Mikroskopijne gromadzenie danych z komórek zakonserwowanych kriogenicznie

Summary

Ten protokół pokazuje, jak obrazować biologiczne próbki kriokonserwowane za pomocą kriostrukturalnej mikroskopii świetlnej. Demonstrujemy metodologię, obrazując cytoszkielet komórek U2OS.

Abstract

Trójwymiarowa (3D) strukturalna mikroskopia iluminacyjna (SIM) umożliwia obrazowanie fluorescencyjnie znakowanych struktur komórkowych w wyższej rozdzielczości niż konwencjonalna mikroskopia fluorescencyjna. Ta technika superrozdzielczości (SR) umożliwia wizualizację procesów molekularnych w całych komórkach i może być stosowana w połączeniu z mikroskopią elektronową i tomografią rentgenowską w celu skorelowania informacji strukturalnych i funkcjonalnych. Mikroskop SIM do próbek zakonserwowanych kriogenicznie (cryoSIM) został niedawno uruchomiony na linii badawczej B24 w synchrotronie w Wielkiej Brytanii.

Został zaprojektowany specjalnie do obrazowania 3D próbek biologicznych w temperaturach kriogenicznych w sposób zgodny z późniejszym obrazowaniem tych samych próbek za pomocą metod mikroskopii rentgenowskiej, takich jak kriogeniczna tomografia rentgenowska. Ten artykuł wideo zawiera szczegółowe metody i protokoły udanego obrazowania przy użyciu cryoSIM. Oprócz instrukcji obsługi mikroskopu krioSIM zawarto zalecenia dotyczące doboru próbek, fluoroforów i ustawień parametrów. Protokół wykazano w próbkach komórek U2OS, których mitochondria i tubulina zostały znakowane fluorescencyjnie.

Introduction

Techniki obrazowania SR stały się powszechnie dostępne dla biologów w ciągu ostatniej dekady¹. Umożliwiają one obrazowanie w wysokiej rozdzielczości próbek znakowanych fluorescencyjnie poza granicą dyfrakcji. Jednak dostosowanie metod mikroskopii SR do pracy z próbkami w temperaturach kriogenicznych było wyzwaniem². Byłoby to korzystne w przypadku obrazowania korelacyjnego w połączeniu z tomografią elektronową lub rentgenowską. Ostatnio SIM został przystosowany do użytku z próbkami kriogenicznymi i z powodzeniem wykazano, że umożliwia badania korelacyjne komórek biologicznych w połączeniu z miękką tomografią rentgenowską (SXT)³ na korelacyjnej linii badawczej B24 w synchrotronie Diamond Light Source (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Biological-Cryo-Imaging/B24.html). SIM może podwoić rozdzielczość konwencjonalnej mikroskopii szerokokątnej poprzez oświetlenie próbki pasiastymi wzorami światła (prążki mory) pod trzema kątami i w pięciu fazach. Interferencja między tymi wzorami światła a fluorescencją próbki może być wykorzystana do obliczeniowego odkrycia dodatkowych informacji o strukturach subdyfrakcyjnych^4,5.

Istnieje kilka zalet SIM w porównaniu z innymi technikami SR do zastosowań kriogenicznych. Po pierwsze, może działać bez specjalnie zaprojektowanych fluoroforów; Można stosować konwencjonalne fluorofory, co daje dostęp do szerszego zakresu potencjalnych środków do znakowania fluorescencyjnego⁶. Ponadto wymaga tylko 15 obrazów na wycinek z (w 3D; 9 obrazów w 2D), podczas gdy inne metody SR wymagają około 1000 obrazów na plasterek, co zwiększa szansę na podgrzanie próbki, a tym samym zwiększa ryzyko tworzenia się kryształków lodu, które mogą powodować artefakty. Wreszcie, technika ta może obrazować grubsze próbki biologiczne o wielkości ponad 10 μm, co pozwala na obrazowanie całych komórek w ich stanie zbliżonym do natywnego⁶. CryoSIM został zbudowany przy użyciu standardowych komponentów optycznych i z ogólnodostępnym oprogramowaniem do obrazowania, dzięki czemu można go łatwo dokumentować i duplikować w razie potrzeby⁶. CryoSIM ma obiektyw z aperturą numeryczną 100x/0,9 (patrz tabela materiałów); dalsze informacje na temat jego komponentów optycznych, parametrów konstrukcyjnych i wydajności zostały opisane przez Phillips et al.⁶ Tutaj protokół ten pokazuje, jak korzystać z mikroskopu cryoSIM, w tym jak ładować i rozładowywać próbki na stoliku kriogenicznym, jak zbierać dane na mikroskopie i jak rekonstruować obrazy SIM.

Protocol

UWAGA: Ten protokół dotyczy próbek zawierających komórki wyhodowane lub zdeponowane na transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) 3 mm płaskie złote siatki z dziurawą warstwą węglową, które zostały zeszklone przez zamrażanie wgłębne lub zamrażanie pod wysokim ciśnieniem. Protokół ten zakłada, że próbki zostały już zobrazowane przy użyciu konwencjonalnego mikroskopu epifluorescencyjnego i jasnego pola w celu zmapowania miejsc interesujących do obrazowania w cryoSIM. Zobacz Rysunek 1, aby zapoznać się z całym protokołem.

1. Przygotowanie krioetapu

1. Przygotuj ciekły azot bez lodu (LN₂), przepuszczając LN₂ przez lejek wyłożony dowolnymi standardowymi chusteczkami z suchego papieru naukowego.
   UWAGA: Ponieważ LN₂ powoduje oparzenia, podczas obchodzenia się z nim należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym rękawice i okulary krioochronne. Takie płyny mogą wypierać tlen i powodować szybkie uduszenie i należy się z nimi obchodzić w odpowiednio wentylowanym miejscu.
2. Usuń pył powierzchniowy ze stolika kriogenicznego za pomocą sprężonego powietrza. Przed użyciem należy usunąć płyn ze zbiornika na sprężone powietrze.
3. Upewnij się, że kaseta do ładowania próbki jest na swoim miejscu z odpowiednim komorowym uchwytem na próbkę (sprawdź, czy w uchwycie próbki nie pozostała żadna siatka z poprzedniego eksperymentu) (Rysunek 2).
4. Zdejmij pokrywkę z zewnętrznego dewara kriostage i wlej przefiltrowany LN₂ do około 1/4 napełnienia. Poczekaj, aż początkowe gotowanie ustąpi, zanim wlejesz więcej; Napełnij naczynie do około 2/3^wysokości. Ostrożnie załóż pokrywę, kierując dyszę z dala od uchwytu i stage/optics, podczas gdy LN₂ wykipi z wylotu.
5. Gdy LN₂ przestanie wychodzić z wylotu, umieść rurę wylotową nad stage dewar na krio-stage.
6. Podłącz źródło zasilania stage i podłącz USB do cryo-stage. Upewnij się, że podgrzewana pokrywa komory na próbkę jest podłączona. Podłącz zewnętrzny dewar do stage.
   UWAGA: Nie podłączaj zewnętrznego dewara, dopóki rura wylotowa nie zostanie umieszczona nad stage dewar na krio-stage. Jeśli LN₂ przeleje się (lub aby zapobiec jego przepełnieniu), wyciągnij USB na ~10 s, pozwól mu się zrównoważyć i ponownie podłącz USB, aby ponownie aktywować czujnik.
7. Po dostarczeniu LN₂ do stage dewar, naciśnij przycisk zwalniający na krio-stage, aby umożliwić LN₂ wejście do komory próbki.
   UWAGA: Nie pozostawiaj systemu bez nadzoru, gdy LN₂ napełnia komorę.
8. Odczekaj ~30-45 minut, aby system ostygł i ustabilizował się przed rozpoczęciem akwizycji obrazu. Okresowo sprawdzaj zewnętrzny dewar i uzupełniaj filtrowanym LN₂, jeśli jest napełniony mniej niż w jednej czwartej (mniej więcej co godzinę).

2. Przeniesienie pojemnika do przechowywania próbek do krioetapu

UWAGA: Zanurz pojemnik do przechowywania próbek, uchwyt i końcówki wszelkich instrumentów (np. kleszczyków) w przefiltrowanym LN₂, aby je schłodzić przed dotknięciem jakichkolwiek zimnych powierzchni, takich jak próbka lub jakiekolwiek przedmioty wewnątrz komory próbki. Podczas pracy z próbkami biologicznymi należy nosić fartuch laboratoryjny i rękawice.

1. Upewnij się, że zeszklone próbki znajdują się w pojemniku kompatybilnym z krioskopem i przynieś je do mikroskopu. Naciśnij odpowiedni przycisk na kriostoliku, aby włączyć światło w komorze na próbkę.
2. Użyj klucza imbusowego na narzędziu do kasety, aby otworzyć dwie płytki kasety do przenoszenia próbek. Otwórz płyty na tyle szeroko, aby opaść w siatkę między dwiema płytami, ale unikaj otwierania do maksymalnej pozycji otwartej, aby zapobiec wypadnięciu siatki przez drugą stronę.
3. Użyj długich kleszczy, aby podnieść pojemnik z siatką próbki z LN₂, obróć go w miejscu, w którym wycięcie pokrywa się z położeniem miejsca przechowywania wewnątrz stolika i umieść go na stoliku. Użyj odpowiedniego urządzenia (np. śrubokręta), aby otworzyć pokrywę schowka do właściwej sample pozycja.
4. Za pomocą odwróconych kleszczy (lub dowolnych kleszczyków chirurgicznych z cienką końcówką) wyjmij siatkę TEM z uchwytu próbki, zanurz ją w LN₂ i upuść na miejsce w kasecie do przenoszenia próbek, trzymając się blisko LN₂ podczas procesu przenoszenia. Upewnij się, że strona z folią węglową jest umieszczona tak, aby ostatecznie była skierowana w stronę celu na mostku próbki.
5. Zamknij kasetę z próbką za pomocą klucza imbusowego na kasecie. Zamknij i wyjmij schowek wraz z pozostałymi próbkami.
6. Użyj punktu magnesu na narzędziu kasetowym, aby podnieść i zamontować wkład zawierający siatkę na mostku próbki. Trzymaj go zanurzony/blisko LN₂ podczas procesu przenoszenia. Upewnij się, że orientacja jest odpowiednia dla mostu (dwa magnesy będą stykać się z magnesami na mostku). Umieść kasetę płasko w kołkach pozycjonujących mostka i delikatnie popchnij, aby upewnić się, że jest zamocowana.
   UWAGA: Kaseta z próbkami do siatek przyciętych, które zostały przygotowane do późniejszego mielenia wiązką jonów w ognisku, jest również dostępna w zakładzie CryoSIM na linii badawczej B24.

3. Dokowanie i ustawianie ostrości na scenie

1. Przesuń otwór pokrywy kriostolika do pozycji obrazowania i wyłącz oświetlenie komory próbki. Przesuń stolik w kierunku optyki, aby ustawić go pod soczewką obiektywu. Delikatnie upuść obiektyw na miejsce za pomocą dźwigni, upewniając się, że spoczywa w pokrywie kriostolika, ale go nie dotyka.
   UWAGA: Upewnij się, że zewnętrzna rura wylotowa Dewara nie dotyka stage dewar na krio-stage w żadnym momencie podczas zbierania danych.
2. Zakryj scenę i optykę nieprzezroczystą czarną kurtyną. Uruchom oprogramowanie sterujące Cockpit na komputerze cryoSIM (Rysunek 3 i Rysunek 4).
3. Kliknij przycisk trybu odczytu dla każdej kamery i ustaw go na CONV 3 MHz. Sprawdź, czy temperatura każdej kamery wynosi -80 °C, a wentylator kamery jest wyłączony.
4. Włącz odbitą kamerę. W sekcji Światła wybierz otoczenie (ekspozycja 20 ms), a w obszarze linkam kliknij kondensator. Kliknij przycisk Tryb wideo.
5. W oknie Widok mozaiki pomniejsz (przewijanie myszą), aby wyświetlić kontur siatki. Kliknij Znajdź scenę, jeśli nie jest widoczna. Wyśrodkuj siatkę, klikając dwukrotnie lewym przyciskiem myszy środek okręgu.
6. Skoncentruj próbkę, aż folia podtrzymująca siatkę (lub dowolna inna istotna cecha próbki) będzie ostra, używając w górę i w dół, aby przesunąć kriostolik, a następnie używając 9 i 3 na klawiaturze numerycznej, aby zmienić krok z (ustaw go na 20 μm w celu początkowego ustawienia ostrości).
   UWAGA: Jeśli użytkownikowi skończy się skok w z, stolik można ręcznie przesunąć w górę lub w dół za pomocą koła pod kriostolikiem. Obróć go o jedno nacięcie na raz i sprawdź, czy próbka znajduje się w zakresie view. Ponownie zmień kierunek, jeśli ostrość się pogorszy.

4. Akwizycja mozaiki Brightfield

1. Po wyśrodkowaniu sceny wyłącz tryb wideo i zbierz mozaikę światła widzialnego (kliknij Uruchom mozaikę w widoku Mozaika, aby utworzyć kafelki obrazów światła widzialnego, które spiralnie biegną na zewnątrz od środka). Jeśli siatka jest wygięta, wypróbuj różne pozycje na siatce (kliknij dwukrotnie lewym przyciskiem myszy w widoku mozaiki), ponownie ustaw ostrość i ponownie kliknij Uruchom mozaikę, aby zebrać częściowe mozaiki. Alternatywnie, wrzuć skoncentrowany obraz na wierzch mozaiki (Rysunek 3).
2. Zapisz widok, klikając Zapisz mozaikę. Nadaj mu krótką nazwę pliku zawierającą informacje o pudełku do przechowywania i odpowiednim numerze siatki (znacznik czasu zostanie automatycznie dołączony do nazwy pliku).

5. Identyfikacja obszarów zainteresowań

1. Sprawdź mozaikę jasnego pola wraz z poprzednimi obrazami "mapy" fluorescencji, aby dowiedzieć się, gdzie wcześniej zlokalizowano komórki lub cechy biologiczne będące przedmiotem zainteresowania. Sprawdź, czy te obszary wytwarzają odpowiednią fluorescencję.
   1. Wyłącz światło otoczenia i kondensors, a także tryb wideo, jeśli jest aktywny. Włącz żądany laser wzbudzający (405, 488, 561 lub 647) i wybierz odpowiednią kamerę i filtr, początkowo o mocy 50 mW, na czas naświetlania 50 ms.
      UWAGA: Zwiększ/zmniejsz te ustawienia aparatu i filtra w zależności od sygnału fluorescencji.
   2. Naciśnij 0, aby przyciągnąć obraz i *, aby uzyskać automatyczny kontrast. Możesz też ręcznie dostosować kontrast za pomocą suwaka u dołu obrazu.
      UWAGA: Włącz znak Laser w pomieszczeniu.
   3. Po znalezieniu biologicznie interesujących komórek o odpowiedniej fluorescencji zaznacz ich położenie za pomocą przycisku Oznacz miejsce w widoku mozaiki.
      UWAGA: Te oznaczone miejsca pojawią się na załączonej liście i można uzyskać do nich dostęp, klikając dwukrotnie współrzędne. Po powrocie do oznaczonego miejsca powiększ obszar przed dwukrotnym kliknięciem.
   4. Kontynuuj oznaczanie wszystkich potencjalnych witryn przed rozpoczęciem pozyskiwania obrazu. Ponownie zapisz mozaikę z zaznaczonymi miejscami; Kliknij Zapisz witryny do pliku.
      1. Aby zszyć obrazy mozaiki za pomocą oprogramowania StitchM (opracowanego wewnętrznie na linii badawczej B24), przeciągnij i upuść plik mozaiki .txt do pliku StitchM z rozszerzeniem .bat i zapisz połączony obraz tiff płytek mozaiki w tym samym folderze. Aby zapisać obraz z zaznaczonymi witrynami, przeciągnij i upuść plik mosaic.txt i plik markers.txt na ikonę w tym samym czasie.
         UWAGA: Zrównoważ gromadzenie danych z potrzebami projektu (np. jeśli zostanie wykonane obrazowanie korelacyjne, sprawdź, ile obrazów można wykonać za pomocą metody obrazowania partnerskiego i wybierz odpowiednią liczbę miejsc do obrazowania krioSIM). Ponadto, jeśli zewnętrzny dewar wymaga ponownego napełnienia LN₂ , system kriostolika zmieni pozycję, a zaznaczone miejsca prawdopodobnie nie powrócą do tych samych lokalizacji; Dlatego weź to pod uwagę przy wyborze liczby witryn, które mają być obrazowane.

6. Strategia zbierania danych

1. Ustaw czas ekspozycji lasera na podstawie zliczeń w zakresie dynamicznym na obrazie fluorescencyjnym (u dołu okna widoków kamery). Wybierz filtr, który chcesz zastosować, i zoptymalizuj te ustawienia dla każdej długości fali światła wzbudzenia, które ma być używane, włączając każdy laser osobno.
   UWAGA: Chociaż 10 000-20 000 zliczeń jest optymalnych, niższe liczby są dopuszczalne, jeśli istnieje dobry kontrast. Najlepiej sprawdzić ustawienia filtra przed uzyskaniem każdego stosu obrazów, ponieważ komórki w różnych obszarach siatki mogą mieć różne poziomy fluorescencji.

7. Zbieranie danych

1. Kliknij obie kamery, aby je włączyć. Wróć do jednego z zaznaczonych miejsc i ponownie skup się na żądanej głębokości. Po ustawieniu ostrości w obszarze zainteresowania, przesuń się poza ostrość w górę (↑) w oknie XY w Makro Stage, aby wybrać wysokość stosu z do uzyskania, a następnie kliknij Zapisz górę. Przesuń się z ostrości w dół (↓), kliknij Zapisz na dole, a następnie Przejdź do środka i sprawdź, czy obraz jest nadal ostry.
   UWAGA: Wysokość próbki zostanie pokazana w oknie.
2. Kliknij prawym przyciskiem myszy slm (przestrzenny modulator światła) w oknie Kokpit i upewnij się, że kąt jest ustawiony na 0,41. W oknie Kokpit wybierz pozycję Eksperyment w jednym miejscu.
   UWAGA: Nie klikaj slm; Kokpit automatycznie włączy go podczas akwizycji obrazu.
   1. Z listy rozwijanej wybierz opcję Oświetlenie strukturalne. Zmień wysokość stosu tak, aby była równa wysokości z + 1 μm.
      UWAGA: Dodanie 1 μm zapewnia uchwycenie całej próbki w z i minimalizuje artefakty rekonstrukcyjne.
   2. Wprowadź czasy naświetlania (ms) dla laserów 405 nm i 488 nm w górnym rzędzie (dla kamery odbitej) oraz czasy naświetlania dla laserów 561 nm i 647 nm w dolnym rzędzie (dla kamery transmitowanej).
      UWAGA: Wartości czasu naświetlania powinny być zgodne z wartościami, o których ustalono wcześniej i które są wyświetlane w głównym oknie kokpitu.
   3. Wprowadź nazwę pliku (konwencja nazewnictwa: pole number_grid area_filters_FL) (FL (fluorescencja) lub BF (jasne pole) w zależności od rodzaju wykonywanego obrazowania). Kliknij Aktualizuj, aby utworzyć nowy plik zawierający datę i godzinę bez nadpisywania poprzednich plików. Następnie kliknij Start.
3. Sprawdź widok z kamery podczas zbierania danych. Zrób ponownie obrazy, jeśli występuje jakiekolwiek przemieszczenie xy. Jeśli LN₂ dewar ponownie napełni stolik kriogeniczny podczas akwizycji obrazu, przerwij proces, klikając przycisk Przerwij w oprogramowaniu Cockpit.
   1. Gdy zewnętrzny dewar zakończy napełnianie stolika dewara, powtórz eksperyment, ponieważ wkład przesuwa próbkę w pionie. Ponownie ustaw ostrość obrazu, aby wyśrodkować go w osi z, a następnie powtórz eksperyment z jednym miejscem. Powtórz eksperyment w jednym miejscu dla wszystkich potrzebnych kombinacji laserów i filtrów.
      UWAGA: Zakończenie napełniania zajmuje około 30 s-1 min. Podczas obrazowania jednej siatki uzupełnienie nastąpi ~4-8x.
4. W każdej pozycji zbierz stos z za pomocą światła widzialnego.
   1. Wyłącz lasery i włącz światło otoczenia i kondensator. W obszarze Eksperyment w jednym miejscu wybierz opcję Stos osi Z, ustaw ekspozycję Światło otoczenia na 20 ms i zachowaj wysokość z jak powyżej.
5. Powtórz kroki od 7.2 do 7.4 dla wszystkich miejsc zaznaczonych na siatce.
6. Przed przejściem do innego przykładu usuń mozaikę, klikając pozycję Usuń kafelki.
   1. Narysuj kwadrat wokół wszystkich płytek, aby je usunąć. Usuń również znaczniki, zaznaczając je wszystkie na liście, a następnie klikając Usuń wybrane witryny.
7. Wyłącz światło otoczenia i skraplacz przed przystąpieniem do zmiany siatki. Wykonaj czynności opisane w sekcji 4 w odwrotnej kolejności, aby oddokować etap spod celu i zmienić siatkę.

8. Po obrazowaniu

1. Po zakończeniu obrazowania odłącz stolik i usuń wszystkie próbki. Wyłącz oświetlenie komory na próbkę. Odłącz zewnętrzny dewar i zdekantuj pozostały LN₂ do innego pojemnika kompatybilnego z krio, umożliwiając dewarowi bezpieczny powrót do normalnej temperatury.
2. Umieść zatyczkę pokrywy na kriostage. Poczekaj, aż opcja wypalenia krio-stage wyświetlacz stanie się dostępny, gdy w stage dewar nie pozostanie już LN₂. Naciśnij przycisk wypalania, aby przejść do trybu ogrzewania i usuń wilgoć ze stopnia kriogenicznego, aby uniknąć tworzenia się lodu.

9. Rekonstrukcja

1. Prześlij nieprzetworzone pliki danych SIM do odpowiedniej stacji roboczej w celu rekonstrukcji. Uruchom przetwarzanie w partiach za pomocą okna konstruktora zadań przetwarzania przy użyciu specyficznych dla kanału funkcji transferu optycznego (OTFS) (obliczonych na podstawie funkcji punktowego rozproszenia wielofluorescencyjnego) i kątów K₀ (0,29278, -1,8028, 2,3786) ze stałym filtrem Wienera dla wszystkich kanałów wynoszącym 0,004 i przesunięciem odchylenia 200.
2. W panelu Opcje dodatkowe upewnij się, że ujemne intensywności są odrzucane, pozostawiając inne opcje niezaznaczone. Zapisz obrazy SIR w folderze o nazwie "processed".
   UWAGA: Komercyjne oprogramowanie do rekonstrukcji karty SIM zwykle tworzy zrekonstruowane dane karty SIM i zachowuje nazwę pliku, ale dołącza SIR.dv na końcu. Tworzony jest również plik dziennika, który zawiera protokół przetwarzania, kroki i informacje statystyczne dotyczące powodzenia odbudowy.

10. Korekcja przesunięcia chromatycznego

1. Pobierz oprogramowanie Chromagnon⁷, aby skorygować przesunięcie chromatyczne.
2. Należy użyć matrycy odniesienia przesunięcia chromatycznego, która odpowiada długościom fal fluorescencji zebranych danych (dostarczonych przez linię badawczą).
   UWAGA: Plik referencyjny jest plikiem "chromagnon.csv", który zawiera parametry wyrównania i został uzyskany z obrazów kalibracyjnych przy użyciu wielofluorescencyjnych nanocząstek. Może być używany do przetwarzania wsadowego wielu zestawów danych jednocześnie.
   1. Wybierz odpowiedni plik referencyjny, który odpowiada długości fali lasera i filtrowi używanemu do obrazowania próbki, a następnie dodaj go do pola referencyjnego. Dodaj zrekonstruowane dane SIR do wyrównania w polu źródłowym i kliknij Uruchom.
   2. Sprawdź, czy sygnał fluorescencji jest teraz wyrównany na obrazach. W przypadku przetwarzania wsadowego umieść wszystkie obrazy SIR do wyrównania w polu źródłowym, a plik referencyjny w polu odniesienia, a następnie naciśnij przycisk Uruchom wszystko.

Results

Próbka zawierająca komórki U2OS została zabarwiona mieszaniną zielonego barwnika cytoszkieletu mikrotubul i czerwonego barwnika mitochondriów, co spowodowało zabarwienie składnika mikrotubuli cytoszkieletu (zielony) i mitochondriów (czerwony). Późniejsze obrazowanie wykazało lokalizację mitochondriów w komórce, a także rozmieszczenie mikrotubul, podkreślając strukturę strukturalną, którą zapewniają komórce, oraz montaż cytoszkieletu wokół organelli, takich jak jądro. Rozdzielczość w cryoSIM jest znacznie wyższa niż w standardowej mikroskopii epifluorescencyjnej (Rysunek 5). Rysunek 6 pokazuje, jak fluorescencyjna "mapa" z konwencjonalnego mikroskopu epifluorescencyjnego może być wykorzystana do zlokalizowania obszarów zainteresowania do obrazowania i odpowiadającego im obrazu zrekonstruowanego za pomocą cryoSIM z miejsca na siatce.

Rysunek 1: Schemat blokowy pokazujący etapy protokołu obrazowania cryoSIM. Skrót: cryoSIM = kriostrukturalna mikroskopia oświetleniowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Krio-etap. (A) Konfiguracja krio-etapu. (B) Siatka na próbki, pokazana jako trzymana przez odwrócone kleszcze. (C) Elementy składowe krioetapu. Porty połączeniowe są oznaczone kolorami odpowiadającymi pomarańczowemu: zasilanie, żółtemu: podgrzewana pokrywa sceny, niebieskiemu: zewnętrznemu dewarowi, zielonemu: połączenie z komputerem. Skróty: PC = komputer osobisty; LN₂ = ciekły azot. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Widoki paneli oprogramowania kokpitu. (A) Panel główny, (B) stopień makro XY, (C) widok mozaiki, (D) widoki z kamery. Skrót: SLM = przestrzenny modulator światła. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Widoki paneli oprogramowania kokpitu. (A) Eksperyment z pojedynczym miejscem stosu Z. (B) Eksperyment SI w jednym miejscu. (C) Skróty klawiaturowe oprogramowania kokpitu używane podczas pozyskiwania obrazu. (D) Mikroskop krioSIM znajduje się na miejscu na linii badawczej B24 w synchrotronie Diamond Light Source. Skrót: cryoSIM = kriostrukturalna mikroskopia oświetleniowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Rozdzielczość cryoSIM. (A) Mozaikowy widok badanej siatki. (B) Obraz w jasnym polu obszaru zainteresowania (AOI). (C) Obraz pseudoszerokokątny w porównaniu z obrazem (D) SIM pokazujący wzrost rozdzielczości. Biała strzałka wskazuje artefakty rekonstrukcji karty SIM. (E) Mapa kontrastu modulacji łącząca informacje o intensywności pikseli zrekonstruowanego obrazu z informacjami o kolorze odpowiednich wartości stosunku kontrastu do szumu modulacji (MCNR) surowych danych wygenerowanych przez SIMCheck². Jasne i ciemne obszary mają odpowiednio wysoki i niski kontrast. Podziałka = 10 μm. Ustawienia obrazowania CryoSIM: długości fal wzbudzenia/emisji: 488/525 nm, moc lasera 50 mW, czas naświetlania 50 ms oraz 647/655 nm, moc lasera 20 mW, czas naświetlania 5 ms. Skrót: cryoSIM = kriostrukturalna mikroskopia oświetleniowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Rekonstrukcja obrazu w cryoSIM z miejsca na siatce na mapie fluorescencji z konwencjonalnej mapy epifluorescencji. (A,B) Nakładanie map obrazów jasnego pola i fluorescencji wygenerowanych za pomocą konwencjonalnego mikroskopu epifluorescencyjnego. Mapa ta służy do lokalizowania obszarów zainteresowania w celu późniejszego zobrazowania w cryoSIM. (C) Zrekonstruowany obraz cryoSIM uzyskany w miejscu pokazanym w (B). Skrót: cryoSIM = Mikroskopia oświetlenia kriostrukturalnego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

3D SIM w temperaturach kriogenicznych ma wiele zalet w porównaniu z innymi technikami obrazowania SR do obrazowania zeszklonego materiału biologicznego. Wymaga znacznie mniej obrazów na wycinek z w porównaniu z innymi metodami SR, co skutkuje mniejszym napromieniowaniem i mniejszym prawdopodobieństwem tworzenia się kryształków lodu w przypadku próbek zeszklonych. Jest również w stanie obrazować całe komórki i może być skorelowany z tomografią rentgenowską w celu dopasowania struktury do funkcji. Co ciekawe, większość dostępnych na rynku fluoroforów i znaczników fluorescencyjnych wybiela się mniej w warunkach kriogenicznych niż w temperaturze pokojowej. Biorąc jednak pod uwagę wysoką wydajność kwantową większości popularnych fluoroforów w temperaturze pokojowej (w niektórych przypadkach ponad 80%), bezwzględne wzmocnienie wykryte w fotonach nie wynika ze zmian w wydajności kwantowej, ale ze zmniejszenia złożonych procesów bielenia. Więcej informacji na temat wydajności fluoroforów w temperaturach kriogenicznych można znaleźć w ⁸.

Bardzo ważne jest, aby próbki docierające do cryoSIM zostały wstępnie zmapowane przy użyciu konwencjonalnego mikroskopu kriofluorescencyjnego z funkcją jasnego pola w celu wytworzenia "mapy" siatki, która zawiera podświetlenie wszystkich potencjalnych AOI do dalszego obrazowania (ryc. 5). Czas dostępu do cryoSIM jest przydzielany w drodze konkurencyjnego procesu, który obejmuje złożenie propozycji, która jest następnie oceniana pod kątem wykonalności techniki i wpływu biomedycznego. Czas spędzony przy sprzęcie jest więc zawsze "na wagę złota", a wstępnie odwzorowane siatki pozwalają na najbardziej efektywne wykorzystanie alokacji. Istotne jest również, aby próbka była utrzymywana w stanie zeszklonym, zwłaszcza podczas przenoszenia próbki z uchwytu próbki na platformę obrazowania, aby zminimalizować tworzenie się kryształków lodu i późniejsze uszkodzenie próbki. Próbka powinna być dobrej jakości, aby uzyskać najlepsze obrazy kart SIM. Dobrze przygotowana próbka będzie charakteryzować się następującymi cechami: (a) nie będzie miała zanieczyszczenia kryształkami lodu, (b) użyta siatka będzie siatką szukacza, (c) nośnik będzie płaski, (d) siatka siatki i powierzchnia podłoża nie będą autofluorescencyjne oraz (e) nie będzie pęknięć w membranie nośnej. Te warunki wstępne można osiągnąć poprzez ostrożne obchodzenie się z próbką i zapewnienie, że próbki zawsze pozostają zeszklone.

Ważne jest, aby wcześniej sprawdzić, czy proponowane fluorofory próbek dadzą wystarczający sygnał w mikroskopie kriosim. Narzędzia takie jak SPEKCheck⁹ mogą pomóc w wyborze optymalnych kombinacji fluoroforów i filtrów. Jeśli wystąpią problemy z gromadzeniem surowych danych lub procesem rekonstrukcji, artefakty mogą pojawić się na obrazach po rekonstrukcji. Przykłady różnych artefaktów zostały udokumentowane przez Demmerle i ^wsp.10 Parametry rekonstrukcji obrazu można przejrzeć w pliku dziennika SoftWoRx, jeśli rekonstrukcja nie jest optymalna, otwierając plik podsumowania rekonstrukcji. Powinny być stałe odstępy między liniami pod kątem w danym kanale i względnie stała amplituda. Odchylenia większe niż 30% i wartości znacznie powyżej 1 (jeśli zastosuje się kompensację wielkości ściegu) powinny być dokładniej zbadane i mogą wskazywać na nieudane rekonstrukcje. Ponadto oprogramowanie SIMcheck² na Fidżi może być również używane do wykonywania różnych kontroli surowych i zrekonstruowanych danych w celu zdiagnozowania przyczyny błędów w ustawieniach parametrów obrazowania lub rekonstrukcji. SIM-check i jego mapa kontrastu modulacji mogą również pomóc w ocenie jakości zrekonstruowanych danych poprzez interpretację, które obszary obrazu mogą być rzeczywistymi strukturami, a które artefaktami.

Niski kontrast modulacji (pokazany ciemnym kolorem, na rysunku 5E) w obszarze jądra oznacza, że obszar ten będzie bardziej podatny na artefakty rekonstrukcyjne, co sugeruje, że wzorce skrótu pokazane w jądrze mogą być sklasyfikowane (Rysunek 5D) jako artefakt. Obszary sygnału silnej fluorescencji z większym prawdopodobieństwem dokładnie odzwierciedlą struktury natywne w przetwarzanych danych. W obszarach o słabym sygnale, w których fluorofory są rozmieszczone na większych obszarach, takich jak całkowita powierzchnia pęcherzyka, prawdopodobne jest, że rzeczywisty sygnał współistnieje z artefaktami przetwarzania i należy zachować ostrożność przy interpretacji tych danych. Po sprawdzeniu pełnego zakresu zrekonstruowanych danych, aby upewnić się, że nie ma żadnych dziwnych artefaktów i że tło jest generalnie gaussowskie i wyśrodkowane blisko zera, dane są zazwyczaj przycinane do zera lub wartość modalna - szczyt sygnału tła - powinna być bardzo bliska zeru. Dzięki temu zakres dynamiczny wyświetlanego obrazu nie jest zdominowany przez negatywne artefakty tła. Gdy spodziewany jest słabszy sygnał, należy zachować szczególną ostrożność przy analizie obiektów i upewnieniu się, że są to rzeczywiste konstrukcje, a nie artefakty rekonstrukcyjne.

Istnieją pewne ograniczenia systemu obrazowania. Ponieważ stolik próbki jest płaski, próbki o zmiennej grubości lub siatki, które nie są płaskie, nie są idealnymi obiektami do obrazowania. Dodatkowo, jeśli obrazowanie korelacyjne będzie wykonywane za pomocą miękkiej tomografii rentgenowskiej, komórki w pobliżu granic siatki nie powinny być obrazowane, ponieważ nie będą one widoczne w mikroskopie rentgenowskim podczas akwizycji serii pochylenia. Wreszcie, ilość osuszenia próbki przed zamrożeniem wgłębnym ma znaczący wpływ na jakość obrazowania; zbyt mała ilość blottingu powoduje, że próbki są zbyt grube, dając nieoptymalne obrazy SIM z wysokim szumem tła, podczas gdy zbyt dużo blottingu może powodować zniekształcenie komórek, a tym samym większą podatność na uszkodzenia cieplne spowodowane padającą wiązką laserową. Podsumowując, cryoSIM jest potężnym narzędziem do mikroskopii fluorescencyjnej do obrazowania próbek biologicznych w 3D na poziomie zbliżonym do natywnego i ma szerokie zastosowanie w wielu obszarach.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Siatki samochodowe	FEI
Autogrids	Thermo Fisher Scientific	1036173
BioTracker 488 Zielony mikrotubula Cytoszkielet Barwnik	Sigma-Aldrich	SCT142
Oprogramowanie kokpitu	Uniwersytet		https://github.com/MicronOxford/cockpit
kriokompatybilny pojemnik poliuretanowy	Jena bioscience	CC-FD-800
Skrzynka do przechowywania siatki Cryo TEM	Model naukowy Thermo Fisher	Mikroskop
	Wykonane na zamówienie	Nie dotyczy	Wykonane na zamówienie, patrz poniższe odniesienie do projektu:  Michael A. Phillips, Maria Harkiolaki, David Miguel Susano Pinto, Richard M. Parton, Ana Palanca, Manuel Garcia-Moreno, Ilias Kounatidis, John W. Sedat, David I. Stuart, Alfredo Castello, Martin J. Booth, Ilan Davis i Ian M. Dobbie, "CryoSIM: kriogeniczna mikroskopia fluorescencyjna 3D z oświetleniem strukturalnym o wysokiej rozdzielczości super-resolution do skorelowanego obrazowania ultrastrukturalnego", Optica 7, 802-812 (2020). Posiada obiektyw Nikon TU Plan Apo 100x/0.9 NA.
System kriostolików	Linkam Scientific Instruments	CMS196
Kleszcze chirurgiczne z cienką końcówką	Ted Pella	38125
MitoTracker Deep Red FM	Thermo Fisher Scientific	M22426
Oprogramowanie do mikroskopu Python	Uniwersytet		https://www.python-microscope.org/
Naukowe chusteczki do suchego papieru	Kimberly-Clark 7551
Oprogramowanie do rekonstrukcji karty SIM	softWoRx, GE Healthcare	Wersja  6.5.2
Oprogramowanie StitchM	Diamentowe źródło		https://github.com/DiamondLightSource/StitchM
siatki TEM do próbek	Quantifoil Micro Tools	G200F1