Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badania przesiewowe toksyczności w ludzkich organoidach siatkówki do odkryć farmaceutycznych

3.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62269

⸱

4 marca 2021

 ,  ,  , 
1Lowy Medical Research Institute, 2The Scripps Research Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy krok po kroku protokół generowania dojrzałych ludzkich organoidów siatkówki i wykorzystywania ich w teście toksyczności fotoreceptorów do identyfikacji kandydatów farmaceutycznych na chorobę zwyrodnieniową siatkówki związaną z wiekiem teleangiektazję plamki żółtej typu 2 (MacTel).

Streszczenie

Organoidy stanowią obiecującą platformę do badania mechanizmów chorobowych i metod leczenia, bezpośrednio w kontekście tkanek ludzkich z wszechstronnością i wydajnością hodowli komórkowych. Dojrzałe ludzkie organoidy siatkówki są wykorzystywane do badań przesiewowych potencjalnych metod leczenia farmakologicznego choroby zwyrodnieniowej siatkówki związanej z wiekiem teleangiektazji plamki żółtej typu 2 (MacTel).

Ostatnio wykazaliśmy, że MacTel może być spowodowany podwyższonym poziomem nietypowego gatunku lipidów, deoksysfingolipidów (deoksySLs). Te lipidy są toksyczne dla siatkówki i mogą powodować utratę fotoreceptorów, która występuje u pacjentów z MacTel. Aby przebadać leki pod kątem ich zdolności do zapobiegania toksyczności fotoreceptorów deoksySL, wygenerowaliśmy ludzkie organoidy siatkówki z linii pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) indukowanych przez MacTel i dojrzało je do wieku postmitotycznego, w którym rozwijają wszystkie komórki siatkówki pochodzące z linii neuronalnej, w tym funkcjonalnie dojrzałe fotoreceptory. Organoidy siatkówki potraktowano metabolitem deoxySL, a apoptozę zmierzono w warstwie fotoreceptorów za pomocą immunohistochemii. Korzystając z tego modelu toksyczności, przeprowadzono badania przesiewowe związków farmakologicznych, które zapobiegają śmierci fotoreceptorów wywołanej przez deoxySL. Stosując ukierunkowane podejście kandydujące, ustaliliśmy, że fenofibrat, lek powszechnie przepisywany w leczeniu wysokiego poziomu cholesterolu i trójglicerydów, może również zapobiegać toksyczności deoksySL w komórkach siatkówki.

Badanie toksyczności z powodzeniem zidentyfikowało zatwierdzony przez FDA lek, który może zapobiec śmierci fotoreceptorów. Jest to bezpośrednie możliwe do zastosowania odkrycie ze względu na testowany model o wysokim znaczeniu dla choroby. Platformę tę można łatwo modyfikować w celu testowania dowolnej liczby stresorów metabolicznych i potencjalnych interwencji farmakologicznych w celu odkrycia przyszłych metod leczenia chorób siatkówki.

Wprowadzenie

Modelowanie chorób ludzkich w hodowlach komórkowych i modelach zwierzęcych dostarczyło nieocenionych narzędzi do odkrywania, modyfikowania i walidacji terapii farmakologicznej, umożliwiając im przejście od kandydującego leku do zatwierdzonej terapii. Chociaż połączenie modeli in vitro i in vivo z udziałem innych niż ludzie od dawna stanowi kluczowy element procesu opracowywania leków, często nie są one w stanie przewidzieć skuteczności klinicznej nowych kandydatów na leki1. Istnieje wyraźna potrzeba opracowania technologii, które wypełnią lukę między uproszczonymi monokulturami komórkowymi a badaniami klinicznymi. Ostatnie osiągnięcia technologiczne w zakresie samoorganizujących się trójwymiarowych kultur tkankowych, organoidów, poprawiły ich wierność w stosunku do modelowanych tkanek, co czyni je obiecującymi narzędziami w procesie przedklinicznego opracowywania leków2.

Główną przewagą hodowli komórek ludzkich nad modelami in vivo innymi niż ludzkie jest możliwość odtworzenia specyficznych zawiłości ludzkiego metabolizmu, które mogą się znacznie różnić nawet między kręgowcami wyższego rzędu, takimi jak ludzie i myszy3. Jednak ta specyfika może zostać przyćmiona przez utratę złożoności tkanki; Tak jest w przypadku tkanki siatkówki, w której wiele typów komórek jest misternie splecionych i ma unikalną symbiotyczną interakcję metaboliczną między podtypami komórkowymi, której nie można powielić w monokulturze4. Ludzkie organoidy, które zapewniają kopię złożonych tkanek ludzkich z dostępnością i skalowalnością hodowli komórkowej, mają potencjał, aby przezwyciężyć braki tych platform do modelowania chorób.

Organoidy siatkówki pochodzące z komórek macierzystych okazały się szczególnie wierne w modelowaniu złożonej tkanki ludzkiej siatkówki nerwowej5. To sprawiło, że model organoidu siatkówki stał się obiecującą technologią do badania i leczenia chorób siatkówki6,7. Do tej pory większość modelowania chorób w organoidach siatkówki koncentrowała się na monogenowych chorobach siatkówki, w których organoidy siatkówki pochodzą z linii iPSC z chorobotwórczymi wariantami genetycznymi7. Są to na ogół wysoce penetrujące mutacje, które objawiają się jako fenotypy rozwojowe. Mniej skutecznie wykonano w zakresie chorób związanych ze starzeniem się, w których mutacje genetyczne i stresory środowiskowe wpływają na tkanki, które rozwijają się normalnie. Choroby neurodegeneracyjne związane ze starzeniem się mogą mieć złożone dziedziczenie genetyczne i wpływ stresorów środowiskowych, które są z natury trudne do modelowania przy użyciu krótkoterminowych hodowli komórkowych. Jednak w wielu przypadkach te złożone choroby mogą łączyć się ze zwykłymi stresorami komórkowymi lub metabolicznymi, które po przetestowaniu na w pełni rozwiniętej tkance ludzkiej mogą dostarczyć potężnego wglądu w choroby neurodegeneracyjne związane ze starzeniem się8.

Choroba zwyrodnieniowa plamki żółtej o późnym początku, teleangiektazja plamkowa typu II (MacTel), jest doskonałym przykładem genetycznie złożonej choroby neurodegeneracyjnej, która łączy się w powszechny defekt metaboliczny. MacTel to rzadka choroba zwyrodnieniowa siatkówki wynikająca ze starzenia się, która powoduje utratę fotoreceptorów i gleju Müllera w plamce żółtej, co prowadzi do postępującej utraty widzenia centralnego9,10,11,12,13. W MacTel nieokreślone, prawdopodobnie wieloczynnikowe, dziedziczenie genetyczne powoduje powszechne zmniejszenie krążącej seryny u pacjentów, co skutkuje wzrostem neurotoksycznej formy lipidów zwanej deoksysfingolipidami (deoxySL)14,15. Aby udowodnić, że akumulacja deoxySL jest toksyczna dla siatkówki i zwalidować potencjalne terapie farmaceutyczne, opracowaliśmy ten protokół do badania toksyczności fotoreceptorów w organoidach ludzkiej siatkówki14.

Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół różnicowania ludzkich organoidów siatkówki, ustalania testu toksyczności i ratowania za pomocą organoidów oraz ilościowego określania wyników. Podajemy udany przykład, w którym określamy specyficzną dla tkanki toksyczność podejrzewanego czynnika chorobotwórczego, deoxySL, i walidujemy stosowanie bezpiecznego leku generycznego, fenofibratu, w potencjalnym leczeniu toksyczności siatkówki wywołanej przez deoksySL. Wcześniejsze prace wykazały, że fenofibrat może zwiększać degradację deoxySL i obniżać krążący deoxySL u pacjentów, jednak jego skuteczność w zmniejszaniu toksyczności siatkówkowej wywołanej przez deoksySL nie została przetestowana16,17. Chociaż przedstawiamy konkretny przykład, protokół ten może być wykorzystany do oceny wpływu dowolnej liczby stresorów metabolicznych/środowiskowych i potencjalnych leków terapeutycznych na tkankę siatkówki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Rozmrażanie, przechodzenie i rozszerzanie iPSC/ESC

UWAGA: Dla wszystkich etapów hodowli komórek, stosuj najlepsze praktyki w celu utrzymania sterylnej hodowli komórek.

  1. Pokryj 6-dołkową płytkę do hodowli komórkowych podłożem z matrycą błony podstawnej.
    1. Aby przygotować 1x tego podłoża, postępuj zgodnie ze specyfikacją produktu lub rozcieńczyć 75 μl zimnej pożywki z 9 ml DMEM/F12. Dodaj 1,5 ml świeżo przygotowanego 1x podłoża na dołek do płytki 6-dołkowej. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    2. Odessać podłoże z matrycy błony podstawnej i przepłukać każdą studzienkę 3 ml DMEM/F12. Dodać 2 ml DMEM/F12 i inkubować w temperaturze 37 °C aż do użycia. Zużyj talerz w dniu, w którym jest przygotowany.
  2. Przygotować 10 mM roztwór podstawowy inhibitora skał (dichlorowodorku Y-27632) w PBS i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
  3. Rozmrozić fiolkę z iPSC/ESC w pożywce DMEM/F12 i odwirować przy 400 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w pożywce mTeSR. Umieścić 1 fiolkę z komórkami w powlekanym 6-dołkowym dołku w pożywce mTeSR z 10 μM inhibitora skalnego (dichlorowodorek Y-27632) i inkubować przez noc w inkubatorze. Następnego dnia odessaj pożywkę i dodaj z powrotem tylko mTeSR.
    UWAGA: Zmieniaj nośnik codziennie, aż do przejścia.
  4. Przygotować 0,5 mM EDTA w PBS, rozcieńczając 500 μl 0,5 M EDTA w 500 ml PBS.
  5. Komórki pasażowe, gdy osiągną 80-90% konfluencji. Podziel komórki 1:3 lub 1:6 na dołek, w zależności od tempa wzrostu komórek.
    1. Aby usunąć przylegające komórki z płytki, należy odessać pożywkę i inkubować z 0,5 mM EDTA w PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji usunąć roztwór EDTA i oderwać komórki, wyrzucając na siłę 1 ml pożywki mTeSR do komórek za pomocą pipety p1000.
    2. Kontynuuj zasysanie i mocne wyrzucanie pożywki mTeSR i komórek, do 5x, aby usunąć przylegające pozostałe komórki. Umieść komórki na świeżej, pokrytej matrycą 6-dołkową płytkę z błoną podstawną, z pożywką mTeSR. Kontynuuj codzienną wymianę pożywki, aż płytki ponownie osiągną 80-100% zbieżności.
  6. Gdy komórki rozszerzą się do pełnej 6-dołkowej płytki i osiągną 80-100% konfluencji, odłóż na bok jedną studzienkę, aby rozszerzyć linię komórkową do kolejnych różnicowań lub zamrozić w celu kriokonserwacji. Użyj pozostałych pięciu dołków, aby rozpocząć proces różnicowania poprzez tworzenie ciał embrionalnych.

2. Tworzenie ciał embrionalnych (EBs)

UWAGA: Przepisy na tworzenie i różnicowanie pożywek EB pochodzą z protokołów w Cowan et al.5, Ohlemacher et al.18, oraz Zhong et al.19.

  1. Przygotuj 1x roztwór dispazy i pożywkę do indukcji neuronalnej (NIM) zgodnie z poniższym opisem.
    1. Przygotować 10 mg/ml 5x roztworu podstawowego leku Dispase, rozpuszczając proszek w DMEM/F12. Sterylny filtr z filtrem 0,22 μm. Przechowywać 1 ml porcji w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
    2. Używając 5x roztworu Dyspazy, przygotuj 1 ml / studzienkę 2 mg / ml Dispase w DMEM/F12. Ogrzewać roztwór w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    3. Przygotować NIM, uzupełniając DMEM/F12 1% suplementem N2, 1% MEM NEAA i 2 mg/ml heparyny w stężeniu 180 U/mg. NIM może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca.
  2. Przygotować i ogrzać 16 ml mieszaniny 3:1 roztworu mTeSR:NIM (12 ml:4 ml) do temperatury pokojowej.
  3. Usuń zróżnicowane komórki i dodaj ciepły roztwór Dispase.
    1. Usuń różnicujące się komórki z hodowli komórkowej iPSC/ESC. Pod lunetą preparacyjną zeskrob nieprzezroczyste białe kolonie za pomocą końcówki pipety p10. Odessać pożywkę mTeSR z dołków hodowlanych. Spowoduje to usunięcie zróżnicowanych grudek, które zostały właśnie zeskrobane.
    2. Natychmiast dodać wstępnie podgrzany roztwór Dyspazy i inkubować w temperaturze 37 °C, aż większość krawędzi kolonii komórkowych zacznie się zwijać pod mikroskopem. Zajmie to 4-8 min.
      UWAGA: Czas inkubacji komórek w Dispase będzie musiał zostać określony dla każdego laboratorium. Czas trwania może się różnić w zależności od linii komórkowych, a w przypadku komórek, które były posiane przez 3 dni lub dłużej, wymagana jest dłuższa inkubacja. Wolno rosnące iPSC/ESC, które potrzebują więcej niż 3 dni, aby osiągnąć zbieg, zaczną przylegać z większą siłą do płytki, co utrudni oderwanie komórek. W przypadku wolno rosnących komórek spróbuj pasażować komórki w stosunku 1:2 w celu ekspansji do pełnej płytki 6-dołkowej, aby skrócić czas od posiewu do zgrywki.
  4. Odessać roztwór i delikatnie dodać z powrotem co najmniej 2 ml pożywki DMEM/F12 do dołka. Powoli dodawać pożywkę DMEM/F12 z boku studzienki, uważając, aby nie usunąć komórek.
    1. Odessać pożywkę DMEM/F12, a następnie na siłę dodać z powrotem świeży 1 ml DMEM/F12 bezpośrednio na komórki, aby podnieść kolonie komórek z płytki. Za pomocą pipety p1000 kilkakrotnie zasysaj i mocno wyrzucaj DMEM/F12 do studzienki, do 5x, aby usunąć jak najwięcej kolonii komórek.
      UWAGA: Różnicujące/zróżnicowane iPSC/ESC przylegają do płytki bardziej niż niezróżnicowane iPSC/ESC. Komórki, które nie odpadają przy wielokrotnym pipetowaniu, najlepiej pozostawić w tyle. Nadmierne pipetowanie zabija komórki i zmniejsza wydajność produkcji EB. Grudki komórek będą miały od 100 do 400 komórek na kępę.
  5. Przenieś pływające kolonie do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i przepłucz studzienki dodatkowym 1 ml pożywki DMEM/F12 na studzienkę, aby zebrać pozostałe pływające kolonie.
  6. Pozwól pływającym koloniom osiąść grawitacyjnie nie dłużej niż 5 minut. Po ustabilizowaniu usuń wszystko oprócz 1-2 ml supernatantu. Uważaj, aby nie poruszyć miękkiego granulatu na dnie.
  7. Zawiesić osad we wstępnie ogrzanym podłożu 3:1 mTeSR:NIM i przenieść do kolby T75 o bardzo niskim mocowaniu. Inkubować przez noc, aby umożliwić utworzenie EB. Będzie to traktowane jako Dzień 0 zróżnicowania.
  8. Stopniowo zmieniaj pożywkę na NIM, aby rozpocząć różnicowanie EB w neuronalne komórki progenitorowe.
    1. Następnego dnia usuń pożywkę i zastąp ją 10 ml pożywki 1:1 mTeSR:NIM. Aby usunąć pożywkę ze swobodnie pływającej kultury EB, należy przechylić kolbę do góry, tak aby EB zebrały się w dolnym rogu kolby. Odessać supernatant, uważając, aby nie zassać żadnego z EB w osadzie na dnie.
    2. Następnego dnia należy zastąpić pożywkę 10 ml pożywki 1:3 mTeSR:NIM.
    3. Następnego dnia wymień nośnik na pełny nośnik NIM. Kontynuuj zmianę pożywki co 2 dni z pożywką NIM do 7 dni po leczeniu lekiem Dispase.

3. Posiewanie EB i inicjowanie różnicowania neuronalnego siatkówki

  1. Tydzień po poddaniu działaniu dypazy, swobodnie unoszące się EB na 6-dołkowej płytce pokrytej podłożem o obniżonym współczynniku wzrostu pożywki z matrycą błony podstawnej. Aby pokryć płytę, patrz krok 1.1.
    1. Odessać zużyte pożywki z EB i zastąpić 12 ml NIM.
    2. Zapewnić równomierne rozprowadzenie EB w każdym dołku, mieszając pożywkę zawierającą EB w celu ponownego zawieszenia EB, a następnie szybko usuń 1/6 pożywki (2 ml) i dozuj do jednej studzienki. Powtórz dla pozostałych dołków.
    3. Przed inkubacją delikatnie potrząśnij płytką, w przód iw tył, a następnie z boku na bok, aby równomiernie rozprowadzić EB. Jeśli EB zbijają się w środku, nie różnicują się prawidłowo.
      UWAGA: Gęstość poszycia ma kluczowe znaczenie dla różnicowania. Upewnij się, że talerzyk jest większy niż 30 EB na dołek. Jeśli produkcja EB nie była wydajna, rozprowadź EB do mniejszej liczby odwiertów.
  2. Zmieniaj nośnik codziennie za pomocą nośnika NIM. Utrzymuj poziom pożywki w studzienkach na poziomie ~3 ml. Podczas zmiany pożywki usuń wszystkie oprócz 1 ml pożywki, aby nie wysuszyć platerowanych EB, i delikatnie dodaj 2 ml pożywki z boku studzienki, aby nie podnosić komórek z płytki.
  3. Dziewięć dni po posiewie EB należy rozpocząć zmianę podłoża z NIM na podłoże różnicujące siatkówkę (RDM) w ciągu dwóch dni.
    1. Przygotuj RDM, mieszając następujące składniki: 48% DMEM/F12 (1:1) i 48% DMEM uzupełnione 2% suplementem B27 bez witaminy A, 1% MEM NEAA i 1% Pen-Strep. Filtr sterylizować za pomocą filtra 0,20 μm. RDM może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca.
    2. Pierwszego dnia przełącz media na miks 1:1 NIM:RDM. Drugiego dnia zmień nośnik na RDM. Wszystkie kolejne dni karmią komórki RDM.
      UWAGA: W ciągu najbliższych kilku tygodni platerowane EB utworzą neuronalne komórki progenitorowe siatkówki, które zaczną generować widocznie pigmentowane RPE.

4. Tworzenie swobodnie pływających organoidów i utrzymywanie swobodnie pływających kultur organoidów

  1. Fragmentować posiane EB po 28 dniach od początkowego leczenia Dippase (21 dni po posiewie EB) za pomocą sterylnego skalpela w celu pocięcia siatki 1-2mm2 na platerowane EB. Spowoduje to rozdzielenie kolonii progenitorowych siatkówki na małe kawałki, dzięki czemu w późniejszym okresie rozwoju nie staną się zbyt duże i nekrozowe z powodu niewystarczającej wymiany składników odżywczych w ich środku.
  2. Odczepić platerowane EB.
    1. Aby to zrobić, najpierw dodaj dodatkowe 2 ml RDM do każdej studzienki. Następnie odessać ~1000 μL pożywki ze studzienek za pomocą pipety p1000. Teraz mocno wyrzuć nośnik bezpośrednio na platerowane EB z końcówką całkowicie zanurzoną.
    2. Powtarzaj tę czynność, aż wszystkie komórki zostaną wyjęte z płytki. Podczas wyrzucania pożywki należy trzymać końcówkę zanurzoną i nie należy wypychać tłoka pipety poza pierwszy ogranicznik, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza.
  3. Ponownie zawiesić oderwane kawałki EB w sterylnej plastikowej kolbie Erlenmeyera o pojemności 125 ml i napełnić kolbę ~40 ml pożywki RDM. Umieścić kolbę na wytrząsarce orbitalnej umieszczonej w standardowym inkubatorze. Ustaw prędkość wytrząsarki na 130-140 obr./min (ustawienie prędkości 3).
    UWAGA: Hodowla organoidów na shakerze zapobiega ich sklejaniu się podczas hodowli przy wyższym stężeniu organoidów. Bioreaktory również osiągają te same cele, ale wytrząsarka jest tańsza.
  4. Podawaj organoidy z częściową zmianą pożywki, zastępując około 12 ml RDM 2-3 razy w tygodniu, w zależności od tego, jak żółte staje się podłoże. Wczesne organoidy nie będą wymagały dużo karmienia, ale w miarę wzrostu będą wymagały częstszych zmian pożywek z większą liczbą pożywek.
  5. Przycinaj organoidy co dwa tygodnie, aby usunąć organoidy inne niż siatkówkowe, przerośnięte i umierające. Zapobiega to marnowaniu pożywki i poprawia zdrowie pozostałych organoidów siatkówki.
    1. Przenieść komórki z kolby na płytkę 6-dołkową lub naczynie o średnicy 10 cm za pomocą pipety o pojemności 5 ml. Zachowaj organoidy, które wykazują warstwowy nabłonek nerwowy (Ryc. 1A, gwiazdka). Te organoidy są przezroczyste i białe.
    2. Uporządkuj i usuń nieprawidłowo wykształcone lub przerośnięte organoidy siatkówki oraz organoidy niesiatkówkowe za pomocą pipety o pojemności 5 ml. Będą one na ogół nieprzezroczyste i żółtawe (Rysunek 1A). Usuń również wszystko, co nie wygląda jak rozwarstwiony nabłonek nerwowy. Pierwsze kilka przycinania będzie pracochłonne, ale za każdym kolejnym razem stanie się znacznie łatwiejsze, ponieważ organoidy staną się większe i bardziej jednorodne (Rysunek 1B).

5. Utrzymanie dojrzałych organoidów i różnicowanie ich do postmitotycznej tkanki siatkówki

  1. W 56 dniu (8 tydzień) po początkowym leczeniu Dispase w celu tworzenia EB (28 dni po wyhodowaniu usuniętych EB w kolbie) zmień podłoże organoidowe na RDM+. Zapewni to dodatkowe składniki odżywcze dla w pełni dojrzałych organoidów, takich jak tkanka siatkówki.
    1. Przygotuj 100 mM tauryny w PBS. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
    2. Przygotuj RDM+, uzupełniając RDM 10% FBS, 100 μM Tauryny i 2 mM komercyjny suplement glutaminy. Filtr sterylizować za pomocą filtra 0,20 μm.
    3. Kontynuuj wymianę nośnika RDM+ 2-3 razy w tygodniu.
  2. W 17-18 tygodniu (po leczeniu dippasą) przenieść organoidy z kolby Erlenmeyera na 6-dołkową płytkę o bardzo niskim nasadce za pomocą pipety o pojemności 5 ml. Przez pierwszy tydzień kontynuuj codzienne przycinanie i oddzielanie organoidów od siebie, aż organoidy przestaną się ze sobą sklejać. Optymalna gęstość to 10-15 organoidów na studzienkę. Zmieniaj media 2-3 razy w tygodniu.
    UWAGA: Zmniejsz liczbę organoidów w studzince, jeśli organoidy często przylegają do siebie lub jeśli pożywka zmienia kolor na bardzo żółty między zmianami pożywki.
  3. Spodziewaj się, że organoidy staną się w pełni postmitotyczne do 18 tygodnia5, gdy komórki nerwowe siatkówki są obecne przez cały czas. Do 24 tygodnia sprawdź, czy na zewnątrz organoidu nie tworzą się szczątkowe segmenty zewnętrzne. Do 26-28 tygodnia upewnij się, że zewnętrzne segmenty są grube na zewnątrz organoidów (Rysunek 1C). Przeprowadzić testy toksyczności po 26 tygodniu, gdy organoidy mają zdefiniowane zewnętrzne segmenty oznaczające dojrzały stan różnicowania.
    UWAGA: Do badania toksyczności należy używać tylko dobrze zróżnicowanych organoidów siatkówki. Przeprowadzenie testu toksyczności na organoidach z dobrze zdefiniowanymi segmentami zewnętrznymi pozwoli na ich identyfikację.

6. Deoksysfinganina (deoksySA) i leczenie farmakologiczne

UWAGA: Przedstawiono tutaj pojedynczą terapię fenofibratem w celu ratowania toksyczności deoksySA przez okres 4 dni (Rysunek 2). Stężenie deoksySA dodawanego do organoidów, czas trwania leczenia deoksySA na organoidach oraz rodzaj leku stosowanego do ratowania toksyczności14 można jednak modyfikować zgodnie z potrzebami eksperymentalnymi w celu oznaczenia toksyczności i toksyczności ratunkowej.

  1. Przygotować 1 mM roztwór podstawowy deoksySA w etanolu. Przechowywać w temperaturze -20 °C przez 1 miesiąc. Alternatywnie w DMSO można przygotować roztwór podstawowy deoksySA.
  2. Wykonać seryjne rozcieńczanie deoksySA w celu określenia odpowiedniego stężenia toksycznego deoksySA do ratowania leków.
    UWAGA: Najpierw określ stężenie deoksySA, które spowoduje śmierć komórki wystarczającą do zmierzenia efektu ratunkowego. Jeśli stężenie jest zbyt wysokie, reakcja toksyczna spowoduje rozpad organoidu i nie będzie można zaobserwować ratunku. Jeśli reakcja toksyczna jest zbyt niska, trudno będzie zaobserwować znaczący efekt ratunkowy. Reakcja toksyczna deoksySA może się różnić w zależności od laboratorium i partii po partii.
    1. Rozcieńczyć 1 mM roztwór podstawowy deoksySA do stężeń 0,5 μM, 1 μM i 2 μM w 3 ml RDM+ każdy. Dodać 3 μl etanolu do RDM+, aby przygotować zabieg kontrolny.
    2. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj sterylnej sondy, aby wybrać 4 grupy organoidów z co najmniej 5 organoidami na grupę. Podziel grupy na oddzielne dołki z 6-dołkową płytką o bardzo niskim mocowaniu. Wybierz organoidy, które mają w przybliżeniu ten sam rozmiar i kształt.
    3. Odessać jak najwięcej RDM+ z organoidów. Do każdej studzienki organoidów dodaj jedno stężenie deoksySA w RDM+. Dodaj kontrolę pojazdu do czwartej studzienki organoidów.
    4. Po dwóch dniach hodowli w deoksySA lub nośniku, zastąpić pożywkę świeżo przygotowanymi odpowiednimi rozcieńczeniami deoksySA w RDM+.
    5. W czwartym dniu leczenia należy przejść do kroku 7 w celu przetworzenia i oznaczenia organoidów pod kątem śmierci komórki. Po wybraniu stężenia deoksySA przejdź do kroku 6.3, aby leczyć fenofibratem.
      UWAGA: Docelowa śmierć komórek w wybranej grupie traktowanej deoksySA wynosi 5 - 20 komórek TUNEL dodatnich na 10 000 μm2. Organoidy nie powinny rozpadać się pod wpływem dotknięcia sondy w trakcie leczenia.
  3. Traktować organoidy wybraną toksyczną dawką deoksySA i fenofibratu.
    1. Przygotować 40 mM roztwór podstawowy fenofibratu w DMSO. Przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku.
    2. Przygotować pożywkę do leczenia lekiem: W 3 ml RDM+ rozcieńczyć 1 mM roztworu podstawowego deoksySA do 1 μM deoksySA i rozcieńczyć 40 mM roztworu podstawowego fenofibratu do 20 μM.
    3. Przygotować pożywkę do leczenia deoksySA: W 3 ml RDM+ rozcieńczyć 1 mM roztworu podstawowego deoksySA do 1 μM deoksySA i dodać 1,5 μl DMSO.
    4. Przygotuj pożywkę kontrolną: Do 3 ml RDM+ dodaj 3 μl etanolu i 1,5 μl DMSO.
    5. Pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą sterylnej sondy wybierz trzy grupy organoidów z co najmniej pięcioma organoidami na grupę. Podziel grupy na oddzielne dołki z 6-dołkową płytką o bardzo niskim mocowaniu.
    6. Dodać przygotowane zabiegi (deoksySA, deoksySA + fenofibrat lub kontrola) do organoidów. Po dwóch dniach zmienić pożywkę w studzienkach na świeżo przygotowany RDM+ uzupełniony odpowiednimi roztworami deoksySA / fenofibrat / kontrolnymi.
    7. W czwartym dniu leczenia należy przejść do etapu 7 w celu przetworzenia i oznaczenia organoidów pod kątem śmierci komórki (Rycina 2).

7. Osadzanie i kriosekcja organoidów

  1. Przygotuj świeże 4% PFA, dodając 1 ml ampułki 16% PFA do 3 ml PBS.
  2. Usuń pożywkę RDM+ z organoidów i spłucz raz PBS. Usuń jak najwięcej PBS z organoidów. Dodać 2 ml świeżo przygotowanego 4% PFA (w PBS) do organoidów i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Po 15 minutach inkubacji przepłukać organoidy dwukrotnie 2 ml PBS, a następnie przemyć w PBS przez 10 min.
    UWAGA: Przeprowadzić utrwalenie w dygestorium chemicznym i wyrzucić roztwór PFA oraz dwa kolejne płukania PBS do odpowiednio oznakowanego pojemnika na odpady PFA przechowywanego w dygestorium.
  4. Odessać cały PBS, a następnie dodać 20% sacharozy z PBS do utrwalonych organoidów. Upewnij się, że organoidy są zmieszane z roztworem sacharozy i nie pozostają w pęcherzyku PBS na wierzchu. Utrzymuj organoidy w roztworze sacharozy, aż opadną na dno roztworu sacharozy, tj. ~1 godzinę w temperaturze pokojowej. Utrwalone organoidy można przechowywać przez noc w roztworze sacharozy w temperaturze 4 °C.
  5. Osadź organoidy w roztworze OCT w formie do kriosekcji. Wiele organoidów na stan można osadzić w jednej formie. Zorientuj organoidy, upewniając się, że ich najlepsze obszary siatkówki zostaną przecięte na kriostacie, a środek organoidów znajduje się mniej więcej w tej samej płaszczyźnie. Osadzone organoidy należy zamrozić w temperaturze -20 °C. Osadzone organoidy można przechowywać w temperaturze -80 °C przez lata.
    UWAGA: Organoidy są trudne do zauważenia w zamrożonym OCT; Zorientuj klastry RPE w kierunku strony formy, która będzie skierowana w stronę ostrza, aby ułatwić identyfikację organoidów.
  6. Kriosekcja organoidów na odcinki o grubości 10-14 μm i przyleganie do szkiełek nasączonych poli-lizyną. Podczas kriosekcji należy wielokrotnie sprawdzać szkiełka pod mikroskopem, aby zidentyfikować sekcje zawierające środek organoidów. Zbieraj tylko środkowe plasterki organoidów, w których wszystkie warstwy są równomiernie reprezentowane (Rysunek 2A-C, Rysunek 3). Po pocięciu na sekcje szkiełka można przechowywać w pudełku na szkiełka w temperaturze -80 °C przez lata.
    UWAGA: Plastry pobrane na końcach organoidu będą nadmiernie próbkować najbardziej zewnętrzne fotoreceptory i nie nadają się do oznaczania ilościowego. Organoidy średniej wielkości zapewnią 10-15 plasterków środka organoidu, który reprezentuje przekrój warstwowych warstw siatkówki.

8. Barwienie TUNEL dla komórek apoptotycznych

  1. Rozmrażanie zamrożonych szkiełek należy rozmrażać przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Natychmiastowe umieszczenie szkiełek w temperaturze 37 °C zapobiega kondensacji. Próbki tkanek nasączone czystą wodą mogą zniekształcić tkankę. Inkubacja w temperaturze 37 °C poprawia również przyleganie tkanki do szkiełka podstawowego.
  2. Utwórz ciągłą obwódkę na szkiełku podstawowym wokół odcinków tkanki za pomocą pisaka hydrofobowego. Zapewni to granicę i zapewni odpowiednie utrwalenie i inkubację przeciwciał przy małej objętości roztworów. Dodaj około 100-200 μL (objętość wypełni obszar z hydrofobową granicą bez rozlewania) świeżo przygotowanego 4% PFA przez 20 minut. Wykonać utrwalenie w dygestorii chemicznej i wylać roztwór PFA do odpowiednio oznakowanego pojemnika na odpady PFA przechowywanego w dygestorium.
  3. Spłucz szkiełka raz w PBS, a następnie pierz w PBS przez 25 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Przygotować mieszaninę TUNEL. Rozmrozić zarówno fioletowe, jak i niebieskie fiolki z zestawu do wykrywania śmierci komórek in situ. Pobrać 100 μl roztworu z fioletowej fiolki (można użyć do kontroli ujemnej) i połączyć pozostałe 450 μl roztworu z fioletowej fiolki z 50 μl roztworu z niebieskiej fiolki. Dobrze wymieszaj i trzymaj w ciemności. Każdy zestaw fiolek (łącznie 500 μl) może zabarwić 5-10 szkiełek.
  5. Przepuszczalne plastry tkanki.
    1. Przygotuj roztwór przepuszczalny: PBS z 0,1% TritonX-100 i 0,1% cytrynianem sodu
    2. Usuń PBS z preparatów próbnych, a następnie dodaj roztwór do przepuszczalności do próbek. Inkubować przez 2 minuty na bloku lodu lub w temperaturze 4 °C. Następnie spłucz raz w PBS, a następnie umyj w PBS przez 10 minut.
  6. Usuń PBS i osusz jak najwięcej roztworu, używając rogu złożonej chusteczki. Do próbek dodać 50-100 μL przygotowanej mieszaniny TUNEL, w zależności od wielkości obszaru pobranego przez pisak hydrofobowy. Przykryć szkiełkiem nakrywkowym i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w ciemności.
    UWAGA: Wszystkie inkubacje i płukanie dla poniższych etapów należy wykonywać w ciemności, aby zapobiec bieleniu fluoroforów. Użyj ciemnego pudełka lub przykryj szkiełka folią aluminiową, aby zablokować światło.
  7. Oznacz fotoreceptory. Spłucz raz PBS, a następnie praj przez 20 minut w PBS. Usuń PBS, a następnie dodaj pierwszorzędowe przeciwciało Recoverin (królicze przeciwciało anty-Recoverin) rozcieńczone w stosunku 1:500 w PBS z 0,1% Tween i 5% surowicą osła. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
  8. Po usunięciu przeciwciała pierwszorzędowego spłukać raz w PBS, a następnie myć w PBS przez 20 minut. Dodać przeciwciało drugorzędowe, anty-królik osła z pomarańczowym lub czerwonym fluoroforem, rozcieńczone w stosunku 1:1,000 w PBS z 0,1% Tween i 5% surowicą osła i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Spłukać raz PBS, a następnie myć przez 20 minut w PBS. Dodaj DAPI w stosunku 1:1000 do PBS, inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  9. Spłucz raz PBS, a następnie praj przez 20 minut w PBS. Usuń PBS i dodaj nośnik instalacyjny. Dodaj szkiełko nakrywkowe, uszczelnij lakierem do paznokci i pozostaw do wyschnięcia w ciemności. Szkiełka można przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemnym pojemniku do 1 tygodnia.
    UWAGA: Aby uzyskać najlepszą jakość obrazu, rób zdjęcia następnego dnia.

9. Obrazowanie wycinków organoidów i ilościowe określanie śmierci.

UWAGA: Obrazowanie wymaga mikroskopu konfokalnego z możliwością rozróżnienia trzech kanałów fluoroforowych. W tym eksperymencie wykorzystano kanały zielony (Alexa Fluor 488), pomarańczowy (Alexa Fluor 555) i UV (DAPI). Można zastosować dowolną kombinację fluoroforów, zapewniając, że emisje nie przedostają się do innych kanałów.

  1. Zlokalizuj skrawki siatkówki do obrazowania i oceny ilościowej. Pod małym powiększeniem mikroskopu (5x lub 10x) użyj barwienia Recoverin, które oznacza cytoplazmę fotoreceptorów, oraz barwienia DAPI, które oznacza jądra wszystkich komórek, aby zlokalizować obszar pokrojonego organoidu, który jest nienaruszony, dobrze uformowany i w płaszczyźnie, która pobiera reprezentatywny przekrój organoidu (Rysunek 2 i Rysunek 3). Znajdź sekcję, która ma wyraźną zewnętrzną warstwę jądrową fotoreceptorów, która ma grubość co najmniej kilku komórek, oraz oddzielną i odrębną warstwę jąder, które nie mają barwienia Recoverin (Rysunek 2 i Rysunek 3).
  2. Wykadruj obraz. Zwiększ powiększenie mikroskopu do obiektywu 20x i wykadruj szkiełko tak, aby wypełnić obraz jak największą warstwą fotoreceptora (Rysunek 3).
  3. Ustaw płaszczyznę Z. Jeśli używasz mikroskopu, który obrazuje stosy Z, ustaw górną i dolną granicę zakresu Z, aby zobrazować całą głębokość przekroju. Użyj tej samej grubości stosu Z dla wszystkich obrazów w zestawie eksperymentalnym, tak aby ta sama ilość tkanki była oznaczana we wszystkich próbkach. Jeśli nie używasz mikroskopu, który obrazuje stosy Z, ustaw ostrość obrazu na środku plasterka.
  4. Zobrazuj wszystkie trzy kanały fluoroforów w akwizycji stosu Z. Wszystkie trzy kanały są wymagane do pozytywnej identyfikacji umierającej komórki. Obraz jeden obszar na organoid.
  5. Zapisz zestaw obrazów w formacie pliku, który zachowuje stosunek powierzchni do piksela.

10. Kwantyfikacja umierających komórek

  1. Otwórz stosy obrazów w oprogramowaniu FIJI (Image J). W oknie Opcje importu formatów biologicznych upewnij się, że w sekcji "podziel na osobne okna" nie są zaznaczone żadne pola. Przewijanie między wyrównanymi kanałami obrazu ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej identyfikacji komórek.
  2. Spłaszcz zestaw obrazów Z-stack, klikając Image > Stacks, a następnie wybierz "Projekt Z" z menu rozwijanego. Spowoduje to utworzenie nowego obrazu do oceny ilościowej. Jeśli organoidy nie zostały zobrazowane w serii Z, pomiń ten krok.
  3. Wybierz kanał obrazu, na którym widoczne jest barwienie Recoverin (w tym przykładzie kolor czerwony). Kliknij narzędzie do zaznaczania wielokątów na pasku narzędzi i nakreśl ciągły obszar fotoreceptorów na obrazie (Rysunek 3A). Kliknij Analizuj > ustaw pomiary. W wyskakującym oknie Ustaw pomiary zaznacz pole obok opcji Obszar, kliknij Analizuj i wybierz Zmierz, aby zmierzyć obszar (lub naciśnij "m" jako skrót) fotoreceptorów, aby policzyć umierające komórki. Pomiar powierzchni pojawi się w wyskakującym oknie pomiarów.
  4. Policz jądra TUNEL-dodatnie w wcześniej wybranym regionie fotoreceptora (Rysunek 3B,C). Kliknij prawym przyciskiem myszy narzędzie punktowe na pasku narzędzi i wybierz narzędzie wielopunktowe. Tylko w kanale TUNEL kliknij barwienie dodatnie TUNEL, które nakłada się na jądra dodatnie DAPI i barwienie Recoverin. Przełączaj się między kanałami, aby zweryfikować pozytywne komórki.
  5. Podziel liczbę komórek dodatnich TUNEL przez obszar, aby uzyskać znormalizowaną wartość śmierci komórki w fotoreceptorach na organoid (Rysunek 2D, E).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Organoidy siatkówki wygenerowano z kontrolnej linii iPSC nieobciążonej zespołem MacTel. Po osiągnięciu przez organoidy 26 tygodnia hodowli zostały one wyselekcjonowane i podzielone na grupy eksperymentalne. Organoidy poddano działaniu różnych stężeń deoxySA, aby ustalić, czy deoxySA jest toksyczny dla fotoreceptorów. Przetestowano cztery stężenia deoxySA, od 0 do 1 µM (Rysunek 2), a organoidy traktowano przez 8 dni, wymieniając pożywkę co drugi dzień. Śmierć komórek w odpowiedzi na deoxySA j...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Warianty protokołu różnicowania
Od czasu wynalezienia samoformujących się miseczek wzrokowych przez grupę20 Yoshiki Sasai, wiele laboratoriów opracowało protokoły generowania organoidów siatkówki, które mogą się zmieniać prawie na każdym kroku 5,18,19,21. Wyczerpująca lista protokołów znajduje się w Capowski et al.22. Przedst...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Wspierane przez Lowy Medical Research Institute. Serdecznie dziękujemy rodzinie Lowy za wsparcie projektu MacTel. Chcielibyśmy podziękować Mari Gantner, Mike'owi Dorrellowi i Lei Scheppke za ich wkład intelektualny i pomoc w przygotowaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,5 mln EDTAInvitrogen15575020
125 ml Kolby ErlenmeyeraVWR89095-258
1-deoksysfinganinaAvanti
B27 Suplement, bez witaminy AGibco12587010
Beaver 6900 Mini-BladeBeaver-VisitecBEAVER6900
D-(+)-sacharozaVWR97061-432
DAPIThermo-fisherD1306
Dispase II, proszekGibco17105041
DMEM, wysoka glukoza, pirogronianGibco11995073
DMEM/F12Gibco11330
Oślica przeciw królikom Ig-G, Alexa Fluor plus 555Thermo-fisherA32794
osła surowicaSigmaD9663-10ML
FBS, Inaktywowany termicznieCorning45001-108
FenofibratSigmaF6020
GlutamaxGibco35050061
HeparinStemcell Technologies7980
Zestaw do wykrywania śmierci komórek in situ, FluorescinSigma11684795910
Matrigel, Obniżony czynnik wzrostuCorning356230
MEM Roztwór aminokwasów endogennychGibco11140050
mTeSR 1Stemcell Technologies85850
Suplement N2Gibco17502048
Penicylina-StreptomycynaGibco15140122
Pierce 16% FormaldehydThermo-fisher28906
Królicze przeciwciało anty-RecoverinMilliporeAB5585
Cytrynian soduSigmaW302600
Steriflip Sterylne jednorazowe filtry próżnioweMilliporeSigmaSE1M179M6
Taurine SigmaT0625
Tissue Plus- Związek O.C.T.Fisher Scientific23-730-571
Tissue-Tek CryomoldEMS62534-10
Triton X-100SigmaX100
Tween-20SigmaP1379
Ultra-Niska nasadka 6-dołkowaPłytki Corning29443-030
Ultra-Niska nasadka 75cm2 U-FlaskCorning3814
System filtracji próżniowejVWR10040-436
Nośnik do montażu Vectashieldwektor LabsH-1000
długopis woskowy-ImmEdgewektor LabsH-4000
Y-27632 Dichlorowodorek (inhibitor skały)SigmaY0503
860493

Bibliografia

  1. Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Review Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
  2. Khalil, A. S., Jaenisch, R., Mooney, D. J. Engineered tissues and strategies to overcome challenges in drug development. Advances in Drug Delivery Reviews. 158, 116-139 (2020).
  3. Demetrius, L. Of mice and men. When it comes to studying ageing and the means to slow it down, mice are not just small humans. EMBO Reports. , 6 Spec No 39-44 (2005).
  4. Lindsay, K. J., et al. Pyruvate kinase and aspartate-glutamate carrier distributions reveal key metabolic links between neurons and glia in retina. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111 (43), 15579-15584 (2014).
  5. Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
  6. Kruczek, K., Swaroop, A. Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies. Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).
  7. Sinha, D., Phillips, J., Phillips, M. J., Gamm, D. M. Mimicking retinal development and disease with human pluripotent stem cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (5), 1-9 (2016).
  8. Gan, L., Cookson, M. R., Petrucelli, L., La Spada, A. R. Converging pathways in neurodegeneration, from genetics to mechanisms. Nature Neuroscience. 21 (10), 1300-1309 (2018).
  9. Aung, K. Z., Wickremasinghe, S. S., Makeyeva, G., Robman, L., Guymer, R. H. The prevalence estimates of macular telangiectasia type 2: the Melbourne collaborative cohort study. Retina. 30 (3), 473-478 (2010).
  10. Chew, E. Y., et al. Effect of ciliary neurotrophic factor on retinal neurodegeneration in patients with macular telangiectasia type 2: A randomized clinical trial. Ophthalmology. 126 (4), 540-549 (2019).
  11. Gass, J. D., Blodi, B. A. Idiopathic juxtafoveolar retinal telangiectasis. Update of classification and follow-up study. Ophthalmology. 100 (10), 1536-1546 (1993).
  12. Klein, R., et al. The prevalence of macular telangiectasia type 2 in the Beaver Dam eye study. American Journal of Ophthalmology. 150 (1), 55-62 (2010).
  13. Powner, M. B., et al. Loss of Muller's cells and photoreceptors in macular telangiectasia type 2. Ophthalmology. 120 (11), 2344-2352 (2013).
  14. Gantner, M. L., et al. Serine and lipid metabolism in macular disease and peripheral neuropathy. New England Journal of Medicine. 381 (15), 1422-1433 (2019).
  15. Scerri, T. S., et al. Genome-wide analyses identify common variants associated with macular telangiectasia type 2. Nature Genetics. 49 (4), 559-567 (2017).
  16. Alecu, I., et al. Cytotoxic 1-deoxysphingolipids are metabolized by a cytochrome P450-dependent pathway. Journal of Lipid Research. 58 (1), 60-71 (2017).
  17. Othman, A., et al. Fenofibrate lowers atypical sphingolipids in plasma of dyslipidemic patients: A novel approach for treating diabetic neuropathy. Journal of Clinical Lipidology. 9 (4), 568-575 (2015).
  18. Ohlemacher, S. K., Iglesias, C. L., Sridhar, A., Gamm, D. M., Meyer, J. S. Generation of highly enriched populations of optic vesicle-like retinal cells from human pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 32, 1-20 (2015).
  19. Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communication. 5, 4047(2014).
  20. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  21. Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells. Science Reports. 7 (1), 766(2017).
  22. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
  23. Luo, Z., et al. An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation. Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).
  24. Ovando-Roche, P., et al. Use of bioreactors for culturing human retinal organoids improves photoreceptor yields. Stem Cell Research Therapy. 9 (1), 156(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Telengiektazja plamkitoksyczno deoksysfingolipid wmier fotoreceptor wimmunohistochemiaindukowane pluripotencjalne kom rki macierzystemetabolizm lipid wleczenie fenofibratem
Badania przesiewowe toksyczności w ludzkich organoidach siatkówki do odkryć farmaceutycznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.