Artykuł metodologiczny

Izolacja pierwotnych hepatocytów szczura z wieloparametrową kontrolą perfuzji

DOI:

10.3791/62289

⸱

5 kwietnia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology & The Institute for Digital Medicine (WisDM), National University of Singapore, 2College of Agriculture and Biology, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, 3Mechanobiology Institute, National University of Singapore, 4Institute of Bioengineering and Nanotechnology, A*STAR, 5NUS Graduate School for Integrative Sciences and Engineering, 6CAMP, Singapore-MIT Alliance for Research and Technology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół szczegółowo opisuje użycie specjalnego cewnika dożylnego, standaryzowanego sterylnego jednorazowego wężyka, kontroli temperatury uzupełnionej monitorowaniem w czasie rzeczywistym, oraz systemu alarmowego dla dwuetapowej procedury perfuzji kolagenazy w celu poprawy spójności żywotności, wydajności i funkcjonalności izolowanych pierwotnych hepatocytów szczurów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwotne hepatocyty są szeroko stosowane w podstawowych badaniach nad chorobami wątroby oraz do testowania toksyczności in vitro. Dwuetapowa procedura perfuzji kolagenazy do pierwotnej izolacji hepatocytów jest technicznie trudna, szczególnie w przypadku kaniulacji żyły wrotnej. Procedura jest również podatna na sporadyczne zanieczyszczenia i zmiany warunków perfuzji z powodu trudności w montażu, optymalizacji lub konserwacji układu perfuzji. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół ulepszonej dwuetapowej procedury perfuzji kolagenazy z wieloparametrową kontrolą perfuzji. Pierwotne hepatocyty szczura zostały pomyślnie i niezawodnie wyizolowane dzięki zastosowaniu niezbędnych technicznych środków ostrożności na krytycznych etapach procedury oraz poprzez zmniejszenie trudności operacyjnych i złagodzenie zmienności parametrów perfuzji poprzez zastosowanie specjalnego cewnika dożylnego, znormalizowanego sterylnego jednorazowego rurki, kontroli temperatury oraz systemu monitorowania i alarmowania w czasie rzeczywistym. Wyizolowane pierwotne hepatocyty szczura konsekwentnie wykazują wysoką żywotność komórek (85%-95%), wydajność (2-5 x 108 komórek na 200-300 g szczura) i funkcjonalność (aktywność albuminy, mocznika i CYP). Procedura została uzupełniona o zintegrowany system perfuzyjny, który jest na tyle kompaktowy, że można go ustawić w okapie z przepływem laminarnym, aby zapewnić aseptyczną pracę.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwotne hepatocyty są ważnymi narzędziami do podstawowych badań związanych z wątrobą, leczenia chorób i zastosowań, takich jak testowanie leków. Obecnym złotym standardem pierwotnej izolacji hepatocytów jest dwuetapowa procedura perfuzji kolagenazy1,2,3 wprowadzona przez Seglena w latach 19704. Jednak ta procedura jest trudna technicznie i ma wysoki wskaźnik niepowodzeń, gdy jest wykonywana przez początkujących chirurgów. Nawet jeśli perfuzja zostanie uznana za udaną, można zaobserwować drastyczne różnice w żywotności hepatocytów (zwykle 60%-95%) i wydajności (0,5-5 x 108 na szczura o wadze 200-300 g) między izolacjami. Ma to wpływ na jakość i skalę dalszych eksperymentów. Oprócz procedury technicznej, czynnikiem przyczyniającym się do tego jest konfiguracja perfuzyjna używana do izolacji, dostępna na rynku lub zbudowana na zamówienie. Należy zwrócić uwagę na montaż, optymalizację i konserwację zestawu perfuzyjnego. Celem tego protokołu jest poprawa wskaźnika powodzenia i stabilności między izolacjami pierwotnych hepatocytów szczura poprzez wieloparametrową kontrolę perfuzji procedury technicznej i konfigurację perfuzji dwuetapowej procedury perfuzji kolagenazy.

Z technicznego punktu widzenia, najtrudniejszym krokiem w procedurze jest kaniulacja żyły wrotnej. Jeśli chodzi o pozostałe etapy, to jeśli przestrzegana jest dobra praktyka i podejmowane są ogólne środki ostrożności, stabilność izolacji może ulec poprawie. Dlatego ważne jest zrozumienie uzasadnienia każdego kroku, aby chirurg mógł reagować na różne zmienne, które mogą wystąpić podczas zabiegu.

Opublikowano różne protokoły izolacji hepatocytów i komórek wątrobowych niemiąższowych od szczurów i myszy1,2,5,6,7,8,9. Konfiguracje perfuzyjne stosowane w tych protokołach miały kilka wad, do których należą ponowne użycie rurki perfuzyjnej, problemy z kontrolą temperatury, konieczność rutynowej optymalizacji parametrów perfuzji i/lub użycie nieodpowiedniego typu cewnika dożylnego (IV) do kaniulacji żyły wrotnej. Ponowne użycie rurki perfuzyjnej zwiększy ryzyko zanieczyszczenia, zwłaszcza jeśli rurka nie została odpowiednio oczyszczona i zdezynfekowana. Ponowne użycie rurki bez rutynowej wymiany narazi również zestaw perfuzyjny na problemy, takie jak nieszczelne rurki lub łączniki, zatkana pułapka bąbelkowa i zwężone rurki, z których wszystkie znacznie zmniejszą ciśnienie perfuzatu i szybkość przepływu, wpływając w ten sposób na wydajność trawienia wątroby. Bez stałego źródła ciepła w niektórych konfiguracjach do kontroli temperatury, wstępnie podgrzane z czasem ostygną, co prowadzi do niskiej aktywności kolagenazy i trawienia. Chociaż inne konfiguracje wykorzystują szklany skraplacz z płaszczem połączony z cyrkulatorem wody w celu ogrzania bufora, są one nieporęczne i wymagają starannego czyszczenia. Temperatura, ciśnienie i natężenie przepływu buforu wychodzącego z cewnika muszą być mierzone i optymalizowane przed rozpoczęciem izolacji, aby zapewnić stabilne warunki perfuzji. Nawet po optymalizacji parametry mogą nadal zmieniać się w połowie podczas izolacji ze względu na działania operatora, prowadząc w ten sposób do nieoptymalnej perfuzji i trawienia. Większość rodzajów cewników dożylnych nie nadaje się do kaniulacji żyły wrotnej, ponieważ nie pozwalają one na ciągłą perfuzję podczas kaniulacji. Nie są w stanie natychmiast poinformować chirurga, gdy kaniulacja się powiedzie. Ponadto trudno jest zabezpieczyć żyłę wrotną na cewniku miękkim bez jej deformacji.

Tutaj rozwiązujemy te problemy za pomocą standardowych jednorazowych sterylnych przewodów, silikonowej osłony grzewczej do precyzyjnej i stabilnej kontroli temperatury, monitorowania w czasie rzeczywistym i systemu alarmowego z przechowywaniem i zarządzaniem danymi oraz użyciem specjalnego cewnika dożylnego, który umożliwia ciągłą perfuzję podczas nakłuwania żyły wrotnej podczas kaniulacji. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, jesteśmy pierwszą grupą, która połączyła wszystkie te cechy w zintegrowany system perfuzyjny (IPS), który jest kompaktowy, dzięki czemu jest wysoce przenośny i można go zmieścić w okapie z przepływem laminarnym, aby zapewnić aseptyczną pracę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury i pomieszczenia dla zwierząt zostały przeprowadzone na podstawie numerów protokołów R15-0027 i R19-0669 zgodnie z wymaganiami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Narodowego Uniwersytetu Singapuru.

1. Przygotowanie roztworów i narzędzi chirurgicznych

  1. Przygotować i pożywki do hodowli komórkowych wymienione w tabeli 1, używając wody ultraczystej.
  2. Przed użyciem podgrzej bufor bezwapniowy i bufor kolagenazy do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.
  3. Przeprowadź w autoklawie następujące narzędzia chirurgiczne i sprzęt laboratoryjny: parę ostrych, nożyczek chirurgicznych, parę nożyczek chirurgicznych, parę zakrzywionych nożyczek chirurgicznych, dwie pary kleszczyków do tkanek zęba, dwie pary zakrzywionych kleszczy, dwa klipsy do żył, jedwabny szew chirurgiczny 3-0 o długości 5 cm, nylonowy filtr siatkowy 100 μm, zlewkę o pojemności 400 ml, oraz stolik (pływający stojak na probówki do mikrowirówek).

2. Konfiguracja IPS (zobacz Rysunek 1)

  1. Wytrzyj okap z przepływem laminarnym 70% etanolem. Przetrzyj IPS 70% etanolem i przenieś go do okapu z przepływem laminarnym. Sterylizuj promieniami UV przez >15 minut przed włączeniem okapu.
    UWAGA: Ekspozycja na światło UV może powodować ból oczu i oparzenia skóry. Upewnij się, że skrzydło jest całkowicie zamknięte, gdy włączone jest światło UV.
  2. Zamontuj nowy zestaw jednorazowych wężyków na IPS. Owiń rurkę za pompą perystaltyczną silikonową osłoną grzejną. Zamontuj monitor perfuzji na rurce za silikonową osłoną grzałki.
  3. Upewnij się, że rolka clamps dla obu wlotów rurek są całkowicie poluzowane. Podłącz każdy wlot rurki do stożkowego końca sterylnej pipety aspiracyjnej o pojemności 2 ml. Pozostawić zarówno pipety aspiracyjne (wloty), jak i cewnik dożylny (wylot) w butelce o pojemności 1 l z buforem bezwapniowym, aby umożliwić recyrkulację buforu podczas kolejnych etapów zasysania.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Interfejs autotestu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Włącz IPS. Wykonaj następujące operacje na panelu sterowania z ekranem dotykowym. Oprogramowanie przeprowadzi kompleksowy autotest przy każdym uruchomieniu.
    UWAGA: IPS to urządzenie elektryczne, które jest podłączone do zewnętrznego źródła zasilania. Rozlanie płynu na IPS lub zasilające może spowodować zagrożenie elektryczne.
    1. Upewnij się, że stan autotestu jest wyświetlany na ekranie (Rysunek 2). Komponenty, które przeszły autotest, będą wyświetlane na zielono; Te, które się nie powiodły, zostaną pokazane na czerwono. Po skorygowaniu dotknij ikony Testowanie, aby ponownie powtórzyć autotest lub dotknij ikony Wejdź do systemu, aby przejść bezpośrednio do interfejsu operacyjnego.
    2. Stuknij w dowolnym miejscu na ekranie, aby zalogować się do interfejsu operacyjnego.
    3. W lewym górnym rogu interfejsu operacyjnego (Rysunek 3) dotknij jednej z ikon okrągłych strzałek, aby ustawić kierunek obrotów pompy perystaltycznej. W prawym panelu interfejsu dotknij ikon strzałek w górę/w dół, aby ustawić wartości odpowiednich parametrów. Ustaw przepływ w trybie stałego przepływu; temperatura płaszcza grzałki do 42 °C (do dostosowania w celu zapewnienia, że temperatura perfuzatu jest utrzymywana na poziomie 37 °C); i prędkość pompy do 38 obr./min dla natężenia przepływu ~33 ml/min.
    4. W prawym dolnym panelu interfejsu operacyjnego sprawdź stan alarmu bąbelkowego, alarmu zatrzymania perfuzji i ikony wyciszenia.
    5. Sprawdź temperaturę, ciśnienie i natężenie przepływu perfuzatu w lewym panelu. Ręcznie ustaw interwały, klikając strzałki góra-dół u góry i u dołu kolumn. Sprawdź dane w czasie rzeczywistym wyświetlane jako wartości w środku kolumn. Kolor kolumny zmieni się z zielonego na czerwony, jeśli dane w czasie rzeczywistym wyjdą poza ustawiony zakres.
    6. Znajdź ikony, aby rozpocząć, wstrzymać i zatrzymać perfuzję, oraz ikonę, aby przełączyć się z wyświetlania danych w czasie rzeczywistym do trybu wykresu w środkowym panelu. Stuknij ikonę start, aby rozpocząć perfuzję i zalać rurkę buforem bezwapniowym. Zostanie utworzony nowy dziennik. Wprowadź nazwę pliku i nazwę użytkownika w wyskakującym okienku (Rysunek 4).

figure-protocol-2
Rysunek 3: Interfejs operacyjny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-3
Rysunek 4: Wyskakujące okienko z prośbą o nazwę pliku i nazwę użytkownika. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Napełnij komorę ociekową do połowy. Upewnij się, że podczas zalewania w rurze nie ma uwięzionych kieszeni powietrznych.
  2. Usuń wszelkie pęcherzyki, które tworzą się za filtrem bąbelkowym, przesuwając rurkę, aby odłączyć pęcherzyk i umożliwić jego wypłukanie.
    UWAGA: Wzdłuż rurki mogą tworzyć się bąbelki, gdy bufor jest rozgrzewany przez płaszcz grzałki.
  3. Napełnij zlewkę o pojemności 400 ml 200 ml buforu kolagenazy. Umieść scenę na zlewce. Nie wprowadzając powietrza do rurki, całkowicie dokręć rolkę clamp dla jednego z wlotów przewodów i przesuń pipetę zasysającą do wlotu do zlewki.

3. Procedura na zwierzętach

  1. Przygotuj młodego dorosłego samca szczura Wistar o masie około 200-300 g.
    UWAGA: Ten protokół został zoptymalizowany dla szczurów o masie ciała około 200-300 g. Samce szczurów są preferowane, ponieważ zmiany hormonalne podczas cyklu rujowego u samic szczurów wpływają na funkcję hepatocytów.
  2. znieczulenie
    1. Pobrać wymaganą objętość heparyny przeciwzakrzepowej (5 000 j.m./ml; 0,2 ml/100 g masy ciała) i koktajlu ketaminy/ksylazyny do znieczulenia szczura (37,5 mg/ml ketaminy, 5 mg/ml ksylazyny; 0,2 ml/100 g masy ciała) do strzykawek o pojemności 1 ml z igłą 27 G.
      UWAGA: Znieczulenie i heparyna są substancjami szkodliwymi. Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z ostrymi narzędziami.
    2. Powstrzymaj szczura. Dootrzewnowo wstrzyknąć heparynę, a następnie koktajl ketaminy/ksylazyny w prawy dolny kwadrant brzucha.
      UWAGA: Kątnica ma większe prawdopodobieństwo, że znajduje się po lewej stronie. Należy unikać nakłuwania kątnicy podczas wstrzykiwania, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia.
    3. Po 10 minutach sprawdź głębokość znieczulenia, oceniając odruch pedałowania na obu łapach szczura. Kontynuuj sprawdzanie od czasu do czasu i poczekaj, aż szczur przestanie reagować na szczypanie palców. W razie potrzeby można wstrzyknąć dodatkowe znieczulenie.
  3. Umieść szczura w pozycji leżącej z kończynami wyciągniętymi na pokrytej folią aluminiową platformie polistyrenowej na tacy. Przyklej taśmą łapy szczura i przypnij taśmę do platformy za pomocą igieł 27 G.
  4. Zdezynfekuj klatkę piersiową i brzuch, spryskując je i zalewając 70% etanolem. Golenie przed dezynfekcją jest opcjonalne. Umieść szczura w kapturze. Kontynuuj następny krok, gdy futro jest jeszcze mokre.
    UWAGA: Nasączanie 70% etanolem ogranicza również do minimum sierść i kurz sierściowy.
  5. Oddziel skórę od mięśnia.
    1. Trzymając w jednej ręce kleszczyki do tkanek zęba, unieś skórę w pobliżu podstawy brzucha. Trzymając w drugiej ręce ostro-nożyczki chirurgiczne, przetnij skórę namiotu. Wciśnij ostry koniec nożyczek pod skórę i wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry od tuż nad tylnymi nogami do tuż poniżej przednich nóg.
    2. Podciągając się i lekko rozciągając skórę kleszczami, przetnij tkankę łączną utrzymującą skórę na mięśniu klatki piersiowej i brzucha. Aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia, należy zapobiegać opadaniu luźnej sierści na mięśnie. Aby usunąć nagromadzoną luźną sierść na nożyczkach, zetrzyj je na zdezynfekowanej zewnętrznej stronie skóry.
    3. Wykonaj boczne nacięcia na skórze, od linii środkowej do obu stron szczura nieco powyżej tylnych nóg i nieco poniżej przednich nóg. Popchnij płaty skóry na boki, aby odsłonić mięsień.
  6. Rozetnij mięsień brzucha, aby odsłonić narządy.
    1. Trzymając nową parę kleszczyków do tkanek zęba w jednej ręce, unieś mięsień w pobliżu podstawy brzucha. Trzymając w drugiej ręce nożyczki chirurgiczne, ostrożnie przetnij mięsień, nie nacinając żadnego z narządów. Wykonaj nacięcie w linii środkowej mięśnia od nieco powyżej tylnych nóg do mostka.
    2. Wykonaj boczne nacięcia na mięśniu, od linii środkowej do obu stron szczura nieco powyżej tylnych nóg i tuż poniżej klatki piersiowej, nie nacinając żadnego z narządów. Popchnij płaty mięśni na boki, aby odsłonić narządy. Upewnij się, że boczne nacięcia skóry i mięśni sięgają boków szczura, aby umożliwić przepływ krwi i z jamy brzusznej w późniejszych krokach.
  7. Kaniulacja żyły wrotnej
    1. Grzbietem zakrzywionych kleszczy delikatnie popchnij jelita w prawo. Delikatnie odchyl płaty wątroby do góry, aby odsłonić żyłę wrotną.
    2. Użyj jedwabnego szwu chirurgicznego 3-0, aby wykonać bardzo luźną ligaturę wokół żyły wrotnej w pobliżu wątroby, tuż przed rozgałęzieniem żyły w lewo i w prawo do różnych płatów wątroby. Nie zaciskaj więzadła, aby uniknąć zakłócenia przepływu krwi przez żyłę wrotną. Bardzo cienka błona pod przewodem żółciowym będzie musiała zostać przebita końcówką zakrzywionych kleszczy, zanim szew będzie mógł przejść pod spodem i zostać zapętlony wokół żyły wrotnej (i przewodu żółciowego).
    3. Używając końcówek dwóch par zakrzywionych kleszczy, ostrożnie przebij otwór przez tkankę pod żyłą wrotną, nie uszkadzając żyły wrotnej. Zrób to około 2-3 cm przed pierwszą ligaturą, tuż przed odgałęzieniem żyły żołądkowej od żyły wrotnej. Tkanka jest cieńsza w tym konkretnym miejscu.
    4. Ostrożnie rozciągnij otwór większy za pomocą kleszczy. Ten otwór pozwoli kleszczom podeprzeć żyłę wrotną podczas kaniulacji.
    5. Zmniejsz prędkość pompy do 4 obr./min, aby uzyskać natężenie przepływu ~3 ml/min. Upewnij się, że odpływ bezwapniowego buforu z cewnika dożylnego jest zmniejszony do powolnego kapania.
      UWAGA: Wzrost ciśnienia w wątrobie spowoduje śmierć hepatocytów. Mniejsze natężenie przepływu powinno spowolnić wzrost ciśnienia w wątrobie po pomyślnym wprowadzeniu kaniuli do żyły wrotnej na późniejszym etapie.
    6. Delikatnie podeprzyj żyłę wrotną za pomocą kleszczy. Drugą ręką przytrzymaj cewnik dożylny skosem igły skierowanym do góry. Skieruj igłę do żyły wrotnej pod kątem 10-20° i powoli przesuwaj, aż cały skos znajdzie się wewnątrz żyły. Po prawidłowym wprowadzeniu igły do żyły wrotnej, wątroba zacznie blednąć i straci swój ciemnoczerwony kolor.
      UWAGA: Cały skos igły musi zostać wprowadzony do żyły, aby utworzyć otwór wystarczająco duży do wprowadzenia kaniuli. Nie należy jednak wkładać igły zbyt głęboko, aby uniknąć nadmiernego przebicia żyły.
    7. Przesuń kaniulę przez igłę i do żyły. Następnie wycofaj igłę, aż znajdzie się 2-3 mm za kaniulą; Tylko tyle, aby ostra końcówka znalazła się bezpiecznie w kaniuli. Użyj kciuka i środkowego palca, aby przytrzymać cewnik i użyj palca wskazującego, aby odciągnąć skrzydełko, aby cofnąć igłę.
    8. Szybko przymocuj żyłę wrotną do cewnika za pomocą klipsa dożylnego. Nie zatrzaskiwać bezpośrednio w bocznym otworze igły, aby uniknąć zakłócenia przepływu perfuzatu. Zamiast tego przytnij pod nim.
    9. Natychmiast przeciąć żyłę podwątrobową dolną (IVC), aby zapobiec wzrostowi ciśnienia w wątrobie. Do tej pory IVC podwątrobowy i przyległe naczynia krwionośne będą zasłonięte krwią z żyły wrotnej. Aby upewnić się, że IVC został prawidłowo przecięty i odcięty, obserwuj, czy krew tryska impulsami; Krew będzie sączyć się tylko z sąsiednich naczyń.
      UWAGA: Zbyt długie przecięcie podwątrobowego IVC po kaniulacji lub nieprzecięcie go przed przejściem do następnego kroku spowoduje śmierć hepatocytów. Zwierzę jest poddawane eutanazji w znieczuleniu przez wykrwawienie (poprzez przecięcie IVC) na tym etapie. Procedura powinna być kontynuowana w trakcie utraty krwi. Zgon można potwierdzić poprzez wzrokową obserwację ustania bicia serca/oddychania, gdy jama klatki piersiowej zostanie otwarta na późniejszym etapie.
    10. Zwiększ prędkość pompy do 38 obr./min, aby uzyskać natężenie przepływu ~33 ml/min. Przepłucz wątrobę trzy razy, zamykając IVC kleszkami na 2-3 s (ale nie za długo) i ponownie otwierając.
      UWAGA: Podczas płukania wątroba nieznacznie się rozszerzy, zanim powróci do normy. Zaczerwienienie ułatwia przenikanie perfuzatu przez całą wątrobę. Po spłukaniu wątroba powinna być całkowicie jasnobrązowa.
    11. Upewnij się, że końcówka kaniuli jest umieszczona przed punktem, w którym żyła wrotna rozgałęzia się na różne płaty wątroby, aby zapewnić perfuzję wszystkich płatów wątroby. W razie potrzeby odpiąć żyłę wrotną i wyregulować położenie kaniuli. Następnie przytnij ponownie.
    12. Dokręć luźną ligaturę wokół żyły wrotnej, nieco przed punktem rozgałęzienia. Wykonaj trzy węzły w miejscu, w którym miękka kaniula jest podtrzymywana przez igłę z twardego metalu, pomiędzy skosem a bocznym otworem. Upewnij się, że węzły utrzymują kaniulę na miejscu, mocując ją do żyły wrotnej i zapobiegając cofaniu się.
  8. Wyciąć całą wątrobę w stanie nienaruszonym.
    1. Perfekować wątrobę buforem bezwapniowym z szybkością przepływu ~33 ml / min przez następne 12 minut (patrz Rysunek 5A). W międzyczasie wykonaj resekcję wątroby. W razie potrzeby czas perfuzji można wydłużyć, ale należy upewnić się, że nie wyczerpie się bufor bezwapniowy.
    2. Za pomocą zakrzywionych nożyczek ostrożnie odłącz żyłę wrotną od jelit, przecinając krezkę, która je łączy. Nie należy nacinać przewodu pokarmowego (przełyku, żołądka oraz jelita cienkiego i grubego), aby upewnić się, że nie dojdzie do zanieczyszczenia.
      UWAGA: Ma to na celu zapobieżenie rozerwaniu żyły wrotnej, gdy wątroba jest poruszana podczas resekcji.
    3. Odłącz wątrobę od przewodu pokarmowego, przecinając tkankę łączną, trzustkę i krezkę, która łączy wątrobę z przewodem pokarmowym. Aby odłączyć, zawsze tnij nożyczkami i nie ciągnij, aby rozerwać się. Ponownie, nie nacinaj ani nie przecinaj przewodu pokarmowego.
    4. Delikatnie opuść wątrobę, aby odsłonić przeponę. Przetnij membranę wzdłuż ścianek żeber. Upewnij się, że większość przepony pozostaje połączona z wątrobą. Uważaj, aby nie szturchnąć ani nie posiniaczyć wątroby.
    5. Po otwarciu jamy klatki piersiowej można zobaczyć dwa przewody: białawy IVC nadwątrobowy po lewej stronie i żółtawy przełyk po prawej. Przytnij IVC nadwątrobowy i przetnij go tuż nad klipsem. Przycinanie IVC nadwątrobowego jest opcjonalne. Zapobiega zalaniu jamy klatki piersiowej.
      UWAGA: Obserwować wzrokowo, czy ustaje bicie serca/oddychanie, aby potwierdzić śmierć zwierzęcia.
    6. Przełyk otoczony jest przeponą. Aby odizolować przełyk od przepony, przeciąć przeponę od prawej strony w kierunku przełyku. Przetnij wszelkie pozostałe tkanki łączne łączące przełyk i żołądek z wątrobą i przeponą.
    7. Odepchnij przewód pokarmowy w prawo. Przenieść klips żylny z IVC nadwątrobowego do IVC podwątrobowego; bufor będzie teraz perfekcyjnie wydalany z nadwątrobowego IVC.
      UWAGA: Podczas perfuzji kaniula i IVC podwątrobowa zostaną pokryte przez wątrobę. Silny odpływ buforu z IVC nadwątrobowego pomoże chirurgowi wykluczyć przecieki perfuzyjne.
    8. Przetnij pozostałą przeponę, która łączy wątrobę z jamą klatki piersiowej. Odetnij tkanki łączące wątrobę z jamą brzuszną. Należy uważać, aby nie przeciąć podwątrobowego IVC powyżej klipsa, aby uniknąć odłączenia klipsa od wątroby.
    9. Aby upewnić się, że wątroba jest całkowicie wycięta, ostrożnie podnieś wątrobę, trzymając się przepony kleszczami. Jeśli pozostały jakiekolwiek tkanki łączące wątrobę z jamą brzuszną, odetnij je. Jeśli nerka i śledziona są nadal połączone z wątrobą, odłącz je.

4. Perfuzja i trawienie wątroby

  1. Jeśli resekcja została zakończona wcześnie, poczekaj, aż wątroba zostanie wypełniona buforem bezwapniowym przez 12 minut.
  2. Zmień bufor perfuzyjny na bufor kolagenazy. Całkowicie poluzuj zacisk rolkowy buforu kolagenazy przed całkowitym dokręceniem zacisku rolki dla buforu bezwapniowego (patrz Rysunek 5B). Gdy bufor kolagenazy dotrze do wątroby przez rurkę, należy przepłukać wątrobę trzykrotnie, zamykając IVC nadwątrobowy na 2-3 s i ponownie go otwierając.
  3. Ostrożnie przenieść wątrobę do etapu na górze zlewki w celu recyrkulacji buforu kolagenazy. Poruszaj wątrobą, przytrzymując przeponę kleszczami, jednocześnie podtrzymując cewnik. Unikaj szarpania cewnika, aby zapobiec przypadkowemu odłączeniu cewnika.
    UWAGA: Jeśli cewnik odczepia się, a żyła wrotna jest zbyt uszkodzona, aby można było ją ponownie kaniulować, należy przeprowadzić kaniulację IVC nadwątrobowego i pozwolić buforowi na perfuzję z żyły wrotnej. Upewnij się, że IVC podwątrobowy pozostaje zaciśnięty.
  4. Trawić wątrobę przez 12 minut. Obserwuj pojawienie się półprzezroczystych plam/sieci, gdy wątroba zaczyna tracić swoją gładką brązową teksturę. Wątroba stanie się większa i bardziej miękka w miarę trawienia. Gdy wątroba będzie miała papkowatą konsystencję, przerwij perfuzję. W razie potrzeby czas trawienia można wydłużyć.
    UWAGA: Jeśli kapsułka Glissona została uszkodzona, bufor kolagenazy w zlewce może stać się mętny z powodu ucieczki komórek wątroby.

5. Izolacja hepatocytów

  1. Ostrożnie wyjmij kaniulę, odcinając żyłę wrotną. Ostrożnie zdejmij klips. Przenieś wątrobę do naczynia o średnicy 150 mm zawierającego 60 ml zimnego zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco.
  2. Delikatnie postukaj w wątrobę, używając tylnej strony zakrzywionych kleszczy, aby złamać i oderwać kapsułkę Glissona. Następnie delikatnie kołysz wątrobę na boki w DMEM, aby uwolnić komórki wątroby. Kontynuuj to, aż komórki wątroby zostaną całkowicie zdysocjowane do DMEM.
    UWAGA: Czasami cała wątroba lub niektóre płaty są trawione tylko częściowo. Nie skrobając wątroby, która na siłę usunie i uszkodzi niezdysocjowane hepatocyty, można uzyskać wyższą i bardziej spójną żywotność komórek.
  3. Delikatnie kołysz szalką o średnicy 150 mm, aż komórki wątroby zostaną dobrze rozmieszczone w DMEM. Aby usunąć kawałki tkanek i grudki komórek, przelej zawiesinę komórek przez nylonowy filtr siatkowy o wielkości porów 100 μm umieszczony na nowym naczyniu o średnicy 150 mm. Opłucz stare naczynie 30 ml DMEM i przenieś zawiesinę do filtra siatkowego. Delikatnie dotknij filtra siatkowego, aby umożliwić przejście uwięzionym pojedynczym komórkom wątroby.
  4. Wyjmij filtr siatkowy i delikatnie kołysz nową naczynią o średnicy 150 mm, aż komórki wątroby zostaną dobrze rozprowadzone. Podzielić zawiesinę równomiernie na 4 probówki po 50 ml. Wypłukać naczynie 30 ml DMEM i równo podzielić zawiesinę na te same probówki. Upewnij się, że każda probówka ma równą objętość zawiesiny komórek.
  5. Odwirować 4 x 50 ml probówki z zawiesiną komórkową o sile 50 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Ostrożnie zassać supernatant, nie naruszając luźnego osadu. Odrzucić supernatant. Dodaj 20 ml DMEM do każdej probówki i delikatnie kołysz probówkami, aby ponownie zawiesić osad komórkowy. Połączyć zawiesinę komórek z czterech probówek na dwie.
  6. Odwirować 2 probówki o pojemności 50 ml o stężeniu 20 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Odessać i odrzucić supernatant. Dodaj 20 ml DMEM do każdej probówki i delikatnie kołysz probówkami, aby ponownie zawiesić osad komórkowy. Połącz zawiesinę komórkową z dwóch probówek w jedną. Trzymaj komórki na lodzie do czasu użycia.
  7. Przygotować roztwór błękitu trypanowego, mieszając 400 μl 1x PBS z 50 μl błękitu trypanowego. Dodać 50 μl zawiesiny hepatocytów do roztworu błękitu trypanowego. Policz liczbę żywotnych i martwych hepatocytów za pomocą hemocytometru pod mikroskopem świetlnym.

6. Posiew hepatocytów

  1. Wykonaj wszystkie etapy hodowli komórkowej w kapturze. Dodać 1 ml roztworu powlekającego kolagen do naczynia o średnicy 35 mm i inkubować przez 4 godziny. Opłucz naczynia trzy razy za pomocą 1x PBS.
  2. Rozcieńczyć zawiesinę hepatocytów w pożywce do hodowli hepatocytów do stężenia 0,8 miliona komórek/ml. Dodać 1 ml rozcieńczonej zawiesiny hepatocytów do szalki o średnicy 35 mm.
    UWAGA: Hepatocyty są wrażliwe na naprężenia ścinające podczas pipetowania. Rozważ użycie końcówek do pipet o szerokim otworze.
  3. Rozbujaj naczynie, aby równomiernie rozprowadzić hepatocyty. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 3-4 godziny, aby umożliwić przyłączenie się hepatocytów.
  4. Do uprawy kanapek.
    1. Usuń pożywkę do hodowli hepatocytów. Spłucz raz 1 ml pożywki do hodowli hepatocytów, aby usunąć nieprzyłączone komórki. Dodaj 1 ml roztworu do nakładki kolagenowej. Dodaj roztwór nakładki kolagenowej na ścianki naczynia, aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków do roztworu.
    2. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc, aby umożliwić żelowanie kolagenu.
    3. Dodać 1 ml świeżej pożywki do hodowli hepatocytów. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  5. Do hodowli jednowarstwowej.
    1. Po kroku 6.3 usuń pożywkę do hodowli hepatocytów. Spłucz raz 1 ml pożywki do hodowli hepatocytów, aby usunąć nieprzyłączone komórki.
    2. Dodać 1 ml świeżej pożywki do hodowli hepatocytów. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  6. Oceń czystość i funkcję hepatocytów, wykonując barwienie immunologiczne dla markerów specyficznych dla hepatocytów i testów funkcjonalnych, jak opisano wcześniej10,11.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chirurg mógłby stwierdzić, czy perfuzja wątroby przebiega bez zakłóceń, obserwując wynik po pewnych krokach. Pierwszy wynik można zaobserwować po kaniulacji, przecięciu IVC podwątrobowego i przywróceniu szybkości przepływu perfuzji. Wątroba powinna całkowicie zmienić kolor z ciemnoczerwonego na brązowy, zachowując swoją objętość. Jeśli wątroba wygląda na lekko opróżnioną i ma czerwonawy odcień lub czerwone plamy, oznacza to, że szybkość przepływu perfuzji została ustawiona nieprawidłowo (zbyt niska) lub żyła wrotna nie z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jest kilka punktów, które są szczególnie ważne do przestrzegania w przypadku dwuetapowej procedury perfuzji kolagenazy w ogóle. Po pierwsze, należy zachować szczególną ostrożność podczas resekcji wątroby. Upewnij się, że przewód pokarmowy nie jest uszkodzony, ponieważ wyciek zawartości spowoduje zanieczyszczenie bakteryjne. Ponadto należy unikać uszkodzenia kapsułki Glissona, która pokrywa powierzchnię wątroby podczas zabiegu na zwierzętach. Jeśli rozdarcie jest wystarczająco duże, może to pozwolić na przedwczesne uwolni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zhou Yan i Hanry Yu deklarują konkurencyjne interesy, ponieważ posiadają udziały w firmie Vasinfuse, która produkuje i sprzedaje Zintegrowany System Perfuzji. Hanry Yu posiada udziały w Histoindex, Invitrocue, Osteopore, Pishon Biomedical, Ants Innovate i Synally Futuristech, które nie mają konkurencyjnych interesów w stosunku do przedstawionych tutaj informacji.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest częściowo wspierana przez MOE ARC (MOE2017-T2-1-149); Dotacja NUHS Innovation Seed Grant 2017 (NUHSRO/2017/051/InnovSeed/02); Instytut Mechanobiologii w Singapurze (R-714-106-004-135); oraz Instytut Bioinżynierii i Nanotechnologii, Rada ds. Badań Biomedycznych, Agencja ds. Nauki, Technologii i Badań (A*STAR) (numery projektów IAF-PP H18/01/a0/014, IAF-PP H18/01/a0/K14 i MedCaP-LOA-18-02) finansowanie dla Hanry Yu. Ng Chan Way jest pracownikiem naukowym Narodowego Uniwersytetu Singapuru. Chcielibyśmy podziękować Zakładowi Mikroskopii Konfokalnej i Zarządowi Cytometrii Przepływowej Narodowego Uniwersytetu Singapuru za pomoc i porady w analizie czystości hepatocytów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiał/Sprzęt
1 mL strzykawkaIgła Nipro
27GNipro
pleciony jedwabny niewchłanialny, niesterylny szew chirurgicznyLookSP117
Kleszczyki ze stali nierdzewnej Bochem 18/10, ostra końcówka zawiera wygiętą okrągłą końcówkęBochem10333511
Jednorazowy zestaw perfuzyjnyVasinfuseBPF-112
Pływający okrągły stojak na probówki do mikrowirówek 1,5 mlSigma-AldrichR3133
Niemieckie standardowe kleszczyki do tkanek, ząbkowane / 1 i razy; 2 zęby, pipeta aspiracyjna 14,5 cmWalentech
Greiner CellstarMerckGN710183
Hemocytometr
Zintegrowany system perfuzyjnyVasinfuseIPS-001
Nożyczki do tęczówki zakrzywione, nierdzewne, 11 cmOptimal Medical Products Pte LtdCVD
Light z soczewką10XArkusz siatki Olympus
100µ M NylonSpectra-Teknic(s) Pte Ltd06630-75
Nożyczki operacyjne, BL/BL, 13cmOptimal Medical Products Pte LtdSTR – Nożyczki operacyjne BL/BL
, SH/BL, 13cmOptimal Medical Products Pte LtdSTR – SH / BL
Klips hemostatyczny o odwrotnej sileShanghai Jin Zhong Pte LtdXEC230
Kąpiel wodnaGrant
Odczynniki/Chemikalia
10X Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)Sigma-Aldrich
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA9056
CaCl2· 2H2OMerck137101
Kolagenaza typu IVGibco17104019
DeksametazonTCID1961
DMEMGibco31600-034
GlutamaxGibco35050061
HEPESInvitrogen11344-041
InsulinaSigma-Aldrich1-9278
KClVWRVWRC26764.298
KH2PO4Sigma-AldrichP5379
Kwas linolowySigma-AldrichL9530
NaClSigma-AldrichS5886
NaHCO3Sigma-AldrichS8875
NaOHMerck106462
Penicylina-StreptomycynaSigma-AldrichP4333
Kolagen bydlęcy typu IZaawansowany BioMatrix5005-100ml
William' s E MediaSigma-AldrichW1878
Mikroskop

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. H., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917(2012).
  2. Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993(2018).
  3. Green, C. J., et al. The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus. Cell and Tissue Banking. 18 (4), 597-604 (2017).
  4. Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
  5. Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3138(2011).
  6. Wen, J. W., Olsen, A. L., Perepelyuk, M., Wells, R. G. Isolation of rat portal fibroblasts by in situ liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3669(2012).
  7. Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60501(2019).
  8. Shi, W., et al. Isolation and purification of immune cells from the liver. International Immunopharmacology. 85 (95), 106632(2020).
  9. Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive L-azidohomoalanine labeling method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323(2018).
  10. Xia, L., et al. Tethered spheroids as an in vitro hepatocyte model for drug safety screening. Biomaterials. 33 (7), 2165-2176 (2012).
  11. Kegel, V., et al. Protocol for isolation of primary human hepatocytes and corresponding major populations of non-parenchymal liver cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53069(2016).
  12. Zhu, L., et al. A vertical-flow bioreactor array compacts hepatocytes for enhanced polarity and functions. Lab on a Chip. 16 (20), 3898-3908 (2016).
  13. Du, Y., et al. Synthetic sandwich culture of 3D hepatocyte monolayer. Biomaterials. 29 (3), 290-301 (2008).
  14. Tong, W. H., et al. Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture. Biomaterials. 80, 106-120 (2016).
  15. Xia, L., et al. Laminar-flow immediate-overlay hepatocyte sandwich perfusion system for drug hepatotoxicity testing. Biomaterials. 30 (30), 5927-5936 (2009).
  16. Gupta, K., et al. Bile canaliculi contract autonomously by releasing calcium into hepatocytes via mechanosensitive calcium channel. Biomaterials. 259, 120283(2020).
  17. Horner, R., et al. Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes. Scientific Reports. 9 (1), 6542(2019).
  18. Osypiw, J. C., et al. Subpopulations of rat hepatocytes separated by Percoll density-gradient centrifugation show characteristics consistent with different acinar locations. The Biochemical Journal. 304, Pt 2 617-624 (1994).
  19. Beal, E. W., et al. A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541(2018).
  20. Hillebrandt, K., et al. Procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), e53029(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja hepatocyt wperfuzja kolagenazkaniulacja y y wrotnejresekcja w trobyywotno kom reksekrecja albuminytest cytochromu P450hodowla typu sandwich

Powiązane artykuły