Technika sterylnych owadów (SIT) jest używana do kontrolowania określonych, ważnych z medycznego punktu widzenia populacji komarów, które mogą być odporne na chemiczne kontrole. W tym miejscu opisujemy metodę masowego chowu i przygotowania bezpłodnych samców komarów do wypuszczenia na wolność w operacyjnym programie SIT ukierunkowanym na komara Aedes aegypti.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie napromieniowanych i oznakowanych samców komarów Aedes aegypti do uwolnienia w operacyjnym programie techniki sterylnych owadów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kontrola takich chorób ludzkich jak denga, Zika i chikungunya opiera się na kontroli ich wektora, komara Aedes aegypti, ponieważ nie ma żadnej prewencji. Zwalczanie komarów-wektorów może opierać się na środkach chemicznych stosowanych w stadiach niedojrzałych i dorosłych, co może przyczyniać się do śmiertelności zwierząt niebędących celami, a co ważniejsze, prowadzić do odporności wektora na środki owadobójcze. Technika sterylnych owadów (SIT) to metoda kontrolowania populacji szkodników poprzez wypuszczanie wysterylizowanych dorosłych samców, które kojarzą się z dzikimi samicami, aby uzyskać niezdolne do życia potomstwo. W artykule opisano proces produkcji bezpłodnych samców do wykorzystania w operacyjnym programie SIT do zwalczania komarów Aedes aegypti. Poniżej przedstawiono kroki stosowane w programie, w tym hodowlę i utrzymanie kolonii, oddzielanie poczwarek płci męskiej i żeńskiej, napromienianie i znakowanie dorosłych samców oraz wysyłkę samców Aedes aegypti do miejsca uwolnienia. Omówiono również zastrzeżenia proceduralne, ograniczenia programu i przyszłe cele.
Wprowadzenie
Przenoszenie patogenów przenoszonych przez komary na ludzi powoduje miliony przypadków chorób i zgonów każdego roku na całym świecie. Wobec braku skutecznych, zatwierdzonych szczepionek przeciwko chorobom przenoszonym przez komary, takim jak Zika czy gorączka denga, jednym z najskuteczniejszych sposobów ograniczenia transmisji jest zmniejszenie populacji komarów będących wektorami choroby. Irytujące jest to, że coraz więcej gatunków komarów, tradycyjnie będących celem pestycydów, wykazuje coraz wyższy poziom odporności na pestycydy1. Jednocześnie agencje rządowe agresywnie wyrejestrowały lub zakazały stosowania wcześniej zatwierdzonych pestycydów i opracowywanych jest niewiele nowych, skutecznych środków kontroli chemicznej2,3. Ta konstelacja przeszkód w zwalczaniu komarów zmotywowała do zbadania alternatywnych technik niechemicznych w celu zmniejszenia populacji komarów.
Niektóre gatunki komarów stanowią wyzwanie dla problemów z odpornością i rejestracją pestycydów. Aedes aegypti (L.) jest wybitnym komarem wektorem choroby, który jest niezwykle trudny do zwalczania za pomocą tradycyjnego zintegrowanego zarządzania wektorami ze względu na tajemnicze siedlisko okołodomowe wykorzystywane przez ten gatunek do niedojrzałego rozwoju i odpoczynku dorosłego osobnika4,5. Wyzwania związane z eksploatacją tajemniczych siedlisk wokół rezydencji obejmują trudności w dotarciu do tych miejsc za pomocą technik opryskiwania pestycydami, a także potencjalny brak akceptacji społeczeństwa dla powtarzającego się dostępu do prywatnej własności dla agencji zdrowia publicznego zajmujących się kontrolą wektorów w celu prowadzenia intensywnych działań w zakresie nadzoru i kontroli, które mają kluczowe znaczenie dla skutecznego zintegrowanego zarządzania wektorami (IVM) dla tego gatunku.
Na szczęście, SIT, podejście, które okazało się skuteczne w długotrwałym zwalczaniu innych bardzo trudnych gatunków owadów6, jest stosowane do problemu Aedes aegypti w przełomowej serii eksperymentów i prób operacyjnych w St. Augustine na Florydzie (dane niepublikowane przez KJL, RLA, SCB). SIT został zastosowany do wielu gatunków owadów, w tym komarów, i został dogłębnie sprawdzony7,8. SIT wykorzystuje masowe uwalnianie samców hodowanych w koloniach, wysterylizowanych, na przykład przez wystawienie na promieniowanie jonizujące lub chemikalia, aby przytłoczyć wybór partnera w naturalnych populacjach samic. Wysterylizowane samce, które kojarzą się z dzikimi samicami, sprawiają, że jaja stają się bezpłodne z powodu uszkodzeń doznanych przez męskie gamety, a jeśli są obecne w wystarczającej liczbie, mogą teoretycznie rozbić naturalną populację Aedes aegypti.
Program SIT został zainicjowany w celu zmniejszenia populacji Aedes aegypti w obszarze miejskim na wybrzeżu Atlantyku na Florydzie, gdzie gatunek ten niedawno ponownie skolonizował i rozprzestrzenia się, stanowiąc zagrożenie dla zdrowia publicznego dla przenoszenia wirusów takich jak Zika, denga czy chikungunya. Aby zmaksymalizować potencjał kompatybilności z dzikimi samicami, założono nową kolonię przy użyciu dziko złowionych Aedes aegypti z populacji docelowej w celu wyprodukowania samców dla programu9. Opierało się to na hipotezie, że lokalnie pochodzące, hodowane w koloniach samce będą bardziej skłonne do konkurowania z lokalnymi dzikimi samcami w kojarzeniu się z lokalnymi dzikimi samicami. Aby SIT był skuteczny, nie tylko przytłaczająca liczba bezpłodnych samców musi być obecna na obszarze docelowym, ale także muszą być zdolne do skutecznego zalecania się i kojarzenia z lokalnymi dzikimi samicami komarów.
Przeprowadzono serię eksperymentów w celu określenia optymalnej liczby bezpłodnych samców do uwolnienia (dane niepublikowane KJL, RLA, SCB), jak również optymalnych dawek promieniowania, które uczyniłyby samce bezpłodnymi, nie ingerując w przeżycie, zachowanie lub akceptację przez dzikie samice (dane niepublikowane przez KJL, RLA, SCB). Dane te zostaną wkrótce opublikowane w publikacjach tej grupy, ale niektóre z tych ustaleń zostały również ujęte w tym protokole i mogą być wykorzystane jako punkt wyjścia dla nowych programów kontrolnych SIT Aedes aegypti w innych miejscach. Gatunek ten stale poszerza swój zasięg, a programy SIT są bardzo obiecujące, aby być opłacalnymi, długoterminowymi rozwiązaniami do kontrolowania tej populacji. Celem tego protokołu jest produkcja wysterylizowanych, samców, hodowanych w koloniach komarów Aedes aegypti w celu systematycznego wypuszczania na tereny zewnętrzne w celu zakłócenia naturalnych cykli rozrodczych lokalnych populacji Aedes aegypti w ramach operacyjnego programu kontroli wektorów zdrowia publicznego.
Chociaż podobne protokoły i przepływy pracy zostały opublikowane dla produkcji transgenicznych samców Aedes aegypti i przepływy pracy dla Aedes SIT, lub programy niekompatybilności oparte na Wolbachii zostały opublikowane gdzie indziej, ten protokół ilustruje, jak istniejące protokoły zostały zaadaptowane dla Aedes aegypti Produkcja, separacja i napromienianie poczwarek samców, znakowanie i pakowanie dorosłych samców oraz wysyłka do miejsca wydania dla tego programu9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Element znakowania tego protokołu może nie być wymagany w dojrzałym operacyjnym programie SIT; jednak został on uwzględniony tutaj, ponieważ jest to jeden ze sposobów monitorowania skuteczności i kontrolowania jakości całego procesu we wczesnych latach tworzenia programu SIT. Programy zwalczania komarów są zazwyczaj prowadzone przez władze lokalne, więc mogą się znacznie różnić w wielu aspektach swojej organizacji, od wielkości i bazy finansowania po dostrajanie taktyk kontroli w celu maksymalizacji lokalnego sukcesu. W związku z tym protokół opisany w niniejszym dokumencie powinien zostać oceniony pod kątem kompatybilności z dostępnymi zasobami.
Protokół
UWAGA: Niniejszy protokół jest specyficzny dla obchodzenia się z Aedes aegypti, lecz może zostać zmodyfikowany w celu zastosowania go u innych gatunków komarów.
1. Produkcja i utrzymanie kolonii Aedes aegypti
- Hodowla dorosłych osobników Aedes aegypti i pozyskiwanie jaj.
- Przygotować dużą klatkę hodowlaną o wymiarach 0,6 m x 0,6 m x 0,6 m ze składanym aluminiowym stelażem, z siatką z włókna szklanego o oczkach 20 x 20 oraz rękawem z tkaniny dzianinowej na jednej z pionowych ścian.
- W każdej klatce hodowlanej umieścić plastikowy pojemnik o pojemności 1900 mL z poczwarkami Aedes aegypti (stosunek płci 1:1), zawiązać rękaw i pozostawić pojemniki do czasu wyklucia się wszystkich dorosłych osobników (tj. przez około 4 dni). Po tym czasie usunąć pojemniki i utrzymywać klatki z dorosłymi osobnikami w temperaturze 28-30 °C, wilgotności względnej (Rh) >50% oraz cyklu światło:ciemność (L:D) 12:12 lub 14:10.
UWAGA: Produkcja poczwarek Aedes aegypti została opisana w sekcji 1.2. Zagęszczenie poczwarek w pojemniku 1900 mL powinno być takie, aby wszystkie poczwarki miały wystarczająco dużo miejsca, by jednocześnie wypłynąć na powierzchnię po powietrze. - Dwadzieścia cztery godziny po umieszczeniu poczwarek w klatkach hodowlanych, wstawić pojemnik z 10% roztworem sacharozy z knotem z gąbki oraz zawiesić na drucianym haczyku gąbkę o wymiarach 10 cm x 2 cm nasączoną miodem, aby zapewnić dorosłym komarom oddzielne źródła nawodnienia i pożywienia. Monitorować gąbki i pojemnik z sacharozą pod kątem wysychania lub wzrostu pleśni i w razie potrzeby uzupełniać lub wymieniać.
UWAGA: W małych klatkach hodowlanych należy używać plastikowego kubka o pojemności 120 mL z knotem z gąbki 10 cm x 2 cm przeprowadzonym przez wycięcie w pokrywce, a w dużych klatkach plastikowego kubka 460 mL z knotem z gąbki 12 cm x 8 cm. - Zapewnić posiłek krwi w każdej klatce hodowlanej 48-72 h po wykluciu się większości dorosłych osobników, a następnie co 2-3 dni, aby utrzymać wysoką liczbę nakarmionych krwią samic i zmaksymalizować wydajność jaj. Napełnić kondom z jagnięcej skóry 50-100 mL defibrynowanej krwi bydlęcej i podgrzać do około 37 °C w łaźni wodnej. Następnie za pomocą ściereczki lub ręcznika papierowego osuszyć kondom i umieścić go na wyłożonej papierem płytce Petriego wewnątrz klatki na 30-60 min.
UWAGA: Przed użyciem przepłukać wnętrze i zewnętrzną stronę każdego kondoma wodą 2-3 razy w celu usunięcia lubrykantów lub innych substancji oraz sprawdzić, czy nie ma dziur. Kondomy można ponownie wykorzystać podczas 3-5 karmień, wypłukując krew i przechowując je w kubku z chłodną wodą. Ponieważ w niektórych koloniach mogą wystąpić infestacje mrówek, kondomy mogą wymagać zawieszenia w celu ograniczenia dostępu. - Odczekać 48-72 h po każdym karmieniu krwią, a następnie wprowadzić kubek do składania jaj do każdej klatki hodowlanej dorosłych osobników. Przygotować kubki do składania jaj, wlewając 200 mL przefiltrowanej wody z poczwarkami (tj. wody, w której hodowano larwy i poczwarki) do plastikowego kubka o pojemności 460 mL, w którym umieszczono arkusz papieru do kiełkowania nasion (papier do składania jaj) o wymiarach 8-10 cm wysokości x 30 cm szerokości, dopasowany ściśle do wewnętrznej obwodu kubka. Codziennie sprawdzać papiery do składania jaj, wymieniać je co 2-4 dni i ostrożnie przechowywać papiery z jajami, pozostawiając je do wyschnięcia przez 24-48 h przy Rh >50%19.
UWAGA: Pozostawić kubki do składania jaj w klatkach hodowlanych nie dłużej niż przez 72 h, aby zapobiec wykluciu się jaj. - Utrzymywać klatki hodowlane z dorosłymi osobnikami przez maksymalnie 3-4 tygodnie przed ich demontażem i ustawieniem nowych klatek.
- Aby zdemontować klatkę hodowlaną, należy usunąć i wyczyścić kubek do składania jaj, przechować papier do składania jaj z jajami, usunąć i wyczyścić pojemnik z roztworem sacharozy oraz gąbkę z miodem, a następnie zamrozić klatkę, aby zabić wszystkie komary.
- Usunąć wszystkie ciała komarów i dokładnie wyczyścić wnętrze oraz zewnętrzną stronę każdej klatki za pomocą rozcieńczonego mydła i wody, używając ręczników papierowych oraz gąbek szorstkich. Pozostawić czystą klatkę do wyschnięcia przez co najmniej 24 h przed użyciem jej w kolejnym cyklu hodowlanym.
UWAGA: Używać sprzętu próżniowego wyposażonego w wysokowydajną filtrację, aby usunąć cząstki, które mogą wywołać alergie. Pojemniki na roztwór sacharozy można czyścić i ponownie wykorzystywać 3-5 razy.
- Hodowla larw Aedes aegypti z jaj
- Przygotować zapas odżywczej zawiesiny dla larw, mieszając 80 g proszku z wątroby bydlęcej i drożdży piwowarskich w stosunku 3:2 w 2200 mL wody z kranu. Przygotować sproszkowany pokarm dla ryb. Wsypać płatki dla ryb do młynka do przypraw i mielić, aż powstanie drobny proszek.
UWAGA: Ta zawiesina jest w tym laboratorium oznaczona jako brown . - Używając papieru do składania jaj z jajami (5 000-10 000 jaj) z kroku 1.1.5, wyciąć fragment papieru o szerokości 3-7 cm prostopadle do linii składania jaj i umieścić go w pojemniku o pojemności 460 mL wypełnionym w połowie wodą z kranu wraz ze szczyptą sproszkowanych płatków pokarmu dla ryb. Przykryć i energicznie wstrząsać przez co najmniej 1 min.
UWAGA: Papier z jajami musi być przechowywany przez co najmniej 7 dni (ale nie więcej niż 90 dni, co może zmniejszyć wylęgnąłość) po złożeniu jaj przed rozpoczęciem procesu wylegania, aby umożliwić embriogenezę. Bakterie i glony obecne w pokarmie dla ryb szybko odtleniają wodę, co stymuluje rozwój larwalny. - Wlać całą zawartość pojemnika z kroku 1.2.2 do kuwety do hodowli larw przygotowanej z 3 L wody z kranu i 50 mL zawiesiny brown . Oznaczyć kuwetę datą rozpoczęcia, informacją o szczepie, harmonogramem karmienia zgodnie z Tabelą 1 i przechowywać w temperaturze 28-30 °C, Rh >50% oraz cyklu L:D 12:12 lub 14:10.
UWAGA: Stosunek 3 L wody do 50 mL zawiesiny brown opiera się na głębokości wody w konkretnych kuwetach dla larw wymienionych w Tabeli Materiałów. Kuwety o różnych rozmiarach będą pozwalać na różną gęstość poczwarek, a zatem wymagają różnych ilości wody i zawiesiny brown . Szybkość karmienia larw w Tabeli 1 podana jest jako zakres; wybór ilości zależy od doświadczenia i oceny ogólnego stanu zdrowia rozwijających się larw przy użyciu takich zmiennych jak mętność wody, kolor i zapach; obecność filmu bakteryjnego na wodzie; liczba lub stosunek larw żywych do martwych oraz ruchliwość larw. W dniach od 3 do 6 karmić niedojrzałe komary sproszkowanym pokarmem dla ryb zgodnie z Tabelą 1. Dodawanie wody, ograniczanie ilości pokarmu oraz przygotowanie 2-3 dodatkowych kuwet ponad zapotrzebowanie projektu to sposoby zarządzania niezdrowymi kuwetami z larwami.
- Przygotować zapas odżywczej zawiesiny dla larw, mieszając 80 g proszku z wątroby bydlęcej i drożdży piwowarskich w stosunku 3:2 w 2200 mL wody z kranu. Przygotować sproszkowany pokarm dla ryb. Wsypać płatki dla ryb do młynka do przypraw i mielić, aż powstanie drobny proszek.
| Dzień | Objętość dodanej zawiesiny odżywczej | Objętość dodanej wody | Działania |
| 1 | 50 ml (zawiesina) | 3000 ml | |
| 2 | (bez pożywki) | (bez wody) | |
| 3 | 1/4 – 1/2 łyżeczki (sproszkowanej karmy dla ryb) | 500-1000 mL | |
| 4 | 1/2 - 3/4 łyżeczki (sproszkowanej karmy dla ryb) | 500-1000 ml | |
| 5 | 1/2 - 3/4 łyżeczki (sproszkowana karma dla ryb) | 500-1000 ml | |
| 6 | 1/4 – 1/2 łyżeczki (sproszkowanej karmy dla ryb) | 500-1000 ml | |
| 7 | (bez pożywki) | (bez wody) | szczepy poczwarek i larw |
Tabela 1: Harmonogram karmienia w masowej hodowli Aedes aegypti larwy.
2. Oddzielanie poczwarek samców Aedes aegypti
- Skoncentruj poczwarki z pan z larwami. Po osiągnięciu przybliżonej proporcji progowej poczwarek, przelej zawartość każdej pan przez sito (rozmiar 20-40). Użyj butelki zmywaka z wodą z kranu, aby wypłukać poczwarki i larwy z sita do plastikowego zlewka pomiarowego o pojemności 3000 mL.
UWAGA: Do każdego zlewka 3000 mL należy przenieść tylko 2-3 pan z larwami, aby uniknąć przepełnienia, co pozwoli poczwarkom swobodnie dotrzeć do powierzchni. Przewiduje się, że poczwarki rozwiną się między 130-140 h po wykluciu z jaj w temperaturze i warunkach oświetlenia wspomnianych w kroku 1.2.3. Zauważalne wykluwanie się jaj powinno nastąpić w tym samym dniu, w którym jaja zostały przygotowane. W zależności od warunków środowiskowych, około 20-70% larw przepoczwarzy się i będzie gotowych do przesiewania w ciągu 6 dni. Podział poczwarek na kilka zlewków o pojemności 3000 mL zapewnia objętości możliwe do łatwego przelania do separatora. - Oddziel poczwarki samców od larw i poczwarek samic.
UWAGA: Ten krok może być wykonany przez jednego lub dwóch operatorów.- W przypadku jednego operatora oddzielającego poczwarki samców:
- Podziel zawartość każdego zlewka 3000 mL przygotowanego w kroku 2.1 do kilku plastikowych pojemników o pojemności 1900 mL, aby zredukować ryzyko rozlania i przeciążenia separatora. Przygotuj separator płytek, umieszczając sztywny, płytki pojemnik zbiorczy o pojemności 4000 mL pod rynną u podstawy separatora (Rycina 1). Napełnij dwa plastikowe zlewki pomiarowe 3000 mL wodą z kranu do około ¾ wysokości.
UWAGA: Jako alternatywę dla zlewków pomiarowych 3000 mL można użyć węża zlewozmywakowego. W przeciwnym razie zlewki będą wymagały ciągłego napełniania w trakcie procesu separacji. Dodatkowe szczegóły dotyczące obsługi separatora poczwarek znajdują się w literaturze12,20. - Wlej wodę w przestrzeń między szklanymi płytkami i reguluj górne oraz dolne pokrętła zgodnie lub przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, aby umożliwić ciągły przepływ wody, jednocześnie tworząc lustro wody o wysokości około 1,25 cm od podstawy płytek. Zaznacz taśmą pozycje początkowe dolnych pokręteł. Gdy woda zostanie równomiernie rozłożona u podstawy szklanych płytek z taką samą wysokością i prędkością odpływu, zacznij wlewać zawartość pojemników z poczwarkami i larwami w przestrzeń między płytkami.
UWAGA: Między małymi (samce) a dużymi (samice) poczwarkami powinna wystąpić wyraźna separacja; w przeciwnym razie przepłucz tę partię i wyreguluj górne pokrętła, aby zmniejszyć odstęp między płytkami. - Powoli wlewając wodę przez separator, stale obracaj dolne pokrętła parami przeciwnie do ruchu wskazówek zegara o ok. 1-2 cm od zaznaczonej taśmą pozycji początkowej, aż większość lub wszystkie larwy zostaną wypłukane i spłyną rynną do pojemnika zbiorczego.
UWAGA: Podczas gdy jedna ręka wlewa wodę, druga ręka obraca pokrętła pojedynczo, ale równomiernie i w małych przyrostach, aby powoli otwierać płytki. Większość larw zostaje szybko wypłukana, jednak niektóre z nich mogą utknąć wraz z poczwarkami samców. Te spóźnione larwy zostaną napromieniowane, ale ich rozwój będzie opóźniony i nie wyklują się do postaci dorosłej wraz z główną kohortą poczwarek. - Wyrzuć larwy lub zwróć je do kolonii, ale w obu przypadkach usuń je z pojemnika zbiorczego, zanim poczwarki samców zaczną spływać przez separator. Wstrzymaj proces, przerywając przepływ wody, podczas gdy larwy z pojemnika zbiorczego u podstawy rynny są usuwane poprzez przesiewanie przez sito #30, a następnie płukanie wsteczne do osobnego pojemnika.
UWAGA: Najpierw wypływają larwy, następnie poczwarki samców, a na końcu samice (Rycina 1). - Kontynuuj wlewanie wody i obracanie dolnych pokręteł, aż larwy zostaną wypłukane i oddzielone do pojemnika zbiorczego. Wstrzymaj proces, aby sprawdzić i usunąć larwy z pojemnika zbiorczego przed przeniesieniem poczwarek samców w następnym kroku.
UWAGA: Liczba niezbędnych przepłukań do oddzielenia samców zależy od tempa wlewania wody i szybkości obracania pokręteł. Zazwyczaj potrzeba 2000-2500 mL wody do wypłukania larw, 1000-1500 mL do wypłukania poczwarek samców i 200-400 mL do wypłukania poczwarek samic. - Wylej poczwarki samców z pojemnika zbiorczego przez sito #20 do zlewozmywaka. Użyj butelki zmywaka 1000 mL z wodą z kranu, aby wypłukać poczwarki samców z sita, wlewając je do osobnego pojemnika 1900 mL.
- Po oddzieleniu wszystkich poczwarek samców kontynuuj wlewanie wody przez separator i wyreguluj dolne pokrętła, aby wypłukać poczwarki samic. Przenieś samice, korzystając z procesu przesiewania opisanego w kroku 2.2.1.6, do osobnego pojemnika, aż wszystkie niedojrzałe komary zostaną wypłukane z separatora. Wyrzuć poczwarki samic. Po przetworzeniu partii przywróć pokrętła do ich oryginalnych pozycji początkowych i powtórz proces z kolejną partią. Po przetworzeniu wszystkich partii pozostaw płytki otwarte, aby separator mógł wyschnąć.
UWAGA: Przy użyciu tego urządzenia nie można osiągnąć idealnej separacji, co wymaga cierpliwości i wprawy. Uporczywe poczwarki lub larwy można usunąć silnym strumieniem wody, jednak nie tak mocnym, by wypchnąć je na boki, co mogłoby zanieczyścić przyszłe przepłukiwania.
- Podziel zawartość każdego zlewka 3000 mL przygotowanego w kroku 2.1 do kilku plastikowych pojemników o pojemności 1900 mL, aby zredukować ryzyko rozlania i przeciążenia separatora. Przygotuj separator płytek, umieszczając sztywny, płytki pojemnik zbiorczy o pojemności 4000 mL pod rynną u podstawy separatora (Rycina 1). Napełnij dwa plastikowe zlewki pomiarowe 3000 mL wodą z kranu do około ¾ wysokości.
- W przypadku dwóch operatorów oddzielających poczwarki samców, zmodyfikuj sekcję 2.2.1 w następujący sposób:
- Pierwszy operator: Wlewa wodę przez separator i stopniowo obraca pokrętłami, aby oddzielić larwy, poczwarki samców i poczwarki samic.
- Drugi operator: Po zebraniu każdego stadium w pojemniku rynnowym, przesiewa zawartość pojemnika rynnowego, aby podzielić larwy, poczwarki samców i poczwarki samic do wielu osobnych pojemników zbiorczych rynny. Utrzymuj duże zlewki wypełnione wodą, jeśli wąż zlewozmywakowy nie jest dostępny.
- W przypadku jednego operatora oddzielającego poczwarki samców:
Rycina 1: Separator poczwarek zawierający partię niedojrzałych Aedes aegypti. Separację rozpoczyna się poprzez wlewanie wody przez separator przy jednoczesnym obracaniu dolnych pokręteł o 1-2 cm w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aż docelowa grupa, tj. larwy, poczwarki samców lub poczwarki samic, zostanie w maksymalnym stopniu odizolowana od pozostałych grup (obraz po lewej). Obraz po prawej przedstawia separację larw (najniższy pas), poczwarek samców (środkowy pas) i poczwarek samic (górny pas). Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
3. Przygotowanie poczwarek samców Aedes aegypti do naświetlania
- Rozdziel poczwarki samców do plastikowych szalek Petri o średnicy 60 mm.
UWAGA: Liczba potrzebnych szalek Petri zależy od liczby poczwarek samców dostępnych do napromieniowania: jedna kuweta do hodowli larw z etapu 1.2 wypełni około 1,5 szalki Petri. Wiek poczwarek mieści się w przedziale od 1 do 40 h. W niniejszym protokole głębsza część szalki Petri o mniejszej średnicy jest nazywana dnami, a płytsza część o większej średnicy jest nazywana pokrywami.- Przygotuj docięte krążki papieru filtracyjnego dopasowane do średnicy wewnętrznej dna szalki Petri. Umieść jeden nawilżony wodą krążek papieru filtracyjnego w każdym dnie szalki Petri, aby utrzymać nawodnienie poczwarek podczas transportu i procesu napromieniowania.
- Przenieś poczwarki do szalek Petri. Przecedź poczwarki samców zebrane w etapie 2.2.1.6 przez sito i wypłucz je do zlewki miarkowej o pojemności 1000 mL przy użyciu jak najmniejszej ilości wody. Ostrożnie przelej poczwarki do szalek Petri, aż każdy krążek papieru filtracyjnego zostanie równomiernie pokryty pojedynczą warstwą poczwarek (Rycina 2A - C). Ustaw szalki Petri w rzędzie na krawędzi stołu, aby ułatwić przelewanie.
UWAGA: Alternatywą dla przecedzania poczwarek jest odcięcie końcówki plastikowej pipety Pasteura o pojemności 3 mL do średnicy wystarczająco dużej, aby pomieścić poczwarki. Użyj pipety, aby przenieść poczwarki z pojemnika z etapu 2.2.1.6 bezpośrednio na krążki papieru filtracyjnego, tak aby w każdej szalce Petri znajdowała się pojedyncza, gęsto upakowana warstwa poczwarek. Jest to praktyczne tylko w przypadku małych partii. - Użyj niezmienionej pipety Pasteura o pojemności 3 mL, aby usunąć stojącą wodę z dna szalki Petri, co zapobiegnie przemieszczaniu się poczwarek podczas etapu segregacji płciowej (3.2) i transportu.
Rysunek 2: Przenoszenie poczwarek do szalek Petri w celu naświetlania. (A) Przesiane poczwarki są wlewane i płukane w plastikowym zlewce o pojemności 1000 mL. (B) W zlewce pozostaje minimalna ilość wody, aby ułatwić wlewanie do szalek Petri. (C) Szalki Petri ustawione wzdłuż krawędzi powierzchni, aby ułatwić wlewanie poczwarek w jednej warstwie. (D) Szalki Petri z poczwarkami są układane w stosy i zabezpieczane do transportu do zakładu naświetlania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
- Określ płeć poczek do sprawdzenia obecności samic. Pod mikroskopem stereoskopowym, używając sond, obracaj każdą poczekę, aby sprawdzić powierzchnię brzuszną pod kątem obecności dużego płata genitalnego (Rycina 3), który wskazuje na płeć męską. Usuń i odrzuć poczeky z zredukowanymi lub małymi płatami genitalnymi wskazującymi na samice i zastąp je równą liczbą poczek męskich, aby zachować prawidłową liczebność.
UWAGA: W programie operacyjnym ten krok nie jest praktyczny ze względu na dużą liczbę komarów oraz fakt, że separacja, przenoszenie, napromieniowanie i przygotowanie klatek po napromieniowaniu odbywają się w ciągu jednego dnia w ograniczonym czasie. Można przeprowadzić kontrolę jakości próbki z wybranych szalek Petriego, szczególnie w początkowych fazach rozwoju programu SIT.
Rycina 3: Określanie płci poczwarek na podstawie płata genitalnego. (A) Widok brzuszny i (B) boczny poczwarek samicy (♀) i samca (♂) Aedes aegypti, z zaznaczonymi płatami genitalnymi wykazującymi dymorfizm płciowy. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
- Przykryć dna pokrywkami naczyń Petriego i zabezpieczyć taśmą laboratoryjną. Związać zaklejone naczynia Petriego gumkami recepturkami w stosach dopasowanych rozmiarem do komory naświetlającej, a następnie zamknąć w oznakowanej 3,8 L torebce strunowej (Rysunek 2D). Nie dopuszczać do pozostawania poczwarek bez przykrycia przez czas >1 h.
4. Naświetlanie poczwarek samców Aedes aegypti
- Przygotować folię dosymetryczną z tej samej partii, wycinając kwadraty o wymiarach 1 cm2 i umieszczając każdy kwadrat w oddzielnej kopercie.
UWAGA: Wszystkie folie wykorzystywane w danym dniu są wycinane w tym samym czasie. Pozwala to zredukować niewielkie wahania wynikające z przechowywania. Liczba kwadratów potrzebnych dla każdego stosu to 1 + (liczba szalek Petriego). - Przygotować zestaw do zabrania do placówki napromieniowania, który powinien zawierać minutnik laboratoryjny, taśmę laboratoryjną, permanentny marker, przygotowane koperty z folią dosymetryczną, plakietkę dosymetryczną oraz arkusz notatek laboratoryjnych z listami kontrolnymi w celu śledzenia kluczowych informacji (Rysunek 4).
Rysunek 4: Schemat dziennika laboratoryjnego-IR wypełniony dla zestawu odpowiedzi na dawkę. Ramki zaznaczone na czerwono (wskazane czerwonymi strzałkami) zawierają przydatne uwagi do poszczególnych sekcji oraz powtarzają kluczowe informacje. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
- Transport poczki do placówki naświetlań. Umieść szalki Petriego z samicami poczek z kroku 3.3 w izolowanych pojemnikach i przechowuj je poza bezpośrednim działaniem promieni słonecznych, w klimatyzowanych warunkach podczas transportu.
- Przygotuj stosy szalek Petriego do naświetlania w irradiatorze. Ułóż odpowiednią liczbę szalek Petriego tak, aby zmieściły się w komorze naświetlającej, umieszczając kopertę z folią dosymetryczną pomiędzy każdą szalką oraz na górze i na dole stosu. Zabezpiecz koperty i cały stos taśmą laboratoryjną, aby zapobiec przesunięciom i ułatwić umieszczenie stosu w komorze.
- Naświetl szalki Petriego z samicami poczek. Umieść stos szalek Petriego na sztywnej metalowej siatce w komorze, aby ustawić je na właściwej wysokości dla optymalnego stożka naświetlania, w oparciu o wcześniejsze mapowanie dawki dla konkretnej jednostki naświetlającej21. Uruchom obrotowy stół w irradiatorze i rozpocznij naświetlanie, jednocześnie włączając timer laboratoryjny. Naświetlaj przez odpowiedni czas, aby uzyskać pożądaną dawkę (przykłady przedstawiono w Tabeli 2).
UWAGA: Niniejszy protokół opiera się na irradiatorze cezu-137 (patrz Tabela materiałów) i docelowej dawce 50 Gy. Ponieważ Cs-137 ulega rozpadowi w czasie, szybkość dawki jest korygowana co roku poprzez przeprowadzenie serii odpowiedź-dawka z użyciem dosymetrów alaninowych, uzupełnionych folią radiochromową do rutynowej dosymetrii oraz alaniną w około 10% naświetlonych próbek. Przy obecnej szybkości dawki 8,8 Gy/min, uzyskanie docelowej dawki 50 Gy wymaga 5 min 41 s naświetlania. Rutynowa dosymetria foliowa odbywa się zgodnie z opisem w kroku 4.7. Dosymetria peletów alaninowych jest wykonywana w National Center for Electron Beam Research na Texas A&M University lub w National Institute of Standards and Technology w Gaithersburg, MD, USA.
| Dawka (Gy) | Czas (na podstawie 8.8 Gy/min) |
| 0 | nie dotyczy |
| 10 | 1 min 8 s |
| 30 | 3 min 24 s |
| 50 | 5 min 41 s |
| 65 | 7 min 23 s |
| 85 | 9 min 39 s |
| 100 | 11 min 22 s |
| 110 | 12 min 30 s |
Tabela 2: Przykładowe czasy naświetlania dla irradiatora z cezem-137.
- Po upływie wyznaczonego czasu wyjmij szalki Petriego z irradiatora i ostrożnie rozdziel stos. Oznacz wszystkie szalki Petriego oraz koperty z folią datą i pozycją w stosie. Zamknij koperty i przechowuj je do analizy dosymetrycznej. Umieść szalki Petriego z powrotem w izolowanym pojemniku w celu transportu do głównego laboratorium.
UWAGA: Odnotuj, czy podczas napromieniowania pojawiły się osobniki dorosłe i oznacz odpowiednią szalkę Petriego, aby zapobiec ucieczce dorosłych osobników podczas przenoszenia poczwarek do klatek hodowlanych (krok 5.2). - Potwierdź dawkę promieniowania za pomocą folii dosymetrycznej, dokonując pomiaru folii około 24 h po ekspozycji. Włącz czytnik dosymetryczny i poczekaj, aż osiągnie temperaturę pokojową. Włóż folię za pomocą pęsety dostarczonej z czytnikiem i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi odczytu folii napromienianej oraz nienapromienianej folii kontrolnej z tej samej partii. Zeruj czytnik pomiędzy pomiarami (bez folii w urządzeniu) i zapisuj dane zgodnie z przykładowym arkuszem danych przedstawionym na Rysunku 5.
UWAGA: Niniejszy protokół opiera się na standardach zestawu filtrów QA ND0.5 oraz ND1.0. Ważne jest, aby mierzyć folię matową stroną skierowaną w stronę operatora.
Rysunek 5: Arkusz danych dozymetrycznych wypełniony przykładowymi danymi. Nagłówki kolumn wskazują operatorowi, jakie kluczowe dane należy zarejestrować do późniejszej analizy. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
5. Hodowla napromieniowanych poczwarek samców Aedes aegypti do stadium imago
- Wyczyścić i przygotować małe plastikowe klatki hodowlane o wymiarach 30 cm x 30 cm x 30 cm, aby były gotowe na przyjęcie napromieniowanych poczek po powrocie do głównego laboratorium. Na każde 2 szalki Petriego z napromieniowanymi poczek samców przygotować 1 klatkę hodowlaną. W każdej klatce umieścić wypełniony do połowy plastikowy kubek zawierający 460 mL wody z kranu oraz jeden pojemnik z 10% roztworem sacharozy, zgodnie z opisem w kroku 1.1.3.
- Natychmiast po powrocie z placówki napromieniowania przenieść napromieniowane poczek do przygotowanych klatek hodowlanych. Używając butelki zmywaka z wodą, ostrożnie wypłukać poczek z każdej szalki Petriego do 460 mL wody w plastikowym kubku w każdej klatce. Po 24 h przenieść kubki do nowych, czystych klatek hodowlanych zawierających źródło pożywienia i odczekać na resztę procesu wykluwania się dorosłych, napromieniowanych samców Aedes aegypti.
UWAGA: Jeśli podczas procesu napromieniowania doszło do wyklucia osobników, otworzyć szalki Petriego z owadami nad pustą klatką, a następnie kontynuować krok 5.2. Samce zebrane w tej klatce należy odrzucić. Poczek przenosi się do nowych klatek hodowlanych po 24 h, ponieważ samce wykluwają się wcześniej niż samice z tej samej kohorty, a izolacja dni wykluwania może zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia populacji samicami i zapewnić dokładne określenie wieku samców.
6. Znakowanie i ważenie napromieniowanych samców dorosłych Aedes aegypti
UWAGA: Ta sekcja protokołu zakłada, że zadania wykonują dwie osoby; w przypadku jednej osoby należy przejść do punktu 6.4.
Rysunek 6: Pakowanie oznakowanych, napromieniowanych samców Aedes aegypti do pojemników uwalniających. (A) Pojemnik uwalniający z pokazaną oplotką przymocowaną do otworu wyciętego w boku tekturowego cylindra za pomocą taśmy maskującej, zszywek i kleju na gorąco. Pierścień jest na miejscu, z przyklejonym do boku podkładem etykiety z taśmy maskującej. Pierścień utrzymuje mocno naciągniętą osłonę z siatki tiulowej; gumka (niewidoczna) również utrzymuje tiul na miejscu pod pierścieniem. (B) Partia znieczulonych samców w trakcie obracania w różowym barwniku w małym tekturowym kubku. (C) Cztery pojemniki uwalniające wewnątrz izolowanego pojemnika transportowego. Należy zwrócić uwagę, że rękawy z oplotki są skierowane w stronę środka pojemnika transportowego, materiały pakunkowe są włożone wokół pojemników uwalniających, a źródła odżywcze i nawadniające znajdują się na górze każdego pojemnika uwalniającego, przykryte odwróconym dnem szalki Petriego, przymocowanym skrzyżowanymi gumkami i kawałkami taśmy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
- Przygotuj tekturowe pojemniki do wypuszczania.
- Wypal lub wytnij otwór o średnicy 11,5 cm w boku cylindrycznego, zamykanego tekturowego pojemnika o pojemności 3,9 L, w odległości 1,5-3,0 cm od dna, tak aby otwór nie był zakryty przez pokrywę (Rysunek 6A).
- Odetnij kawałek bawełnianej siatki (stockinette) o długości 40-50 cm i zszyj jeden z jego końców od wewnętrznej strony otworu o średnicy 11,5 cm wyciętego w punkcie 6.1.1. Użyj standardowego zszywacza biurowego w pozycji otwartej, tak aby zszywki mogły zostać wbite przez siatkę i tekturę od wewnątrz pojemnika do odpowiedniej powierzchni roboczej, np. bloku twardej pianki polistyrenowej ekstrudowanej. Dociśnij zszywki za pomocą płaskiego śrubokręta, aby mocno przymocować siatkę do obwodu otworu, a następnie naklej taśmę maskującą na dociśniętą stronę, aby zapobiec zaczepianiu. Przyklej krawędź siatki od wewnętrznej strony cylindra do tektury za pomocą kleju na gorąco i sprawdź cały zestaw pod kątem ewentualnych otworów ucieczki.
- Wykonaj pierścień mocujący, usuwając wewnętrzną dyskę z pokrywy, i wytnij kwadrat z nylonowej siatki tiulowej o wymiarach 33 cm x 33 cm, na tyle gęstej, aby zatrzymać dorosłe samce komarów Aedes aegypti. Połóż siatkę na otwartym końcu cylindra i nałóż pierścień na siatkę, aby utrzymać ją w miejscu bez żadnych szczelin. Pociągnij siatkę w dół, tak aby wystawała poniżej pierścienia, aby była napięta na otwartym końcu, a następnie mocno przymocuj wystającą siatkę do cylindra gumką recepturką.
- Naklej 10 cm kawałek taśmy maskującej na boku pierścienia, a na niej 8 cm kawałek taśmy etykietującej, tak aby etykietę można było łatwo wymienić bez rozrywania pierścienia.
UWAGA: Pojemniki do wypuszczania są trwałe i przy odpowiednim obchodzeniu się mogą być używane >10x. Przed wprowadzeniem każdej nowej partii oznakowanych, napromieniowanych, dorosłych samców komarów należy sprawdzić, czy siatka jest bezpiecznie przymocowana do pojemnika i w razie potrzeby niezwłocznie dokonać napraw.
- Przygotuj stanowisko do ważenia i znakowania.
- Wsyp około 50 mg barwnika do znakowania do tekturowego pojemnika o pojemności 240 mL i rozprowadź barwnik równomiernie jako warstwę proszku na wewnętrznych powierzchniach pojemnika. Delikatnie potrząśnij, aby usunąć nadmiar barwnika. W przypadku użycia wielu barwników stosuj wyraźnie oznakowane kubki, aby zachować rozdzielność kolorów.
- Wytaruj łódeczkę wagową o zakresie 100-500 g na wadze elektronicznej o dokładności 0,0001 g; przygotuj formularz danych (Tabela 3) oraz sklej taśmą cztery arkusze papieru kserograficznego o wymiarach 215,9 mm x 355,6 mm, aby stworzyć powierzchnię roboczą o wymiarach 431,8 mm x 711,2 mm.
| Zwolnij pojemnik | Masa komarów | Numer klatki | Samice w partii | Liczba samców | Zwolnienie pojemnika | Masa całkowita |
| PINK I | 0.024 | D1 #1 | 25 | PINK I | 2.03 | |
| PINK I | 2.007 | D1 #1 | 7 | PINK II | 1.99 | |
| PINK II | 1.990 | D1 #1 | PINK III | 2.03 | ||
| PINK III | 0.026 | D1 #3 | 25 | |||
| PINK III | 2.000 | D1 #3 | 18 |
Tabela 3: Tabela danych stacji ważenia.
- Oznacz pigmentem fluorescencyjnym zważone partie dorosłych napromieniowanych samców.
- Przenieś dorosłe komary (w wieku 2,5–3,5 dnia) z każdej klatki hodowlanej do fiolek aspiratora. Usuń źródła pożywienia z klatki hodowlanej z kroku 5.2 i umieść całą klatkę w dużej komorze z CO2 na 5–7 min, uderzając w ścianki pojemnika, aby strząsnąć komary, które mogą przywierać do klatki. Po upływie czasu ekspozycji wyjmij klatkę z komory i odessij wszystkie dorosłe komary do serii plastikowych fiolek aspiracyjnych.
UWAGA: Podawanie 99,5–100% CO2 odbywa się z butli z regulatorem, mosiężną złączką i rurką silikonową prowadzącą do komory z przepływem 6 L/min. Liczba fiolek potrzebnych do opróżnienia klatki hodowlanej zależy od liczby komarów w klatce i wprawy operatora, ale zazwyczaj wymagane jest 3–5 fiolek na klatkę. Wybierz aspirator z małymi, łatwo wymiennymi fiolkami, aby ułatwić zarządzanie dorosłymi komarami w partiach, na przykład taki, który wykorzystuje 60 mL polistyrenową fiolkę zbierającą zamkniętą z jednej strony siatką aluminiową o oczkach 20 x 20, a z drugiej przezroczystym zaworem klapowym z octanu. Cała klatka jest znieczulana przed aspiracją, aby skrócić czas przenoszenia komarów do fiolek, zredukować stres u owadów i utrzymać przejrzystość protokołu. - Posegreguj wszystkie dorosłe komary z każdej klatki hodowlanej według płci.
- Naraź pierwszą fiolkę z kroku 6.3.1 na działanie CO2 w małej komorze przez 4 min, a następnie delikatnie wysyp znieczulone komary, rozkładając je na białej papierowej powierzchni roboczej przygotowanej w kroku 6.2.2.
- Włóż nową, pustą fiolkę do aspiratora i ostrożnie odessij wszystkie samce z powierzchni roboczej, a następnie przekaż tę fiolkę na stanowisko ważenia (krok 6.3.3.). Policz pozostałe samice, odessij je do oddzielnej fiolki i wyrzuć wraz z wszelkimi zmiażdżonymi samcami.
- Powtórz ten proces z pozostałymi fiolkami z kroku 6.3.1, ale w pewnym momencie procesu segregacji płci przygotuj oddzielną fiolkę zawierającą tylko 25 samców, która również zostanie przekazana na stanowisko ważenia. Powtórz krok 6.3.2. dla każdej klatki hodowlanej.
UWAGA: Podczas przetwarzania napromieniowanych dorosłych samców w celu segregacji płci, ważenia i oznaczania, monitoruj liczbę samic w każdej partii, co stanowi kluczowe dane do rozwiązywania problemów i zapewnienia jakości segregacji płci poczwarek oraz całego procesu. Jeśli liczba samic jest wyższa niż oczekiwano, druga osoba powinna usuwać samice, podczas gdy główny operator odsysa samce. Ważne jest zważenie próbki 25 samców z każdej klatki hodowlanej w celu obliczenia średniej masy jednego komara, co zostanie wykorzystane do oszacowania liczby oznaczonych napromieniowanych samców wypuszczonych na końcu protokołu.
- Zważ i zafarbuj partie dorosłych samców komarów.
- Na stanowisku ważenia umieść pierwszą fiolkę dorosłych samców komarów ze stanowiska segregacji płci (sekcja 6.3.2) w małej komorze z CO2 na 2 min, a następnie ostrożnie wysyp komary do tary lodzika wagowego przygotowanego w kroku 6.2.2. Zapisz masę komarów i przelej je do kubka z barwnikiem przygotowanego w kroku 6.2.1.
- Powoli przechylaj i obracaj kubek o jeden pełny obrót zgodnie i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, aby komary miały kontakt z powłoką proszkową na wewnętrznych powierzchniach kubka i zostały lekko oprószone barwnikiem (Rycina 6B). Przesyp oznaczone komary do lodzika wagowego.
- Przejdź szybko do następnego kroku, aby komary nie ocknęły się i nie uciekły. Powtarzaj ten krok, aż wszystkie fiolki z sekcji 6.3.2 zostaną przetworzone.
UWAGA: Masa samców z oddzielnej fiolki 25 samców przygotowanej dla każdej klatki hodowlanej w sekcji 6.3.2 jest zapisywana i wykorzystywana do obliczenia średniej masy samca z danej klatki.
- Załaduj pojemniki do wypuszczenia oznaczonymi napromieniowanymi dorosłymi samcami. Lekko zegnij lodzik wagowy zawierający znieczulone, oznaczone, napromieniowane samce z końca sekcji 6.3.3., aby utworzyć kanał, a następnie skieruj ten kanał przez rękaw z dzianiny, aby przenieść samce do pojemnika do wypuszczenia. Dodawaj komary, aż w pojemniku znajdzie się około 2,0 g lub 1500–3000 samców, a następnie zawiąż rękaw. Oznacz taśmę etykietującą na pierścieniu pojemnika kolorem barwnika, numerem pojemnika i całkowitą masą komarów, a następnie skopiuj te dane do formularza z kroku 6.2.2.
UWAGA: Manipulowanie komarami na dowolnym etapie cyklu życiowego wywołuje stres i może zmniejszyć przeżywalność lub wigor. Seria znieczuleń opisana w tym protokole może wpływać na komary; jednak próby łapania i odsysania niezniewolnionych komarów na każdym etapie wywołałyby większy stres i uczyniłyby protokół niewykonalnym. Podziel całkowitą masę komarów w każdym pojemniku do wypuszczenia przez średnią masę jednego samca obliczoną w sekcji 6.3.3, aby uzyskać szacunkową liczbę samców w tym pojemniku; każdy pojemnik do wypuszczenia nie powinien zawierać więcej niż 2 g samców, co odpowiada około jednej dużej klatce hodowlanej.
- Przenieś dorosłe komary (w wieku 2,5–3,5 dnia) z każdej klatki hodowlanej do fiolek aspiratora. Usuń źródła pożywienia z klatki hodowlanej z kroku 5.2 i umieść całą klatkę w dużej komorze z CO2 na 5–7 min, uderzając w ścianki pojemnika, aby strząsnąć komary, które mogą przywierać do klatki. Po upływie czasu ekspozycji wyjmij klatkę z komory i odessij wszystkie dorosłe komary do serii plastikowych fiolek aspiracyjnych.
- Modyfikacje protokołu oznaczania dla jednego operatora
- Najpierw przeprowadź segregację płci dla wszystkich dużych klatek. Naraź każdą dużą klatkę na działanie CO2 przez 4–5 min i odessij wszystkie komary do 4–5 fiolek. Naraź każdą fiolkę na działanie CO2 przez 2–3 min, wysyp wszystkie komary na białą papierową powierzchnię roboczą, usuń samice i je policz, a samce zwróć do ich dużej klatki populacyjnej.
- Ważenie i oznaczanie
- Zacznij od pierwszej klatki z samcami przygotowanej w kroku 6.4.1: usuń źródło pożywienia i znieczul samce w dużej komorze z CO2 przez 5–7 min. Odessij znieczulone samce równomiernie do oddzielnych fiolek. Powtórz ten krok z każdą klatką w kolejności, w jakiej zostały przygotowane.
UWAGA: Z każdej klatki powstanie około 2–3 pełnych fiolek. Przetwarzanie klatek z samcami w kolejności ich przygotowania maksymalizuje czas regeneracji dla każdej grupy samców. - Znieczul pierwszą fiolkę przygotowaną w kroku 6.4.2.1. przez 1–2 min w małej komorze z CO2. Wysyp niewielką liczbę komarów na białą papierową powierzchnię roboczą, odessij 25 samców do nowej fiolki i przetwórz zgodnie z krokiem 6.3.2, aby wyznaczyć średnią masę samca dla tej klatki. Zwróć pozostałe samce do fiolki źródłowej lub odessij do nowej, oddzielnej fiolki do późniejszego przetworzenia; następnie przeprowadź ważenie, oznaczanie i przeniesienie do pojemników do wypuszczenia dla reszty samców z pierwszej fiolki, jak opisano w pozostałej części kroku 6.3. Powtórz krok 6.4.2.2. (z wyjątkiem izolowania 25 samców do oddzielnej fiolki) dla pozostałych fiolek przygotowanych w kroku 6.4.2.1. w kolejności ich przygotowania, a następnie przejdź do następnej posegregowanej klatki hodowlanej z kroku 6.4.1.
UWAGA: Przepływ pracy przy jednej osobie jest wolniejszy i niektóre samce będą musiały zostać znieczulone wielokrotnie. Nieustannie szukaj i usuwaj samice komarów.
- Zacznij od pierwszej klatki z samcami przygotowanej w kroku 6.4.1: usuń źródło pożywienia i znieczul samce w dużej komorze z CO2 przez 5–7 min. Odessij znieczulone samce równomiernie do oddzielnych fiolek. Powtórz ten krok z każdą klatką w kolejności, w jakiej zostały przygotowane.
7. Pakowanie i wysyłka pojemników z oznakowanymi, napromieniowanymi, dorosłymi samcami Aedes aegypti
- Przygotować pojemniki transportowe do wysyłki. Po wypełnieniu pojemnika oznakowanymi samcami, na siatkową pokrywkę położyć 4 kulki waty nasączone 10% roztworem sacharozy i przykryć odwróconym dnem szalki Petriego, mocując go za pomocą dwóch gumek recepturek rozciągniętych wokół całego pojemnika i nad szalką Petriego w taki sposób, aby stworzyły krzyż. Na miejscu przecięcia gumek nakleić kawałek taśmy maskującej, aby utrzymać je na górze odwróconej szalki Petriego.
UWAGA: Należy upewnić się, że kulki waty z 10% roztworem sacharozy nie są tak mocno nasączone, aby roztwór ściekał, co mogłoby uszkodzić pojemnik oraz uwięzić i zabić komary. - Umieścić tekturowe pojemniki transportowe w styropianowej skrzyni wysyłkowej. W pokrywie skrzyni wykonać 4 otwory wentylacyjne i zatkać je watą, aby zapobiec dostaniu się mrówek oraz ucieczce komarów. Umieścić 4 pojemniki transportowe pionowo w skrzyni wysyłkowej w taki sposób, aby materiał dzianinowy każdego z nich był skierowany do środka (Rycina 6C). Pomiędzy pojemnikami oraz w centralnej części umieścić folię bąbelkową w celu ich stabilizacji. Pozostałą przestrzeń w skrzyni wysyłkowej wypełnić poduszkami powietrznymi lub ułożyć drugą warstwę 4 pojemników transportowych bezpośrednio na pierwszej warstwie i w podobny sposób ustabilizować poduszkami powietrznymi.
UWAGA: Pojemniki transportowe powinny być wystarczająco ustabilizowane, aby nie przesuwały się podczas potrząsania. Temperatura wewnątrz przesyłki jest temperaturą otoczenia. - Przygotować skrzynię wysyłkową do dostawy. Zamknąć skrzynię wysyłkową z wentylowaną pokrywą, umieścić ją w kartonowym opakowaniu zewnętrznym, zakleić taśmą i wysłać przesyłką ekspresową do miejsca uwalniania.
Wyniki
Czujny i odpowiedni wychow komarów polega na zapewnieniu zrównoważonej dostępności samców i samic w klatkach kolonijnych, utrzymywaniu świeżego roztworu sacharozy i miodu oraz stałym żywieniu krwi wysokiej jakości. Warunki te zapewnią gęsto upakowane arkusze jaj optymalne do stosowania w chlewniach do odchowu larw SIT. Właściwe przechowywanie i stosowanie suszonych arkuszy jaj, takie jak systematyczne etykietowanie w celu ułatwienia użycia od najstarszego do najnowszego, zapewni równomierne wylęganie na wszystkich patelniach. Napełnienie wszystkich pojemników do odchowu larw wodą przed wykluciem może skrócić czas, w którym arkusze jaj znajdują się w pojemnikach wylęgowych i sprzyjać zdrowemu rozwojowi. Utrzymanie misek larwalnych od wylęgu do przepoczwarzenia wymaga starannego zaangażowania personelu kolonii, ponieważ niektóre karmidła mogą potrzebować więcej lub mniej pokarmu lub dodatkowej wody w zależności od etapów rozwoju i zmiennych środowiskowych. Jeśli wystąpią problemy ze stopniem rozwoju do zaplanowanego dnia separacji płci poczwarki, należy dokonać korekt na wcześniejszym etapie procesu, takich jak wcześniejsze lub późniejsze wykluwanie, dostosowanie pokarmu lub zmiana temperatury inkubatora.
Proces hodowli w tym protokole nie sprawia, że wszystkie jaja wykluwają się na czas, aby przekształcić się w poczwarki, które mogą być napromieniowane i wykorzystane do celów kontrolnych. Od 20 do 50% komarów hodowanych w koloniach nadal będzie larwami, zanim poczwarki będą musiały zostać oddzielone. Jednak larwy te nie są marnotrawione, ale pozwalają im dojrzeć przez 24 godziny, aby wytworzyć dodatkowe poczwarki, które można połączyć z poczwarkami samic z separacji poprzedniego dnia i ponownie umieścić w klatkach kolonijnych. W klatkach kolonijnych poczwarki będą mogły dojrzeć do postaci dorosłych, łączyć się w pary, karmić krwią i produkować jaja, które podtrzymują projekt SIT.
Rozdzielanie poczwarek, wlewanie poczwarek na szalki Petriego, napromienianie i umieszczanie w klatkach dla dorosłych po napromieniowaniu musi nastąpić w ciągu jednego dnia; dlatego należy przeznaczyć odpowiedni czas na komfortowe wykonanie wszystkich kroków. Montaż i przygotowanie pojemników zwalniających powinno być wykonane przed procesem znakowania. Po zwrocie pudełek wysyłkowych z miejsca wydania, pojemniki zwalniające powinny zostać sprawdzone i przygotowane do następnego użycia. Wyrzucanie mokrych wacików, wietrzenie mokrych pojemników do uwalniania, czyszczenie szalek Petriego, wymiana siatki i usuwanie elastycznych opasek z pojemnika, gdy nie są używane, znacznie przedłuży żywotność pojemników do uwalniania.
Biorąc pod uwagę ogólnoświatową rzeczywistość pandemii wirusa COVID-19, ten protokół, który zazwyczaj jest operacją wieloosobową, został zmodyfikowany tak, aby był możliwy do wykonania przez jedną osobę pracującą samodzielnie w laboratorium na każdym kroku. Etapy procesu, które są najbardziej utrudnione przez scenariusz jednoosobowy, to etapy określania płci, znakowania, ważenia i utrzymania hodowli kolonii. Oddzielenie poczwarek według płci przez jedną osobę powinno być wystarczające, jeśli w różnych pomieszczeniach pracuje jednocześnie wiele separatorów. W sytuacji pandemii, w której w miejscu pracy występuje dystans społeczny, wymagane jest wyposażenie wielu stanowisk, aby wykonać kroki od seksu po pakowanie. W zależności od prędkości operatora, jedna osoba potrzebuje ~4 godzin, aby zmodyfikować 15 000 komarów, a następnie kolejne 1-2 godziny na ich oznaczenie, zważenie i zapakowanie. Scenariusz dwuosobowy skraca czas, w którym komary są znieczulane do znakowania i skraca ogólny czas pracy. Jednak nawet w scenariuszu dwuosobowym przydzielenie pełnych 2,0 g komarów na klatkę wypuszczania może być trudne ze względu na ograniczony czas pracy, gdy komary są uspokojone. Chociaż proces czyszczenia i przygotowania materiału do odchowu larw i osobników dorosłych jest niezwykle czasochłonny i pracochłonny, można go podzielić tak, aby poszczególni operatorzy mogli pracować samodzielnie i bezpiecznie w czasie pandemii.
Wypuszczanie dorosłych, oznaczonych, napromieniowanych samców Aedes aegypti wykracza poza zakres tego protokołu, ale jest tutaj przedstawione w skrócie. Proces uwalniania oznaczonych, napromieniowanych samców komarów rozpoczyna się od określenia równomiernego rozkładu uwalniania pojemników na uwolnienie w oparciu o wagę (a tym samym wywnioskowaną liczbę bezpłodnych samców), jak podano w tabeli 3. Po dostarczeniu przesyłek do okręgu kontroli wektorów, pudełka są otwierane, a pojemniki zwalniające oceniane pod kątem wszelkich problemów ze śmiertelnością lub stanem kontenerów wydawniczych. Komary w pojemnikach uwalniających są następnie pozostawiane do aklimatyzacji do temperatury i wilgotności otoczenia przez 1-2 godziny przed transportem do obszaru leczenia. Miejsca uwolnienia na obszarze objętym badaniem są identyfikowane po intensywnym nadzorze pod kątem gorących punktów dzikich populacji Aedes aegypti. Czas, częstotliwość i gęstość wypuszczania są równoważone przez bionomię gatunku, a także meteorologię, wsparcie publiczne i możliwości hodowli laboratoryjnej.
Ponieważ konkretne pojemniki uwalniające są dopasowywane do konkretnych miejsc wydania, etykieta musi zostać sprawdzona krzyżowo przed otwarciem pojemnika na uwolnienie poprzez przecięcie siatki na górze, co pozwala operatorowi na odkształcenie siatki, tak aby część samców mogła uciec. Ta metoda uwalniania frakcyjnego jest powtarzana w każdym przypisanym punkcie wypuszczenia dla pojemnika, aż wszystkie swobodnie latające samce zostaną wypuszczone. Proces ten jest następnie powtarzany dla każdego kontenera wydania w odpowiedniej przypisanej lokalizacji wydania, aż wszystkie kontenery zostaną przetworzone. Fakultatywnie, po uwolnieniu komarów, wszystkie martwe lub niepełnosprawne komary, które nie opuściły swobodnie komarów, mogą zostać zebrane na szalki Petriego i oznaczone w celu ręcznego policzenia lub zważenia w celu skorygowania szacowanej liczby uwolnionych komarów. Ciągły i wszechobecny nadzór nad dorosłymi, jajowymi i niedojrzałymi stadiami dzikiego Aedes aegypti na obszarze docelowym i ewentualnie w miejscach kontroli nieinterwencyjnej jest prowadzony w celu oceny skuteczności operacji SIT.
Dyskusja
Zainicjowanie programu kontrolnego z udziałem SIT, który wykorzystuje promieniowanie, wymaga ustanowienia lokalnego szczepu Aedes aegypti. Ten krok ma kluczowe znaczenie i może pozwolić SIT naprawdę odróżnić się od podobnych technologii sterowania. Opracowując projekt na lokalnym szczepie komarów, wygenerowane samce prawdopodobnie będą miały zachowania, które pozwolą im przystosować się do zmian i sygnałów środowiskowych oraz zlokalizować i kojarzyć się z dzikimi samicami w pobliżu. Co więcej, wypuszczenie napromieniowanych miejscowych samców może nie wywołać negatywnej opinii publicznej w porównaniu z, powiedzmy, uwolnieniem nielokalnego szczepu genetycznie zmodyfikowanych komarów, który mógłby na przykład wprowadzić nowe allele do lokalnej populacji komarów.
Wydatkowanie znacznych środków na hodowlę ogromnych ilości komarów tylko po to, aby móc wykorzystać około połowy z nich do celów kontrolnych, jest ograniczeniem programu Aedes aegypti SIT. Należy wprowadzić udoskonalenia do protokołu chowu, aby skondensować dojrzewanie larw w bardziej określonych ramach czasowych, w których poczwarki będą gotowe. Pozwoliłoby to na zebranie większej liczby poczwarek w optymalnym momencie separacji. Jednak dodatkowe poczwarki do przetworzenia zwiększają ryzyko przepoczwarzania się większej liczby samic po zebraniu poczwarek, a tym samym zwiększają prawdopodobieństwo, że samice trafią na szalki Petriego z samcami i prawdopodobnie zostaną uwolnione. Chociaż długość życia, zachowania związane z karmieniem krwią i składaniem jaj u napromieniowanych poczwarek Aedes aegypti są zmniejszone u dorosłych, nie jest dobrą strategią przypadkowe wypuszczanie samic wraz z napromieniowanymi samcami22. Dlatego priorytetem powinno pozostać zminimalizowanie liczby samic przypadkowo oddzielonych, napromieniowanych, znakowanych i wypuszczanych z samcami.
Sukces programu SIT ostatecznie zależy od udanej konkurencji partnerskiej ze strony hodowanych w koloniach, napromieniowanych samców. Zachowanie konkurencyjności samców opiera się na wyczerpującym, eksperymentalnie uzyskanym doborze dawki i maksymalizacji szacowanego stosunku bezpłodnych do dzikich samców w populacji. Wybór dawki zależy od kilku kluczowych czynników, takich jak długowieczność, płodność, płodność i śmiertelność poczwarek. Zaobserwowano, że samce komarów będą wykazywać asymptotyczną krzywą płodności, która zbliża się do zera wraz ze wzrostem promieniowania (dane niepublikowane KJL, RLA, SCB). Jednocześnie długowieczność i poziom aktywności samców komarów maleje wykładniczo wraz ze wzrostem dawki promieniowania (dane niepublikowane KJL, RLA, SCB). Dlatego też, zamiast identyfikować dawkę, która daje 99,9% bezpłodności u mężczyzn, lepiej jest skupić się na niższym procencie bezpłodności, jednocześnie wspierając przeżywalność. Po ustaleniu zakresu dawek, który nie różnicuje długowieczności ani śmiertelności w okresie poczwarek u samców poddanych promieniowaniu od śmiertelności samców nienapromieniowanych, należy przeprowadzić dodatkowe oceny płodności w celu określenia dawki, która sprawia, że samce stają się przytłaczająco bezpłodne, a mimo to konkurencyjne.
Jednocześnie bardzo ważne jest porównanie liczby samców komarów w populacji z liczbą uwolnionych napromieniowanych samców. Można to osiągnąć poprzez wielokrotne zbieranie samców z różnych miejsc w obszarze docelowego uwolnienia i wokół niego z tego samego miejsca oraz przed, w trakcie i po zainicjowaniu programu SIT. Należy przeprowadzić badanie znakowania, uwalniania i ponownego chwytania, aby ocenić stosunek dzikich samców komarów do uwolnionych komarów. Badanie typu "znakuj, wypuszczaj, ponownie chwytaj" opiera się na wypuszczeniu znanej liczby oznaczonych komarów z określonego punktu i ich późniejszym ponownym schwytaniu w punktach znajdujących się w bliskiej odległości od początkowego punktu uwolnienia. Porównując liczbę ponownie schwytanych samców i dzikich samców w odległościach od punktu wypuszczenia, możliwe jest oszacowanie ogólnej dzikiej populacji samców na tym obszarze, tak aby można było wypuścić konkurencyjne proporcje bezpłodnych samców23. Maksymalizację stosunku bezpłodnych samców do dzikich samców można osiągnąć poprzez wypuszczenie większej liczby bezpłodnych samców i/lub zmniejszenie dzikiej populacji za pomocą klasycznych środków kontroli, takich jak redukcja źródła, kontrola niedojrzałości lub leczenie dorosłością.
Aby ocenić skuteczność sterylnych wypuszczeń samców, dorosłe kolekcje można porównać chronologicznie z obszarem nieinterwencyjnym. Gdy bezpłodne samce są wypuszczane, a liczba zebranych samców i samic na danym obszarze zmniejsza się w stosunku do porównywalnego obszaru nieobjętego interwencją, można postawić hipotezę, że jest to spowodowane tym, że wypuszczone bezpłodne samce skutecznie konkurują z lokalnymi płodnymi samcami. Efekt ten można również zaobserwować w miseczkach pułapek do składania jaj rozmieszczonych zarówno w miejscach interwencji, jak i nieinterwencji. Jaja mogą być nadal produkowane w miejscu interwencji, ale jeśli wykluwa się mniej jaj niż w miejscu nieinterwencyjnym, można przypuszczać, że nie są one zapłodnione z powodu kojarzenia się samic z bezpłodnymi samcami. Coraz częstsze składanie jaj przez niezapłodnione jaja może ostatecznie prowadzić do zmniejszenia składania jaj z powodu braku wymiany samic w miejscu interwencji 8,24.
Przyszłe kierunki rozwoju technologii i programów SIT w naturalny sposób rozszerzają się na dodatkowe gatunki komarów o znaczeniu medycznym. Na przykład, technologia ta może być łatwo zaadaptowana do zwalczania Aedes albopictus, biorąc pod uwagę bardzo podobną bionomię Aedes aegypti i Aedes albopictus. Inne interesujące gatunki komarów wektorów chorób to Culex quinquefasciatus, Culex tarsalis i różne gatunki Anopheles . Poprawa skuteczności tej technologii zależy od zwiększenia zdolności wytwarzanych w danym czasie poczwarek płci męskiej, co można osiągnąć poprzez manipulację genetyczną lub sztuczną selekcję, oraz poprawy konkurencyjności samców, którą można osiągnąć poprzez zwiększenie męskości, płodności lub długowieczności.
Ostatecznie programy SIT nie są srebrną kulą do zwalczania komarów. Zamiast tego są narzędziem w zestawie innych technik kontroli, takich jak programy IVM, które kompensują krzyżowo słabości między technikami. Na przykład, podczas gdy kontrola chemiczna zapewnia szybką i tanią kontrolę, sprzyja ona również rozwojowi oporności i śmiertelności niebędącej celem zwalczania; i podczas gdy SIT jest specyficzny dla gatunku i prawdopodobnie nie wytworzy odporności, samce SIT muszą być produkowane i wypuszczane na zawsze, aby kontrolować populacje imigracyjne spoza okręgu kontroli wektorów.
Oświadczenia
Wszyscy autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Dziękujemy doktorom R.-D. Xue, C. Bibbs, W. Qualls i V. Aryaprema z Anastasia Mosquito Control District, St. Augustine na Florydzie, za partnerstwo w rozwoju programu SIT i wiedzę ekspercką na temat skutecznego operacyjnego uwalniania bezpłodnych samców Aedes aegypti. Badania te były wspierane przez USDA-ARS i Departament Rolnictwa i Usług Konsumenckich Florydy (FDACS). Wzmianki o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych w tej publikacji służą wyłącznie dostarczeniu konkretnych informacji i nie oznaczają rekomendacji ani poparcia ze strony USDA lub FDACS.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Klucz 1-1/8" (1" (1 cal) = 2,54 cm) | Craftsman | CMMT44707 | |
| /2 litra kubka kartonowego (1/2 litra = 236,5 ml) | Science Supplies WLE corp | 1/2 pinty | |
| rurki 1/4" - tygon | Hudson Extrusions | LLDPE1/8 X 1/4 BLK | do zamocowania do reduktora gazu CO2 |
| /8" mosiężny zadzior z przyłączem MIP | B& K | BHB-85NLB | do podłączenia do reduktora gazu CO2 |
| 1000 ml zlewki z podziałki plastikowej z uchwytem | Thermo Scientific | 1223-1000 | |
| 3000 mL plastikowe zlewki z podziałką z uchwytem | Thermo Scientific | 1223-3000 | |
| Duża klatka dla dorosłych | Bioquip | 1450D | |
| Fiolki z aspiratorem | Bioquip | 2809V | |
| Wątroba bydlęca w proszku | MP Biomedicals | 290039601 | |
| Drożdże piwne | MP Biomericals | 02903312-CF | |
| Regulator CO2 | Zbiornik CO2 Randor | ||
| (kanister 20 #) | Zbiornik na CDBEVCARB20 Praxair | Treasure | |
| Gurus | KI-ENAMELMISKA | do separatora | |
| Waciki - duża | Fisher Scientific | 22-456-883 | |
| Kubki delikatesowe z pokrywkami - 470 ml | Pactiv DELItainer | PCTYSD2516 | |
| Kubki delikatesowe z pokrywkami - 1900 ml | Berry Global | T60764 | |
| DoseReader 4 | ND0.5 i ND1.0 QA Zestaw filtrów Standardy Folia | ||
| dozymetryczna | Far West Technology, Inc. | ||
| Bibuła filtracyjna | Millipore | AP10045S0 | |
| Aspirator latarki | Bioquip | 2809D | |
| Kleszcze - drobne piórka | Bioquip | 4748 lub 4750 | o wadze piórkowej |
| GAFchromowa | folia radiochromowa | ||
| Gammator M | Radiation Machinery Corporation, Parsippany, NJ | Cesium-137 promiennik | |
| Ręczny aspirator mechaniczny | Clarke Mosquito | 13500 | |
| Prezerwatywy ze skóry jagnięcej | Trojan | Naturalamb | |
| Duża komora CO2 | Sterilite | Walmart # | |
| Patelnie do odchowu larw | Blue Ridge Thermoforming& | nbsp; 01-FG-400-3N-ABS | Wymiary: 22,375 x 17,5 x 3 (cale) |
| Magnesy - 20 # ciągnięcie Magnesy | Master | MHHH20BX | |
| Barwnik do znakowania | Dayglo | ECO-11 | Aurora Różowy |
| Barwnik do znakowania | Dayglo | ECO-17 | Saturn Yellow |
| Mesh | Falk | T301 | |
| Pipety pastwiskowe | Thermo Scientific | 02-708-006 | |
| Szalki Petriego - duże | VWR International | 25384-090 CS | |
| Szalki Petriego - małe (60 mm x 15 mm) | Marka Fisher FB0875713A | ||
| Separator poczwarek | J.W. Hock | 1512 | |
| Czerwony wąż gumowy | Welch | 331040-5 | |
| Pojemniki zwalniające | Science Supplies WLE corp | 1 galon | |
| Gumki recepturki - krzyż #19 | Alliance | ALL37196 | |
| Gumki recepturki - latitude #64 | Skillcraft | NSN0589974 | |
| Scale | Ohaus | H-4737 | |
| Papier do kiełkowania nasion - Ciężki materiał 76# | Anchor Paper | #76 | |
| Chłodziarki transportowe - 16 x 13 x 12.5" | MrBoxonline.com | Zestaw | |
| Sito #20 | Advantech | 20BS8F | |
| Sito #30 | Advantech | 30BS8F | |
| Mała klatka - Bug Dorm | MegaView | Bug Dorm-1 | |
| Mała komora CO2 | Filary | Walmart # | |
| Pokrywka do sufletu | SOLO | 41165277456 | |
| Kubki sufletowe - 4 uncje (1 uncja = 29.6 ml) | SOLO | 41165024104 | |
| Gąbka | ocelo | MMM7274FD | |
| Butelka do wyciskania | Dynalon | 3UUP6 | |
| Stereoskop | Meiji Techno | EMZ-5 | |
| Pończocha | BSN Medyczna | 30-1006 | |
| Styropianowa | ekstrudowana pianka polistyrenowa | ||
| Pokarm w płatkach ryb tropikalnych | Tetra | 4,52 funta | |
| Komora próżniowa - eksykator | BelArt | T9FB892757 | |
| Łodzie wagowe | Globe Scientific | 3621 |
Bibliografia
- Moyes, C. L., et al. Contemporary status of insecticide resistance in the major Aedes vectors of arboviruses infecting humans. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (7), 0005625(2017).
- Baldacchino, F., et al. Control methods against invasive Aedes mosquitoes in Europe: a review. Pest Management Science. 71 (11), 1471-1485 (2015).
- Burkett, D. A., Cope, S. E., Strickman, D. A., White, G. B. The Deployed Warfighter Protection (DWFP) Research Program: Developing new public health pesticides, application technologies, and repellent systems. Journal of Integrated Pest Management. 4 (2), 1-7 (2013).
- Harwood, J. F., et al. Controlling Aedes aegypti in cryptic environments with manually carried ultra-low volume and mist blower pesticide applications. Journal of the American Mosquito Control Association. 32 (3), 217-223 (2016).
- Morrison, A. C., Zielinski-Gutierrez, E., Scott, T. W., Rosenberg, R. Defining challenges and proposing solutions for control of the virus vector Aedes aegypti. PLoS Medicine. 5 (3), 68(2008).
- Klassen, W., Curtis, C. F. History of the sterile insect technique. Sterile insect technique: principles and practice in area-wide integrated pest management. InDyck, V. A., Hendrichs, J., Robinson, A. S. , Springer. Netherlands, Dordrecht. 3-36 (2005).
- Alphey, L., et al. Sterile-insect methods for control of mosquito-borne diseases: an analysis. Vector Borne and Zoonotic Diseases. 10 (3), 295-311 (2010).
- Dame, D. A., Curtis, C. F., Benedict, M. Q., Robinson, A. S., Knols, B. G. Historical applications of induced sterilisation in field populations of mosquitoes. Malaria Journal. 8, Suppl 2 (2009).
- FAO IAEA. Guidelines for colonization of Aedes mosquito species. Version 1.0. Maiga, H., et al. , Vienna, Austria. Available from: http://www.naweb.iaea.org/nafa/ipc/public/Guidelines-for-colonisation-of-Aedes-mosquito-species-v1.0.final.pdf (2018).
- Bond, J. G., et al. Optimization of irradiation dose to Aedes aegypti and Ae. albopictus in a sterile insect technique program. PloS One. 14 (2), 0212520(2019).
- Bourtzis, K., Lees, R. S., Hendrichs, J., Vreysen, M. J. B. More than one rabbit out of the hat: Radiation, transgenic and symbiont-based approaches for sustainable management of mosquito and tsetse fly populations. Acta Tropica. 157, 115-130 (2016).
- Carvalho, D. O., et al. Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e3579(2014).
- Carvalho, D. O., et al. Aedes aegypti lines for combined sterile insect technique and incompatible insect technique applications: the importance of host genomic background. Entomologia experimentalis et applicata. 168 (6-7), 560-572 (2020).
- FAO/IAEA. Guidelines for mass-rearing of Aedes mosquito species. Version 1.0. Maiga, H., et al. , Vienna, Austria. Available from: http://www-naweb.iaea.org/nafa/ipc/public/Guidelines-for-mass-rearingofAedes-mosquitoes_v1.0.pdf (2020).
- FAO/IAEA. Guidelines for mark-release-recapture procedures of Aedes mosquitoes. Bouyer, J., et al. , Vienna, Austria. Available from: http://www-naweb.iaea.org/nafa/ipc/public/Guidelines-for-MRR-Aedes_v1.0.pdf (2020).
- FAO/IAEA. Guidelines for Routine Colony Maintenance of Aedes Mosquito Species, Version 1.0. Maiga, H., et al. , Vienna, Austria. Available from: http://www-naweb.iaea.org/nafa/ipc/public/guidelines-for-routine-colony-maintenance-of-Aedes-mosquito-species-v1.0.pdf (2017).
- Mamai, W., et al. Aedes aegypti larval development and pupal production in the FAO/IAEA mass-rearing rack and factors influencing sex sorting efficiency. Parasite. 27, 43(2020).
- Zheng, X., et al. Incompatible and sterile insect techniques combined eliminate mosquitoes. Nature. 572 (7767), 56-61 (2019).
- BEI Resources. Methods in Aedes Research. , Available from: https://www.beiresources.org/Portals/2/VectorResources/Methods%20in%20Aedes%20Research%202016.pdf (2016).
- Focks, D. A. An improved separator for the developmental stages, sexes, and species of mosquitoes (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 17 (6), 567-568 (1980).
- International Atomic Energy Agency. Manual of Dosimetry in Radiotherapy. Technical Reports Series No. 110. , Vienna. (1970).
- Aldridge, R. L., et al. Gamma-irradiation reduces survivorship, feeding behavior, and oviposition of female Aedes aegypti. Journal of the American Mosquito Control Association. 36 (3), 152-160 (2020).
- Cianci, D., et al. Estimating mosquito population size from mark-release-recapture data. Journal of Medical Entomology. 50 (3), 533-542 (2013).
- Knipling, E. F. The basic principles of insect population suppression and management. , United States Department of Agriculture. Washington, DC. (1979).
Przedruki i uprawnienia
