Barwienie i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości trójwymiarowych modeli organoidów i sferoidów

Podsumowanie

Tutaj udostępniamy szczegółowe, solidne i uzupełniające protokoły do wykonywania barwienia i obrazowania w rozdzielczości subkomórkowej stałych trójwymiarowych modeli hodowli komórkowych w zakresie od 100 μm do kilku milimetrów, umożliwiając w ten sposób wizualizację ich morfologii, składu typu komórki i interakcji.

Streszczenie

Trójwymiarowe (3D) modele hodowli komórkowych in vitro, takie jak organoidy i sferoidy, są cennymi narzędziami do wielu zastosowań, w tym do rozwoju i modelowania chorób, odkrywania leków i medycyny regeneracyjnej. Aby w pełni wykorzystać te modele, konieczne jest ich badanie na poziomie komórkowym i subkomórkowym. Jednak scharakteryzowanie takich modeli hodowli komórkowych 3D in vitro może być trudne technicznie i wymaga specjalistycznej wiedzy w celu przeprowadzenia skutecznych analiz. W tym artykule przedstawiono szczegółowe, solidne i uzupełniające protokoły do wykonywania barwienia i obrazowania w rozdzielczości subkomórkowej ustalonych modeli hodowli komórkowych 3D in vitro w zakresie od 100 μm do kilku milimetrów. Protokoły te mają zastosowanie do szerokiej gamy organoidów i sferoidów, które różnią się pochodzeniem komórki, morfologią i warunkami hodowli. Od zbierania struktur 3D po analizę obrazu, protokoły te można ukończyć w ciągu 4-5 dni. Krótko mówiąc, struktury 3D są zbierane, utrwalane, a następnie mogą być przetwarzane albo poprzez zatapianie w parafinie i barwienie histologiczne/immunohistochemiczne, albo bezpośrednio znakowane immunologicznie i przygotowywane do optycznego oczyszczania i rekonstrukcji 3D (głębokość 200 μm) za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Wprowadzenie

W ciągu ostatnich dziesięcioleci postęp w biologii komórek macierzystych i technologiach hodowli 3D in vitro zwiastował rewolucję w biologii i medycynie. Modele komórkowe o wyższej złożoności w 3D stały się bardzo popularne, ponieważ pozwalają komórkom rosnąć i wchodzić w interakcje z otaczającą strukturą zewnątrzkomórkową, ściśle podsumowując aspekty żywych tkanek, w tym ich architekturę, organizację i interakcje komórek, a nawet charakterystykę dyfuzji. W związku z tym modele 3D hodowli komórkowych mogą dostarczyć unikalnych informacji na temat zachowania komórek w rozwijających się lub chorych tkankach in vitro. Organoidy i sferoidy są wielokomórkowymi strukturami 3D, od kilku mikrometrów do milimetrów, i są najbardziej widocznymi strukturami 3D in vitro. Oba mogą być hodowane w rusztowaniu nośnym, w tym (i) hydrożele pochodzące od zwierząt (ekstrakt z błony podstawnej, kolagen), roślin (alginian / agaroza) lub syntetyzowane z chemikaliów lub (ii) obojętne matryce zawierające pory w celu promowania proliferacji i wzrostu komórek.

Organoidy i sferoidy mogą również rozwijać się bez obecności rusztowania wspierającego, polegając na komórkach do samodzielnego składania się w klastry. Opiera się to na różnych technikach, takich jak użycie materiałów nieadhezyjnych do hamowania przyczepiania komórek, napięcia powierzchniowego i siły grawitacji (np. techniki wiszących kropli) lub stałego obrotu kołowego naczyń (np. hodowla przędzalnic). We wszystkich przypadkach techniki te ułatwiają interakcje komórka-komórka i komórka-macierz w celu przezwyciężenia ograniczeń tradycyjnej monowarstwowej hodowli komórkowej¹. Terminy "organoidy" i "sferoidy" były używane zamiennie w przeszłości, ale istnieją kluczowe różnice między tymi dwoma modelami hodowli komórkowych 3D. Organoidy to klastry komórkowe 3D in vitro pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych lub komórek macierzystych specyficznych dla tkanki, w których komórki spontanicznie samoorganizują się w komórki progenitorowe i zróżnicowane typy komórek i które podsumowują przynajmniej niektóre funkcje narządu będącego przedmiotem zainteresowania². Sferoidy obejmują szerszy zakres wielokomórkowych struktur 3D powstałych w warunkach nieprzylegających i mogą powstawać z dużej różnorodności typów komórek, takich jak unieśmiertelnione linie komórkowe lub komórki pierwotne³. W związku z tym, nieodłącznie związane z ich wewnętrznym pochodzeniem komórek macierzystych, organoidy mają większą skłonność do samoorganizacji, żywotności i stabilności niż sferoidy.

Niemniej jednak, w istocie, te dwa modele są strukturami 3D złożonymi z wielu komórek, a techniki opracowane do ich badania są więc bardzo podobne. Na przykład zaawansowane metody obrazowania na poziomie rozdzielczości pojedynczej komórki są niezbędne do zbadania złożoności komórkowej zarówno organoidów, jak i sferoidów. Tutaj, podsumowując doświadczenie tej grupy i liderów w dziedzinie organoidów⁴, artykuł ten opisuje szczegółowe procedury wykonywania dwuwymiarowego (2D) i 3D barwienia całego mocowania, obrazowania i analiz składu komórkowego i subkomórkowego oraz organizacji przestrzennej organoidów i sferoidów w zakresie od 100 μm do kilku milimetrów. Rzeczywiście, procedura ta przedstawia dwa różne i uzupełniające się typy barwienia i akwizycji obrazowania w celu analizy dużej różnorodności rozmiarów i typów modeli hodowli komórkowych 3D in vitro. Zastosowanie jednego (analiza 3D całego montażu) lub drugiego (analiza przekroju 2D) będzie zależało od badanego modelu i poszukiwanych odpowiedzi. Analiza 3D całego montażu za pomocą mikroskopii konfokalnej może być na przykład stosowana do wizualizacji komórek w hodowli 3D o głębokości do 200 μm, niezależnie od ogólnego rozmiaru struktury 3D, podczas gdy analiza przekrojów 2D zapewnia wgląd w próbki o dowolnej wielkości, aczkolwiek na poziomie 2D. Procedura ta została z powodzeniem zastosowana w odniesieniu do różnych organoidów^4,5 oraz sferoidów pochodzących z komórek ludzkich i mysich, pochodzących z różnych embrionalnych listków rozrodczych. Przegląd procedury jest pokazany w Rysunek 1. Wskazane są główne etapy, relacje między nimi, decydujące kroki i oczekiwany czas.

Rysunek 1: Schematyczny przegląd procedury. Modele hodowli komórkowych 3D in vitro są zbierane i utrwalane, a następnie przygotowywane do barwienia 3D w całości (opcja a) lub zatopiane w parafinie w celu przekroju i barwienia 2D (opcja b). W przypadku eksperymentów barwienia 3D z całym mocowaniem, utrwalone struktury 3D są znakowane immunologicznie po etapie utrwalania. Opcjonalny etap oczyszczania optycznego można wykonać w celu poprawy jakości obrazowania i głębi mikroskopii optycznej poprzez zmniejszenie rozpraszania światła podczas przetwarzania obrazu. Obrazy są rejestrowane za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego lub konfokalnego systemu o wysokiej zawartości i analizowane za pomocą odpowiedniego oprogramowania. W przypadku zatapiania parafiny struktury 3D są przetwarzane bezpośrednio (opcja b.1 dla dużych struktur ≥ 400 μm) lub umieszczane w żelu (b.2; małe struktury ≤ 400 μm) w celu odwodnienia i zatopienia parafiny. Bloki parafiny są następnie cięte i barwione (barwienie histologiczne lub immunochemiczne). Obrazy przekrojów 2D są uzyskiwane na cyfrowym skanerze preparatów lub mikroskopie pionowym i analizowane na platformie analizy obrazu za pomocą szybkiej cyfrowej analizy ilościowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

UWAGA: Należy spodziewać się utraty ≤25% początkowej liczby struktur 3D podczas etapów obejmujących wymianę odczynników i mycie w następującej procedurze. Zaplanuj użycie końcowej liczby co najmniej dziesięciu struktur 3D o rozmiarach od 100 do 500 μm na badane warunki w celu przeprowadzenia jakościowych i ilościowych analiz obrazu. W razie potrzeby, w przypadku większych konstrukcji, odetnij końce końcówek pipet o pojemności 1 ml, aby uniknąć uszkodzenia struktur. Na wszystkich etapach, jeśli sedymentacja struktury 3D jest zbyt długa, komórki można delikatnie wirować pod ciśnieniem 50 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). W zależności od badanego zagadnienia należy rozważyć zalety i wady takiego etapu przędzenia, ponieważ wirowanie może pogorszyć kształt struktur 3D. Unikaj wirowania w >100 × g.

1. Zbieranie i utrwalanie modeli 3D kultur komórkowych

UWAGA: Uważaj, aby nie zasysać struktur 3D, które będą tylko luźno przymocowane do ścianki rury.

1. Pobieranie modeli 3D kultur komórkowych osadzonych w matrycy
   UWAGA: W tej sekcji opisano odzyskiwanie struktur 3D wyhodowanych w kroplach ekstraktu błony podstawnej z mysiego mięsaka Engelbretha-Holma-Swarma (BME), ale może być dostosowany do innych matryc. Zapoznaj się z dyskusją, aby zapoznać się z kluczowymi punktami dotyczącymi ECM.
   1. Usuń pożywkę hodowlaną z dołków bez naruszania matrycy 3D. Wstępnie pokryj wewnętrzną i zewnętrzną stronę końcówki pipety o pojemności 1 ml białkiem (zwaną dalej wstępnie powlekaną końcówką o pojemności 1 ml), zanurzając całą długość końcówki w 0,1% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) w buforowanym fosforanem roztworze soli fizjologicznej (PBS) (zwanym dalej 0,1% roztworem PBS-BSA) i pipetując dwukrotnie 1 ml tego roztworu w górę i w dół.
      UWAGA: Ta wstępna powłoka zapobiegnie przywieraniu komórek do końcówki i zminimalizuje wszelkie straty.
   2. Wstępnie pokryj wnętrze probówki wirówki (15 ml) białkiem (zwanym dalej wstępnie powlekaną probówką wirówkową), wielokrotnie napełniając 0,1% roztworem PBS-BSA i opróżniając probówkę.
      UWAGA: Zapobiegnie to przywieraniu komórek do rurki i zminimalizuje wszelkie straty.
   3. Używając wstępnie powlekanej końcówki o pojemności 1 ml, ostrożnie ponownie zawiesić struktury 3D studzienki za pomocą 1 ml lodowatego 1x PBS i delikatnie przenieść zawiesinę zawierającą struktury 3D do wstępnie powlekanej probówki wirówkowej.
   4. Delikatnie dodaj 13 ml lodowatego 1x PBS i pozwól strukturom 3D osadzać się na lodzie przez co najmniej 10 minut.
      UWAGA: W razie potrzeby wirować przez 5 minut w temperaturze 50 × g w temperaturze 4 °C. Unikaj wirowania >100 × g, ponieważ wpłynie to negatywnie na kształt struktur 3D.
   5. Usunąć supernatant. Używając wstępnie powlekanej końcówki o pojemności 1 ml, delikatnie ponownie zawieś struktury 3D w 1 ml lodowatego 1x PBS. Powtórzyć kroki od 1.1.4 do 1.1.5 w celu uzyskania jednorodnej osadki bez pozostałości matrycy 3D.
      UWAGA: Na skuteczne usuwanie matrycy ma wpływ rodzaj matrycy, liczba i rozmiar struktur 3D i wymaga optymalizacji pod kątem różnych warunków hodowli. W przypadku struktur 3D wyhodowanych w BME, rekonwalescencja po usunięciu matrycy trwa zwykle 45-60 minut.
   6. Używając wstępnie powlekanej końcówki o pojemności 1 ml, przenieś zawiesinę 1 ml 1x PBS zawierającą struktury 3D do wstępnie powlekanej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i przejdź do sekcji 1.3.
2. Zbieranie pływających modeli 3D kultur komórkowych
   1. Używając wstępnie powlekanej końcówki o pojemności 1 ml, ostrożnie zbierz i przenieś struktury 3D do wstępnie powlekanej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Pozwól strukturom 3D osiadać lub wiruj przez 5 minut przy 50 × g przy natężeniu światła.
   2. Usunąć supernatant. Używając wstępnie powlekanej końcówki o pojemności 1 ml, ponownie zawieś struktury 3D w 1 ml 1x PBS. Przejdź do sekcji 1.3.
3. Utrwalanie modeli 3D kultur komórkowych
   1. Pozwól strukturom 3D osiadać. Ostrożnie usunąć supernatant; pod wyciągiem delikatnie zawiesić struktury 3D w 1 ml formaliny za pomocą wstępnie powlekanej końcówki o pojemności 1 ml.
      UWAGA: Formalina zawiera formaldehyd, który jest niebezpieczny. Manipuluj substancją chemiczną w okapie chemicznym. Nosić gumowe rękawice i okulary ochronne.
   2. Inkubuj struktury 3D przez 30 minut w RT.
      UWAGA: 30-minutowy etap utrwalania formaliną jest wymagany do barwienia immunologicznego szerokiej gamy struktur 3D (różniących się rozmiarem, kształtem i pochodzeniem). Jednak ogólnie rzecz biorąc, dłuższe czasy wiązania (>3 godziny) są lepiej przystosowane do zachowania fluorescencji białek reporterowych.
   3. Pozwól strukturom 3D osiadać lub wiruj przez 5 minut przy 50 × g w temperaturze pokojowej. Delikatnie usuń formalinę i zastąp ją 1 ml 1x PBS. Powtórz ten krok prania w 1x PBS dwa razy. Przechowywać próbki w temperaturze 4 °C i postępować zgodnie z sekcją 2 lub sekcją 3.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać, a ogniwa można utrzymywać w temperaturze 4 °C do długotrwałego przechowywania (>1 rok).

2. 3D barwienie, obrazowanie i analiza modeli 3D hodowli komórkowych

UWAGA: Ponieważ organoidy są luźno przymocowane do ścianki probówki, należy obchodzić się z nimi delikatnie, ponieważ wszystkie następujące zmiany odczynników mogą spowodować utratę próbki. Przed rozpoczęciem upewnij się, że dostępne są odpowiednie elementy sterujące do barwienia. Kontrole pozytywne i ujemne mogą być komórkami, w których wiadomo, że białko będące przedmiotem zainteresowania jest odpowiednio nadmiernie eksprymowane lub nieobecne. Inkubować próbki bez przeciwciała pierwszorzędowego, aby określić, czy obserwowany sygnał jest spowodowany niespecyficznym wiązaniem przeciwciała drugorzędowego. Ponieważ niektóre komórki mają tendencję do wykazywania wysokiego poziomu autofluorescencji, użyj kontroli pozbawionych przeciwciał wtórnych, aby określić, czy obserwowana fluorescencja pochodzi z autofluorescencji tła. Znakowanie immunologiczne i fluorescencyjna wizualizacja reportera mogą być połączone.

1. Barwienie całego mocowania 3D
   1. Przygotować roztwór blokujący przenikanie (PB), uzupełniając 1x PBS 0,1%-1% niejonowego środka powierzchniowo czynnego (patrz Tabela materiałów), 1% dimetylosulfotlenku, 1% BSA i 1% surowicy osła (lub od zwierzęcia, u którego wyhodowano przeciwciała drugorzędowe).
      UWAGA: Ostrożnie optymalizuj stężenie niejonowego środka powierzchniowo czynnego w zależności od lokalizacji celu: błony (0-0,5%), cytoplazmy (0,5-1%) i jądra (1%). Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4°C do 1 miesiąca. BSA zwykle sprawdza się na etapie blokowania, ale w przypadku dużego szumu tła należy wykonać test empiryczny, aby uzyskać jak najlepsze wyniki dla danej kombinacji przeciwciał.
   2. Przenieść organoidy z probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml do probówki o pojemności 0,5 ml za pomocą wstępnie powlekanej końcówki o pojemności 1 ml. Pozwól organoidom się osadzić, delikatnie usuń 1x PBS i zastąp go 0,5 ml roztworu PB. Inkubować organoidy z delikatnym mieszaniem poziomym (30-50 obr./min) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   3. Pozwól organoidom się osadzić, delikatnie usuń roztwór PB i przemyj dwukrotnie w 1 ml PBS-BSA 0,1% przez 3 min.
      UWAGA: Odczekanie 3 minut pozwala strukturom osiadać na dnie rury.
   4. Delikatnie usunąć PBS-BSA 0,1% i dodać 250 μl przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w odpowiednim stężeniu w roztworze PB:1x PBS (1:10). Aby przygotować 10 ml roztworu PB:1x PBS (1:10), rozcieńczyć 1 ml roztworu PB w 9 ml 1x PBS. Inkubować przez 2-3 dni z delikatnym mieszaniem poziomym (30-50 obr./min) w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Odpowiedni czas inkubacji przeciwciał ma kluczowe znaczenie dla odpowiedniej penetracji przeciwciał, ponieważ struktury 3D mogą czasami osiągać duże rozmiary.
   5. Pozwól organoidom osiąść i delikatnie usuń pierwszorzędowy roztwór przeciwciał. Prać 5x w PBS-BSA 0,1% przez 3 minuty na pranie, a następnie 2x w 1 ml PBS-BSA 0,1% przez 15 minut na pranie z delikatnym mieszaniem poziomym.
   6. Dodać 250 μl przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w stosunku 1:250 do roztworu PB:1x PBS (1:10). Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 4°C z delikatnym mieszaniem poziomym (30-50 obr./min). Na tym etapie należy chronić próbki przed światłem.
   7. Dodać 250 μl Hoechst 33342 (20 μM roztworu podstawowego) rozcieńczonego w stosunku 1:1000 w roztworze PB:1x PBS (1:10) i inkubować przez kolejne 2 godziny w temperaturze 4 °C z delikatnym mieszaniem poziomym (30-50 obr./min).
   8. Pozwól organoidom osiąść i delikatnie usuń roztwór zawierający przeciwciało drugorzędowe + Hoechst 33342. Myć organoidy 5x w 1 ml 1x PBS przez 3 minuty na pranie, a następnie 2x w 1 ml 1x PBS przez 15 minut na pranie z delikatnym mieszaniem poziomym (30-50 obr./min).
      UWAGA: Bardzo ważne jest, aby dokładnie umyć próbki, aby uniknąć szumów tła lub utraty sygnału.
   9. Przechowywać próbki w PBS w temperaturze 4 °C do czasu uzyskania obrazu. Postępować zgodnie z sekcją 2.2.
      UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, a próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy, chroniąc je przed światłem.
2. Przygotowanie próbki do obrazowania konfokalnego
   1. Używając wstępnie powlekanej końcówki o pojemności 1 ml, ostrożnie przenieś organoidy do 50 μl 1x PBS na studzienkę w 96-dołkowej czarnej mikropłytce polistyrenowej. Przejdź do kroku 2.2.3 lub sekcji 2.3.
      UWAGA: Na tym etapie próbkę można chronić przed światłem i przechowywać w temperaturze 4 °C przez wiele tygodni.
   2. Clearing
      UWAGA: Etap oczyszczania jest opcjonalny i może być stosowany do znakowania immunologicznego organoidów lub do wykrywania endogennej fluorescencji. Oczyszczanie może powodować kurczenie się struktury 3D, ale nie zmienia ogólnej morfologii, z wyjątkiem sferycznych jednowarstwowych organoidów o dużych lumenach⁴. W przypadku tych organoidów torbielowatych pomiń etap oczyszczania i wykonaj obrazowanie tkanek głębokich⁶.
      1. Przygotować 2,5 M roztwór do usuwania glicerolu i fruktozy zawierający 50% v/v glicerolu, 11% v/v wody destylowanej i 45% w/v fruktozy, mieszając na mieszadle magnetycznym co najmniej przez noc, aż roztwór będzie całkowicie rozpuszczony i jednorodny. Przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności przez okres do 1 miesiąca.
      2. Usuń jak najwięcej 1x PBS bez dotykania organoidów. Po zdjęciu końcówki dodać 200 μl roztworu czyszczącego za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml i delikatnie zawiesić, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków. Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 12 godzin i przejść do sekcji 3.
         UWAGA: Ponieważ roztwór czyszczący jest lepki, małe objętości są trudne w obsłudze. Aby ułatwić obsługę, upewnij się, że roztwór ma temperaturę roboczą i powoli pipetuj. W celu optymalnego oczyszczenia, przed obrazowaniem należy pozostawić próbkę do osadzenia się w roztworze oczyszczającym przez co najmniej 24 godziny. Jeśli struktury 3D unoszą się w powietrzu w momencie akwizycji, wykonaj opcjonalne wirowanie przez 10 minut przy <100 × g przy natężeniu obrotu lub daj im więcej czasu (od jednego do kilku dni), aby mogły się osadzić. Na tym etapie protokół można wstrzymać przed przystąpieniem do obrazowania, jeśli jest chroniony przed światłem i przechowywany w temperaturze 4 °C (przez tygodnie) lub -20 °C (przez miesiące).
3. Akwizycja i analiza obrazu
   UWAGA: Do obrazowania konstrukcji 3D wymagana będzie technologia przekrojów obrazu.
   1. Używaj mikroskopów konfokalnych i faworyzuj obiektywy immersyjne o większej aperturze numerycznej (NA) w porównaniu z powietrzem. Obiektywy o powiększeniu (10x, 20x, 40x) należy dobrać do wielkości struktur 3D, rekonstrukcji obrazu (stitchingu) oraz rozwiązań użytych do analizy.
   2. Wybierając tryb akwizycji, należy wziąć pod uwagę głębokość ostrości obiektywu użytego do zdefiniowania kroku dla układania w stos Z; pozwalają na optymalne renderowanie 3D.
      UWAGA: Rozwiązania do analizy obrazu różnią się między sobą, a analiza będzie musiała być dostosowana do używanego oprogramowania. Na przykład ten protokół analizy został opracowany w oprogramowaniu do analizy o wysokiej zawartości (szczegółowe informacje można znaleźć w tabeli materiałów i rysunku uzupełniającym 1) i dostarcza danych na temat segmentacji obiektów, obliczania właściwości i wyboru populacji komórek w zrekonstruowanym obiekcie 3D.

3. Przekroje 2D, barwienie, obrazowanie i analiza modeli 3D hodowli komórkowych

UWAGA: Modele 3D kultur komórkowych różnią się wielkością. Postępuj zgodnie z sekcją 3.1 lub 3.2, aby skutecznie zatapiać parafinę (Rysunek 2). Odczekaj wystarczająco dużo czasu na sedymentację struktury 3D przed jakimikolwiek myciami i wymianą odczynników. Uważaj, aby nie zassać organoidów, które będą unosić się na dnie probówki. Informacje na temat zatapiania parafiny można znaleźć w Rysunek 2, aby uzyskać wskazówki.

1. Parafinowe zatapianie dużych (Ø ≥ 400 μm) modeli 3D hodowli komórkowych
   1. Na dzień przed zatopieniem należy ogrzać dwie kolby o pojemności 150 ml wypełnione parafiną (kąpiele parafinowe), małą metalową formę do zatapiania na próbkę i cienkie kleszcze do temperatury 65 °C.
   2. Używając wstępnie powlekanej końcówki o pojemności 1 ml, ostrożnie przenieś organoidy w 1x PBS do szklanej probówki o płaskim dnie z nakrętką wyłożoną politetrafluoroetylenem. Pozwól organoidom się osadzić, ostrożnie usuń 1x PBS i zastąp go 70% etanolem. Inkubować przez co najmniej 30 minut.
   3. Pozwól organoidom osiąść i ostrożnie usuń 70% etanolu. Zastąp go 1 ml gotowego do użycia roztworu eozyny Y. Przesuń tubkę i bejcuj przez co najmniej 30 minut. Ostrożnie usuń roztwór eozyny i odwadniaj organoidy w trzech kolejnych płukaniach 1 ml 100% etanolu przez ~30 minut każde.
      UWAGA: Etanol, łatwopalna i lotna ciecz, powoduje silne podrażnienie oczu i dróg oddechowych. Manipuluj nim w okapie i noś ochronne okulary.
   4. Ostrożnie usuń 100% etanol i pod chemicznym kapturem wyczyść organoidy w 3 kolejnych płukaniach 1 ml ksylenu przez ~30 minut każde.
      UWAGA: Ksylen jest toksyczną, łatwopalną cieczą, której opary mogą powodować podrażnienia. Manipuluj nim w dygestorium. Unikaj bezpośredniego kontaktu ze skórą i noś gumowe rękawice i okulary ochronne
   .
   5. Pod kapturem chemicznym przygotuj białą kasetę z mikrobliźniakami tkankowymi, umieszczając kawałek podkładki biopsyjnej (wcześniej nasączonej ksylenem) w jednej z komór kasety. Ostrożnie przenieś struktury 3D za pomocą wstępnie powlekanej plastikowej pipety Pasteura o pojemności 2 ml do podkładki biopsyjnej. Przykryj je inną podkładką biopsyjną nasączoną ksylenem, aby zapobiec przesuwaniu się organoidów, i zamknij kasetę.
   6. Jeśli przetwarzanych jest kilka próbek, umieść kasetę w kąpieli ksylenowej, aby oczekiwać na dalszą obróbkę. Po przeniesieniu wszystkich próbek do kaset należy umieścić kasety we wstępnie podgrzanej kąpieli parafinowej na 30 minut w temperaturze 65 °C. Przenieść kasety do świeżej, wstępnie podgrzanej kąpieli parafinowej na noc.
   7. Po nasączeniu parafiną weź podgrzaną formę do zatapiania i dodaj do niej podgrzaną parafinę. Umieść podkładkę biopsyjną zawierającą struktury 3D w formie i delikatnie ją mieszaj, aż wszystkie organoidy opadną na dno formy. Bardzo ostrożnie umieść struktury 3D na środku formy za pomocą wstępnie podgrzanych drobnych kleszczyków. Postępować zgodnie z sekcją 3.3.
      UWAGA: Uważaj, aby nie zakłócić struktur 3D kleszczami; Naciskaj, ale nie ściskaj ich.
2. Parafinowe zatapianie małych (Ø ≤ 400 μm) modeli 3D hodowli komórkowych
   1. Na dzień przed zatopieniem należy ogrzać dwie kolby o pojemności 150 ml wypełnione parafiną (kąpiele parafinowe), małą metalową formę do zatapiania na próbkę i cienkie kleszcze do temperatury 65 °C.
   2. Ostrożnie usunąć 1x PBS z zawiesiny organoidu. Delikatnie wykonaj 3 płukania w 1 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS). Usuń jak najwięcej 1x TBS bez dotykania organoidów.
      UWAGA: Uważaj, aby nie zassać próbki. W razie potrzeby należy wykonać 5-minutowe wirowanie przy 50 x g przy suchej smołce. Pozostałe ślady fosforanu będą zakłócać następujące etapy, w szczególności zapobiegając polimeryzacji żelu. Z tego względu nie należy używać roztworów PBS na żadnym etapie przetwarzania. Na tym etapie użyto komercyjnego zestawu zawierającego kasety, odczynnik #1 (przezroczysty płyn) i odczynnik #2 (kolorowy płyn), aby ułatwić procedurę zatopienia parafiny bez potencjalnej utraty drobnych fragmentów (patrz Tabela materiałów). Postępuj zgodnie z instrukcjami zestawu. Kasety są wstępnie zmontowane z papierami podkładowymi i wkładkami z płyty.
   3. Dodaj 2 krople odczynnika #2 do probówki i delikatnie wymieszaj, stukając w probówkę. Dodaj 2 krople odczynnika #1 i ponownie wymieszaj, stukając, aby żel zestalił się. Za pomocą cienkich kleszczyków wyjmij żel z tubki i umieść go w studzience kasety.
   4. Pod wyciągiem odwodnić próbkę, umieszczając kasetę w kolejnych kąpielach w następujący sposób (użyć kolb o pojemności 150 ml i użyć świeżego etanolu lub ksylenu do każdej kąpieli): etanol 70%, 30 min; etanol 96%, 30 min; etanol 100%, trzy płukania po 30 min każde; ksylen, trzy płukania po 30 min każde.
   5. Umieścić kasety w podgrzanej kąpieli parafinowej na 30 minut w temperaturze 65 °C i przenieść je na noc do świeżej, wstępnie podgrzanej łaźni parafinowej. Po impregnacji parafiną weź wstępnie podgrzaną formę do zatapiania i dodaj do niej podgrzaną parafinę. Otwórz kasetę, ostrożnie usuń żel za pomocą drobnych kleszczyków i umieść żel zawierający struktury 3D na środku formy do zatapiania. Postępuj zgodnie z sekcją 3.3.
3. Typowe etapy zatapiania parafiny
   1. Delikatnie przenieś formę w zimne miejsce, aby parafina zastygła w cienkiej warstwie, co utrzyma struktury 3D w odpowiedniej pozycji. Dodaj kasetę na chusteczki na wierzchu formy i dodaj gorącą parafinę, aby przykryć tę plastikową kasetę. Wyjmij formę, gdy całkowicie zastygnie, i przejdź do sekcji 3.4.
      UWAGA: Bloki parafiny mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej przez lata.

Rysunek 2: Przegląd procedury zatapiania parafiny w dużych i małych modelach hodowli komórkowych in vitro 3D.
(A) Standardowa procedura zatapiania parafiny. Po utrwaleniu i odwodnieniu struktury 3D są barwione eozyną, aby ułatwić ich wizualizację (lewy górny i dolny róg). Struktury 3D są ostrożnie umieszczane na podkładce biopsyjnej (niebieskiej) w kasecie za pomocą pipety Pasteura o pojemności 2 ml (w środku). Po impregnacji parafiną struktury 3D są delikatnie wrzucane do ciekłej parafiny za pomocą kleszczy i delikatnie mieszane w podkładce biopsyjnej. Na tym etapie małe struktury 3D są tracone, ponieważ nie można ich zwolnić z pola lutowniczego (u dołu po prawej: nieudane osadzenie). Osadzane będą tylko duże struktury 3D (u góry po prawej: pomyślne osadzenie). Groty strzałek wskazują kultury 3D. (B) Alternatywa dla standardowego protokołu zatapiania parafiny. Po utrwaleniu małych struktur 3D stosuje się komercyjny zestaw do utrzymania komórek w żelu i ułatwienia ich przeniesienia do formy po impregnacji parafinową (po prawej: udane zatopienie). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Cięcie bloków i barwienie
   1. Wyciąć skrawki o wielkości 4 μm za pomocą standardowego mikrotomu i wykonać standardowe techniki histologiczne i immunohistochemiczne. Postępować zgodnie z sekcją 3.5.
      UWAGA: Zastosowano specjalne szkiełka (patrz Tabela materiałów) w celu lepszej przyczepności sekcji. Szkiełka można przechowywać w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C przez lata.
5. Akwizycja i analiza obrazu
   1. Wykonuj obrazowanie za pomocą cyfrowego skanera slajdów lub mikroskopu pionowego i analizuj dane za pomocą platformy do szybkiej cyfrowej analizy ilościowej, która raportuje dane morfologiczne i multipleksowane dane ekspresji na podstawie komórki po komórce w całych sekcjach struktury 3D (szczegóły patrz rysunek uzupełniający 2).
      UWAGA: Obiektyw 20x jest rutynowo używany przez tę grupę.

Wyniki

Ten protokół zawiera przegląd krytycznych etapów barwienia 2D i 3D z pełnym mocowaniem, a także obrazowanie i analizy ilościowe modeli hodowli komórkowych 3D (Rysunek 3 i Rysunek 4). Ma zastosowanie do szerokiej gamy modeli hodowli komórkowych 3D - od sferoid po organoidy z różnych gatunków gospodarzy lub tkanek - i umożliwia uzyskanie dokładnych i ilościowych informacji na temat architektury, organizacji komórek i interakcji na poziomie komórkowym i subkomórkowym (Rysunek 3 i Rysunek 4). Laboratoria mogą być zmuszone do optymalizacji technik histologicznych i immunohistochemicznych 2D oraz stężeń przeciwciał zgodnie z własnymi potrzebami.

Obie metody dostarczają cennych information. 3D biologicznych barwienie całego mocowania i mikroskopia konfokalna dostarczają wizualnych informacji o składzie komórkowym i pozycji przestrzennej z polem głębokości do 200 μm (Rysunek 3B). Jednak przekroje 2D są wygodne w przypadku większych struktur 3D, aby ujawnić szczegółowe cechy morfologiczne komórek w całym przekroju struktur 3D, które w przeciwnym razie mogą być trudne do zaobserwowania in situ ze względu na rozpraszanie światła, które pogarsza rozdzielczość w większych próbkach. Co więcej, obie techniki mogą dostarczyć danych ilościowych. Rzeczywiście, uzyskana rozdzielczość pozwala na zastosowanie algorytmów segmentacji komórkowej i subkomórkowej do ilościowego określania liczby komórek i wykrywania obecności różnych markerów komórkowych w różnych podtypach komórkowych (Rysunek 3F i Rysunek 4). Podsumowując, opisane tutaj techniki obrazowania są powtarzalne, proste i komplementarne oraz stanowią cenne narzędzia do badania heterogeniczności komórkowej.

Rysunek 3: Reprezentatywne wyniki dla całego montażu 3D, obrazowania i analiz przekrojów optycznych 3D i 2D. (A) Obrazy konfokalne ludzkiego (h) sferoidu glejaka wysokiego stopnia hodowanego przez tydzień i oznaczonego Hoechst (niebieski), Olig2 (żółty) i Actin (czerwony) (20-krotny obiektyw wodny). Dla wszystkich uzyskanych obrazów ustawienia mikroskopu ustalono za pomocą kontroli pozytywnej (u góry), a następnie kontrolę ujemną zobrazowano przy użyciu identycznych ustawień w celu kontroli braku fluorescencji przy braku przeciwciała pierwszorzędowego (na dole). (B) Ortogonalne odwzorowanie 3D całego mocowania barwienia Ki67 wykonane w (h) sferoidalnym glejaku wysokiego stopnia hodowanym przez tydzień (oczyszczanie glicerolowo-fruktozowe; 20x obiektyw wodny, konfokalny). (C) Obrazy konfokalne (h) sferoidy glejaka wysokiego stopnia hodowanej przez tydzień i oznaczonej Hoechst (niebieski), Olig2 (żółty) i Phalloidine-488 (zielony) (usuwanie glicerolu i fruktozy; 20-krotny obiektyw wodny). (D) Konfokalne obrazy sferoid ludzkich (h) mięsaka prążkowanokomórkowego (na górze) i myszy (m) z komórkami grzebienia nerwowego (na dole) hodowanych przez tydzień i znakowanych odpowiednio Hoechstem (niebieski), aktyną (czerwoną) i Ki67 (zieloną) (usuwanie glicerolu i fruktozy; 20x suchy obiektyw). (E) Obrazy konfokalne (h) sferoidy glejaka wysokiego stopnia hodowanej przez tydzień i oznaczonej Hoechstem (niebieski) i Ki67 (zielony) (usuwanie glicerolu i fruktozy; 40-krotny obiektyw wodny) (u góry po lewej). Segmentowane obrazy na kanale Hoechsta i regiony jądrowe Ki67-dodatnie (+) na kanale zielonym zostały wygenerowane przy użyciu oprogramowania do analizy o wysokiej zawartości (patrz rysunek uzupełniający 1 i tabela materiałów) (na dole). Podany wynik to procent jąder Ki67⁺ na segmentowaną strukturę 3D (u góry po prawej). Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Reprezentatywne wyniki dla obrazowania i analiz przekrojów optycznych 2D. (A, D) Obrazy przekrojów 2D modelu komórkowego 3D (ludzkie sferoidy mięsaka prążkowanokomórkowego hodowane przez miesiąc) uzyskane za pomocą cyfrowego skanera slajdów i analizowane na platformie do szybkiej cyfrowej analizy ilościowej. (A) Barwienie H&E i wykrywanie komórek w zależności od ich wielkości. Podziałka liniowa = 500 μm. (B) Histogram pokazuje procent komórek < 100^μm2 i > 100^μm2 wykrytych za pomocą oprogramowania do szybkiej cyfrowej analizy ilościowej (po lewej: Halo) lub ręcznego liczenia (po prawej: MC). (C) Barwienie Ki67 i wykrywanie komórek zgodnie z intensywnością ich sygnału 3,3'-diaminobenzydyny (DAB). Ujemny (niebieski), słabo dodatni (żółty), dodatni (czerwony). Pasek skali = 500 μm. (D) Histogram pokazuje procent komórek Ki67-ujemnych, słabo dodatnich i dodatnich. Skróty: H&E = hematoksylina i eozyna; MC = liczenie ręczne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Przegląd kroków w oprogramowaniu do analizy obrazowania. Analizy opierają się na asocjacji elementów składowych. Każdy blok konstrukcyjny odpowiada funkcji - segmentacji, obliczeniu, asocjacji, definicji danych wyjściowych - i oferuje wiele algorytmów i wyborów zmiennych w celu dopasowania do obrazowanej próbki biologicznej. Oprogramowanie zapewnia wiele protokołów analizy RMS (Ready Made Solution), które można łatwo używać i modyfikować. Zintegrowane protokoły analizy obrazu mogą być zapisywane, stosowane do różnych zestawów danych i udostępniane między użytkownikami. Krótko mówiąc, protokół analizy implikuje sekwencyjną segmentację obiektów: sferoida, jądra i wreszcie kieszenie Ki67 (A488). Następnie obliczana jest średnia intensywność kieszeni Ki67, aby jeszcze bardziej rozróżnić pozytywne zdarzenia. Na koniec dodatnio selekcjonowane są jądra obejmujące kieszenie dodatnie Ki67. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Przegląd etapów procedury oprogramowania do analizy ilościowej. Krok 1. Prześlij pliki za pomocą zakładki Studia. Pliki zostaną otwarte w sekcji Akcje obrazu. Krok 2. Otwórz kartę Adnotacje, a następnie kliknij Akcje warstwy, aby zaprojektować nową warstwę wokół konstrukcji za pomocą narzędzia okręgu na pasku narzędzi. W przypadku struktur nieokrągłych można zamiast tego użyć narzędzia Pióro. Krok 3. Pasek narzędzi może być używany do projektowania adnotacji i wizualizacji kwantyfikacji za pomocą narzędzia tool. Krok 4. Otwórz zakładkę Analiza i wybierz najlepsze warunki do analizy próbki (w tym miejscu może być konieczne wykonanie kilku prób). Krok 4.1. Użyj sekcji Wybór bejcy, aby ustawić warunki barwienia. W przypadku kilku plam można je dodać i zmienić ich nazwę, a wirtualny kolor można zmodyfikować. Wykrywanie lokalizacji można określić - barwienie jądrowe lub cytoplazmowe. Krok 4.2. Użyj sekcji Wykrywanie komórek, aby skonfigurować wykrywanie komórek. Ta sekcja będzie najważniejsza dla analizy. Sekcja Próg kontrastu jądrowego umożliwi detekcję wszystkich jąder. Należy zwrócić uwagę w przypadku, gdy istnieje wiele rozmiarów populacji, oprogramowanie może wykryć kilka komórek zamiast jednej pojedynczej. Sekcje Rozmiar jądra i Agresywność segmentacji jądrowej mogą być używane do ilościowego określania zakresów populacji wielkości komórek. Krok 5. Opis sposobu przeprowadzania analizy próbki. Postępuj zgodnie z instrukcjami pokazanymi na rysunku. Sekcja Warstwa adnotacji uruchomi ustawienie tylko na tym slajdzie. Kwantyfikacja może być zwizualizowana za pomocą narzędzia tool. Powtarzać kroki 4.1-5 aż do uzyskania odpowiedniej oceny ilościowej. Kroki 6-6.1. Te kroki umożliwiają narysowanie figury za pomocą oprogramowania. Krok 7. Grafikę kwantyfikacyjną uzyskaną za pomocą oprogramowania można zapisać. Krok 8. Dane można eksportować. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Hodowla komórkowa jest niezbędnym narzędziem do odkrycia podstawowych mechanizmów biologicznych związanych z rozwojem, funkcjonowaniem, regeneracją i zakłóceniami tkanek i narządów, a także chorobami. Chociaż dominowała monowarstwowa hodowla komórkowa 2D, ostatnie badania przesunęły się w kierunku kultur generujących struktury 3D bardziej odzwierciedlające odpowiedzi komórkowe in vivo, w szczególności dzięki dodatkowej organizacji przestrzennej i kontaktom komórka-komórka, które wpływają na ekspresję genów i zachowanie komórki, a tym samym mogą dostarczyć więcej danych predykcyjnych⁷. Niemniej jednak nadal istnieje wiele wyzwań, w tym potrzeba przyjaznych dla użytkownika technik barwienia i obrazowania do szczegółowej wizualizacji mikroskopowej i oceny złożonych struktur 3D na poziomie komórkowym i subkomórkowym. W tym kontekście dostarczono szczegółowe, solidne i uzupełniające protokoły do wykonywania barwienia oraz obrazowania w rozdzielczości komórkowej i subkomórkowej ustalonych modeli hodowli komórkowych 3D in vitro o rozmiarach od 100 μm do kilku milimetrów.

Procedura ta przedstawia dwie różne strategie radzenia sobie z dużą różnorodnością rozmiarów i typów modeli hodowli komórkowych 3D in vitro. Wybór jednej (analiza 3D całego montażu) lub drugiej (analiza przekrojów 2D) będzie zależał od użytego modelu i badanego problemu. Analiza 3D całego montażu za pomocą mikroskopii konfokalnej umożliwia wizualizację komórek o polu głębokości do 200 μm, niezależnie od całkowitej wielkości struktury 3D, podczas gdy przekroje 2D mają zastosowanie do próbek o dowolnej wielkości, ale wizualizacja pozostaje wymiarowa 2D. Poniżej znajduje się kilka sugestii dotyczących rozwiązywania problemów i kwestii technicznych.

Utrata struktur 3D podczas przepływu pracy jest najczęstszą wadą. Mogą one pozostać przylegające do końcówek i rurek, dlatego kluczowe znaczenie ma wstępne powlekanie końcówek i rurek 0,1% roztworem PBS-BSA. Co więcej, bardzo ważne jest, aby struktury 3D osiadły między zmianami odczynnika i aby wszystkie pipety były wykonywane bardzo ostrożnie. Jak wspomniano w procedurze, dla wszystkich etapów, jeśli sedymentacja struktury 3D jest zbyt długa, komórki można delikatnie wirować z prędkością 50 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. W zależności od celu badania, należy rozważyć zalety/wady takiego etapu wirowania, ponieważ wirowanie może zagrozić kształtowi struktur 3D. Ponadto należy zachować ostrożność w celu zachowania tej morfologii na etapie fiksacji, ponieważ organoidy torbielowate mają tendencję do zapadania się. Mocowanie konstrukcji o wielkości poniżej 400 μm powinno zapobiegać zmianom konstrukcyjnym.

Dla optymalnego znakowania immunologicznego kluczowym krokiem jest odzyskanie organoidów z ich matryc 3D. Macierz 3D może utrudniać odpowiednią penetrację przeciwciał lub prowadzić do wysokiego barwienia tła z powodu niespecyficznego wiązania z matrycą. Usunięcie ECM może zmienić morfologię zewnętrznych segmentów organoidów (szczególnie w przypadku małych wypukłości komórkowych wystających z badanych struktur 3D) i częściowo utrudnić analizy. W przypadku takich struktur 3D matryca może być zachowana przez cały czas trwania procedury; Jednakże warunki hodowli powinny być starannie dostosowane do wzrostu komórek w minimalnej ilości matrycy, aby zapobiec niedostatecznemu przenikaniu roztworów i przeciwciał oraz aby uniknąć kolejnych etapów płukania mających na celu zmniejszenie nadmiernego szumu tła ^6,8.

Etap oczyszczania optycznego opisany w tym protokole w sekcji barwienia całego mocowania 3D jest istotny dla obrazowania struktur 3D o głębokości do 150-200 μm zamiast 50-80 μm bez oczyszczania. W porównaniu z innymi metodologiami oczyszczania, które często wymagały kilku tygodni i stosowania toksycznych środków czyszczących, w niniejszym protokole zastosowano wcześniej opublikowany szybki i bezpieczny etap usuwania ^4,9. Ponadto ten etap oczyszczania jest odwracalny, a nowe przeciwciała mogą być dodawane do początkowego barwienia bez utraty rozdzielczości lub jasności⁴. Niemniej jednak, w zależności od badanego modelu hodowli komórkowej 3D, głębokość 150-200 μm może nie być wystarczająca do zobrazowania struktury 3D w sposób informacyjny, a ten protokół oczyszczania może spowodować zmiany w ogólnej morfologii sferycznych, jednowarstwowych organoidów o dużych prześwitach⁴. Użytkownicy powinni starannie zaprojektować swój eksperyment i, jeśli to konieczne, zoptymalizować czas etapu przepuszczalności/blokowania (aby umożliwić penetrację przeciwciał i roztworu), etapu oczyszczania (aby wniknąć głębiej niż 200 μm, próbki powinny zostać całkowicie oczyszczone) i akwizycji obrazu. Dwie najbardziej rozpowszechnione technologie dostępne w głównych obiektach to mikroskopia świetlna i mikroskopia konfokalna. Użytkownicy będą musieli starannie wybrać technologię w oparciu o rozmiar swoich struktur 3D i pytanie biologiczne¹⁰. Jednak w porównaniu z mikroskopią konfokalną, rozdzielczość mikroskopii arkuszowej światła uzyskana dla tak głębokich struktur pozostaje nieoptymalna dla uzyskania rozdzielczości subkomórkowej.

W tym przypadku opisano szczegółowy i solidny proces, który jest dedykowany do zatapiania parafiny w pojedynczych próbkach. Co ciekawe, Gabriel i in. opracowali niedawno protokół osadzania kultur komórkowych 3D w parafinie ze zwiększoną przepustowością. Wykorzystali formę polidimetylosiloksanu (PDMS) do uwięzienia 96 struktur 3D we wzorze mikromacierzy w jednym bloku, zapewniając nowe perspektywy dla badań nad modelami guzów 3D obejmującymi więcej grup, punktów czasowych, warunków leczenia i replik¹¹. Jednak ta metoda wymaga rozległych umiejętności i maszyn, w szczególności do wytwarzania premoldu używanego do tworzenia form PDMS.

Podsumowując, w artykule opisano dwa różne, uzupełniające się i adaptowalne podejścia umożliwiające uzyskanie dokładnych i ilościowych informacji na temat składu architektonicznego i komórkowego modeli komórkowych 3D. Oba parametry mają kluczowe znaczenie dla badania procesów biologicznych, takich jak wewnątrznowotworowa heterogeniczność komórkowa i jej rola w oporności na leczenie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sprzęt
Podkładka do biopsji Q Path niebieska	VWR	720-2254
Kasety macrostar III Blc couv. Char. x1500	VWR	720-2233
Kaseta microtwin biała	VWR	720-2183
Osłona chemiczna	Erlab	FI82 5585-06
Końcówki filtrujące 1000 µ L	Star lab Tip-One	S1122-1730
Szczypce do drobnych robótek	Innowacja piramidy	R35002-E
Rurki szklane z płaskim dnem wyłożone PTFE 2 mL	Fisher Scientific	11784259	Doskonały  dla środowiska      próbki,      farmaceutyki i odczynniki diagnostyczne. PTFE został zaprojektowany z myślą o najwyższym bezpieczeństwie produktu. PTFE zapewnia całkowicie obojętne uszczelnienie wewnętrzne i powierzchnię skierowaną w stronę próbki lub produktu.
Szklana płyta dolna 35 mm	Ibedi	2018003
Mieszanie poziome	N-BIOTEK	NB-205
Inkubator podgrzany do 65 ° C	Inkubator Memmert	LAB129
Formy Inox 15x15	VWR	720-1918
Szkiełka mikroskopowe Matsunami TOMO-11/90	Diagnostyka Roche	8082286001	te szkiełka służą do lepszej przyczepności przekrojów
Microtome	Microm Microtech Francja	HM340E
Skan panoramiczny II	3dhistech	2397612
Sprzęt do zatapiania parafiny	Leica	EG1150C
Pipeta plastikowa Pasteur 2 ml	VWR	612-1681
Q Path flakon 150mL cape blanc x250	VWR	216-1308	Dobre dla środowiska      próbki,      farmaceutyki i odczynniki diagnostyczne. Polipropylen (PP) jest sztywny,  solidny, zapewnia doskonałą  stres  spolszczenie  oraz  Wpływ  odporność i  dobra bariera olejowa i alkoholowa oraz odporność chemiczna. Nasadka wyłożona PE jest odporna na pękanie naprężeniowe i oferuje  Doskonały  Uszczelnianie  Charakterystyka.
Zestaw mikropipetorów  (P200, P1000)	Thermo Scientific	11877351 (20-200) 11887351(p1000)
OPERA PHENIX	PerkinElmer	HH14000000
SP5 odwrócony mikroskop konfokalny	Leica	LSM780
	VWR	720-0228
Mikroskop Zeiss Axiomager	Leica	SIP 60549
odczynnik
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030-100G
Cytoblok (zestaw)	Thermofisher Scientific	10066588
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma-Aldrich	57648266	UWAGA: toksyczny i łatwopalny. Opary mogą powodować podrażnienia. Manipulować w dygestorium. Unikać bezpośredniego kontaktu ze skórą. Nosić gumowe rękawice, okulary ochronne.
Eozyna wodna 1%	Sigma-Aldrich	HT110316
etanol 96%	VWR	83804.360	UWAGA: Powoduje silne działanie drażniące na oczy. Łatwopalna ciecz i para. Działa drażniąco na drogi oddechowe. Manipulować w dygestorium. Nosić okulary ochronne.
Etanol 100%	VWR	20821.365	UWAGA: Działa silnie drażniąco na oczy. Łatwopalna ciecz i para. Działa drażniąco na drogi oddechowe. Manipulować w dygestorium. Nosić okulary ochronne.
Formalina 4%	Microm Microtech France	F/40877-36	UWAGA: Formalina zawiera formaldehyd, który jest niebezpieczny. Manipulować w dygestorium. Unikać bezpośredniego kontaktu ze skórą. Nosić gumowe rękawice i okulary ochronne
Fruktoza	Sigma-Aldrich	F0127
Hematoksylina skrzelowa typu II	Microm Microtech France	F/CP813
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516	500 mL
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570	UWAGA: Podejrzewa się, że powoduje wady genetyczne.  Unikać bezpośredniego kontaktu ze skórą. Nosić gumowe rękawice i okulary ochronne
Normalna surowica osła	Sigma-Aldrich	D9663	10 ml
wosku parafinowego tek III	Sakura	4511
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS) 1 X	Gibco	14190-094
Sól fizjologiczna buforowana trisem (TBS) 10X	Microm Microtech France	F/00801	100 ml
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8532	UWAGA: Triton X­ 100 jest niebezpieczne. Unikać kontaktu ze skórą i oczami.
Ksylen	Sigma-Aldrich	534056	UWAGA: Ksylen jest toksyczny i łatwopalny. Opary mogą powodować podrażnienia. Manipulować w dygestorium. Unikać bezpośredniego kontaktu ze skórą. Nosić gumowe rękawice, okulary ochronne.
Solutions
Roztwór czyszczący	Roztwór oczyszczający glicerol-fruktoza to 60% (obj./w) glicerolu i 2,5 M fruktozy. Aby przygotować 10 ml tego roztworu, wymieszaj 6 ml glicerolu i 4,5 g fruktozy. Uzupełnij do 10 ml z dH2O. Użyj mieszadła magnetycznego na noc. Współczynnik załamania światła = 1,4688 w temperaturze pokojowej (RT: 19– 23 &stopnie; Przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C w ciemności do 1 miesiąca.
PBS-BSA 0,1% roztwór	Aby przygotować 0,1% (obj./wag.) 0,1% roztwór PBS-BSA, rozpuścić 500 mg BSA w 50 ml PBS-1X (przechowywać w temperaturze 4& C przez okres do 2 tygodni). I rozcieńczyć 1 ml tego roztworu w 9 ml PBS-1X. To rozwiązanie może być używane do wstępnego powlekania końcówki i probówki wirówkowej.
Roztwór blokujący przenikanie (roztwór PB)	Roztwór blokujący PBSDT to PBS-1X uzupełniony 0,1% – 1% Tritonx-100 (w zależności od lokalizacji błony/jądra białkowego), 1% DMSO, 1% BSA i 1% surowicy osła (lub ze zwierzęcia, u którego wyniesiono przeciwciała drugorzędowe). Roztwór ten może być przechowywany w temperaturze 4° C przez okres do 1 miesiąca.
PB:PBS-1X  ( 1:10) rozwiązanie	PB:PBS-1X  ( 1:10) jest 10-krotnie rozcieńczonym roztworem PB. Aby przygotować 10 ml tego roztworu, rozcieńczyć 1 ml roztworu PB w 9 ml PBS-1X.
Software
Halo oprogramowanie	Indicalabs	NM 87114
Harmony oprogramowanie	PerkinElmer	HH17000010