulowanej próbki (Rysunek 3C)11. Na tym poziomie zazwyczaj mają one pomijalny wpływ na reakcję i mogą być ignorowane. Ze względów estetycznych można je usunąć z emulsji poprzez przemycie świeżym olejem (Rysunek 3D).
Rysunek 4Ocena cyfrowej PCR w kroplach z emulsją szablonowaną cząsteczkowo. (AObrazowanie fluorescencyjne kropel pozwala na zidentyfikowanie kropel fluorescencyjnych dodatnich oraz kropel niefluorescencyjnych ujemnych.B) Identyfikacja rzadkich matryc lub niskich stężeń matrycy za pomocą cyfrowej PCR kropelkowej. (C) Nadmierna enkapsulacja matrycy, skutkująca zmienną liczbą cząsteczek matrycy w każdej kropli. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Aby zademonstrować użyteczność PTE, wykorzystaliśmy tę metodę do przeprowadzenia cyfrowego PCR bez użycia mikrofluidyki11. W ramach tego procesu enkapsulowaliśmy próbkę zawierającą genomiczne DNA S. cerevisiae, a następnie poddaliśmy ją termocyklowaniu. W cyfrowym PCR krople zawierające amplifikowane cele stają się fluorescencyjne, podczas gdy te bez celu pozostają ciemne. W związku z tym fluorescencyjna kropla wskazuje na obecność celu, co umożliwia bezpośrednie ilościowe oznaczenie celów poprzez policzenie dodatnich kropel (Rysunek 4A). Liczba fluorescencyjnych kropel skaluje się zatem wraz z liczbą cząsteczek celu, dając niewielką liczbę wyników dodatnich, gdy cel występuje rzadko (Rysunek 4B) i dużą liczbę, gdy jest on liczny (Rysunek 4C). Podobnie jak w przypadku enkapsulacji innych dyskretnych komponentów, enkapsulacja celu następuje zgodnie z rozkładem Poissona, co pozwala na przeliczenie frakcji kropel dodatnich na stężenie celu (Rysunek 4D), wykazując tym samym możliwość przeprowadzenia cyfrowego PCR przy użyciu PTE11.
Rysunek 5Demonstracja cyfrowego PCR kropelkowego z wykorzystaniem komercyjnie dostępnego PAA. (AObrazowanie fluorescencyjne kropel pozwala na zidentyfikowanie negatywnych kropel niefluorescencyjnych.BIdentyfikacja niskich stężeń matrycy za pomocą cyfrowego PCR kropelkowego.C) Identyfikacja wysokich stężeń matrycy za pomocą cyfrowej PCR w kropelkach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Wyniki te są powtarzalne przy użyciu komercyjnie dostępnych cząsteczek poliakrylamidu (Rysunek 5) i wykazują zdolność PTE do przeprowadzania standardowego cyfrowego PCR z wykorzystaniem komercyjnie dostępnych cząsteczek poliakrylamidu, co pozwala na uzyskanie dokładnych pomiarów w tym samym zakresie.
Plik uzupełniający. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
PTE wykorzystuje cząstki do kapsułkowania próbek w monorozproszonych kropelkach poprzez wirowanie. Oprócz prostoty i dostępności, PTE zapewnia kilka dodatkowych korzyści, w tym umożliwia natychmiastowe generowanie dużych ilości kropel. Co więcej, proces może być prowadzony w izolowanej probówce, co eliminuje potrzebę przenoszenia próbek do urządzeń mikroprzepływowych, usprawnia ogólny przepływ pracy i ogranicza możliwości zanieczyszczenia lub utraty próbki. Cząstki szablonowe zapewniają również środki, za pomocą których można zaprojektować zawartość wynikowych reakcji kropelkowych. Na przykład wielkość cząstek, skład chemiczny i zwilżalność można zaprojektować w celu ukierunkowanego wychwytywania biomolekuł lub komórek, podczas gdy ugrupowania funkcjonalne, takie jak enzymy, substancje czynne lub kwasy nukleinowe, mogą być wyświetlane na cząstek, aby ułatwić reakcje, takie jak sekwencjonowanie pojedynczych komórek lub charakterystyka funkcjonalna. Chociaż podejście to jest elastyczne, istnieją jednak istotne ograniczenia w jego stosowaniu. Na przykład obecnie nie jest możliwe przeprowadzenie addycji kropelk, jak to często ma miejsce w przypadku mikrofluidyki, co wymaga wprowadzenia wszystkich składników reakcji przed enkapsulacją; Wymaga to, aby odczynniki były kompatybilne i stabilne do momentu wytworzenia kropel, a w przypadku kłopotliwych kombinacji często można rozwiązać problem poprzez szybkie mieszanie i emulgowanie próbki na lodzie. Alternatywnie można zastosować komponenty reaktywne, które mogą być wyzwalane zewnętrznie za pomocą światła lub ciepła13. W ten sposób PTE zapewnia elastyczną i skalowalną metodę przeprowadzania testów kropelkowych dostępną dla osób niebędących ekspertami. To, w połączeniu z wrodzoną prostotą i elastycznością, sprawia, że PTE idealnie nadaje się do wykonywania i opracowywania wielu aplikacji kropelkowych.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca nad opracowaniem tego protokołu była wspierana przez National Institutes of Health (R01-EB019453-02), Biuro Dyrektora Wywiadu Narodowego, Działalność Zaawansowanych Projektów Badawczych Wywiadu poprzez Raytheon BBN Technologies Corp (N66001-18-C-4507), Chan-Zuckerberg Biohub Investigator Program, Defense Advanced Research Projects Agency przez Texas A&M University (W911NF1920013) oraz Centers for Disease Control and Prevention przez Johns Hopkins Uniwersyteckie Laboratorium Fizyki Stosowanej (75D30-11-9C-06818 (CDC3)). Poglądy i wnioski zawarte w niniejszym dokumencie są poglądami autorów i nie powinny być interpretowane jako reprezentujące oficjalną politykę, wyrażoną lub dorozumianą, powyższych organizacji lub rządu Stanów Zjednoczonych. Rząd Stanów Zjednoczonych jest upoważniony do powielania i rozpowszechniania przedruków do celów rządowych, niezależnie od wszelkich zawartych w nich adnotacji o prawach autorskich.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Filtr strzykawkowy 0,22 um | Milipore Sigma SLGP033RS | ||
| 0,5M EDTA, pH 8,0 | Thermo-Fisher | 15575020 | |
| 0,75 mm | World Precision Instruments | 504529 | |
| strzykawki 1 ml | BD | 309628 | |
| 1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) | Sigma-Aldrich | 370533 | |
| 1M Tris-HCI, pH 8,0 | Thermo-Fisher | 15568025 | |
| Igły o rozmiarze 27 | 305109 | ||
| 3-calowe wafle silikonowe, typ P, dziewicza klasa testowa | University Wafers | 447 | |
| Drukowany w 3D uchwyt strzykawki wirówkowej | (niestandardowy) | (niestandardowy) | |
| Roztwór akrylamidu, 40%, do elektroforezy, sterylnie filtrowany | Sigma-Aldrich | A4058-100ML | |
| Nadsiarczan amonu | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
| Aquapel (fluorowana obróbka powierzchni) | Pittsburgh Glass Works | 47100 | |
| Heksan | Sigma-Aldrich | 139386 | |
| FC-40 | Sigma-Aldrich | F9755 | |
| Izopropanol | Sigma-Aldrich | 109827 | |
| N,N′-Methylenebis(akrylamid) | Sigma-Aldrich | 146072-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Novec-7500 Płyn inżynieryjny (olej HFE) | 3M | 98-0212-2928-5 | |
| rurki polietylenowe | Towary naukowe | B31695-PE/2 | |
| fluorosurfaktant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfaktant | |
| Programista PGMEA | Sigma-Aldrich | 484431 | |
| Fotomaski | CadArt Servcies | (niestandardowe) | |
| Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) | Applied Biosystems | 4464263 | |
| Powlekarka | wirowa Specjalistyczne systemy powłokowe | G3P-8 | |
| Rozpiętość 80 (monooleinian sorbitanu) | Sigma-Aldrich | s6760 | |
| SU-8 3025 fotorezystor | Kayaku | 17030192 | |
| Triton X-100 (etoksylowany oktylofenol) | Sigma-Aldrich | t8787 | |
| Tween 20 (polisorbat 20) | Sigma-Aldrich | p2287 | |
| Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) | Applied Biosystems | 4464263 | |
| Drożdże FWD | IDT | 5′-GCAGAGAGACCAGAACAAA-3′ | |
| Drożdże REV | IDT | 5′-ACACGTATGTATCTAGCCGAATA AC-3 | |
| Sonda drożdżowa | IDT | 5′-/56-FAM/ATATGTTGT/ZEN/TCACTCGCGCCTGGG/3IABk FQ/-3′ | |
| EVOS FL AUTO | Life Technologies Kostka | ||
| LED EVOS, GFP | Life Technologies | ||
| ZESTAW SYLGARD 184 1,1 LB (odczynniki bazowe i utwardzające PDMS) | Dow Corning | DC4019862 | |
| TEMED | Thermo Fisher | 17919 | |
| Saccharomyces cerevisiae genomic DNA | Milipore | 69240-3 | |
| Ekspandowany środek do czyszczenia plazmy (spawarka plazmowa) | Harrick Plasma | PDC-002 (230V) |
Bibliografia
- Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. Droplet microfluidics: A tool for biology, chemistry, and nanotechnology. Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).
- Gielen, F., et al. Ultrahigh-throughput-directed enzyme evolution by absorbance-activated droplet sorting (AADS). Proceedings of the National Academy of Sciences of USA. 113 (47), 7383-7389 (2016).
- Mai, S., Murphy, T. W., Lu, C. Microfluidics for genome-wide studies involving next generation sequencing. Biomicrofluidics. 11 (2), 021501(2017).
- Olmedillas-López, S., García-Arranz, M., García-Olmo, D. Current and emerging Applications of Droplet Digital PCR in Oncology. Molecular Diagnosis and Therapy. 21 (5), 493-510 (2017).
- Tong, Y., Shen, S., Jiang, H., Chen, Z. Application of Digital PCR in Detecting Human Diseases Associated Gene Mutation. Cellular Physiology and Biochemistry. 43 (3), 1718-1730 (2017).
- Yan, Y., et al. Evaluation of droplet digital PCR for non-invasive prenatal diagnosis of phenylketonuria. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (27), 7115-7126 (2019).
- Shang, L., Cheng, Y., Zhao, Y. Emerging Droplet Microfluidics. Chemical Reviews. 117 (12), 7964-8040 (2017).
- The, S., Lin, R., Hung, L., Lee, A. P. Droplet Microfluidics. Lab Chip. 8 (2), 198-220 (2008).
- Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nature Methods. 9, 541-544 (2012).
- Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing. Molecular Cell. 58 (4), 610-620 (2015).
- Hatori, M. N., Kim, S. C., Abate, A. R. Particle-Templated Emulsification for Microfluidics-Free Digital Biology. Analytical Chemistry. 90 (16), 9813-9820 (2018).
- Panda, P., et al. Stop-flow lithography to generate cell-laden microgel particles. Lab Chip. 8 (7), 1056-1061 (2008).
- Yozwiak, C. E., Hirschhorn, T., Stockwell, B. R. Towards a microparticle-based system for pooled assays of small molecules in cellular contexts. ACS Chemical Biology. 13 (3), 761-771 (2018).
Przedruki i uprawnienia
