Artykuł metodologiczny

Barwienie i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości trójwymiarowych modeli organoidów i sferoidów

14.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62280

⸱

27 marca 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Childhood Cancer & Cell Death (C3), Université de Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, INSERM 1052, CNRS 5286, Centre Léon Bérard, Centre de recherche en cancérologie de Lyon (CRCL), Lyon 69373, 2Plateforme Anatomopathologie Recherche, Université de Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, INSERM 1052, CNRS 5286, Centre Léon Bérard, Centre de recherche en cancérologie de Lyon (CRCL), 3Plateforme d’Imagerie cellulaire, Université de Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, INSERM 1052, CNRS 5286, Centre Léon Bérard, Centre de recherche en cancérologie de Lyon (CRCL), 4PerkinElmer S.A.S.

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj udostępniamy szczegółowe, solidne i uzupełniające protokoły do wykonywania barwienia i obrazowania w rozdzielczości subkomórkowej stałych trójwymiarowych modeli hodowli komórkowych w zakresie od 100 μm do kilku milimetrów, umożliwiając w ten sposób wizualizację ich morfologii, składu typu komórki i interakcji.

Streszczenie

Trójwymiarowe (3D) modele hodowli komórkowych in vitro, takie jak organoidy i sferoidy, są cennymi narzędziami do wielu zastosowań, w tym do rozwoju i modelowania chorób, odkrywania leków i medycyny regeneracyjnej. Aby w pełni wykorzystać te modele, konieczne jest ich badanie na poziomie komórkowym i subkomórkowym. Jednak scharakteryzowanie takich modeli hodowli komórkowych 3D in vitro może być trudne technicznie i wymaga specjalistycznej wiedzy w celu przeprowadzenia skutecznych analiz. W tym artykule przedstawiono szczegółowe, solidne i uzupełniające protokoły do wykonywania barwienia i obrazowania w rozdzielczości subkomórkowej ustalonych modeli hodowli komórkowych 3D in vitro w zakresie od 100 μm do kilku milimetrów. Protokoły te mają zastosowanie do szerokiej gamy organoidów i sferoidów, które różnią się pochodzeniem komórki, morfologią i warunkami hodowli. Od zbierania struktur 3D po analizę obrazu, protokoły te można ukończyć w ciągu 4-5 dni. Krótko mówiąc, struktury 3D są zbierane, utrwalane, a następnie mogą być przetwarzane albo poprzez zatapianie w parafinie i barwienie histologiczne/immunohistochemiczne, albo bezpośrednio znakowane immunologicznie i przygotowywane do optycznego oczyszczania i rekonstrukcji 3D (głębokość 200 μm) za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Wprowadzenie

W ciągu ostatnich dziesięcioleci postępy w biologii komórek macierzystych oraz w technologiach 3D in vitro zapoczątkowały rewolucję w biologii i medycynie. Bardziej złożone modele komórkowe w 3D zyskały ogromną popularność, ponieważ pozwalają komórkom rosnąć i oddziaływać z otaczającą je strukturą zewnątrzkomórkową, co ściśle odwzorowuje aspekty żywych tkanek, w tym ich architekturę, organizację i oddziaływania komórkowe, a nawet charakterystykę dyfuzji. W związku z tym modele hodowli komórkowych 3D mogą dostarczać unikalnych informacji na temat zachowania komórek w rozwijających się lub chorych tkankach in vitro. Organoidy i sferoidy to wielokomórkowe struktury 3D o rozmiarach od kilku mikrometrów do milimetrów, które stanowią najistotniejsze struktury 3D in vitro. Obie mogą być hodowane w rusztowaniach wspierających, takich jak (i) hydrożele pochodzenia zwierzęcego (ekstrakt błony podstawnej, kolagen), roślinnego (alginian/agaroza) lub syntetyczne, czy (ii) macierze obojętne zawierające pory sprzyjające proliferacji i wzrostowi komórek.

Organoidy i sferoidy mogą rozwijać się również bez obecności wspierającego rusztowania, opierając się na zdolności komórek do samoorganizacji w klastry. Wykorzystuje się w tym celu różne techniki, takie jak stosowanie materiałów nieprzylepnych w celu zahamowania adhezji komórek, napięcie powierzchniowe i siłę grawitacji (np. technika wiszącej kropli) lub stałą rotację naczyń (np. hodowla w bioreaktorach typu spinner). W każdym z tych przypadków techniki te ułatwiają oddziaływania komórka-komórka oraz komórka-macierz, co pozwala przełamać ograniczenia tradycyjnych hodowli monowarstwowych1. Terminy „organoidy” i „sferoidy” były w przeszłości używane zamiennie, jednak istnieją kluczowe różnice między tymi dwoma modelami 3D hodowli komórkowych. Organoidy to 3D klastry komórkowe in vitro pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych lub tkankowo specyficznych komórek macierzystych, w których komórki spontanicznie samoorganizują się w progenitory i zróżnicowane typy komórek, odtwarzając co najmniej niektóre funkcje badanego organu2. Sferoidy obejmują szerszy zakres wielokomórkowych struktur 3D formowanych w warunkach braku adhezji, które mogą powstawać z dużej różnorodności typów komórek, takich jak unieśmiertelnione linie komórkowe lub komórki pierwotne3. Z uwagi na swoje pochodzenie z komórek macierzystych, organoidy wykazują większą skłonność do samoorganizacji, wyższą żywotność i stabilność niż sferoidy.

Niemniej jednak, w swej istocie oba te modele są strukturami 3D składającymi się z wielu komórek, a techniki opracowane w celu ich badania są zatem bardzo podobne. Na przykład potężne podejścia obrazowe na poziomie rozdzielczości pojedynczych komórek są niezbędne do badania złożoności komórkowej zarówno organoidów, jak i sferoidów. W niniejszym artykule, podsumowując doświadczenie tej grupy oraz liderów w dziedzinie organoidów4, opisano szczegółowe procedury przeprowadzania dwuwymiarowego (2D) i trójwymiarowego (3D) barwienia całych preparatów (whole-mount staining), obrazowania oraz analizy składu komórkowego i subkomórkowego oraz organizacji przestrzennej organoidów i sferoidów o rozmiarach od 100 µm do kilku milimetrów. W rzeczywistości procedura ta przedstawia dwa różne i komplementarne typy barwienia i akwizycji obrazu w celu analizy szerokiego zakresu rozmiarów i typów in vitro 3D modeli kultur komórkowych. Wybór jednej metody (analizy 3D całych preparatów) lub drugiej (analizy przekrojów 2D) będzie zależał od badanego modelu i poszukiwanych odpowiedzi. Analizę 3D całych preparatów za pomocą mikroskopii konfokalnej można na przykład zastosować do wizualizacji komórek w kulturze 3D do głębokości 200 µm, niezależnie od całkowitego rozmiaru struktury 3D, podczas gdy analiza przekrojów 2D dostarcza informacji o próbkach dowolnego rozmiaru, choć na poziomie 2D. Procedura ta została z powodzeniem zastosowana w różnych organoidach4,5 oraz sferoidach pochodzących z komórek ludzkich i mysich, wywodzących się z różnych zarodkowych listków embrionalnych. Przegląd procedury przedstawiono na Rysunku 1. Wskazano na nim główne etapy, relacje między nimi, kroki decyzyjne oraz przewidywany czas trwania.

Schemat barwienia całego preparatu 3D i sekcji 2D; konfiguracja mikroskopowa dla analizy immunologicznej i obrazowania.
Rysunek 1: Schematyczny przegląd procedury. Modele 3D hodowli komórkowych in vitro są zbierane i utrwalane, a następnie przygotowywane do barwienia całego preparatu 3D (opcja a) lub zatapiane w parafinie do sekcjonowania 2D i barwienia (opcja b). W przypadku eksperymentów z barwieniem całego preparatu 3D, utrwalone struktury 3D są poddawane immunoznakowaniu po etapie utrwalania. Można przeprowadzić opcjonalny etap przejaśniania optycznego w celu poprawy jakości obrazowania i głębokości mikroskopii optycznej poprzez redukcję rozproszenia światła podczas przetwarzania obrazu. Obrazy są rejestrowane za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego lub konfokalnego systemu wysokoprzepustowego (high content system) i analizowane przy użyciu odpowiedniego oprogramowania. W przypadku zatapiania w parafinie, struktury 3D są przetwarzane bezpośrednio (opcja b.1 dla dużych struktur ≥ 400 µm) lub zawieszone w żelu (b.2; małe struktury ≤ 400 µm) w celu odwodnienia i zatopienia w parafinie. Bloki parafinowe są następnie cięte i barwione (barwienie histologiczne lub immunochemiczne). Obrazy sekcji 2D są pozyskiwane za pomocą cyfrowego skanera slajdów lub mikroskopu biologicznego i analizowane na platformie analizy obrazu z wykorzystaniem szybkiej cyfrowej analizy ilościowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Protokół

UWAGA: W trakcie etapów obejmujących wymianę odczynników i płukanie w poniższej procedurze należy spodziewać się utraty ≤25% początkowej liczby struktur 3D. W celu przeprowadzenia jakościowych i ilościowych analiz obrazu należy zaplanować użycie końcowej liczby co najmniej dziesięciu struktur 3D o rozmiarze od 100 do 500 µm dla każdego badanego warunku. W razie potrzeby, w przypadku większych struktur, należy odciąć końce końcówek pipet 1 mL, aby uniknąć uszkodzenia struktur. Na wszystkich etapach, jeśli sedymentacja struktur 3D trwa zbyt długo, komórki można delikatnie wirować przy 50 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej (RT). W zależności od badanego problemu należy rozważyć zalety i wady takiego etapu wirowania, ponieważ centryfugacja może zniekształcić kształt struktur 3D. Należy unikać wirowania przy >100 × g.

1. Pobieranie i utrwalanie trójwymiarowych modeli hodowli komórkowych

UWAGA: Należy uważać, aby nie odessać struktur 3D, które będą jedynie luźno przytwierdzone do ścianki probówki.

  1. Zbiór modeli 3D kultur komórkowych zatopionych w macierzy
    UWAGA: Ta sekcja opisuje odzyskiwanie struktur 3D hodowanych w kroplach ekstraktu z błony podstawnej z mięsaka Engelbreth-Holm-Swarm myszy (BME), ale można ją dostosować do innych macierzy. Patrz w dyskusji kluczowe punkty dotyczące ECM.
    1. Usunąć medium hodowlane z dołków, nie naruszając macierzy 3D. Powlec białkiem wnętrze i zewnętrzną stronę końcówki pipety 1 mL (zwana dalej powleczoną końcówką 1 mL), zanurzając pełną długość końcówki w 0,1% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) (zwanej dalej roztworem PBS-BSA 0,1%) i dwukrotnie pobierając oraz wydmuchując 1 mL tego roztworu.
      UWAGA: Powlekanie zapobiegnie przywieraniu komórek do końcówki i zminimalizuje straty.
    2. Powlec białkiem wnętrze probówki wirówkowej (15 mL) (zwanej dalej powleczoną probówką wirówkową) poprzez wielokrotne napełnianie i opróżnianie probówki roztworem PBS-BSA 0,1%.
      UWAGA: Zapobiegnie to przywieraniu komórek do ścianek probówki i zminimalizuje straty.
    3. Używając powleczonej końcówki 1 mL, ostrożnie resuspendować struktury 3D w dołku, używając 1 mL lodowatego 1x PBS, a następnie delikatnie przenieść zawiesinę zawierającą struktury 3D do powleczonej probówki wirówkowej.
    4. Delikatnie dodać 13 mL lodowatego 1x PBS i pozwolić strukturom 3D sedymentować na lodzie przez co najmniej 10 min.
      UWAGA: W razie potrzeby wirować przez 5 min przy 50 × g w temperaturze 4 °C. Unikać wirowania z prędkością >100 × g, ponieważ może to zdeformować struktury 3D.
    5. Usunąć nadsącz. Używając powleczonej końcówki 1 mL, delikatnie resuspendować struktury 3D w 1 mL lodowatego 1x PBS. Powtórzyć kroki od 1.1.4 do 1.1.5, aby uzyskać jednorodny osad bez żadnych pozostałości macierzy 3D.
      UWAGA: Efektywność usuwania macierzy zależy od rodzaju macierzy oraz liczby i wielkości struktur 3D i wymaga optymalizacji dla różnych warunków hodowli. W przypadku struktur 3D hodowanych w BME odzyskiwanie po usunięciu macierzy trwa zazwyczaj 45–60 min.
    6. Używając powleczonej końcówki 1 mL, przenieść 1 mL zawiesiny w 1x PBS zawierającej struktury 3D do powleczonej probówki wirówkowej 1,5 mL i przejść do sekcji 1.3.
  2. Zbiór pływających modeli 3D kultur komórkowych
    1. Używając powleczonej końcówki 1 mL, ostrożnie zebrać i przenieść struktury 3D do powleczonej probówki wirówkowej 1,5 mL. Pozostawić struktury 3D do sedymentacji lub wirować przez 5 min przy 50 × g w temperaturze pokojowej (RT).
    2. Usunąć nadsącz. Używając powleczonej końcówki 1 mL, resuspendować struktury 3D w 1 mL 1x PBS. Przejść do sekcji 1.3.
  3. Fiksacja modeli 3D kultur komórkowych
    1. Pozostawić struktury 3D do sedymentacji. Ostrożnie usunąć nadsącz; pod wyciągiem laboratoryjnym delikatnie resuspendować struktury 3D w 1 mL formaliny, używając powleczonej końcówki 1 mL.
      UWAGA: Formalina zawiera formaldehyd, który jest substancją niebezpieczną. Odczynnik należy manipulować w komorze chemicznej. Należy używać rękawic gumowych i okularów ochronnych.
    2. Inkubować struktury 3D przez 30 min w RT.
      UWAGA: 30-minutowy etap fiksacji formaliną jest wymagany do immunostynowania szerokiego zakresu struktur 3D (różniących się rozmiarem, kształtem i pochodzeniem). Jednak generalnie dłuższe czasy fiksacji (>3 h) są bardziej odpowiednie do zachowania fluorescencji białek reporterowych.
    3. Pozostawić struktury 3D do sedymentacji lub wirować przez 5 min przy 50 × g w RT. Delikatnie usunąć formalinę i zastąpić ją 1 mL 1x PBS. Powtórzyć ten etap płukania w 1x PBS dwukrotnie. Przechowywać próbki w 4 °C i przejść do sekcji 2 lub sekcji 3.
      ​UWAGA: W tym miejscu można przerwać protokół, a komórki mogą być przechowywane w 4 °C do długoterminowego magazynowania (>1 rok).

2. Barwienie całych preparatów w 3D, obrazowanie i analiza trójwymiarowych modeli kultur komórkowych

UWAGA: Ponieważ organoidy są słabo przytwierdzone do ścianek probówki, należy obchodzić się z nimi delikatnie, gdyż każda kolejna wymiana odczynników może spowodować utratę próbki. Przed rozpoczęciem należy upewnić się, że dostępne są odpowiednie kontrole do barwienia. Kontrolami pozytywnymi i negatywnymi mogą być komórki, w których białko docelowe jest odpowiednio znane jako nadeksprymowane lub nieobecne. Inkubuj próbki bez przeciwciała pierwszorzędowego, aby ustalić, czy obserwowany sygnał wynika z niespecyficznego wiązania przeciwciała drugorzędowego. Ponieważ niektóre komórki mają tendencję do wykazywania wysokiego poziomu autofluorescencji, należy stosować kontrole pozbawione przeciwciała drugorzędowego, aby określić, czy obserwowana fluorescencja pochodzi z autofluorescencji tła. Immunoznakowanie i wizualizacja reporterów fluorescencyjnych mogą być łączone.

  1. Barwienie całego preparatu 3D
    1. Przygotować roztwór do permeabilizacji i blokowania (PB), dodając do 1x PBS 0,1%–1% surfaktantu niejonowego (patrz Tabela Materiałów), 1% dimetylosulfotlenku, 1% BSA oraz 1% surowicy osiołka (lub surowicy zwierzęcia, w którym wytworzono przeciwciała wtórne).
      UWAGA: Należy starannie zoptymalizować stężenie surfaktantu niejonowego w zależności od lokalizacji celu: błona (0–0,5%), cytoplazma (0,5–1%) oraz jądro (1%). Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4°C do 1 miesiąca. BSA zazwyczaj sprawdza się w etapie blokowania, jednak w przypadku wysokiego tła należy przeprowadzić test empiryczny, aby uzyskać najlepsze możliwe wyniki dla danej kombinacji przeciwciał.
    2. Przenieść organoidy z probówki wirówkowej 1,5 mL do probówki 0,5 mL, używając powlekanego końcówki 1 mL. Pozostawić organoidy do osadzenia, ostrożnie usunąć 1x PBS i zastąpić go 0,5 mL roztworu PB. Inkubować organoidy przy łagodnym mieszaniu poziomym (30–50 rpm) przez 1 h w temperaturze pokojowej (RT).
    3. Pozostawić organoidy do osadzenia, ostrożnie usunąć roztwór PB i dwukrotnie przemyć w 1 mL PBS-BSA 0,1% przez 3 min.
      UWAGA: Oczekiwanie przez 3 min pozwala strukturom osadzić się na dnie probówki.
    4. Ostrożnie usunąć PBS-BSA 0,1% i dodać 250 µL przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych do odpowiedniego stężenia w roztworze PB:1x PBS (1:10). Aby przygotować 10 mL roztworu PB:1x PBS (1:10), należy rozcieńczyć 1 mL roztworu PB w 9 mL 1x PBS. Inkubować przez 2–3 dni przy łagodnym mieszaniu poziomym (30–50 rpm) w temperaturze 4°C.
      UWAGA: Odpowiedni czas inkubacji przeciwciał jest kluczowy dla prawidłowej penetracji, ponieważ struktury 3D mogą czasem osiągać duże rozmiary.
    5. Pozostawić organoidy do osadzenia i ostrożnie usunąć roztwór przeciwciał pierwszorzędowych. Przemyć 5x w PBS-BSA 0,1% przez 3 min na każde mycie, a następnie 2x w 1 mL PBS-BSA 0,1% przez 15 min na każde mycie przy łagodnym mieszaniu poziomym.
    6. Dodać 250 µL przeciwciał wtórnych rozcieńczonych w stosunku 1:250 w roztworze PB:1x PBS (1:10). Inkubować przez 24 h w temperaturze 4°C przy łagodnym mieszaniu poziomym (30–50 rpm). Na tym etapie należy chronić próbki przed światłem.
    7. Dodać 250 µL Hoechst 33342 (roztwór zapasowy 20 µM) rozcieńczonego w stosunku 1:1000 w roztworze PB:1x PBS (1:10) i inkubować przez kolejne 2 h w temperaturze 4°C przy łagodnym mieszaniu poziomym (30–50 rpm).
    8. Pozostawić organoidy do osadzenia i ostrożnie usunąć roztwór zawierający przeciwciała wtórne oraz Hoechst 33342. Przemyć organoidy 5x w 1 mL 1x PBS przez 3 min na każde mycie, a następnie 2x w 1 mL 1x PBS przez 15 min na każde mycie przy łagodnym mieszaniu poziomym (30–50 rpm).
      UWAGA: Kluczowe jest dokładne przemycie próbek, aby uniknąć szumu tła lub utraty sygnału.
    9. Przechowywać próbki w PBS w temperaturze 4°C do momentu akwizycji obrazów. Przejść do sekcji 2.2.
      UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać, a próbki przechowywać w temperaturze 4°C przez kilka miesięcy, chroniąc je przed światłem.
  2. Przygotowanie próbek do obrazowania konfokalnego
    1. Używając powlekanej końcówki 1 mL, ostrożnie przenieść organoidy do 50 µL 1x PBS na każdą studzienkę czarnej polistyrenowej mikropłytki 96-dołkowej. Przejść do kroku 2.2.3 lub sekcji 2.3.
      UWAGA: Na tym etapie próbki można chronić przed światłem i przechowywać w temperaturze 4°C przez wiele tygodni.
    2. Klarowanie
      ​UWAGA: Krok klarowania jest opcjonalny i może być zastosowany zarówno przy immunoznakowaniu organoidów, jak i przy wykrywaniu fluorescencji endogennej. Klarowanie może powodować obkurczanie się struktury 3D, ale nie zmienia ogólnej morfologii, z wyjątkiem sferycznych, jednowarstwowych organoidów z dużymi światłami4. W przypadku tych cystycznych organoidów należy pominąć etap klarowania i przeprowadzić obrazowanie tkanek głębokich6.
      1. Przygotować roztwór klarujący glicerol-fruktoza 2,5 M zawierający 50% v/v glicerolu, 11% v/v wody destylowanej i 45% w/v fruktozy, mieszając na mieszadle magnetycznym przez co najmniej jedną noc, aż roztwór będzie całkowicie rozpuszczony i jednorodny. Przechowywać w temperaturze 4°C w ciemności do 1 miesiąca.
      2. Usunąć jak najwięcej 1x PBS, nie dotykając organoidów. Dodać 200 µL roztworu klarującego, używając końcówki pipety 1 mL z odciętym końcem, i delikatnie resuspender, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez co najmniej 12 h, a następnie przejść do sekcji 3.
        UWAGA: Ponieważ roztwór klarujący jest lepki, małe objętości są trudne do manipulowania. Aby ułatwić pracę, należy upewnić się, że roztwór jest w temperaturze pokojowej i pipetować powoli. Dla optymalnego klarowania pozwolić próbce osadzić się w roztworze przez co najmniej 24 h przed obrazowaniem. Jeśli w momencie akwizycji struktury 3D unoszą się, można opcjonalnie wirować przez 10 min przy <100 × g w temperaturze pokojowej lub pozostawić je na dłużej (od jednego do kilku dni), aby osiadły. Protokół można przerwać na tym etapie przed przejściem do obrazowania, jeśli próbki są chronione przed światłem i przechowywane w temperaturze 4°C (przez tygodnie) lub -20°C (przez miesiące).
  3. Akwizycja i analiza obrazów
    ​UWAGA: Do obrazowania struktur 3D wymagana będzie technologia sekcjonowania obrazu.
    1. Używać mikroskopów konfokalnych, preferując obiektywy imersyjne z wyższą aperturą numeryczną (NA) w porównaniu do obiektywów powietrznych. Wybrać powiększenia obiektywów (10x, 20x, 40x) zgodnie z rozmiarem struktur 3D, planowaną rekonstrukcją obrazu (stitching) oraz stosowanymi rozwiązaniami analitycznymi.
    2. Przy wyborze trybu akwizycji wziąć pod uwagę głębię ostrości użytego obiektywu w celu zdefiniowania kroku dla stosowania Z (Z stacking), co pozwoli na optymalne renderowanie 3D.
      UWAGA: Rozwiązania do analizy obrazów różnią się od siebie, a analiza musi być dostosowana do używanego oprogramowania. Przykładowo, niniejszy protokół analizy został opracowany w oprogramowaniu do analizy wysokoprzepustowej (high-content analysis; szczegóły w Tabeli Materiałów i Ryc. Uzupełniającej 1) i dostarcza danych o segmentacji obiektów, obliczaniu właściwości oraz wyborze populacji komórek wewnątrz zrekonstruowanego obiektu 3D.

3. Sekcjonowanie 2D, barwienie, obrazowanie i analiza 3D modeli hodowli komórkowych

UWAGA: Modele hodowli komórkowych 3D różnią się rozmiarem. W celu przeprowadzenia efektywnego zatapiania w parafinie należy przejść do sekcji 3.1 lub 3.2 (Rycina 2). Przed każdym płukaniem i wymianą odczynników należy odczekać odpowiedni czas na sedymentację struktur 3D. Należy uważać, aby nie odessać organoidów, które będą unosić się przy dnie probówki. W kwestii zatapiania w parafinie należy kierować się wskazówkami przedstawionymi na Rycynie 2.

  1. Zalewanie parafinowe dużych (Ø ≥ 400 µm) 3D modeli kultur komórkowych
    1. W dniu poprzedzającym zalewanie podgrzej do 65 °C dwie kolby o pojemności 150 mL wypełnione parafiną (kąpiele parafinowe), małą metalową formę do zalewania dla każdej próbki oraz precyzyjną pęsetę.
    2. Używając powlekanego końcówki 1 mL, ostrożnie przenieś organoidy w 1x PBS do szklanej probówki z płaskim dnem i zakrętką wyłożoną politetrafluoroetylenem. Pozostaw organoidy do osadzenia, ostrożnie usuń 1x PBS i zastąp go 70% etanolem. Inkubuj przez co najmniej 30 min.
    3. Pozostaw organoidy do osadzenia i ostrożnie usuń 70% etanol. Zastąp go 1 mL gotowego do użycia roztworu eozyny Y. Potrząśnij probówką i barw przez co najmniej 30 min. Ostrożnie usuń roztwór eozyny i odwodnij organoidy w trzech kolejnych przemyciach w 1 mL 100% etanolu przez około 30 min każde.
      UWAGA: Etanol, ciecz łatwopalna i lotna, powoduje silne podrażnienie oczu i dróg oddechowych. Należy go używać pod wyciągiem i nosić ochronne gogle.
    4. Ostrożnie usuń 100% etanol i pod wyciągiem chemicznym przeprowadź przejaśnianie organoidów w trzech kolejnych przemyciach w 1 mL ksylenu przez około 30 min każde.
      UWAGA: Ksylen jest toksyczną, łatwopalną cieczą, której opary mogą powodować podrażnienia. Należy go używać pod wyciągiem. Unikaj bezpośredniego kontaktu ze skórą, używaj rękawic gumowych i ochronnych gogli.
    5. Pod wyciągiem chemicznym przygotuj białą kasetkę tkankową microtwin, umieszczając kawałek wkładki biopsyjnej (wcześniej namoczonej w ksylenie) w jednej z komór kasetki. Ostrożnie przenieś struktury 3D za pomocą powlekanej plastikowej pipety Pasteura o pojemności 2 mL na wkładkę biopsyjną. Przykryj je drugą wkładką biopsyjną namoczoną w ksylenie, aby zapobiec przemieszczaniu się organoidów, i zamknij kasetkę.
    6. W przypadku przetwarzania kilku próbek, umieść kasetkę w kąpieli ksylenu do czasu dalszej obróbki. Po przeniesieniu wszystkich próbek do kasetek, umieść je w podgrzanej kąpieli parafinowej na 30 min w temperaturze 65 °C. Przenieś kasetki do świeżej, podgrzanej kąpieli parafinowej na noc.
    7. Po impregnacji parafiną weź podgrzaną formę do zalewania i wlej do niej podgrzaną parafinę. Umieść wkładkę biopsyjną zawierającą struktury 3D w formie i delikatnie nią potrząśnij, aż wszystkie organoidy opadną na dno formy. Bardzo ostrożnie ustaw struktury 3D na środku formy, używając podgrzanej precyzyjnej pęsety. Przejdź do sekcji 3.3.
      UWAGA: Należy uważać, aby nie uszkodzić struktur 3D pęsetą; należy je przesuwać, a nie ściskać.
  2. Zalewanie parafinowe małych (Ø ≤ 400 µm) 3D modeli kultur komórkowych
    1. W dniu poprzedzającym zalewanie podgrzej do 65 °C dwie kolby o pojemności 150 mL wypełnione parafiną (kąpiele parafinowe), małą metalową formę do zalewania dla każdej próbki oraz precyzyjną pęsetę.
    2. Ostrożnie usuń 1x PBS z zawiesiny organoidów. Przeprowadź delikatnie 3 przemycia w 1 mL 1x soli buforowanej Tris (TBS). Usuń jak najwięcej 1x TBS, nie dotykając organoidów.
      ​UWAGA: Należy uważać, aby nie odessać próbki. W razie potrzeby przeprowadź wirowanie przez 5 min przy 50 x g w temperaturze pokojowej (RT). Pozostałe ślady fosforanu będą zakłócać kolejne etapy, w szczególności zapobiegając polimeryzacji żelu. Dlatego nie należy używać roztworów PBS na żadnym etapie przetwarzania. W tym kroku użyto komercyjnego zestawu zawierającego kasetki, Reagent #1 (ciecz przejaśniająca) i Reagent #2 (ciecz barwna), aby ułatwić procedurę zalewania parafinowego bez ryzyka utraty drobnych fragmentów (patrz Tabela materiałów). Postępuj zgodnie z instrukcją zestawu. Kasetki są wstępnie zmontowane z papierami podkładowymi i wkładkami płytowymi.
    3. Dodaj 2 krople Reagent #2 do probówki i delikatnie wymieszaj, stukując probówką. Dodaj 2 krople Reagent #1 i ponownie wymieszaj przez stukanie, aby żel stężał. Za pomocą precyzyjnej pęsety wyjmij żel z probówki i umieść go w wgłębieniu kasetki.
    4. Pod wyciągiem odwodnij próbkę, umieszczając kasetkę w kolejnych kąpielach w następujący sposób (użyj kolb 150 mL oraz świeżego etanolu lub ksylenu dla każdej kąpieli): etanol 70%, 30 min; etanol 96%, 30 min; etanol 100%, trzy przemycia po 30 min każde; ksylen, trzy przemycia po 30 min każde.
    5. Umieść kasetki w podgrzanej kąpieli parafinowej na 30 min w temperaturze 65 °C, a następnie przenieś je do świeżej, podgrzanej kąpieli parafinowej na noc. Po impregnacji parafiną weź podgrzaną formę do zalewania i wlej do niej podgrzaną parafinę. Otwórz kasetkę, ostrożnie wyjmij żel precyzyjną pęsetą i umieść żel zawierający struktury 3D na środku formy do zalewania. Przejdź do sekcji 3.3.
  3. Wspólne etapy zalewania parafinowego
    1. Delikatnie przenieś formę w chłodne miejsce, aby parafina zastygła w cienkiej warstwie, która utrzyma struktury 3D w odpowiedniej pozycji. Umieść kasetkę tkankową na górze formy i dolej gorącej parafiny, aby zakryć tę plastikową kasetkę. Wyjmij formę, gdy całkowicie zastygnie, i przejdź do sekcji 3.4.
      UWAGA: Bloki parafiny można przechowywać w temperaturze pokojowej przez lata.

Porównanie procedur zatapiania w parafinie: klasyczna vs żelowa; schemat sukcesu i niepowodzenia zatapiania.
Rycina 2: Przegląd procedury zatapiania w parafinie dużych i małych modeli 3D hodowli komórkowych in vitro.
(A) Standardowa procedura zatapiania w parafinie. Po fiksacji i odwodnieniu struktury 3D są barwione eozyną w celu ułatwienia ich wizualizacji (lewa góra i dół). Struktury 3D są ostrożnie umieszczane na wkładce biopsyjnej (niebieska) w kasecie przy użyciu pipety Pasteura 2 mL (środek). Po impregnacji parafiną struktury 3D są delikatnie przenoszone do ciekłej parafiny za pomocą pęsety i delikatnie poruszane we wkładce biopsyjnej. Małe struktury 3D ulegają utracie na tym etapie, ponieważ nie mogą zostać uwolnione z wkładki (prawy dół: nieudane zatapianie). Zatopione zostaną tylko duże struktury 3D (prawy góra: udane zatapianie). Groty strzałek wskazują hodowle 3D. (B) Alternatywa dla standardowego protokołu zatapiania w parafinie. Po ufiksowaniu małych struktur 3D wykorzystuje się komercyjny zestaw, aby utrzymać komórki w żelu i ułatwić ich przeniesienie do formy po impregnacji parafiną (prawo: udane zatapianie). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Skrawanie bloków i barwienie
    1. Wyciąć skrawki o grubości 4 µm przy użyciu standardowego mikrotomu, a następnie zastosować standardowe techniki histologiczne i immunohistochemiczne. Przejść do sekcji 3.5.
      UWAGA: W celu zapewnienia lepszej adhezji skrawków zastosowano specjalistyczne szkiełka (patrz Tabela materiałów). Szkiełka mogą być przechowywane przez lata w temperaturze pokojowej lub w 4 °C.
  2. Pozyskiwanie i analiza obrazów
    1. Wykonać obrazowanie przy użyciu cyfrowego skanera szkiełek lub mikroskopu pionowego, a następnie przeanalizować dane za pomocą platformy do szybkiej cyfrowej analizy ilościowej, która dostarcza danych morfologicznych i danych o ekspresji multipleksowej w ujęciu pojedynczych komórek w obrębie całych przekrojów struktury 3D (szczegóły w Rysunku uzupełniającym 2).
      UWAGA: Grupa badawcza rutynowo stosuje obiektyw 20x.

Wyniki

Niniejszy protokół przedstawia przegląd krytycznych etapów barwienia całych preparatów (whole-mount) w 2D i 3D, a także obrazowania i analiz ilościowych trójwymiarowych modeli hodowli komórkowych (Rycina 3 i Rycina 4). Jest on możliwy do zastosowania w szerokim zakresie modeli hodowli komórkowych 3D – od sferoidów po organoidy z różnych gatunków gospodarzy lub tkanek – i umożliwia pozyskanie dokładnych i ilościowych informacji na temat architektury, organizacji komórkowej oraz oddziaływań na poziomie komórkowym i subkomórkowym (Rycina 3 i Rycina 4). Laboratoria mogą potrzebować optymalizacji technik histologicznych i immunohistochemicznych 2D oraz stężeń przeciwciał zgodnie z własnymi potrzebami.

Obie metody dostarczają cennych informacji biologicznych. Barwienie całego preparatu w 3D oraz mikroskopia konfokalna zapewniają informacje wizualne na temat składu komórkowego i położenia przestrzennego z głębokością pola wynoszącą do 200 µm (Rysunek 3B)Jednakże sekcjonowanie 2D jest dogodne w przypadku większych struktur 3D, pozwalając na ujawnienie szczegółowych cech morfologicznych komórek w całym przekroju struktur 3D, które w przeciwnym razie mogłyby być trudne do zaobserwowania in situ ze względu na rozpraszanie światła, które obniża rozdzielczość w większych próbkach. Ponadto obie techniki mogą dostarczać danych ilościowych. W rzeczywistości uzyskana rozdzielczość umożliwia zastosowanie algorytmów segmentacji komórkowej i podkomórkowej w celu ilościowego oznaczenia liczby komórek oraz wykrycia obecności różnych markerów komórkowych w różnych podtypach komórek. (Rycina 3F i Rysunek 4)Podsumowując, opisane tutaj techniki obrazowania są powtarzalne, proste i komplementarne, stanowiąc wartościowe narzędzia do badania heterogeniczności komórkowej.

Mikroskopia fluorescencyjna glejaka wysokiego stopnia złośliwości; barwienia Ki67 i Olig2; analiza segmentacji komórek.
Rysunek 3: Reprezentatywne wyniki dla całego preparatu 3D, obrazowania oraz analiz przekrojów optycznych 3D i 2D. (A) Obrazy konfokalne sferoidu ludzkiego (h) glejaka wysokiego stopnia złośliwości hodowanego przez tydzień i znakowanego Hoechst (niebieski), Olig2 (żółty) oraz aktyną (czerwony) (obiektyw wodny 20x). Dla wszystkich uzyskanych obrazów ustawienia mikroskopu ustalono przy użyciu kontroli pozytywnej (góra), a następnie wykonano obrazowanie kontroli negatywnej przy użyciu identycznych ustawień, aby potwierdzić brak fluorescencji w przypadku braku przeciwciała pierwszorzędowego (dół). (B) Ortogonalna reprezentacja 3D całego preparatu z barwieniem Ki67 wykonanym w sferoidzie (h) glejaka wysokiego stopnia złośliwości hodowanym przez tydzień (klarowanie glicerolo-fruktozowe; obiektyw wodny 20x, konfokalnie). (C) Obrazy konfokalne sferoidu (h) glejaka wysokiego stopnia złośliwości hodowanego przez tydzień i znakowanego Hoechst (niebieski), Olig2 (żółty) oraz faloidyną-488 (zielony) (klarowanie glicerolo-fruktozowe; obiektyw wodny 20x). (D) Obrazy konfokalne sferoidów ludzkiego (h) rabdomyosarcoma (góra) oraz mysiej (m) komórki grzebienia neuronalnego (dół) hodowanych przez tydzień i znakowanych odpowiednio Hoechst (niebieski), aktyną (czerwony) i Ki67 (zielony) (klarowanie glicerolo-fruktozowe; obiektyw suchy 20x). (E) Obrazy konfokalne sferoidu (h) glejaka wysokiego stopnia złośliwości hodowanego przez tydzień i znakowanego Hoechst (niebieski) oraz Ki67 (zielony) (klarowanie glicerolo-fruktozowe; obiektyw wodny 40x) (lewa góra). Obrazy segmentowane w kanale Hoechst oraz dodatnie (+) regiony jądrowe Ki67 w kanale zielonym zostały wygenerowane przy użyciu oprogramowania do analizy wysokoprzepustowej (zobacz Uzupełniający Rysunek 1 oraz Tabelę materiałów) (dół). Wynik przedstawia procent jądra Ki67+ na zsegmentowaną strukturę 3D (prawa góra). Pasek skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza histologiczna, barwienie H&E; ilościowe oznaczenie Ki67; rozkład wielkości komórek; wyniki przedstawione na wykresach słupkowych.
Rysunek 4: Reprezentatywne wyniki obrazowania i analizy 2D przekrojów optycznych. (A, D) Obrazy przekrojów 2D modelu komórkowego 3D (sferoidy rabdomyosarcoma człowieka hodowane przez miesiąc), uzyskane za pomocą cyfrowego skanera preparatów i analizowane na platformie do szybkiej cyfrowej analizy ilościowej. (A) Barwienie H&E i detekcja komórek w zależności od ich wielkości. Pasek skali = 500 µm. (B) Histogram przedstawia procent komórek < 100 µm2 i > 100 µm2 wykrytych przy użyciu oprogramowania do szybkiej cyfrowej analizy ilościowej (lewo: Halo) lub poprzez liczenie ręczne (prawo: MC). (C) Barwienie Ki67 i detekcja komórek w zależności od intensywności sygnału 3,3'-diaminobenzydyny (DAB). Negatywne (niebieskie), słabo dodatnie (żółte), dodatnie (czerwone). Pasek skali = 500 µm. (D) Histogram przedstawia procent komórek Ki67-ujemnych, słabo dodatnich i dodatnich. Skróty: H&E = hematoksylina i eozyna; MC = liczenie ręczne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Przegląd kroków w oprogramowaniu do analizy obrazowania. Analizy opierają się na powiązaniu bloków budulcowych. Każdy blok budulcowy odpowiada danej funkcji — segmentacji, obliczeniom, powiązaniu, definicji wyniku — i oferuje wiele algorytmów oraz opcji wyboru zmiennych, aby dopasować je do obrazowanej próbki biologicznej. Oprogramowanie zapewnia wiele gotowych protokołów analizy RMS (Ready Made Solution), które można łatwo wykorzystać i zmodyfikować. Zintegrowane protokoły analizy obrazu mogą być zapisywane, stosowane do różnych zestawów danych i udostępniane między użytkownikami. W skrócie, protokół analizy zakłada sekwencyjną segmentację obiektów: sferoidu, jąder komórkowych i na końcu obszarów Ki67 (A488). Następnie obliczana jest średnia intensywność obszarów Ki67, aby dalej odróżnić zdarzenia pozytywne. Na koniec jako pozytywne wybierane są jądra komórkowe zawierające pozytywne obszary Ki67. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 2: Przegląd kroków procedury oprogramowania do analizy ilościowej. Krok 1. Prześlij pliki, korzystając z karty Studies. Pliki zostaną otwarte w sekcji Image Actions. Krok 2. Otwórz kartę Annotations, a następnie kliknij Layer Actions, aby zaprojektować nową warstwę wokół struktury, używając narzędzia circle z paska narzędzi. W przypadku struktur niekolistych można zamiast tego użyć narzędzia pen. Krok 3. Pasek narzędzi może być wykorzystany do projektowania adnotacji i wizualizacji ilościowej za pomocą narzędzia spektroskopia przejściowa, ΣFx=0, wykres analizy optycznej, układ spektroskopowy, pomiar wzbudzenia. Krok 4. Otwórz kartę Analysis i wybierz optymalne warunki do analizy próbki (może być konieczne przeprowadzenie kilku prób). Krok 4.1. Skorzystaj z sekcji Stain Selection, aby ustawić warunki barwienia. W przypadku kilku barwników można je dodać i zmienić ich nazwy, a także zmodyfikować kolor virtual. Można określić detekcję lokalizacji – barwienie jądrowe lub cytoplazmatyczne. Krok 4.2. Skorzystaj z sekcji Cell Detection, aby skonfigurować detekcję komórek. Ta sekcja będzie najważniejsza dla analizy. Sekcja Nuclear Contrast Threshold umożliwi wykrycie wszystkich jąder. Należy zwrócić uwagę, że w przypadku występowania wielu rozmiarów populacji oprogramowanie może wykryć kilka komórek zamiast jednej dużej. Sekcje Nuclear Size oraz Nuclear segmentation aggressiveness mogą służyć do ilościowego określania zakresów rozmiarów populacji komórek. Krok 5. Opis sposobu przeprowadzenia analizy próbki. Postępuj zgodnie z krokami przedstawionymi na rysunku. Sekcja Annotation Layer uruchomi ustawienia tylko dla tego slajdu. Ilościowe wyniki można wizualizować za pomocą narzędzia spektroskopia przejściowa, ΣFx=0, wykres analizy optycznej, układ spektroskopowy, pomiar wzbudzenia. Powtarzaj kroki 4.1–5, aż do uzyskania odpowiedniej analizy ilościowej. Kroki 6–6.1. Te kroki umożliwiają narysowanie rysunku za pomocą oprogramowania. Krok 7. Grafiki ilościowe uzyskane za pomocą oprogramowania mogą zostać zapisane. Krok 8. Dane mogą zostać wyeksportowane. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Hodowla komórkowa jest niezbędnym narzędziem do odkrycia podstawowych mechanizmów biologicznych związanych z rozwojem, funkcjonowaniem, regeneracją i zakłóceniami tkanek i narządów, a także chorobami. Chociaż dominowała monowarstwowa hodowla komórkowa 2D, ostatnie badania przesunęły się w kierunku kultur generujących struktury 3D bardziej odzwierciedlające odpowiedzi komórkowe in vivo, w szczególności dzięki dodatkowej organizacji przestrzennej i kontaktom komórka-komórka, które wpływają na ekspresję genów i zachowanie komórki, a tym samym mogą dostarczyć więcej danych predykcyjnych7. Niemniej jednak nadal istnieje wiele wyzwań, w tym potrzeba przyjaznych dla użytkownika technik barwienia i obrazowania do szczegółowej wizualizacji mikroskopowej i oceny złożonych struktur 3D na poziomie komórkowym i subkomórkowym. W tym kontekście dostarczono szczegółowe, solidne i uzupełniające protokoły do wykonywania barwienia oraz obrazowania w rozdzielczości komórkowej i subkomórkowej ustalonych modeli hodowli komórkowych 3D in vitro o rozmiarach od 100 μm do kilku milimetrów.

Procedura ta przedstawia dwie różne strategie radzenia sobie z dużą różnorodnością rozmiarów i typów modeli hodowli komórkowych 3D in vitro. Wybór jednej (analiza 3D całego montażu) lub drugiej (analiza przekrojów 2D) będzie zależał od użytego modelu i badanego problemu. Analiza 3D całego montażu za pomocą mikroskopii konfokalnej umożliwia wizualizację komórek o polu głębokości do 200 μm, niezależnie od całkowitej wielkości struktury 3D, podczas gdy przekroje 2D mają zastosowanie do próbek o dowolnej wielkości, ale wizualizacja pozostaje wymiarowa 2D. Poniżej znajduje się kilka sugestii dotyczących rozwiązywania problemów i kwestii technicznych.

Utrata struktur 3D podczas przepływu pracy jest najczęstszą wadą. Mogą one pozostać przylegające do końcówek i rurek, dlatego kluczowe znaczenie ma wstępne powlekanie końcówek i rurek 0,1% roztworem PBS-BSA. Co więcej, bardzo ważne jest, aby struktury 3D osiadły między zmianami odczynnika i aby wszystkie pipety były wykonywane bardzo ostrożnie. Jak wspomniano w procedurze, dla wszystkich etapów, jeśli sedymentacja struktury 3D jest zbyt długa, komórki można delikatnie wirować z prędkością 50 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. W zależności od celu badania, należy rozważyć zalety/wady takiego etapu wirowania, ponieważ wirowanie może zagrozić kształtowi struktur 3D. Ponadto należy zachować ostrożność w celu zachowania tej morfologii na etapie fiksacji, ponieważ organoidy torbielowate mają tendencję do zapadania się. Mocowanie konstrukcji o wielkości poniżej 400 μm powinno zapobiegać zmianom konstrukcyjnym.

Dla optymalnego znakowania immunologicznego kluczowym krokiem jest odzyskanie organoidów z ich matryc 3D. Macierz 3D może utrudniać odpowiednią penetrację przeciwciał lub prowadzić do wysokiego barwienia tła z powodu niespecyficznego wiązania z matrycą. Usunięcie ECM może zmienić morfologię zewnętrznych segmentów organoidów (szczególnie w przypadku małych wypukłości komórkowych wystających z badanych struktur 3D) i częściowo utrudnić analizy. W przypadku takich struktur 3D matryca może być zachowana przez cały czas trwania procedury; Jednakże warunki hodowli powinny być starannie dostosowane do wzrostu komórek w minimalnej ilości matrycy, aby zapobiec niedostatecznemu przenikaniu roztworów i przeciwciał oraz aby uniknąć kolejnych etapów płukania mających na celu zmniejszenie nadmiernego szumu tła 6,8.

Etap oczyszczania optycznego opisany w tym protokole w sekcji barwienia całego mocowania 3D jest istotny dla obrazowania struktur 3D o głębokości do 150-200 μm zamiast 50-80 μm bez oczyszczania. W porównaniu z innymi metodologiami oczyszczania, które często wymagały kilku tygodni i stosowania toksycznych środków czyszczących, w niniejszym protokole zastosowano wcześniej opublikowany szybki i bezpieczny etap usuwania 4,9. Ponadto ten etap oczyszczania jest odwracalny, a nowe przeciwciała mogą być dodawane do początkowego barwienia bez utraty rozdzielczości lub jasności4. Niemniej jednak, w zależności od badanego modelu hodowli komórkowej 3D, głębokość 150-200 μm może nie być wystarczająca do zobrazowania struktury 3D w sposób informacyjny, a ten protokół oczyszczania może spowodować zmiany w ogólnej morfologii sferycznych, jednowarstwowych organoidów o dużych prześwitach4. Użytkownicy powinni starannie zaprojektować swój eksperyment i, jeśli to konieczne, zoptymalizować czas etapu przepuszczalności/blokowania (aby umożliwić penetrację przeciwciał i roztworu), etapu oczyszczania (aby wniknąć głębiej niż 200 μm, próbki powinny zostać całkowicie oczyszczone) i akwizycji obrazu. Dwie najbardziej rozpowszechnione technologie dostępne w głównych obiektach to mikroskopia świetlna i mikroskopia konfokalna. Użytkownicy będą musieli starannie wybrać technologię w oparciu o rozmiar swoich struktur 3D i pytanie biologiczne10. Jednak w porównaniu z mikroskopią konfokalną, rozdzielczość mikroskopii arkuszowej światła uzyskana dla tak głębokich struktur pozostaje nieoptymalna dla uzyskania rozdzielczości subkomórkowej.

W tym przypadku opisano szczegółowy i solidny proces, który jest dedykowany do zatapiania parafiny w pojedynczych próbkach. Co ciekawe, Gabriel i in. opracowali niedawno protokół osadzania kultur komórkowych 3D w parafinie ze zwiększoną przepustowością. Wykorzystali formę polidimetylosiloksanu (PDMS) do uwięzienia 96 struktur 3D we wzorze mikromacierzy w jednym bloku, zapewniając nowe perspektywy dla badań nad modelami guzów 3D obejmującymi więcej grup, punktów czasowych, warunków leczenia i replik11. Jednak ta metoda wymaga rozległych umiejętności i maszyn, w szczególności do wytwarzania premoldu używanego do tworzenia form PDMS.

Podsumowując, w artykule opisano dwa różne, uzupełniające się i adaptowalne podejścia umożliwiające uzyskanie dokładnych i ilościowych informacji na temat składu architektonicznego i komórkowego modeli komórkowych 3D. Oba parametry mają kluczowe znaczenie dla badania procesów biologicznych, takich jak wewnątrznowotworowa heterogeniczność komórkowa i jej rola w oporności na leczenie.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została wsparta przez St Baldrick's Robert J. Arceci Innovation Award #604303.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sprzęt
Podkładka do biopsji Q Path niebieskaVWR720-2254
Kasety macrostar III Blc couv. Char. x1500VWR720-2233
Kaseta microtwin białaVWR720-2183
Osłona chemicznaErlabFI82 5585-06
Końcówki filtrujące 1000 µ LStar lab Tip-OneS1122-1730
Szczypce do drobnych robótekInnowacja piramidyR35002-E
Rurki szklane z płaskim dnem wyłożone PTFE 2 mLFisher Scientific11784259Doskonały  dla środowiska      próbki,      farmaceutyki i odczynniki diagnostyczne. PTFE został zaprojektowany z myślą o najwyższym bezpieczeństwie produktu. PTFE zapewnia całkowicie obojętne uszczelnienie wewnętrzne i powierzchnię skierowaną w stronę próbki lub produktu.
Szklana płyta dolna 35 mmIbedi2018003
Mieszanie poziomeN-BIOTEKNB-205
Inkubator podgrzany do 65 ° CInkubator MemmertLAB129
Formy Inox 15x15VWR720-1918
Szkiełka mikroskopowe Matsunami TOMO-11/90Diagnostyka Roche8082286001te szkiełka służą do lepszej przyczepności przekrojów
MicrotomeMicrom Microtech FrancjaHM340E
Skan panoramiczny II3dhistech2397612
Sprzęt do zatapiania parafinyLeicaEG1150C
Pipeta plastikowa Pasteur 2 mlVWR612-1681
Q Path flakon 150mL cape blanc x250VWR216-1308Dobre dla środowiska      próbki,      farmaceutyki i odczynniki diagnostyczne. Polipropylen (PP) jest sztywny,  solidny, zapewnia doskonałą  stres  spolszczenie  oraz  Wpływ  odporność i  dobra bariera olejowa i alkoholowa oraz odporność chemiczna. Nasadka wyłożona PE jest odporna na pękanie naprężeniowe i oferuje  Doskonały  Uszczelnianie  Charakterystyka.
Zestaw mikropipetorów  (P200, P1000)Thermo Scientific11877351 (20-200) 11887351(p1000)
OPERA PHENIXPerkinElmerHH14000000
SP5 odwrócony mikroskop konfokalnyLeicaLSM780
VWR720-0228
Mikroskop Zeiss AxiomagerLeicaSIP 60549
odczynnik
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA7030-100G
Cytoblok (zestaw)Thermofisher Scientific10066588
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-Aldrich57648266UWAGA: toksyczny i łatwopalny. Opary mogą powodować podrażnienia. Manipulować w dygestorium. Unikać bezpośredniego kontaktu ze skórą. Nosić gumowe rękawice, okulary ochronne.
Eozyna wodna 1%Sigma-AldrichHT110316
etanol 96%VWR83804.360UWAGA: Powoduje silne działanie drażniące na oczy. Łatwopalna ciecz i para. Działa drażniąco na drogi oddechowe. Manipulować w dygestorium. Nosić okulary ochronne.
Etanol 100%VWR20821.365UWAGA: Działa silnie drażniąco na oczy. Łatwopalna ciecz i para. Działa drażniąco na drogi oddechowe. Manipulować w dygestorium. Nosić okulary ochronne.
Formalina 4%Microm Microtech FranceF/40877-36UWAGA: Formalina zawiera formaldehyd, który jest niebezpieczny. Manipulować w dygestorium. Unikać bezpośredniego kontaktu ze skórą. Nosić gumowe rękawice i okulary ochronne
FruktozaSigma-AldrichF0127
Hematoksylina skrzelowa typu IIMicrom Microtech FranceF/CP813
GlicerolSigma-AldrichG5516500 mL
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570UWAGA: Podejrzewa się, że powoduje wady genetyczne.  Unikać bezpośredniego kontaktu ze skórą. Nosić gumowe rękawice i okulary ochronne
Normalna surowica osłaSigma-AldrichD966310 ml
wosku parafinowego tek IIISakura4511
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS) 1 XGibco14190-094
Sól fizjologiczna buforowana trisem (TBS) 10XMicrom Microtech FranceF/00801100 ml
Triton X-100Sigma-AldrichT8532UWAGA: Triton X­ 100 jest niebezpieczne. Unikać kontaktu ze skórą i oczami.
KsylenSigma-Aldrich534056UWAGA: Ksylen jest toksyczny i łatwopalny. Opary mogą powodować podrażnienia. Manipulować w dygestorium. Unikać bezpośredniego kontaktu ze skórą. Nosić gumowe rękawice, okulary ochronne.
Solutions
Roztwór czyszczącyRoztwór oczyszczający glicerol-fruktoza to 60% (obj./w) glicerolu i 2,5 M fruktozy. Aby przygotować 10 ml tego roztworu, wymieszaj 6 ml glicerolu i 4,5 g fruktozy. Uzupełnij do 10 ml z dH2O. Użyj mieszadła magnetycznego na noc. Współczynnik załamania światła = 1,4688 w temperaturze pokojowej (RT: 19– 23 &stopnie; Przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C w ciemności do 1 miesiąca.
PBS-BSA 0,1% roztwórAby przygotować 0,1% (obj./wag.) 0,1% roztwór PBS-BSA, rozpuścić 500 mg BSA w 50 ml PBS-1X (przechowywać w temperaturze 4& C przez okres do 2 tygodni). I rozcieńczyć 1 ml tego roztworu w 9 ml PBS-1X. To rozwiązanie może być używane do wstępnego powlekania końcówki i probówki wirówkowej. 
Roztwór blokujący przenikanie (roztwór PB)Roztwór blokujący PBSDT to PBS-1X uzupełniony 0,1% – 1% Tritonx-100 (w zależności od lokalizacji błony/jądra białkowego), 1% DMSO, 1% BSA i 1% surowicy osła (lub ze zwierzęcia, u którego wyniesiono przeciwciała drugorzędowe). Roztwór ten może być przechowywany w temperaturze 4° C przez okres do 1 miesiąca.
PB:PBS-1X  ( 1:10) rozwiązaniePB:PBS-1X  ( 1:10) jest 10-krotnie rozcieńczonym roztworem PB. Aby przygotować 10 ml tego roztworu, rozcieńczyć 1 ml roztworu PB w 9 ml PBS-1X.
Software
Halo oprogramowanieIndicalabsNM 87114
Harmony oprogramowaniePerkinElmerHH17000010
Kaseta na tkanki ..

Bibliografia

  1. Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells. Cells. 8 (12), 1-13 (2019).
  2. Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).
  3. Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. Advances in multicellular spheroids formation. Journal of the Royal Society, Interface. 14 (127), (2017).
  4. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
  5. Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).
  6. Rezanejad, H., Lock, J. H., Sullivan, B. A., Bonner-Weir, S. Generation of pancreatic ductal organoids and whole-mount immunostaining of intact organoids. Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 82(2019).
  7. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  8. McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. Handling and assessment of human primary prostate organoid culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e59051(2019).
  9. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews: Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
  10. Lazzari, G., et al. Light sheet fluorescence microscopy versus confocal microscopy: in quest of a suitable tool to assess drug and nanomedicine penetration into multicellular tumor spheroids. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 142, 195-203 (2019).
  11. Gabriel, J., Brennan, D., Elisseeff, J. H., Beachley, V. Microarray embedding/sectioning for parallel analysis of 3D cell spheroids. Scientific Reports. 9, 16287(2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Modele organoidalnetrójwymiarowa hodowla komórkowabarwienie całych preparatówmikroskopia konfokalnazatapianie w parafiniebarwienie immunohistochemiczneutlenianie optyczneobrazowanie subkomórkowedetekcja markerów komórkowych
Barwienie i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości trójwymiarowych modeli organoidów i sferoidów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.