Artykuł metodologiczny

Emulgacja szablonowa cząstek umożliwia oznaczanie kropel bez mikroprzepływowości

DOI:

10.3791/62248

⸱

9 marca 2021

 ,  , 
1Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, California Institute for Quantitative Biosciences, University of California, 2Chan Zuckerberg Biohub

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Testy kropelek wody w oleju są przydatne do chemii analitycznej, ewolucji enzymów i analizy pojedynczych komórek, ale zazwyczaj wymagają mikrofluidyki do formowania kropel. W tym miejscu opisujemy emulgację z szablonami cząstek, bezprzepływowe podejście do wykonywania testów kropelkowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reakcje przeprowadzane w monorozproszonych kropelkach zapewniają większą dokładność i czułość w porównaniu do równoważnych reakcji przeprowadzanych masowo. Jednak wymóg, aby mikrofluidyki tworzyły kontrolowane kropelki, stanowi barierę dla osób niebędących ekspertami, ograniczając ich stosowanie. W tym miejscu opisujemy emulgację szablonową cząstek, podejście do generowania kropel monodyspersyjnych bez mikrofluidyki. Za pomocą kulek hydrożelowych do tworzenia szablonów zamykamy próbki w monorozproszonych kropelkach za pomocą prostego wirowania. Demonstrujemy to podejście, używając go do wykonywania cyfrowej reakcji PCR bez użycia mikroprzepływów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrofluidyka kropelkowa wykorzystuje kompartmentalizację w kropelkach pikolitrów, aby zwiększyć czułość i dokładność testów w porównaniu z reakcjami masowymi, i ma liczne zastosowania w badaniach chemicznych, inżynierii białek i sekwencjonowaniu nowej generacji1,2,3. Na przykład cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy kropelkowej (ddPCR) zapewnia większą dokładność w porównaniu z masową ilościową reakcją łańcuchową polimerazy (qPCR), z zastosowaniami do zmienności genetycznej w nowotworach, wykrywania mutacji powodujących chorobę i diagnostyki prenatalnej4,5,6. Wyzwaniem związanym z mikrofluidyką kropelkową jest jednak wymóg stosowania urządzeń mikroprzepływowych do podziału próbek; Chociaż mikrofluidyka zapewnia doskonałą kontrolę nad właściwościami kropel, wymaga specjalistycznej wiedzy do budowy i obsługi7,8. W związku z tym metody oparte na kropelkach są w dużej mierze ograniczone do laboratoriów eksperckich lub, w rzadkich przypadkach, zastosowań, w których dostępny jest komercyjny instrument9,10. Aby poszerzyć zastosowanie testów kropelkowych, przeszkodą, którą należy pokonać, jest wymóg specjalistycznego oprzyrządowania mikroprzepływowego.

W tym artykule opisujemy Emulsification Szablonową Cząstkę (PTE), bezprzepływową metodę przeprowadzania reakcji w monorozproszonych kropelkach. W PTE, cząstki tworzące szablony pochłaniają próbkę w postaci kropelek w oleju nośnikowym poprzez proste wirowanie (Rysunek 1). Gdy system miesza się, część wodna rozpada się na kropelki o zmniejszającej się wielkości, aż kropelki zawierają pojedyncze cząstki, w którym to momencie dalsza fragmentacja nie jest możliwa, ponieważ wymaga rozbicia cząstek. Pochłonięta próbka otacza cząstki jako otoczkę w kropelkach, zamykając w ten sposób wszelkie rozproszone komórki, odczynniki lub funkcjonalne ugrupowania (Rysunek 1D). W związku z tym PTE nie wymaga żadnego sprzętu ani wiedzy specjalistycznej, aby przeprowadzać reakcje kropelkowe poza zwykłym wirownikiem. Dodatkowo, generowanie kropel trwa sekundy w porównaniu z minutami lub godzinami w przypadku mikrofluidyki, a wytwarzana ilość jest proporcjonalna do objętości pojemnika, a nie do czasu pracy urządzenia, co czyni go niezwykle skalowalnym. Korzyści te sprawiają, że PTE idealnie nadaje się do przeprowadzania testów kropelkowych w różnych okolicznościach, w których mikrofluidyka jest niepraktyczna. Tutaj demonstrujemy PTE i używamy go do przeprowadzenia ddPCR.

figure-introduction-1
Rysunek 1. Przegląd procesu emulgowania cząstek. (A) Cząstki szablonowe miesza się z odczynnikami. (B) Nadmiar odczynników jest usuwany po odwirowaniu. (C) Dodanie cząsteczek matrycowych następuje przed dodaniem oleju. (D) W wyniku wirowania powstają kropelki zawierające pojedynczą cząsteczkę matrycy. (E) Późniejszy termocykl i obrazowanie pozwalają na cyfrową analizę kropel docelowego szablonu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie cząsteczek hydrożelu do emulgacji szablonowej cząstek.

Cząsteczki hydrożelu używane do emulgowania szablonów cząstek mogą być przygotowane przy użyciu dwóch różnych metod.

  1. Preparat z wykorzystaniem dostępnych w handlu cząstek
    1. Dodać 0,5 g wysuszonych cząstek poliakryloamidu kompatybilnych z PTE (np. Bio-Gel P-60 Gel (Bio-Rad), średnica 45-90 μm) do 30 ml sterylnej wody w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i dobrze wymieszać. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  2. Przygotowanie za pomocą mikroprzepływowego wytwarzania cząstek
    UWAGA: Cząsteczki poliakrylamidu kompatybilne z PTE można przygotować za pomocą dostępnych na rynku kroplomierzy (np. QX200 Drop Generator (Bio-Rad), RayDrop (Fluigent) itp.) lub według niestandardowej konstrukcji mikroprzepływowej.
    1. Produkcja niestandardowego wzorca
      1. Zaprojektuj miękką maskę fotolitograficzną za pomocą oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD). Wydrukuj fotomaskę w rozdzielczości 10 μm na folii na płytce drukowanej.
      2. Wlej 1 ml fotorezystu na środek 3-calowej płytki krzemowej. Użyj powlekarki wirowej, aby utworzyć warstwę fotorezystu o grubości 50 μm, obracając ją z prędkością 500 obr./min przez 30 sekund, a następnie 1250 obr./min przez 30 sekund. Umieść wafel na płycie grzejnej ustawionej na 95 °C na 15 minut, aby odparować rozpuszczalnik.
      3. Przymocuj fotomaskę do płytki krzemowej za pomocą szkiełka nakrywkowego i naświetl płytkę pod skolimowaną diodą LED UV o mocy 190 mW, 365 μm przez 2,5 min. Umieść wafel na płycie grzejnej ustawionej na 95 °C na 5 minut w celu wypieczenia po ekspozycji.
      4. Rozwinąć płytkę fotorezystu-krzemową, zanurzając ją w kąpieli ze 100% octanu eteru monometylowego glikolu propylenowego (PGMEA) na okres do 15 minut. Opłucz wafel świeżym 100% PGMEA, a następnie 100% izopropanolem. Wysuszyć wafel na powietrzu.
      5. Usuń wszelkie pozostałości izopropanolu, susząc wafel na płycie grzejnej ustawionej na 95 °C przez 1 minutę. Umieść wafel na czystej szalce Petriego o średnicy 3 cali.
    2. Wykonanie niestandardowego urządzenia mikroprzepływowego
      1. Wymieszać bazę krzemową z polidimetylosiloksanu (PDMS) i odczynnik utwardzający w stosunku 10:1 masowo. Odgazuj zmieszany PDMS za pomocą eksykatora pod próżnią domową, aż nie będzie można zaobserwować pęcherzyków powietrza.
      2. Wlej odgazowany PDMS na matrycę na szalce Petriego, upewniając się, że płytka krzemowa jest całkowicie zanurzona. Odgazuj płytkę krzemową i PDMS, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, które mogły powstać podczas nalewania.
      3. Utwardzić PDMS, umieszczając płytkę krzemową i PDMS w piecu nastawionym na 65 °C na co najmniej 60 minut. Za pomocą skalpela należy wyciąć blok PDMS zawierający cechy mikroprzepływowe z płytki Petriego. Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić żadnych funkcji obecnych w wzorcu krzemowym.
      4. Wbić wloty i wyloty w blok PDMS odpowiadający wlotom i wylotom w urządzeniu mikroprzepływowym za pomocą stempla biopsyjnego 0,75 mm. Usuń kurz i cząstki stałe poprzez wielokrotne nakładanie i usuwanie taśmy pakowej na powierzchnię bloku PDMS.
      5. Wyczyść szkiełko o wymiarach 50 mm x 75 mm, spłukując je 100% izopropanolem, a następnie osuszając powierzchnię na powietrzu. Plazma poddaje działaniu zarówno szkiełka podstawowego, jak i PDMS (cechy skierowane do góry) za pomocą 1 mbar osoczaO2 przez 1 minutę za pomocą spawarki plazmowej.
      6. Przymocuj PDMS do szkiełka podstawowego, umieszczając PDMS poddanego obróbce plazmowej z elementami skierowanymi w dół na szkiełku podstawowym, stroną poddaną plazmie skierowaną do góry. Umieść szkiełko w piekarniku ustawionym na 65 °C na co najmniej 30 minut, aby zakończyć klejenie.
      7. Potraktuj wszystkie kanały mikroprzepływowe fluorowaną obróbką powierzchni, aby zapewnić hydrofobowość powierzchni i zapobiec zwilżaniu. Piecz urządzenie w temperaturze 65 °C przez co najmniej 10 minut.
    3. Wytwarzanie cząstek szablonowych
      1. Przygotować roztwór poliakrylamidu (PAA) składający się z 6,2% akrylamidu, 0,18% N,N′-metylenobisu (akrylamidu) i 0,3% nadsiarczanu amonu. Załadować ten roztwór do strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 28G.
      2. Przygotować nierozpuszczalną fazę ciągłą składającą się z 5% (w/w) fluorosurfaktantu i 1% N,N,NN-tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) w oleju hydrofluoroeterowym (HFE) do wytwarzania i stabilizacji kropel. Załadować roztwór do nowej strzykawki o pojemności 1 ml.
      3. Załaduj zarówno strzykawki zawierające roztwór PAA, jak i HFE do pomp strzykawkowych (np. NE-501). Podłączyć obie strzykawki do urządzenia mikroprzepływowego za pomocą rurki polietylenowej umieszczonej na strzykawce i w urządzeniu. Przed podłączeniem należy zalać pompy, aby usunąć powietrze z przewodu.
        UWAGA: W zależności od modelu, pompy strzykawkowe mogą być sterowane za pomocą wbudowanych danych wejściowych, oprogramowania produkcyjnego lub niestandardowego skryptu (dostępnego pod adresem https://github.com/AbateLab/Pump-Control-Program).
      4. Uruchomić urządzenie do wytwarzania kropli z dopływami oleju PAA i HFE odpowiednio przy 300 μL/h i 500 μL/h. Zebrać 1 ml kropelek do probówki zbiorczej o pojemności 15 ml i inkubować przez 3 godziny w temperaturze pokojowej w celu polimeryzacji. Po inkubacji usunąć dolną warstwę oleju za pomocą pipetowania.
      5. Dodaj 1 ml 20% (v/v) perfluoro-1-oktanolu (PFO) w oleju HFE do probówki zbiorczej o pojemności 15 ml jako deemulgator chemiczny. Po wymieszaniu odwirowywać probówkę o pojemności 15 ml o sile 2000 x g przez 2 minuty. Usunąć supernatant PFO/HFE za pomocą pipetowania. Powtórz 1x.
      6. Dodaj 2 ml 2% monooleinianu sorbitanu w heksanie do 15 ml probówki zbiorczej i odwiruj do wymieszania. Wirować probówkę o masie 3000 x g przez 3 minuty. Usunąć supernatant za pomocą pipetowania w celu usunięcia roztworu środka powierzchniowo czynnego/heksanu. Powtórz 2 razy.
      7. Dodać 5 ml buforu TEBST (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 274 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 20 mM EDTA, 0,2% Triton X-100) i dobrze wymieszać. Wirować z prędkością 3 000 x g przez 3 minuty. Usunąć szwadron przez pipetowanie. Powtórz 3 razy.
      8. Zawiesić w 5 ml TEBST. Roztwór ten może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez czas nieokreślony.

2. Emulgacja szablonowa cząstek.

Po przygotowaniu cząsteczek szablonowych, PTE jest używane do hermetyzacji próbki i odczynników w kropelkach.

  1. Przygotować cząstki poliakrylamidu do emulgowania z szablonem cząstek, wirując przy 6000 x g przez 1 minutę w celu osadzenia cząstek, a następnie usunąć supernatant przez pipetowanie i ponownie zawiesić przy użyciu sterylnej wody. Powtórz 3 razy, aby upewnić się, że usunięto wszelkie pozostałości TEBST.
  2. Określ stężenie i średnicę cząstek szablonowych za pomocą hemocytometru (lub jego odpowiednika). Oblicz średnicę poszczególnych cząstek, mierząc średnice w pikselach i przeliczając je na mikrony. Konwersję pikseli na mikrony można obliczyć przy użyciu hemocytometru (lub jego odpowiednika) jako szkiełka kalibracyjnego i mierzącego znaną odległość siatki w pikselach.
  3. Przygotować fazę dyspersyjną w świeżej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, używając głównej mieszanki PCR, odpowiednich starterów i sondy do hydrolizy fluoresceiny zgodnie z tabelą 1. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut przy delikatnym mieszaniu (10 obr./min) za pomocą rotatora probówkowego, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie składników.
    UWAGA: Objętość i docelowe stężenie cząstek opiera się na obciążeniu Poissona. Zgodnie z ogólną zasadą, liczba cząstek powinna być o rząd wielkości większa niż liczba próbek, które mają być zamknięte w kapsułkach. W przypadku próbek o nieznanych stężeniach konieczne jest wykonanie serii rozcieńczeń, aby zapewnić obciążenie metodą Poissona.
głośnośćOdczynnik
100 μLCząstki (450 cząstek / μL)
200 μL2x mieszanka główna PCR
18 μLPodkład 10 μM do przodu
18 μLPodkład odwrotny 10 μM
18 μLSonda 10 μM
0,8 μlTryton X100
45,2 μlWoda wolna od nukleaz

Tabela 1. Przygotowanie wzorcowej mieszaniny PCR używanej z PTE do cyfrowego PCR kropelkowego.

  1. Odwirować fazę dyspersyjną przy sile 6000 x g przez 1 minutę i usunąć supernatant. Zanotować objętość wyekstrahowanego supernatantu i wykorzystując całkowitą objętość fazy dyspersyjnej obliczoną w ppkt 2.3 oznaczyć objętość osadu.
    UWAGA: Ilość wyekstrahowanego supernatantu będzie się różnić w zależności od upakowania cząstek, średnicy i stężenia, przy minimalnej oczekiwanej objętości 300 μl.
  2. Dodać 1 μl genomowego DNA Saccharomyces cerevisiae o stężeniu 1,62 pg/μl do osadu z 2,4 i dokładnie wymieszać przez pipetowanie lub energiczne stukanie.
    UWAGA: Obecność nadmiaru zawartości wodnej może zmniejszyć skuteczność enkapsulacji. Jeżeli objętość próbki przekracza 1% objętości osadu, należy zagęścić próbkę. Jeżeli próbki nie można zagęścić, należy przeskalować główną mieszankę PCR i wynikową objętość osadu zgodnie z objętością próbki. PTE umożliwia emulgację małych (10 μl) do dużych (2 ml) objętości cząstek wzorcowych. Główna mieszanina PCR (2.3) i olej (2.6) mogą być skalowane odpowiednio zgodnie z docelową (2.3) i zmierzoną (2.4) objętością osadu cząstek.
  3. Dodać 200 μl 2% fluorosurfaktantu w oleju HFE do probówki jako nierozpuszczalną fazę ciągłą do emulgacji. Upewnij się, że granulka została usunięta przez pipetowanie lub stukanie/przesuwanie probówki. Następnie wirować z prędkością 3000 obr./min przez 30 sek.
    UWAGA: Ustawienie odpowiadające 3000 obr./min może się różnić w zależności od marki i modelu.
  4. Pozostawić emulsje na 1 minutę, aby opadły. Usunąć 100 μl dolnej fazy olejowej i zastąpić tę objętość świeżym 2% fluorosurfaktantem w oleju HFE. Delikatnie odwróć rurkę kilka razy, aby wymieszać. Powtórz 3-5 razy lub do momentu, gdy małe kropelki satelitarne zostaną usunięte.

3. Cyfrowa kropelka PCR i analiza.

  1. Po 2-5 minutach osiadania usuń dolną fazę olejową. Zastąp tę objętość 5% fluorosurfaktantem w oleju fluorowęglowym (np. FC-40).
  2. Używając końcówki do pipet o szerokim otworze, ostrożnie odpipetuj 100 μl próbki do probówek PCR o pojemności 200 μl. Umieść probówki PCR w termocyklerze i uruchom zgodnie z tabelą 2.
kroktemperaturaczas trwaniaNotatki
195 °CCzas trwania: 2 min
cyfra arabska95 °C30 sekund
350 °C90 sekund
472 °CCzas trwania: 60 s
5Powtórz kroki x34 od 2 do 4
672 °CCzas trwania: 2 min
74 °Ctrzymać

Tabela 2. Warunki termocyklingu dla cyfrowej kropelkowej PCR z wykorzystaniem emulsji PTE.

  1. Odpipetować próbkę na szkiełko liczące za pomocą końcówki pipety o szerokim otworze do obrazowania fluorescencyjnego. Zobrazuj próbkę za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego o długości fali wzbudzenia 490 nm i detekcji emisji 525 nm.
  2. Określić ilościowo dodatnie kropelki fluorescencyjne (Np) i całkowite krople (NT) w celu sprawdzenia obecności i obliczenia liczby cząsteczek matrycowych (λ) przy użyciu frakcji kropel dodatnich (Np / NT) i statystyk Poissona:
    figure-protocol-1
  3. Oblicz 95% przedział ufności (zc = 1,96) według wzoru:
    figure-protocol-2
  4. Obliczyć stężenie próbki (cząsteczki/μl) przy użyciu objętości (ν w μl) próbki dodanej w kroku 2.5, stosując równanie podane poniżej. Określić średnią i odchylenie standardowe stężenia próbki za pomocą kontrprób technicznych.
    figure-protocol-3

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Rysunek 2. Enkapsulacja próbki w kropelki za pomocą emulgacji szablonowej cząstek. (A) cząstki wzorcowe używane do emulgowania wzorców cząstek. (B) Oddzielenie osadu cząstki tymczasowej od supernatantu po odwirowaniu. (C) Kropelki powstałe w wyniku emulgacji z szablonami cząstek z (D) możliwą do zidentyfikowania powłoką wodną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

W PTE, monodyspersyjność emulsji jest podyktowana przez cząsteczki szablonowe, ponieważ kropelki mają średnicę nieco większą niż cząstki. W związku z tym jednorodne cząstki mają kluczowe znaczenie dla kontrolowanej enkapsulacji PTE11. Istnieje wiele metod generowania jednorodnych cząstek szablonowych, w tym metody chemiczne (zol-żel, polimeryzacja emulsyjna), hydrodynamiczne (emulgacja membranowa, homogenizacja) i filtracji. W szczególności podejścia mikroprzepływowe zapewniają doskonałą monodyspersyjność (Rysunek 2A) i pozwalają na dodatkową inżynierię cząstek w celu zwiększenia ich funkcjonalności w PTE12. Alternatywnie, można zakupić cząstki szablonowe, chociaż ich jednorodność, choć odpowiednia, jest zwykle mniejsza niż w przypadku generacji mikroprzepływowej11.

Aby wykonać PTE, cząstki są mieszane z próbką, która ma być zamknięta w kapsułkach (Rysunek 1A), a nadmiar supernatantu jest usuwany przez wirowanie i pipetowanie (Rysunek 1B), jak ilustruje zdjęcie osadu cząstek na dnie probówki do PCR (Rysunek 2B). Następnie dodaje się olej kapsułkujący zawierający stabilizujący środek powierzchniowo czynny ( Rysunek 1C), a próbkę delikatnie pipetuje się przed wirowaniem przez 30 sekund ( Rysunek 1D), w celu wytworzenia emulsji ( Rysunek 2C). Powstałe kropelki zawierają rdzeń cząstki i wodną powłokę składającą się z próbki początkowej, w której znajdują się odczynniki, cząsteczki docelowe i komórki niezbędne do reakcji (Rysunek 2D). Podobnie jak w przypadku hermetyzacji mikroprzepływowej kropelkowej, dyskretne jednostki, takie jak małe kulki lub komórki, są zamykane losowo i zgodnie z rozkładem Poissona, chociaż prawie wszystkie kropelki zawierają cząstkę szablonową ze względu na naturę fizyki PTE.

figure-results-2
Rysunek 3. Identyfikacja i oczyszczanie kropelek emulgujących z szablonami cząstek. (A) Przykład niejednorodnego wytwarzania kropel z wieloma cząstkami na kroplę w wyniku niewystarczającego wirowania. (B) Spodziewana obecność satelitów i kropel po emulgacji z szablonem cząstek oraz (C) frakcjonowanie wody w oleju. (D) Emulsja otrzymana po przepłukaniu olejem. (E) Nadmierna generacja satelitarna wynikająca z pozostałości supernatantu podczas emulgowania z szablonami cząstek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Nawet w udanym PTE, istnieją kropelki dwu- lub trzyrdzeniowe, chociaż zazwyczaj mają one znikomy wpływ na reakcję, pod warunkiem, że są rzadkie. Osiągnięcie niskiej częstotliwości kropel wielordzeniowych przy zachowaniu odpowiednich powłok wymaga optymalizacji parametrów procesu, w tym napięcia powierzchniowego, sił adhezji między cząsteczkami, lepkości próbki, wielkości pojemnika oraz mocy i czasu wirowania. Na przykład, słabo zoptymalizowana emulgacja może zawierać polirozproszone kropelki z wieloma cząstkami szablonowymi (Rysunek 3A), co wskazuje, że wirowanie było niewystarczające do pełnej emulgacji próbki. W takich przypadkach można dodać detergenty w celu zmniejszenia przyczepności między cząsteczkami i obniżenia napięcia powierzchniowego lub zwiększyć moc wirowania lub czas. Innym częstym problemem jest generowanie nadmiernej ilości satelitów, które są małymi pustymi kropelkami (Rysunek 3B). Obecność satelitów w emulsjach PTE może być nieunikniona, w zależności od napięcia międzyfazowego i właściwości reologicznych próbki i oleju nośnego. Jednak często wynikają one z nieodpowiedniego usunięcia nadmiaru próbki przed emulgacją (Rysunek 2B) lub wirowania ze zbyt dużą mocą, zdzierając muszle z kropel. W udanej emulgacji PTE satelity powinny stanowić nie więcej niż ~10% całkowitej objętości próbki w kapsułki (Rysunek 3C)11. Na tym poziomie zwykle w znikomy sposób przyczyniają się do reakcji i można je zignorować. Ze względów estetycznych można je usunąć z emulsji, przemywając je świeżym olejem (Rysunek 3D).

figure-results-3
Rysunek 4. Ocena emulgacji emulgacji cząstkowej metodą digital droplet PCR. (A) Obrazowanie fluorescencyjne kropel identyfikuje krople fluorescencyjne dodatnie i krople ujemne niefluorescencyjne. (B) Identyfikacja rzadkiej matrycy lub niskich stężeń matrycy za pomocą cyfrowej kropelkowej reakcji PCR. (C) Nadmierna obfita enkapsulacja matrycy, w wyniku której powstaje zmienna liczba cząsteczek matrycowych na kroplę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby zademonstrować użyteczność PTE, użyliśmy go do przeprowadzenia cyfrowego PCR11. Korzystając z tego procesu, zamknęliśmy w kapsułkach próbkę zawierającą genomowe DNA S. cerevisiae i poddaliśmy ją termocyklowi. W cyfrowym PCR kropelki zawierające amplifikowane cele stają się fluorescencyjne, podczas gdy te bez nich pozostają przyciemnione. W ten sposób kropla fluorescencyjna wskazuje cel, umożliwiając bezpośrednie określenie ilościowe celów poprzez zliczenie dodatnich kropel (Rysunek 4A). Liczba kropelek fluorescencyjnych skaluje się zatem wraz z cząsteczkami docelowymi, dając niewiele dodatnich, gdy cel jest rzadki (Rysunek 4B) i wiele, gdy jest obfity (Rysunek 4C). Podobnie jak w przypadku enkapsulacji innych dyskretnych składników, enkapsulacja docelowa przebiega zgodnie z rozkładem Poissona, co pozwala na przekształcenie dodatniej frakcji kropelki w docelowe stężenie (Rysunek 4D), demonstrując w ten sposób zdolność do wykonywania cyfrowego PCR za pomocą PTE11.

figure-results-4
Rysunek 5. Demonstracja cyfrowej reakcji PCR metodą kropelkową z wykorzystaniem dostępnego na rynku PAA. (A) Obrazowanie fluorescencyjne kropel identyfikuje ujemne krople niefluorescencyjne. (B) Identyfikacja niskich stężeń matrycy za pomocą cyfrowego PCR kropelkowego. (C) Identyfikacja wysokich stężeń matrycy za pomocą cyfrowego PCR kropelkowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Te wyniki są powtarzalne przy użyciu komercyjnie dostępnych cząstek poliakrylamidu (Rysunek 5) i pokazują zdolność PTE do wykonywania standardowego cyfrowego PCR z dostępnymi na rynku cząstkami poliakrylamidu, osiągając dokładne pomiary w tym samym zakresie.

Plik uzupełniający. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PTE wykorzystuje cząstki do kapsułkowania próbek w monorozproszonych kropelkach poprzez wirowanie. Oprócz prostoty i dostępności, PTE zapewnia kilka dodatkowych korzyści, w tym umożliwia natychmiastowe generowanie dużych ilości kropel. Co więcej, proces może być prowadzony w izolowanej probówce, co eliminuje potrzebę przenoszenia próbek do urządzeń mikroprzepływowych, usprawnia ogólny przepływ pracy i ogranicza możliwości zanieczyszczenia lub utraty próbki. Cząstki szablonowe zapewniają również środki, za pomocą których można zaprojektować zawartość wynikowych reakcji kropelkowych. Na przykład wielkość cząstek, skład chemiczny i zwilżalność można zaprojektować w celu ukierunkowanego wychwytywania biomolekuł lub komórek, podczas gdy ugrupowania funkcjonalne, takie jak enzymy, substancje czynne lub kwasy nukleinowe, mogą być wyświetlane na cząstek, aby ułatwić reakcje, takie jak sekwencjonowanie pojedynczych komórek lub charakterystyka funkcjonalna. Chociaż podejście to jest elastyczne, istnieją jednak istotne ograniczenia w jego stosowaniu. Na przykład obecnie nie jest możliwe przeprowadzenie addycji kropelk, jak to często ma miejsce w przypadku mikrofluidyki, co wymaga wprowadzenia wszystkich składników reakcji przed enkapsulacją; Wymaga to, aby odczynniki były kompatybilne i stabilne do momentu wytworzenia kropel, a w przypadku kłopotliwych kombinacji często można rozwiązać problem poprzez szybkie mieszanie i emulgowanie próbki na lodzie. Alternatywnie można zastosować komponenty reaktywne, które mogą być wyzwalane zewnętrznie za pomocą światła lub ciepła13. W ten sposób PTE zapewnia elastyczną i skalowalną metodę przeprowadzania testów kropelkowych dostępną dla osób niebędących ekspertami. To, w połączeniu z wrodzoną prostotą i elastycznością, sprawia, że PTE idealnie nadaje się do wykonywania i opracowywania wielu aplikacji kropelkowych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca nad opracowaniem tego protokołu była wspierana przez National Institutes of Health (R01-EB019453-02), Biuro Dyrektora Wywiadu Narodowego, Działalność Zaawansowanych Projektów Badawczych Wywiadu poprzez Raytheon BBN Technologies Corp (N66001-18-C-4507), Chan-Zuckerberg Biohub Investigator Program, Defense Advanced Research Projects Agency przez Texas A&M University (W911NF1920013) oraz Centers for Disease Control and Prevention przez Johns Hopkins Uniwersyteckie Laboratorium Fizyki Stosowanej (75D30-11-9C-06818 (CDC3)). Poglądy i wnioski zawarte w niniejszym dokumencie są poglądami autorów i nie powinny być interpretowane jako reprezentujące oficjalną politykę, wyrażoną lub dorozumianą, powyższych organizacji lub rządu Stanów Zjednoczonych. Rząd Stanów Zjednoczonych jest upoważniony do powielania i rozpowszechniania przedruków do celów rządowych, niezależnie od wszelkich zawartych w nich adnotacji o prawach autorskich.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Filtr strzykawkowy 0,22 umMilipore Sigma SLGP033RS
0,5M EDTA, pH 8,0Thermo-Fisher15575020
0,75 mmWorld Precision Instruments504529
strzykawki 1 mlBD309628
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO)Sigma-Aldrich370533
1M Tris-HCI, pH 8,0Thermo-Fisher15568025
Igły o rozmiarze 27305109
3-calowe wafle silikonowe, typ P, dziewicza klasa testowaUniversity Wafers447
Drukowany w 3D uchwyt strzykawki wirówkowej(niestandardowy)(niestandardowy)
Roztwór akrylamidu, 40%, do elektroforezy, sterylnie filtrowanySigma-AldrichA4058-100ML
Nadsiarczan amonuSigma-AldrichA3678-25G
Aquapel (fluorowana obróbka powierzchni)Pittsburgh Glass Works47100
HeksanSigma-Aldrich139386
FC-40Sigma-AldrichF9755
IzopropanolSigma-Aldrich109827
N,N′-Methylenebis(akrylamid)Sigma-Aldrich146072-100G
NaClSigma-AldrichS9888
Novec-7500 Płyn inżynieryjny (olej HFE)3M98-0212-2928-5
rurki polietylenoweTowary naukoweB31695-PE/2
fluorosurfaktantRan Biotechnologies008-FluoroSurfaktant
Programista PGMEASigma-Aldrich484431
FotomaskiCadArt Servcies(niestandardowe)
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)Applied Biosystems4464263
Powlekarkawirowa Specjalistyczne systemy powłokoweG3P-8
Rozpiętość 80 (monooleinian sorbitanu)Sigma-Aldrichs6760
SU-8 3025 fotorezystorKayaku17030192
Triton X-100 (etoksylowany oktylofenol)Sigma-Aldricht8787
Tween 20 (polisorbat 20)Sigma-Aldrichp2287
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)Applied Biosystems4464263
Drożdże FWDIDT5′-GCAGAGAGACCAGAACAAA-3′
Drożdże REVIDT5′-ACACGTATGTATCTAGCCGAATA
AC-3
Sonda drożdżowaIDT5′-/56-FAM/ATATGTTGT/ZEN/TCACTCGCGCCTGGG/3IABk
FQ/-3′
EVOS FL AUTOLife Technologies Kostka
LED EVOS, GFPLife Technologies 
ZESTAW SYLGARD 184 1,1 LB (odczynniki bazowe i utwardzające PDMS)  Dow CorningDC4019862
TEMEDThermo Fisher17919
Saccharomyces cerevisiae genomic DNAMilipore69240-3
Ekspandowany środek do czyszczenia plazmy (spawarka plazmowa)Harrick PlasmaPDC-002 (230V)
Dziurkacz do biopsji BD Olej fluorowany AMEP4651

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. Droplet microfluidics: A tool for biology, chemistry, and nanotechnology. Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).
  2. Gielen, F., et al. Ultrahigh-throughput-directed enzyme evolution by absorbance-activated droplet sorting (AADS). Proceedings of the National Academy of Sciences of USA. 113 (47), 7383-7389 (2016).
  3. Mai, S., Murphy, T. W., Lu, C. Microfluidics for genome-wide studies involving next generation sequencing. Biomicrofluidics. 11 (2), 021501(2017).
  4. Olmedillas-López, S., García-Arranz, M., García-Olmo, D. Current and emerging Applications of Droplet Digital PCR in Oncology. Molecular Diagnosis and Therapy. 21 (5), 493-510 (2017).
  5. Tong, Y., Shen, S., Jiang, H., Chen, Z. Application of Digital PCR in Detecting Human Diseases Associated Gene Mutation. Cellular Physiology and Biochemistry. 43 (3), 1718-1730 (2017).
  6. Yan, Y., et al. Evaluation of droplet digital PCR for non-invasive prenatal diagnosis of phenylketonuria. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (27), 7115-7126 (2019).
  7. Shang, L., Cheng, Y., Zhao, Y. Emerging Droplet Microfluidics. Chemical Reviews. 117 (12), 7964-8040 (2017).
  8. The, S., Lin, R., Hung, L., Lee, A. P. Droplet Microfluidics. Lab Chip. 8 (2), 198-220 (2008).
  9. Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nature Methods. 9, 541-544 (2012).
  10. Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing. Molecular Cell. 58 (4), 610-620 (2015).
  11. Hatori, M. N., Kim, S. C., Abate, A. R. Particle-Templated Emulsification for Microfluidics-Free Digital Biology. Analytical Chemistry. 90 (16), 9813-9820 (2018).
  12. Panda, P., et al. Stop-flow lithography to generate cell-laden microgel particles. Lab Chip. 8 (7), 1056-1061 (2008).
  13. Yozwiak, C. E., Hirschhorn, T., Stockwell, B. R. Towards a microparticle-based system for pooled assays of small molecules in cellular contexts. ACS Chemical Biology. 13 (3), 761-771 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cyfrowa PCR kroplowakrople monodyspersyjnecz steczki poliakrylamidusfery hydro eloweemulsyfikacja w wir wceenkapsulacja pr bkiobrazowanie fluorescencyjneusuwanie surfaktantu

Powiązane artykuły