Artykuł metodologiczny

Przygotowanie mikroskopowej siatki krioelektronowej do badań rozdzielczych w czasie przy użyciu nowatorskiego systemu robotycznego, Spotiton

DOI:

10.3791/62271

⸱

25 lutego 2021

 ,  ,  ,  , 
1The National Resource for Automated Molecular Microscopy, Simons Electron Microscopy Center, New York Structural Biology Center, 2piTree Software

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół przedstawiony tutaj opisuje użycie Spotiton, nowatorskiego systemu robotycznego, do dostarczenia dwóch interesujących próbek na samozasłaniającą się, nanodrucianą siatkę, które mieszają się przez minimum 90 ms przed zeszkleniem w płynnym kriogenie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uchwycenie krótkotrwałych stanów molekularnych wywołanych wczesnym spotkaniem dwóch lub więcej oddziałujących ze sobą cząstek nadal jest eksperymentalnym wyzwaniem o dużym zainteresowaniu dla dziedziny mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM). Opracowano kilka strategii metodologicznych, które wspierają te badania "rozdzielcze w czasie", z których jedna, Spotiton - nowatorski system robotyczny - łączy dozowanie kropel próbki wielkości pikolitrów z precyzyjną kontrolą czasową i przestrzenną. Przepływ pracy Spotiton z rozdzielczością czasową oferuje wyjątkowo wydajne podejście do badania wczesnych zmian strukturalnych przy minimalnej objętości próbki. Wystrzeliwane z niezależnie sterowanych dozowników piezoelektrycznych, dwie próbki lądują i szybko mieszają się na nanoprzewodowej siatce EM, gdy zanurza się w kierunku kriogenu. Potencjalnie setki siatek można przygotować w krótkim odstępie czasu z zaledwie kilku mikrolitrów próbki. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół działania systemu Spotiton krok po kroku, z naciskiem na rozwiązywanie konkretnych problemów, które pojawiają się podczas przygotowywania sieci.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Potencjał cryo-EM do wychwytywania i ujawniania przejściowych stanów konformacyjnych białek w subsekundowej skali czasowej (krio-EM rozdzielczy czasowo) został wykorzystany przez kilka grup, począwszy od Berrimana i Unwina1, których technika opiera się na standardowej metodzie zamrażania wgłębnego opracowanej przez Dubocheta do przygotowania siatek krio-EM2. Dodali atomizer tuż nad kubkiem kriogenicznym, który wykorzystywał sprężony azot do rozpylania drobnej mgły drugiej próbki na zanurzającą się siatkę EM zawierającą pierwszą próbkę, która została nałożona i osuszona do cienkiej warstwy wodnej. Chociaż system ten mógł osiągnąć czas mieszania nawet 1 ms, nadal wymagał ręcznego osuszania pierwszej próbki przez użytkownika - co było technicznie trudnym zadaniem - i stosunkowo dużej objętości drugiej próbki. Co więcej, w praktyce trudno było ustalić, gdzie doszło do wymieszania dwóch próbek, co wymagało zastosowania nanocząstek ferrytyny jako markera referencyjnego w mieszanej próbce. Późniejsze wysiłki Howarda White'a i współpracowników poprawiły kontrolę i powtarzalność tego podejścia do natryskiwania i mieszania poprzez włączenie komputerowego sterowania etapami blottingu i natryskiwania3,4. Aby określić, jak dobrze i gdzie mieszają się próbki, ta sama grupa5 i inni6,7,8,9,10 przeszli na podejście mieszająco-natryskowe11, w którym dwie próbki są mieszane w wąskich rurkach kapilarnych pod ciśnieniem pomp strzykawkowych lub w mikroprefabrykowanych, mikroprzepływowych chipach napędzanych przez azot gazowy. Te systemy wstępnego mieszania nie tylko zapewniają pełne mieszanie, ale także umożliwiają precyzyjne dostrojenie czasów mieszania w celu zwiększenia rozdzielczości badań z rozdzielczością czasową.

Wprowadzenie dozowników piezoelektrycznych jako alternatywnego sposobu nanoszenia próbki na siatki EM w systemie Spotiton umożliwiło zarówno precyzyjne ukierunkowanie osadzania próbki, jak i wymaganie znacznie mniejszej objętości próbki do stworzenia siatki12. Później zastosowanie siatek nanowire i aplikacji próbki w drodze (wykrywanie w locie) wyeliminowało potrzebę etapu blottingu i skróciło czas od aplikacji do witryfikacji13,14. Na potrzeby opisanego tutaj nowego podejścia do krio-EM z rozdzielczością czasową, do systemu Spotiton dodano drugi dozownik wraz z niezbędnym sprzętem sterującym i aktualizacjami oprogramowania, aby umożliwić dostarczenie drugiej próbki na ruchomą siatkę nanoprzewodową niemal natychmiast po osadzeniu pierwszej15. Dwie nakładające się na siebie próbki mieszają się na siatce, gdy są przesiąknięte przez nanodruty do cienkiej warstwy wodnej przed witryfikacją. Możliwe jest osiągnięcie czasu mieszania wynoszącego zaledwie 90 ms. Protokół ten ma na celu dostarczenie praktycznych informacji na temat sposobu przeprowadzania eksperymentów z rozdzielczością czasową przy użyciu dozowania piezoelektrycznego i siatek nanodrutowych. Dodatkowo, ponieważ sprzęt i oprogramowanie są modyfikowane w celu zwiększenia łatwości użytkowania, spójności i przepustowości, protokół ten służy również jako aktualny opis wcześniej zgłoszonej metody15.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Konfiguracja komputera i oprogramowania Spotiton

  1. Przygotuj system do dozowania (Rysunek 1).
    1. Otwórz główny zawór na zbiorniku doprowadzającym azot. Upewnij się, że zbiornik systemu jest napełniony odgazowaną, ultraczystą wodą. Włącz komputer. Włącz system Spotiton na listwie zasilającej z wieloma gniazdkami.
    2. Kliknij ikonę na pulpicie (Rysunek 2A), aby otworzyć interfejs użytkownika (UI) oprogramowania Spotiton (Rysunek 2B). W menu Narzędzia wybierz opcję Initialize Stages (Inicjalizuj etapy), aby zainicjować i ustawić położenie początkowe robotów 3-osiowych (stolik siatkowy i stolik pipet) oraz zespół obrotowej głowicy dozownika (stolik theta). Upewnij się, że końcówki dozownika są skierowane w dół przed inicjalizacją i bazowaniem.
    3. W oknie głównym kliknij Przejdź do SafePosition, aby wysłać roboty do SafePosition (Rysunek 3).
      UWAGA: Przejście do SafePosition może być wykonane z robotami w dowolnej pozycji bez ryzyka kolizji.
    4. Na karcie Ssanie wybierz opcję Zalej, aby wielokrotnie przepłukać głowice dozownika wodą ze zbiornika. Kontynuuj, aż z dwóch końcówek będzie można zobaczyć nieprzerwane strumienie wody wyłaniające się z dwóch końców.
      UWAGA: Może być konieczne powtórzenie, jeśli znaczna ilość powietrza dostała się do przewodów płynu, gdy końcówki zostały przepłukane metanolem przy ostatnim wyłączeniu.
  2. Sprawdzanie wydajności dozownika
    1. Na karcie Inspekcja wyślij każdą końcówkę do kamery inspekcyjnej w celu przetestowania wody przeciwpożarowej i dopasuj wzór wytwarzania kropel z dwóch dozowników (Rysunek S1).
      UWAGA: Jeśli końcówka nie zapali się z powodu pęcherzyka (Rysunek S2A) lub zanieczyszczeń, wyczyść końcówki w stacji mycia (Rysunek S2B) za pomocą funkcji mycia ultradźwiękowej dostępnej na karcie Zasysanie.
    2. Dostosuj amplitudę wypalania (bez jednostek) dla każdego dozownika i próbki, aby uzyskać strumień dyskretnych kropel o stałej wielkości.
    3. Wizualnie potwierdź równoważne wytwarzanie kropel przez dwa dozowniki.
      1. Naciśnij przycisk nagrywania na monitorze górnej kamery, aby nagrać wideo z odpalania Tip 1. Odtwórz wideo z wystrzeliwania Tip 1 na monitorze po prawej stronie w tym samym czasie, gdy Tip 2 jest uruchamiany na monitorze górnej kamery (Rysunek S1).
        UWAGA: Filmy z każdego strzelania końcówką są nagrywane i przechowywane.
    4. Dozowniki są teraz gotowe do próbnego odpalenia na siatce.
      UWAGA: W tym protokole założono, że zweryfikowano prawidłowe ustawienie stolików kratki i pipet w odpowiednich pozycjach zanurzenia. Brak potwierdzenia prawidłowego wyrównania może spowodować kolizję, uszkodzenie końcówek lub robotów.
  3. Próbny ogień wody na siatce.
    1. Upewnij się, że roboty znajdują się w bezpiecznej pozycji.
    2. Zdejmij pęsetę z uchwytu na robocie siatkowym za pomocą dostarczonego klucza imbusowego.
    3. Na pobliskim blacie stołu umieść siatkę testową, nanodrutem do góry, na krawędzi bloku siatki. Ostrożnie chwyć krawędź siatki, ustaw ją prawidłowo w pęsetie (Rysunek S3) i ponownie zamontuj pęsetę.
    4. Na karcie Cryo kliknij Tip to Camera (Wskazówka do kamery), aby przesunąć końcówki w pole view górnej kamery ścieżki zanurzenia (górna kamera). Upewnij się, że na monitorze górnej kamery wybrano opcję Na żywo, a górne światło kamery jest włączone (pokrętło z przodu szafy maszyny (Rysunek 1).
    5. Zamontuj pęsetę na robocie siatkowym. Ustaw wskazówkę 1, widoczną na monitorze górnej kamery, klikając myszą na monitorze.
      UWAGA: Tylko Wskazówka 1 będzie widoczna i zostanie przeniesiona do miejsca kliknięcia.
    6. Kliknij opcję Siatka do kamery, aby ustawić siatkę przed górną kamerą. W razie potrzeby dostosuj pozycję końcówki 1 jak poprzednio.
    7. Wybierz Końcówkę 1, Końcówkę 2 lub Końcówkę 1 i Końcówkę 2, aby wybrać jeden lub oba dozowniki do przetestowania ognia.
      UWAGA: Podczas próbnego wystrzeliwania końcówek pojedynczo, użyj myszy, aby ustawić końcówkę 1 na monitorze górnej kamery w różnych bocznych miejscach na siatce. Spowoduje to osadzenie płynnych pasków z dwóch końcówek w nienakładający się wzór i umożliwi użytkownikowi potwierdzenie, że każda końcówka została wystrzelona.
    8. Na karcie Cryo upewnij się, że nie wybrano Vitrify Grid, kliknij Queue Target, a następnie Plunge.
      UWAGA: Stage pipety nieznacznie się podniesie, a następnie stage z siatką. Następnie robot siatkowy zanurza siatkę obok dozowników zapłonu oraz górnej i dolnej kamery, zatrzymując się tuż nad pokładem. Obraz przechwycony z górnej kamery pojawia się nad obrazem przechwyconym z dolnej kamery po lewej stronie interfejsu użytkownika.
    9. Oceń górny i dolny obraz: Czy każda końcówka odpaliła po wybraniu? Czy po wypaleniu razem płyn z dwóch końcówek całkowicie na siebie zachodził, tworząc zauważalnie grubszy pasek niż przy wypalaniu pojedynczo?
      1. Jeśli którakolwiek z końcówek nie wystrzeliła, wykonaj jeden lub wiele cykli mycia ultradźwiękowego, aż do zaobserwowania wyraźnego zapłonu.
      2. Jeśli paski próbki nie zachodzą całkowicie na siebie, wyreguluj boczne ustawienie jednego z dozowników za pomocą klucza imbusowego, aby przekręcić boczną regulacyjną na jednym z dozowników o ćwierć obrotu i wykonaj próbne zanurzenie. Powtarzaj, aż paski całkowicie zachodzą na siebie.
        UWAGA: Jeśli obie końcówki zostały uruchomione pomyślnie i zgodnie z oczekiwaniami, system jest gotowy do przygotowania siatek próbek.

2. Przygotuj dwie próbki, mieszane siatki

  1. Zaktualizuj wartości przyspieszenia, opóźnienia i prędkości w pliku XML parametrów maszyny, aby uzyskać interesujący Cię czas mieszania.
    UWAGA: Tabele korelujące te wartości z czasami mieszania zostały wcześniej zgłoszone15.
  2. Przygotuj próbkę i siatki.
    UWAGA: Od tego punktu w protokole upłynie 20-30 minut, zanim pierwsza siatka zostanie przygotowana, a próbki powinny być przechowywane w odpowiednim przedziale czasu w tym czasie.
    1. Rozcieńczyć dwie próbki (tj. białko i ligand lub innego partnera oddziałującego) do pożądanych stężeń odpowiednim buforem, najlepiej takim samym dla obu.
      UWAGA: Kratki Spotiton wymagają 1,5-2 razy wyższych stężeń białka niż zwykle stosowane w automatycznych zamrażarkach wgłębnych. Może to wynikać z minimalnego czasu, jaki białko spędza w cienkiej warstwie wodnej na powierzchni siatki podczas zanurzania, co daje cząstkom mniej możliwości koncentracji na granicy faz powietrze-woda.
    2. Napełnij miskę kriogeniczną ciekłym azotem.
    3. Plazmowo czyste siatki 3-4 nanodrutowe. Jako punkt wyjścia należy użyć 5 W, wodoru i tlenu, 1,5 min.
      UWAGA: Najbardziej efektywny czas trwania i receptura czyszczenia plazmowego mogą się zmieniać z dnia na dzień w zależności od temperatury i wilgotności otoczenia oraz partii użytych siatek nanodrutowych. Alternatywne mieszaniny gazów lub wyładowacz żarzenia mogą być również skuteczne, ale nie zostały przetestowane w tym celu. Ponieważ woda i białko w roztworze buforowym są często odprowadzane z różnymi prędkościami przez nanodruty, najlepszą praktyką jest ocena przepuszczalności siatek, które mają być użyte tego dnia podczas zanurzenia, do którego dozowana jest właściwa próbka.
  3. Ustaw poziom wilgotności w systemie.
    UWAGA: Oprócz warunków stosowanych zarówno do wytwarzania, jak i czyszczenia plazmowego siatek, wilgotność jest kolejnym podstawowym czynnikiem wpływającym na szybkość odprowadzania wilgoci przez siatki nanodrutowe. Chociaż docelowy procent wilgotności dla danej sesji jest określany empirycznie dla każdego dnia i partii siatek, 90-95% jest dobrym punktem wyjścia.
    1. Upewnij się, że nebulizator jest wystarczająco napełniony ultraczystą wodą. Podłącz nebulizator i obserwuj, jak para wydostaje się z centralnego portu na nasadce nebulizatora.
    2. Obserwuj monitor wilgotności na żywo w oknie głównym lub otwórz monitor wilgotności otoczenia w obszarze Raporty | otoczenia (rysunek S4). Sprawdź poziom wilgotności w dwóch strefach: Komorze i Osłonie.
      UWAGA: Komora obejmuje wszystkie obszary w obudowie Spotiton. Osłona to obszar bezpośrednio obejmujący pozycje "przy kamerze" siatki i końcówek dozownika. osłona z żywicy utrzymuje ustawiony poziom wilgotności, gdy drzwi obudowy są otwierane w celu załadowania siatki.
    3. Po osiągnięciu docelowych wartości wilgotności utrzymuj te wartości automatycznie lub ręcznie na karcie Wilgotność. Wybierz opcję Sterowanie automatyczne, a następnie wybierz wartość zadaną i próg, aby utrzymać nastawę w ramach wybranego limitu progowego. Alternatywnie wybierz Sterowanie ręczne i wyreguluj poziom wilgotności za pomocą dwóch elementów sterujących wentylatorem: wentylatora komory i wentylatora osłonowego.
      UWAGA: Włączenie wentylatora komory wciąga parę przez filtr w lewym porcie i zapobiega przedostawaniu się większych kropel wody do komory, zapobiegając dalszemu wzrostowi wilgotności otoczenia. Dopóki drzwi komory pozostają zamknięte, poziom wilgotności ustabilizuje się na żądanym poziomie procentowym. Włączenie wentylatora osłony wciąga parę przez prawy port do osłony. Zmniejsza to zarówno uwalnianie pary do komory, jak i zwiększa poziom wilgotności wewnątrz osłony.
  4. Załaduj próbkę do dozowników.
    1. Dodać 5 μl każdej próbki do kubków na próbki.
      UWAGA: Aby uniknąć wprowadzania bąbelków, należy bardzo ostrożnie dozować objętość na wewnętrzną ściankę boczną kubka, a następnie potrząsnąć, aby wymusić sample na dnie kubka.
    2. Załaduj kubki na próbki do tacki do przechowywania, próbka do końcówki 1 po lewej stronie, do końcówki 2 po prawej. Wsuń tacę z powrotem do urządzenia, aż się osadzi.
    3. Na karcie Aspirat wybierz 3 μl dla objętości, która ma być zasysana przez każdą końcówkę. Upewnij się, że tacka na próbkę została bezpiecznie osadzona, a następnie kliknij przycisk Aspirate (Zasysaj) i obserwuj, jak stolik pipety przesuwa głowice dozownika do kubków na próbki.
    4. Sprawdzić, czy obie próbki zostały prawidłowo zasysane, wyjmując kubki na próbki i obserwując spadek poziomu cieczy.
    5. Na karcie Inspekcja wyślij każdą końcówkę do kamery inspekcyjnej, aby potwierdzić niezakłócone dozowanie. Dostosuj amplitudę zgodnie z potrzebami, aby dopasować się do tworzenia się kropel z każdej końcówki (patrz sekcja 1.2).
      UWAGA: Prawdopodobnie konieczne będzie zwiększenie amplitudy końcówki, która dozuje próbkę białka.
    6. System jest teraz gotowy do przygotowania siatki próbek.
  5. Zamrażanie siatek próbek
    1. Załaduj świeżo oczyszczoną plazmowo siatkę do pęsety, ale nie montuj jeszcze pęsety. Upewnij się, że poziom wilgotności jest podwyższony, ~90-95%. Napełnij kubek na etan.
    2. Wykonaj ostatnie próbne odpalenie obu końcówek przed kamerą inspekcyjną, potwierdzając, że nie ma żadnych przeszkód. Na karcie Cryo kliknij Wskazówka do kamery.
    3. Napełnij kubek na etan. Jeśli utworzy się lód etanowy, w razie potrzeby stopić go dodatkowym gazem etanowym.
      UWAGA: Kroki 2.5.4 i 2.5.5 należy wykonać stosunkowo szybko (<20 s), aby zminimalizować (i) nasycenie nanodrutów w wysokiej wilgotności komory oraz (ii) prawdopodobieństwo, że końcówka wystrzeliwująca próbkę białka zostanie zatkana.
    4. Zamontuj pęsetę z siatką na stoliku siatki. Na karcie Cryo kliknij Siatka do kamery. Upewnij się, że wskazówka 1 jest prawidłowo umieszczona na górnym monitorze kamery (patrz kroki 1.3.4-1.3.5).
    5. Kliknij Vitrify Grid, Queue Target, a następnie Plunge. Kliknij OK, gdy pojawi się monit, aby nakazać robotowi siatkowemu przeskoczenie siatki z etanu do ciekłego azotu i wypuszczenie go na zanurzoną półkę.
      UWAGA: Pęseta następnie podnosi się z powrotem do komory. Po przeskoku do ciekłego azotu pojawia się monit z pytaniem, czy siatka spadła z pęsety. Jeśli nie spadł, kliknij Nie, a pęseta otworzy się i zamknie kilka razy, aby odłączyć siatkę.
    6. Przyjrzyj się obrazom siatki (Rysunek S5), aby zdecydować, czy należy ją zachować, czy wyrzucić.
    7. Jeśli trzymasz ruszt, przenieś go do wstępnie schłodzonej skrzynki rusztowej. Alternatywnie, należy dostrzec kolejne siatki, a następnie przenieść wszystkie siatki naraz do pola siatki, dbając o to, aby każdą siatkę można było zidentyfikować na podstawie jej położenia w obszarze spoczynku.
    8. Aby przenieść siatkę do skrzynki siatkowej, wstępnie ostudź kleszcze z cienką końcówką, delikatnie chwyć siatkę za krawędź i umieść ją w szczelinie siatki, zaczynając od pierwszej szczeliny na lewo od wycięcia zgodnie z ruchem wskazówek zegara.
    9. Gdy wszystkie kratki zostaną załadowane, przymocuj pokrywę kratki do narzędzia do pokrywy i wstępnie schłodź w ciekłym azocie. Przykręć pokrywę do kratki i dokręć za pomocą narzędzia do pokrywki lub wstępnie schłodzonego śrubokręta.
    10. Użyj dużych kleszczy, aby szybko przenieść zamknięte pudełko siatkowe do małego dewara w celu obrazowania lub długotrwałego przechowywania.
  6. Oceń przydatność sieci do obrazowania EM na dalszych etapach.
    1. Obserwuj obrazy z górnych i dolnych kamer na ścieżce zanurzenia, które są wyświetlane po lewej stronie interfejsu użytkownika natychmiast po zanurzeniu siatki. Użyj tych obrazów, aby ocenić prędkość odprowadzania wilgoci, pomyślne wystrzelenie obu końcówek oraz stopień nakładania się dwóch pasków próbek.
    2. Przeglądaj i porównuj obrazy siatki z górnej i dolnej kamery wraz z ustawieniami maszyny i pomiarami wilgotności w momencie zanurzenia za pomocą przeglądarki eksperymentów: Raporty | Eksperymentować.
    3. Wybierz siatki do obrazowania w mikroskopie elektronowym, które wykazują dowody na dobre odprowadzanie wilgoci.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 4 pokazuje obrazy siatek przygotowanych podczas pojedynczej sesji Spotiton z rozdzielczością czasową przez zmieszanie polimerazy RNA i oligomeru DNA o gęstości 105 pz przenoszącego sekwencję promotora przez 150 ms przed witryfikacją15. Na rysunku widoczne są obrazy wykonane przez dwie szybkie kamery sześciu siatek w dwóch punktach czasowych po zastosowaniu próbki. Kamery te, unikalne wśród zamrażarek wgłębnych, pozwalają użytkownikowi natychmiast zdecydować, czy zachować siatkę, czy ją wyrzucić, w oparciu o obserwowany stopień odprowadzania wilgoci przez nanodruty i prawdopodobieństwo, że próbki cieczy zostały wciągnięte do warstwy wodnej wystarczająco cienkiej do obrazowania EM. Chociaż pojedyncza siatka może zapewnić wystarczającą ilość lodu dla pełnego zestawu danych, po osiągnięciu optymalnych warunków przygotowuje się kilka siatek, które można mieć pod ręką w przypadku utraty lub zanieczyszczenia jednej lub więcej. Z sześciu siatek przygotowanych podczas tej sesji, zrzuty obrazu pokazują tylko jedną z nieoptymalnym odprowadzaniem wilgoci (Rysunek 4F).

Pokazane siatki były przygotowywane (kroki od 2.5.1 do 2.5.8) kolejno przez okres 40 minut po godzinie, aby przygotować próbki i maszynę zgodnie z opisem w protokole (kroki od 1.1.1 do 2.4.6). Z sześciu siatek dwie zostały wykorzystane do zbierania danych, a reszta została zapisana do późniejszej analizy w razie potrzeby. Wzór lodu na zeszklonej siatce (Rysunek 5C) ściśle odpowiada wzorowi osadzającej się cieczy widocznemu na zdjęciu z górnej kamery (Rysunek 5B). Skuteczne przesiąkanie mieszanych próbek, widoczne przez brak widocznego paska cieczy na obrazie z dolnej kamery (Rysunek 5A), występuje wzdłuż pokrytych nanodrutami prętów siatki, a próbka rzadko przelewa się na kwadraty sąsiadujące z tymi, w których wylądowała. W kwadratach wypełnionych lodem lód jest zazwyczaj najgrubszy w otworach w środku kwadratu i staje się cieńszy w otworach bliżej prętów siatki (Rysunek 5E). Często otwory bezpośrednio przylegające do prętów siatki są puste ze względu na bliskość nanodrutów (Rysunek 5F).

figure-results-1
Rysunek 1: System Spotiton z rozdzielczością czasową. 1. Stanowisko pracy operatora; 2. Komora środowiskowa; 3. Zaopatrzenie w azot; 4. Zaopatrzenie w etan 5. Sterowanie podświetleniem dla górnej kamery ścieżki zanurzenia 6. Sterowniki dozowników piezoelektrycznych; 7. Pompy strzykawkowe; 8. Pompa próżniowa; 9. Umyj butelki z wodą i odpadami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Interfejs użytkownika oprogramowania Spotiton. (A) Ikona na pulpicie i ekran powitalny. (B) Główny interfejs użytkownika składa się z sześciu obszarów: 1. obszar wyświetlania górnej ścieżki zagłębiania ("górnej") i kamer inspekcyjnych końcówki; 2. Obszar wyświetlania dla dolnej ścieżki zanurzenia ("dolnej") kamery; 3. Obszar odtwarzania filmów z inspekcji końcówek; 4. Wielofunkcyjny obszar zakładek; 5. Monitor wilgotności na żywo; 6. Plik dziennika systemu na żywo. Skrót: UI = interfejs użytkownika. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Widok wnętrza komory Spotiton (roboty w SafePosition). 1. Robot siatkowy (czerwony); 2. Robot dozujący (żółty); 3. Górna kamera ścieżki zanurzenia (różowa); 4. Dolna kamera ścieżki zanurzenia (jasnoniebieska); 5. Kamera inspekcyjna końcówki (pomarańczowa); 6. Osłona przeciwwilgociowa (zielona); 7. taca na próbki; 8. Zespół nebulizatora (ciemnoniebieski); 9. Zbiornik systemowy i przewody wodne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Reprezentatywne obrazy z kamery systemowej z sesji tworzenia siatki Spotiton z rozdzielczością czasową. (Za-F) Górne (po lewej) i dolne (prawe) obrazy z kamery zanurzeniowej sześciu siatek, na które nałożono polimerazę RNA i sekwencję promotora DNA za pomocą Spotiton. Podziałka = 500 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Wzór osadzania lodu na siatce przygotowanej przez Spotiton. Fragmenty zdjęć (A) dolnego i (B) górnego aparatu oraz (C) atlasu siatki pokazane na Rysunek 4F. Przybliżone lokalizacje lodu powstałego w wyniku osadzania się i mieszania próbki są koloru lawendowego. Obszary w kwadracie oznaczone żółtym grotem strzałki są obrazowane w (E-G). Region pokazany w (E) jest oznaczony kolorem żółtym w (D). Reprezentatywne obrazy ekspozycji kwadratu (E), (F) i (G) zebrane z siatki pokazanej w (A-D). Obszary ramkowe na obrazach kwadratu i otworu odpowiadają odpowiednio obrazom otworu i ekspozycji. Podziałka = 100 μm (A-D), 5 μm (E), 2 μm (F), 100 nm (G). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek S1: Kontrola wypalania końcówek. Podgląd na żywo z odpalania Końcówki 2 jest widoczny na monitorze górnej kamery po lewej stronie interfejsu użytkownika, podczas gdy nagranie wykonane wcześniej z Końcówki 1 jest odtwarzane w pętli w celu porównania w obszarze odtwarzania wideo po prawej stronie. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek S2: Ultradźwiękowe czyszczenie końcówek dozowników. Pęcherzyk powietrza w końcówce (A) zakłóci tworzenie się kropel i zapobiegnie wystrzeliwaniu końcówki. (B) Końcówki zanurzone w wodzie w ultradźwiękowej stacji czyszczącej w celu usunięcia pęcherzyków powietrza lub przezroczystego wysuszonego białka blokującego otwór końcówki. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek S3: Ładowanie siatki w pęsetę. (A) Siatka umieszczona nanodrutem do góry na krawędzi bloku siatki. (B) Siatka prawidłowo umieszczona w samozamykającej się pęsetie. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek S4: Monitor wilgotności. Procentowa wilgotność względna w komorze (ciemnoniebieska) i całunie (jasnoniebieska) zarejestrowana podczas typowej sesji tworzenia siatki. Czasy zanurzeń siatki (zielone kwadraty) są wykreślane na wykresie. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek S5: Odprowadzanie wilgoci na siatkach nanodrucianych podczas zanurzania. Reprezentatywne obrazy z górnej (A, C, E) i dolnej (B, D, F) kamery zanurzającej się w siatce nanodrutowej, która jest zbyt wolna (A, B), idealna (C, D) i zbyt szybka (E, F). Lekkie pogrubienie (białe groty strzałek) wskazuje na paski siatki z nanodrutami, które zostały nasycone próbką. Kwadraty w tych obszarach zazwyczaj zawierają lód o odpowiedniej grubości do obrazowania pod mikroskopem elektronowym. Podziałka = 500 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten przedstawia wykorzystanie systemu robotycznego Spotiton do przygotowania siatek do obrazowania krio-EM, które przenoszą dwie próbki, zwykle białko będące przedmiotem zainteresowania i aktywujący ligand, które były mieszane przez 90-500 ms. Chociaż przepływ pracy jest prosty, istnieje kilka kwestii, o których użytkownik musi pamiętać, aby zapewnić produktywną sesję tworzenia siatki. Po pierwsze, nierzadko zdarza się, że jedna z końcówek dozownika piezoelektrycznego zostaje zatkana lub zablokowana, uniemożliwiając jej odpalenie. Taka awaria spowoduje powstanie płynnego paska, widocznego na obrazie z górnej lub dolnej kamery, który jest widocznie węższy niż ten widoczny po wystrzeleniu obu końcówek. Zator może wynikać z osadzenia pęcherzyka powietrza w końcówce, zakłócając tworzenie się kropel, lub z próbki białka, która wyschła i uszczelniła wąski otwór końcówki. Chociaż zasysana próbka jest tracona w procesie, oba problemy można rozwiązać poprzez ultradźwiękowe mycie końcówek i ponowne aspirację próbki. Aby zapobiec późniejszemu zatykaniu się i marnowaniu próbki, konieczne jest dokładne zalanie (przepłukanie) przewodów cieczy przed aspiracją próbki oraz utrzymanie wysokiego i stałego poziomu wilgotności w komorze i osłonie. Dodatkowo, próbka białka o szczególnie wysokim stężeniu może wpływać na wypalanie końcówki pomimo dobrze utrzymanej wilgotności. Chociaż zwiększenie amplitudy wypalania na karcie Inspekcja może częściowo zrekompensować słabe wypalanie spowodowane wysokim stężeniem białka, rozcieńczenie próbki co najmniej 1:2 poprawi wypalanie końcówki i pozwoli uniknąć zatkania.

Po drugie, osiągnięcie idealnej prędkości odprowadzania wilgoci, która jest potrzebna do wytworzenia lodu o optymalnej grubości przez docelowy czas mieszania, może być trudne. Ogólnie rzecz biorąc, krótsze czasy mieszania będą wymagały szybszego odprowadzania wilgoci, wolniejsze czasy mieszania wymagają wolniejszego odprowadzania wilgoci. W przypadku idealnie niegodziwej siatki na zdjęciu z górnego aparatu wyraźnie widać płynny pasek, podczas gdy w dolnym aparacie widoczne jest tylko bardzo niewielkie pogrubienie pasków siatki w miejscu paska. Powolne odprowadzanie wilgoci, oznaczone ciemnym paskiem na dolnym obrazie z kamery, zazwyczaj pozostawia lód, który jest zbyt gruby do obrazowania. Brak paska na którymkolwiek z obrazów wskazuje na szybkie odprowadzanie wilgoci, które mogło nie pozostawić wody w otworach (Rysunek S5). Na szybkość odprowadzania wilgoci może wpływać kilka czynników, takich jak gęstość nanoprzewodów, ustawienia i czas trwania czyszczenia plazmowego oraz czas ekspozycji na działanie i ustawiony poziom wilgotności w komorze. Słabe (powolne) odprowadzanie wilgoci może być wynikiem rzadkiej powłoki nanodrutów na siatce. Poprzez nieznaczne rozcieńczenie i wydłużenie czasu ekspozycji na roztwór nanodrutów16, gęstość i pokrycie nanodrutów na prętach siatki wzrośnie, ułatwiając szybsze odprowadzanie wilgoci. Jeśli gęstość nanoprzewodów jest wystarczająca, zwiększenie ustawienia mocy lub czasu czyszczenia plazmowego również poprawi odprowadzanie wilgoci. Zalecane tutaj ustawienia to stosunkowo niska moc i długi czas trwania, ale w razie potrzeby można je zmienić.

Jeśli jednak zarówno określona partia siatek, jak i ustawienia czyszczenia plazmowego działały dobrze w poprzedniej sesji, powolna wydajność odprowadzania wilgoci może wynikać z nadmiernego wystawienia nanodrutów na wysoką wilgotność w komorze, co prowadzi do ich nasycenia wilgocią i zmniejszenia zdolności zatrzymywania cieczy. Efekt nasycenia siatki przez wilgotność w komorze można zmniejszyć, minimalizując czas, jaki upłynął między montażem pęsety a zanurzeniem rusztu, lub obniżając poziom wilgotności systemu przed zanurzeniem. Należy jednak zauważyć, że to ostatnie niesie ze sobą związane z nim ryzyko, że końcówka załadowana próbką białka zostanie zatkana. Aby zniwelować to ryzyko, trzymanie końcówek w osłonie, w której utrzymywany jest wysoki poziom wilgotności, może wydłużyć dopuszczalną ilość czasu na zamontowanie pęsety trzymającej nową siatkę. Na koniec należy zauważyć, że skrócony czas zanurzania (osiągnięty poprzez zwiększenie przyspieszenia siatki i/lub maksymalnej prędkości) może skutkować siatkami z cieńszym lodem bez faktycznej zmiany charakterystyki odprowadzania wilgoci przez siatkę. Ponieważ jednak czas mieszania dwóch próbek również ulegnie skróceniu, czas zanurzania nie jest czynnikiem, który jest zwykle zmieniany w celu rozwiązania problemu powolnego przesiąkania. Aby rozwiązać problem zbyt szybkiego odprowadzania wilgoci, co skutkuje zbyt cienkim lodem lub brakiem go w otworach siatki, można podjąć środki przeciwne do opisanych powyżej.

Spotiton ma pewne zalety i wady w porównaniu z innymi technikami opracowanymi dla badań z rozdzielczością czasową poniżej sekundy. Ponieważ mieszany pasek próbki zawiera tylko 2-4 nL płynu z każdego dozownika, pojedyncza porcja 3 μl każdej próbki wystarcza do przygotowania wielu siatek - jest to kluczowa zaleta, gdy próbka jest ograniczona. Dodatkowo, obserwacja osadzania próbki za pomocą zintegrowanych kamer, choć nie jest całkowicie unikalna dla Spotiton17, nie jest cechą innych urządzeń mieszających i pozwala na poddanie rusztowania zanurzonych kratek surowej ocenie pozytywnej/negatywnej, co znacznie skraca czas przesiewania. Jedną z kluczowych wad systemu jest minimalny czas mieszania wynoszący 90 ms, ograniczony fizycznymi ograniczeniami elementów mechanicznych, co sprawia, że badanie szybszych reakcji biologicznych jest poza zasięgiem. Dla porównania, czasy mniejsze niż 10 ms są rutynowo osiągane w istniejących systemach mikroprzepływowych. W opartym na Spotiton, dostępnym na rynku systemie kameleon, ulepszenia konstrukcyjne i konstrukcyjne skróciły minimalny czas zanurzania do 54 ms i zwiększają prawdopodobieństwo, że dodanie drugiego dozownika może pozwolić na szybszy czas mieszania niż Spotiton może obecnie zaoferować.

Do tej pory przeprowadzono szereg eksperymentów w celu zbadania wczesnych, krótkotrwałych stanów molekularnych przy użyciu Spotitonu, w tym składania rybosomu 70S, zmian konformacyjnych wywołanych wapniem w transbłonowym kanale jonowym i zwężenia dynaminy w odpowiedzi na hydrolizę GTP15. Od czasu opublikowania tych wyników w systemie wprowadzono kilka zmian mających na celu zwiększenie przepustowości, odtwarzalności i raportowania sesji tworzenia sieci Spotiton. Należą do nich między innymi dwustrefowy, automatyczny system monitorowania i kontroli wilgotności, funkcja przeglądarki eksperymentów, funkcja kontroli końcówek obok siebie oraz kilka drobnych ulepszeń interfejsu użytkownika. Zmodernizowany system będzie lepiej wspierał przyszłe eksperymenty z mieszaniem dwóch próbek, podobne do tych wcześniej opisanych, a także szybkie testy wiązania, takie jak między małocząsteczkowym lekiem a jego docelowym białkiem, a nawet tworzenie kompleksu przeciwciało-antygen. Podczas gdy obecne i przyszłe eksperymenty z rozdzielczością czasową z udziałem dwóch współpracujących partnerów z pewnością będą kontynuowane, dodanie trzeciego dozownika piezoelektrycznego i związanego z nim sprzętu może jeszcze bardziej poszerzyć zakres możliwych eksperymentów. Na przykład, początkowe osadzanie detergentu, a następnie białka będącego przedmiotem zainteresowania, a następnie oddziałującego lub aktywującego liganda może wyeliminować potencjalny negatywny wpływ długotrwałej ekspozycji na detergent, często konieczny, aby zapobiec powszechnym nieoptymalnym wynikom obrazowania, takim jak preferowana orientacja. W świetle zarówno już opublikowanych prac, jak i potencjalnych przyszłych zastosowań, Spotiton stanowi ważne narzędzie dla społeczności cryo-EM, które ułatwia prowadzenie badań z rozdzielczością czasową poniżej sekundy.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

B.C./C.S.P. utrzymują relacje handlowe z SPT Labtech, firmą produkującą dostępny na rynku instrument kameleon, oparty na prototypie Spotiton.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Peterowi A. Kahnowi i Terry'emu Rohde z Engineering Arts LLC (Arizona, USA) za wstępny projekt i późniejszy rozwój systemu Spotiton. Dziękujemy personelowi Centrum Mikroskopii Elektronowej Simonsa w New York Structural Biology Center za pomoc i wsparcie techniczne. Prezentowane tutaj prace zostały przeprowadzone w National Resource for Automated Molecular Microscopy znajdującym się w New York Structural Biology Center, wspieranym przez granty z NIH (GM103310) i Fundacji Simonsa (SF349247).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BuforNIEDOTYCZY Nie dotyczy
kriogenicznych skrzynek magazynowychEMS (Hatfield, PA; USA)N/A
Cu/Rh 300 mesh EM siatki EMS(Hatfield, PA; USA)EMS300-Cu-Rhpoddany obróbce w celu pokrycia nanodrutami, jak opisano wcześniej (Wei i in., 2018)
gaz etanTW Smith Corp. (Brooklyn, NY; USA)N/A
Kleszcze do obsługi siatkiEMS (Hatfield, PA; USA)78320-5B
ciekły azotAirgas, Inc. (Radnor, PA; USA)Nie dotyczy
zbiornika ciekłego azotu z mosiężnym kubkiem na etan (od FEI Vitrobot)ThermoFisher Scientific (Waltham, MA; USA)
PicosystemHydro System and Supplies (Durham, Karolina Północna; USA)Nie dotyczysystem oczyszczania wody
Białko/inna próbkaNIE DOTYCZYdotyczy
Solarus 950 środek do czyszczenia plazmowegoGatan, Inc. (Pleasanton, CA; USA)Nie dotyczy
Nie

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Berriman, J., Unwin, N. Analysis of transient structures by cryo-microscopy combined with rapid mixing of spray droplets. Ultramicroscopy. 56 (4), 241-252 (1994).
  2. Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of microscopy. 124 (3), 3-4 (1981).
  3. White, H. D., Walker, M. L., Trinick, J. A computer-controlled spraying-freezing apparatus for millisecond time-resolution electron cryomicroscopy. Journal of Structural Biology. 121 (3), 306-313 (1998).
  4. White, H. D., Thirumurugan, K., Walker, M. L., Trinick, J. A second generation apparatus for time-resolved electron cryo-microscopy using stepper motors and electrospray. Journal of Structural Biology. 144 (1-2), 246-252 (2003).
  5. Kontziampasis, D., et al. A cryo-EM grid preparation device for time-resolved structural studies. IUCrJ. 6, Pt 6 1024-1031 (2019).
  6. Lu, Z., et al. Gas-assisted annular microsprayer for sample preparation for time-resolved cryo-electron microscopy. Journal of Micromechanics and Microengineering: Structures, Devices, and Systems. 24 (11), 115001(2014).
  7. Chen, B., et al. Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy. Structure. 23 (6), 1097-1105 (2015).
  8. Kaledhonkar, S., et al. Late steps in bacterial translation initiation visualized using time-resolved cryo-EM. Nature. 570 (7761), 400-404 (2019).
  9. Fu, Z., et al. The structural basis for release-factor activation during translation termination revealed by time-resolved cryogenic electron microscopy. Nature Communications. 10 (1), 2579(2019).
  10. Mäeots, M. -E., et al. Modular microfluidics enables kinetic insight from time-resolved cryo-EM. Nature Communications. 11 (1), 3465(2020).
  11. Kaledhonkar, S., Fu, Z., White, H., Frank, J. Time-resolved cryo-electron microscopy using a microfluidic chip. Methods in Molecular Biology. 1764, 59-71 (2018).
  12. Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: a prototype for an integrated inkjet dispense and vitrification system for cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
  13. Razinkov, I., et al. A new method for vitrifying samples for cryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
  14. Dandey, V. P., et al. Spotiton: New features and applications. Journal of Structural Biology. 202 (2), 161-169 (2018).
  15. Dandey, V. P., et al. Time-resolved cryo-EM using Spotiton. Nature Methods. 17, 897-900 (2020).
  16. Wei, H., et al. Optimizing "self-wicking" nanowire grids. Journal of Structural Biology. 202 (2), 170-174 (2018).
  17. Ravelli, R. B. G., et al. Cryo-EM structures from sub-nl volumes using pin-printing and jet vitrification. Nature Communications. 11 (1), 2563(2020).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cryo Electron MicroscopyTime Resolved Cryo EMSpotiton Robotic SystemGrid PreparationNanowire EM GridsProtein Structural DynamicsSample VitrificationPlasma CleaningSubsecond Molecular StatesElectron Microscope Grid

Powiązane artykuły