Ten protokół szczegółowo opisuje użycie specjalnego cewnika dożylnego, standaryzowanego sterylnego jednorazowego wężyka, kontroli temperatury uzupełnionej monitorowaniem w czasie rzeczywistym, oraz systemu alarmowego dla dwuetapowej procedury perfuzji kolagenazy w celu poprawy spójności żywotności, wydajności i funkcjonalności izolowanych pierwotnych hepatocytów szczurów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja pierwotnych hepatocytów szczura z wieloparametrową kontrolą perfuzji
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pierwotne hepatocyty są szeroko stosowane w podstawowych badaniach nad chorobami wątroby oraz do testowania toksyczności in vitro. Dwuetapowa procedura perfuzji kolagenazy do pierwotnej izolacji hepatocytów jest technicznie trudna, szczególnie w przypadku kaniulacji żyły wrotnej. Procedura jest również podatna na sporadyczne zanieczyszczenia i zmiany warunków perfuzji z powodu trudności w montażu, optymalizacji lub konserwacji układu perfuzji. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół ulepszonej dwuetapowej procedury perfuzji kolagenazy z wieloparametrową kontrolą perfuzji. Pierwotne hepatocyty szczura zostały pomyślnie i niezawodnie wyizolowane dzięki zastosowaniu niezbędnych technicznych środków ostrożności na krytycznych etapach procedury oraz poprzez zmniejszenie trudności operacyjnych i złagodzenie zmienności parametrów perfuzji poprzez zastosowanie specjalnego cewnika dożylnego, znormalizowanego sterylnego jednorazowego rurki, kontroli temperatury oraz systemu monitorowania i alarmowania w czasie rzeczywistym. Wyizolowane pierwotne hepatocyty szczura konsekwentnie wykazują wysoką żywotność komórek (85%-95%), wydajność (2-5 x 108 komórek na 200-300 g szczura) i funkcjonalność (aktywność albuminy, mocznika i CYP). Procedura została uzupełniona o zintegrowany system perfuzyjny, który jest na tyle kompaktowy, że można go ustawić w okapie z przepływem laminarnym, aby zapewnić aseptyczną pracę.
Wprowadzenie
Pierwotne hepatocyty są ważnymi narzędziami do podstawowych badań związanych z wątrobą, leczenia chorób i zastosowań, takich jak testowanie leków. Obecnym złotym standardem pierwotnej izolacji hepatocytów jest dwuetapowa procedura perfuzji kolagenazy1,2,3 wprowadzona przez Seglena w latach 19704. Jednak ta procedura jest trudna technicznie i ma wysoki wskaźnik niepowodzeń, gdy jest wykonywana przez początkujących chirurgów. Nawet jeśli perfuzja zostanie uznana za udaną, można zaobserwować drastyczne różnice w żywotności hepatocytów (zwykle 60%-95%) i wydajności (0,5-5 x 108 na szczura o wadze 200-300 g) między izolacjami. Ma to wpływ na jakość i skalę dalszych eksperymentów. Oprócz procedury technicznej, czynnikiem przyczyniającym się do tego jest konfiguracja perfuzyjna używana do izolacji, dostępna na rynku lub zbudowana na zamówienie. Należy zwrócić uwagę na montaż, optymalizację i konserwację zestawu perfuzyjnego. Celem tego protokołu jest poprawa wskaźnika powodzenia i stabilności między izolacjami pierwotnych hepatocytów szczura poprzez wieloparametrową kontrolę perfuzji procedury technicznej i konfigurację perfuzji dwuetapowej procedury perfuzji kolagenazy.
Z technicznego punktu widzenia, najtrudniejszym krokiem w procedurze jest kaniulacja żyły wrotnej. Jeśli chodzi o pozostałe etapy, to jeśli przestrzegana jest dobra praktyka i podejmowane są ogólne środki ostrożności, stabilność izolacji może ulec poprawie. Dlatego ważne jest zrozumienie uzasadnienia każdego kroku, aby chirurg mógł reagować na różne zmienne, które mogą wystąpić podczas zabiegu.
Opublikowano różne protokoły izolacji hepatocytów i komórek wątrobowych niemiąższowych od szczurów i myszy1,2,5,6,7,8,9. Konfiguracje perfuzyjne stosowane w tych protokołach miały kilka wad, do których należą ponowne użycie rurki perfuzyjnej, problemy z kontrolą temperatury, konieczność rutynowej optymalizacji parametrów perfuzji i/lub użycie nieodpowiedniego typu cewnika dożylnego (IV) do kaniulacji żyły wrotnej. Ponowne użycie rurki perfuzyjnej zwiększy ryzyko zanieczyszczenia, zwłaszcza jeśli rurka nie została odpowiednio oczyszczona i zdezynfekowana. Ponowne użycie rurki bez rutynowej wymiany narazi również zestaw perfuzyjny na problemy, takie jak nieszczelne rurki lub łączniki, zatkana pułapka bąbelkowa i zwężone rurki, z których wszystkie znacznie zmniejszą ciśnienie perfuzatu i szybkość przepływu, wpływając w ten sposób na wydajność trawienia wątroby. Bez stałego źródła ciepła w niektórych konfiguracjach do kontroli temperatury, wstępnie podgrzane z czasem ostygną, co prowadzi do niskiej aktywności kolagenazy i trawienia. Chociaż inne konfiguracje wykorzystują szklany skraplacz z płaszczem połączony z cyrkulatorem wody w celu ogrzania bufora, są one nieporęczne i wymagają starannego czyszczenia. Temperatura, ciśnienie i natężenie przepływu buforu wychodzącego z cewnika muszą być mierzone i optymalizowane przed rozpoczęciem izolacji, aby zapewnić stabilne warunki perfuzji. Nawet po optymalizacji parametry mogą nadal zmieniać się w połowie podczas izolacji ze względu na działania operatora, prowadząc w ten sposób do nieoptymalnej perfuzji i trawienia. Większość rodzajów cewników dożylnych nie nadaje się do kaniulacji żyły wrotnej, ponieważ nie pozwalają one na ciągłą perfuzję podczas kaniulacji. Nie są w stanie natychmiast poinformować chirurga, gdy kaniulacja się powiedzie. Ponadto trudno jest zabezpieczyć żyłę wrotną na cewniku miękkim bez jej deformacji.
Tutaj rozwiązujemy te problemy za pomocą standardowych jednorazowych sterylnych przewodów, silikonowej osłony grzewczej do precyzyjnej i stabilnej kontroli temperatury, monitorowania w czasie rzeczywistym i systemu alarmowego z przechowywaniem i zarządzaniem danymi oraz użyciem specjalnego cewnika dożylnego, który umożliwia ciągłą perfuzję podczas nakłuwania żyły wrotnej podczas kaniulacji. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, jesteśmy pierwszą grupą, która połączyła wszystkie te cechy w zintegrowany system perfuzyjny (IPS), który jest kompaktowy, dzięki czemu jest wysoce przenośny i można go zmieścić w okapie z przepływem laminarnym, aby zapewnić aseptyczną pracę.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury oraz warunki utrzymania zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami nr R15-0027 i R19-0669, zgodnie z wymogami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Narodowego Uniwersytetu Singapurskiego.
1. Przygotowanie roztworów i instrumentów chirurgicznych
- Przygotować bufory i pożywki do hodowli komórkowych wymienione w Tabeli 1, używając wody ultrapure.
- Przed użyciem podgrzać bufor wolny od wapnia oraz bufor z kolagenazą do 37 °C w łaźni wodnej.
- Zautoklawować następujące instrumenty chirurgiczne i sprzęt laboratoryjny: parę ostro-tępych nożyczek chirurgicznych, parę tępo-tępych nożyczek chirurgicznych, parę zakrzywionych nożyczek chirurgicznych, dwie pary pincetek ząbkowo-tkankowych, dwie pary pincetek zakrzywionych, dwa klipsy naczyniowe, jedwabną nici chirurgiczną 3-0 o długości 5 cm, filtr z siatki nylonowej o oczkach 100 µm, zlewkę 400 mL oraz statyw (pływający statyw do probówek mikrocentryfużowych).
2. Konfiguracja systemu IPS (patrz Rycina 1)
- Przetrzeć komorę z laminarnym przepływem powietrza 70% etanolem. Przetrzeć system IPS 70% etanolem i umieścić go w komorze. Sterylizować promieniowaniem UV przez >15 min przed włączeniem komory.
UWAGA: Ekspozycja na światło UV może spowodować bolesne oparzenia oczu i skóry. Upewnić się, że szyba ochronna jest całkowicie zamknięta podczas włączonego światła UV. - Zamontować nowy zestaw jednorazowych przewodów w systemie IPS. Owinąć przewody za pompą perystaltyczną silikonową kurtką grzewczą. Zamontować monitor perfuzji na przewodach za silikonową kurtką grzewczą.
- Upewnić się, że zaciski rolkowe obu wlotów przewodów są całkowicie poluzowane. Podłączyć każdy wlot przewodu do stożkowego końca sterylnej pipety aspiracyjnej o pojemności 2 mL. Pozostawić obie pipety aspiracyjne (wloty) oraz cewnik do infuzji (wylot) w butelce o pojemności 1 L z buforem wolnym od wapnia, aby umożliwić recyrkulację buforu podczas kolejnych etapów przygotowania układu.
Rycina 2: Interfejs autotestu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
- Włącz system IPS. Wykonaj następujące operacje na panelu sterowania z ekranem dotykowym. Oprogramowanie przeprowadzi kompleksowy autotest przy każdym uruchomieniu.
UWAGA: System IPS jest urządzeniem elektrycznym podłączonym do zewnętrznego źródła zasilania. Rozlanie cieczy na system IPS lub kable zasilające może stwarzać zagrożenie porażeniem prądem.- Upewnij się, że na ekranie wyświetla się status autotestu (Rycina 2). Komponenty, które przeszły autotest, zostaną wyświetlone na zielono; te, które go nie przeszły, na czerwono. Po usunięciu usterki dotknij ikony Testing, aby powtórzyć autotest, lub dotknij ikony Enter System, aby przejść bezpośrednio do interfejsu operacyjnego.
- Dotknij dowolnego miejsca na ekranie, aby zalogować się do interfejsu operacyjnego.
- W lewym górnym rogu interfejsu operacyjnego (Rycina 3) dotknij jednej z ikon z okrągłą strzałką, aby ustawić kierunek obrotu pompy perystaltycznej. W prawym panelu interfejsu dotknij ikon strzałek w górę/dół, aby ustawić wartości odpowiadających parametrów. Ustaw przepływ w trybie stałego przepływu (constant flow mode), temperaturę płaszcza grzejnego na 42 °C (należy ją dostosować tak, aby temperatura perfuzatu była utrzymywana na poziomie 37 °C), a prędkość pompy na 38 rpm, aby uzyskać natężenie przepływu ~33 mL/min.
- W prawym dolnym panelu interfejsu operacyjnego sprawdź stan alarmu pęcherzyków powietrza (bubble alarm), alarmu zatrzymania perfuzji (perfusion stop alarm) oraz ikonę wyciszenia.
- Sprawdź temperaturę, ciśnienie i natężenie przepływu perfuzatu w lewym panelu. Ręcznie ustaw przedziały, klikając strzałki w górę i w dół na górze i na dole kolumn. Sprawdź dane w czasie rzeczywistym wyświetlane jako wartości w środku kolumn. Kolor kolumny zmieni się z zielonego na czerwony, jeśli dane w czasie rzeczywistym wyjdą poza ustawiony zakres.
- Zlokalizuj w środkowym panelu ikony startu, pauzy i zatrzymania perfuzji oraz ikonę przełączania z wyświetlania danych w czasie rzeczywistym na tryb wykresu. Dotknij ikony startu, aby rozpocząć perfuzję i napełnić przewody buforem bez wapnia. Zostanie utworzony nowy dziennik. Wprowadź nazwę pliku i nazwę użytkownika w oknie pop-up (Rycina 4).
Rycina 3: Interfejs operacyjny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 4: Okno wyskakujące z prośbą o podanie nazwy pliku i nazwy użytkownika. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.
- Napełnij komorę kropelkową do połowy. Podczas przygotowania układu upewnij się, że w przewodach nie pozostały pęcherzyki powietrza.
- Usuń wszelkie pęcherzyki, które utworzą się za filtrem pęcherzykowym, delikatnie uderzając w przewód, aby odczepić pęcherzyk i pozwolić na jego wypłukanie.
UWAGA: W miarę ogrzewania buforu przez płaszcz grzejny w przewodach mogą tworzyć się pęcherzyki powietrza. - Napełnij zlewkę o pojemności 400 mL ilością 200 mL buforu z kolagenazą. Umieść platformę na zlewce. Bez wprowadzania powietrza do przewodów, całkowicie dokręć zacisk rolkowy jednego z wlotów przewodów i przenieś pipetę aspiracyjną tego wlotu do zlewki.
3. Procedura z użyciem zwierząt
- Przygotować młodego dorosłego samca szczura szczepu Wistar o masie ciała około 200-300 g.
UWAGA: Protokół ten został zoptymalizowany dla szczurów o masie ciała około 200-300 g. Preferowane są samce, ponieważ zmiany hormonalne podczas cyklu rujowego u samic wpływają na funkcję hepatocytów. - Znieczulenie
- Nabrać wymaganą objętość przeciwzakrzepowej heparyny (5 000 IU/mL; 0,2 mL/100 g masy ciała) oraz koktajlu znieczulającego dla szczurów z ketaminą i ksylazyną (37,5 mg/mL ketaminy, 5 mg/mL ksylazyny; 0,2 mL/100 g masy ciała) do strzykawek 1 mL z igłą 27 G.
OSTROŻNIE: Środki znieczulające i heparyna są substancjami szkodliwymi. Należy zachować ostrożność podczas pracy z przedmiotami ostrymi. - Utrzymać szczura w unieruchomieniu. Wstrzyknąć heparynę, a następnie koktajl ketaminy/ksylazyny do dolnego prawego kwadrantu brzucha drogą dosytroniczną.
UWAGA: Ślepa kiszka ma większą prawdopodobieństwo znajdowania się po lewej stronie. Należy unikać nakłucia ślepej kiszki podczas wstrzykiwania, aby zmniejszyć ryzyko kontaminacji. - Po 10 min sprawdzić głębokość znieczulenia poprzez ocenę odruchu stopowego w obu łapach szczura. Kontrolować stan znieczulenia w odstępach czasu i czekać, aż szczur przestanie reagować na uszczypnięcia palców. W razie potrzeby można podać dodatkową dawkę znieczulenia.
- Nabrać wymaganą objętość przeciwzakrzepowej heparyny (5 000 IU/mL; 0,2 mL/100 g masy ciała) oraz koktajlu znieczulającego dla szczurów z ketaminą i ksylazyną (37,5 mg/mL ketaminy, 5 mg/mL ksylazyny; 0,2 mL/100 g masy ciała) do strzykawek 1 mL z igłą 27 G.
- Umieścić szczura w pozycji na plecach z wyprostowanymi kończynami na platformie polistyrenowej pokrytej folią aluminiową, umieszczonej na tacy. Przykleić łapy szczura taśmą i przymocować taśmę bezpiecznie do platformy za pomocą igieł 27 G.
- Zdezynfekować klatkę piersiową i brzuch, spryskując i obficie zwilżając je 70% etanolem. Golenie przed dezynfekcją jest opcjonalne. Umieścić szczura w dygestorium. Przejść do następnego kroku, gdy futro jest jeszcze mokre.
UWAGA: Obfite zwilżanie 70% etanolem minimalizuje również ilość łupieżu i pyłu z futra. - Oddzielić skórę od mięśni.
- Za pomocą pęsety z ząbkami w jednej ręce unieść skórę w pobliżu podstawy brzucha. Za pomocą ostro-tępych nożyczek chirurgicznych w drugiej ręce przeciąć uniesioną skórę. Wsunąć ostry koniec nożyczek pod skórę i wykonać cięcie wzdłuż linii środkowej od miejsca tuż nad tylnymi kończynami do miejsca tuż poniżej przednich kończyn.
- Podczas podciągania i lekkiego rozciągania skóry pęsetą, przeciąć wszelką tkankę łączną mocującą skórę do mięśni klatki piersiowej i brzucha. Aby zmniejszyć ryzyko kontaminacji, należy zapobiegać wpadaniu luźnego futra na mięśnie. W celu usunięcia nagromadzonego luźnego futra z nożyczek, należy je wytrzeć o zdezynfekowaną zewnętrzną stronę skóry.
- Wykonać cięcia poprzeczne skóry, od linii środkowej na obie strony szczura, nieco powyżej tylnych kończyn i nieco poniżej przednich kończyn. Odsunąć płaty skóry na boki, aby odsłonić mięśnie.
- Przeciąć mięśnie brzucha, aby odsłonić narządy.
- Za pomocą nowej pęsety z ząbkami w jednej ręce unieść mięsień w pobliżu podstawy brzucha. Za pomocą tępo-tępych nożyczek chirurgicznych w drugiej ręce ostrożnie przeciąć mięsień, uważając, aby nie uszkodzić żadnego z narządów. Wykonać cięcie wzdłuż linii środkowej mięśnia od miejsca nieco powyżej tylnych kończyn do mostka.
- Wykonać cięcia poprzeczne mięśnia, od linii środkowej na obie strony szczura, nieco powyżej tylnych kończyn i tuż poniżej klatki piersiowej, nie uszkadzając żadnego z narządów. Odsunąć płaty mięśni na boki, aby odsłonić narządy. Upewnić się, że poprzeczne cięcia skóry i mięśni sięgają boków szczura, aby umożliwić wypływ krwi i buforów z jamy brzusznej w późniejszych etapach.
- Kaniulacja żyły wrotnej
- Grzbietem zakrzywionej pęsety delikatnie odsunąć jelita w prawo. Delikatnie unieść płaty wątroby, aby odsłonić żyłę wrotną.
- Użyć jedwabnej nici chirurgicznej 3-0, aby wykonać bardzo luźną ligaturę wokół żyły wrotnej blisko wątroby, tuż przed rozgałęzieniem żyły na lewy i prawy płat wątroby. Nie zaciskać ligatury, aby nie zakłócić przepływu krwi przez żyłę wrotną. Przed przejściem nici pod żyłę i zapętleniem jej wokół żyły wrotnej (i przewodu żółciowego), konieczne będzie przebicie bardzo cienkiej błony pod przewodem żółciowym końcem zakrzywionej pęsety.
- Używając końcówek dwóch zakrzywionych pęset, ostrożnie wykonać otwór w tkance pod żyłą wrotną, nie uszkadzając samej żyły. Należy to zrobić około 2-3 cm powyżej pierwszej ligatury, tuż przed odgałęzieniem żyły żołądkowej od żyły wrotnej. Tkanka w tym konkretnym miejscu jest cieńsza.
- Ostrożnie rozszerzyć otwór za pomocą pęsety. Otwór ten pozwoli pęsecie na podtrzymanie żyły wrotnej podczas kaniulacji.
- Zmniejszyć prędkość pompy do 4 rpm, aby uzyskać przepływ ~3 mL/min. Upewnić się, że wypływ buforu wolnego od wapnia z cewnika IV został zredukowany do powolnego kapania.
UWAGA: Wzrost ciśnienia w wątrobie spowoduje śmierć hepatocytów. Niższy przepływ powinien spowolnić wzrost ciśnienia w wątrobie po pomyślnym wprowadzeniu kaniuli do żyły wrotnej w kolejnym kroku. - Delikatnie podtrzymać żyłę wrotną za pomocą pęsety. Drugą ręką trzymać cewnik IV z szydłem igły skierowanym do góry. Wprowadzić igłę do żyły wrotnej pod kątem 10-20° i powoli posuwać, aż całe szydło znajdzie się wewnątrz żyły. Po prawidłowym wprowadzeniu igły do żyły wrotnej wątroba zacznie blednąć i stracić ciemnoczerwony kolor.
UWAGA: Całe szydło igły musi zostać wprowadzone do żyły, aby stworzyć otwór wystarczająco duży do wprowadzenia kaniuli. Jednak nie należy wprowadzać igły zbyt głęboko, aby uniknąć przebicia żyły na wylot. - Wsunąć kaniulę po igle do wnętrza żyły. Następnie wycofać igłę, aż znajdzie się 2-3 mm za kaniulą; na tyle, aby ostry koniec był bezpiecznie wewnątrz kaniuli. Użyć kciuka i palca środkowego do trzymania cewnika, a palca wskazującego do odciągnięcia skrzydełka w celu wycofania igły.
- Szybko przymocować żyłę wrotną do cewnika za pomocą klipsa naczyniowego. Nie zakładać klipsa bezpośrednio na otwór boczny igły, aby nie zakłócić przepływu perfuzatu; założyć go poniżej.
- Natychmiast przeciąć podwątrobowy odcinek żyły głównej dolnej (IVC), aby zapobiec wzrostowi ciśnienia w wątrobie. Do tego czasu podwątrobowy odcinek IVC i sąsiednie naczynia krwionośne będą przesłonięte krwią z żyły wrotnej. Aby upewnić się, że IVC została prawidłowo przecięta i przerwana, należy obserwować pulsacyjne tryskanie krwi; z sąsiednich naczyń krew będzie jedynie wyciekać.
UWAGA: Zbyt długie oczekiwanie z przecięciem podwątrobowego odcinka IVC po kaniulacji lub brak jego przecięcia przed przejściem do następnego kroku spowoduje śmierć hepatocytów. Zwierzę zostaje uśmiercone pod znieczuleniem poprzez upuszczenie krwi (poprzez przecięcie IVC) podczas tego etapu. Procedurę należy kontynuować podczas trwającej utraty krwi. Śmierć można potwierdzić poprzez wizualną obserwację ustania akcji serca/oddechu po otwarciu klatki piersiowej w późniejszym etapie. - Zwiększyć prędkość pompy do 38 rpm, aby uzyskać przepływ ~33 mL/min. Przepłukać wątrobę trzy razy, zamykając IVC pęsetą na 2-3 s (ale nie na zbyt długo) i ponownie ją otwierając.
UWAGA: Podczas płukania wątroba nieco zwiększy swoją objętość, zanim wróci do normy. Płukanie ułatwia przenikanie perfuzatu przez całą wątrobę. Po płukaniu wątroba powinna mieć całkowicie jasnobrązowy kolor. - Upewnić się, że końcówka kaniuli znajduje się przed punktem rozgałęzienia żyły wrotnej na poszczególne płaty wątroby, aby zapewnić perfuzję wszystkich płatów. W razie potrzeby odpiąć żyłę wrotną i skorygować położenie kaniuli, a następnie ponownie ją przypiąć.
- Zacisnąć luźną ligaturę wokół żyły wrotnej, nieco powyżej punktu rozgałęzienia. Zawiązać trzy węzły w miejscu, gdzie miękka kaniula jest podparta przez twardą metalową igłę, pomiędzy szydłem a otworem bocznym. Upewnić się, że węzły unieruchamiają kaniulę, mocując ją do żyły wrotnej i zapobiegając cofaniu się buforów.
- Wyciąć całą wątrobę w całości.
- Perfuzować wątrobę buforem wolnym od wapnia z przepływem ~33 mL/min przez kolejne 12 min (patrz Rycina 5A). W międzyczasie przeprowadzić resekcję wątroby. Czas perfuzji można wydłużyć w razie potrzeby, ale należy upewnić się, że bufor wolny od wapnia się nie wyczerpie.
- Za pomocą zakrzywionych nożyczek ostrożnie oddzielić żyłę wrotną od jelit, przecinając krezkę, która je łączy. Nie uszkodzić przewodu pokarmowego (przełyku, żołądka oraz jelit cienkich i grubych), aby zapobiec kontaminacji.
UWAGA: Ma to na celu zapobieganie rozerwaniu żyły wrotnej podczas przemieszczania wątroby w trakcie resekcji. - Oddzielić wątrobę od przewodu pokarmowego, przecinając tkanki łączną, trzustkę i krezkę łączącą wątrobę z przewodem pokarmowym. Podczas oddzielania zawsze używać nożyczek i nie ciągnąć, aby nie rozerwać tkanek. Ponownie: nie uszkodzić i nie przeciąć przewodu pokarmowego.
- Delikatnie odchylić wątrobę w dół, aby odsłonić przeponę. Przeciąć przeponę wzdłuż ścian żeber. Upewnić się, że większość przepony pozostaje połączona z wątrobą. Uważać, aby nie nakłuć ani nie stłuczyć wątroby.
- Po otwarciu klatki piersiowej widoczne są dwa przewody: białawy nadwątrobowy odcinek IVC po lewej stronie i żółtawy przełyk po prawej stronie. Zapiąć nadwątrobowy odcinek IVC i przeciąć go tuż powyżej klipsa. Zapięcie nadwątrobowego odcinka IVC jest opcjonalne i zapobiega zalaniu jamy klatki piersiowej.
UWAGA: Wizualnie zaobserwować ustanie akcji serca/oddechu, aby potwierdzić śmierć zwierzęcia. - Przełyk jest otoczony przez przeponę. Aby odizolować przełyk od przepony, przeciąć przeponę od prawej strony w kierunku przełyku. Przeciąć wszelkie pozostałe tkanki łączna łączące przełyk i żołądek z wątrobą i przeponą.
- Odsunąć przewód pokarmowy w prawo. Przenieść klips naczyniowy z nadwątrobowego odcinka IVC na podwątrobowy odcinek IVC; bufor będzie teraz wypływać z nadwątrobowego odcinka IVC.
UWAGA: Podczas perfuzji kaniula i podwątrobowy odcinek IVC będą zakryte przez wątrobę. Silny wypływ buforu z nadwątrobowego odcinka IVC pomoże chirurgowi wykluczyć wycieki perfuzatu. - Przeciąć pozostałą część przepony łączącą wątrobę z klatką piersiową. Odciąć tkanki łączące wątrobę z jamą brzuszną. Uważać, aby nie przeciąć podwątrobowego odcinka IVC powyżej klipsa, aby uniknąć oddzielenia klipsa od wątroby.
- Aby upewnić się, że wątroba została całkowicie wycięta, ostrożnie unieść ją, trzymając przeponę pęsetą. Jeśli pozostały jakiekolwiek tkanki łączące wątrobę z jamą brzuszną, należy je odciąć. Jeśli nerka i śledziona są nadal połączone z wątrobą, należy je oddzielić.
4. Perfuzja i trawienie wątroby
- Jeśli resekcja została zakończona wcześniej, należy odczekać, aż wątroba będzie perfundowana buforem wolnym od wapnia przez 12 min.
- Zmienić bufor perfuzyjny na bufor z kolagenazą. Całkowicie poluzować zacisk rolkowy buforu z kolagenazą przed całkowitym dokręceniem zacisku rolkowego buforu wolnego od wapnia (patrz Rysunek 5B). Gdy bufor z kolagenazą dotrze do wątroby przez dreny, przepłukać wątrobę trzykrotnie, zamykając nadwątrobową część IVC na 2-3 s i ponownie ją otwierając.
- Ostrożnie przenieść wątrobę na podstawkę nad zlewem w celu recyrkulacji buforu z kolagenazą. Przenosić wątrobę, trzymając przeponę pęsetą i jednocześnie podtrzymując cewnik. Unikać szarpania za cewnik, aby zapobiec jego przypadkowemu odłączeniu.
UWAGA: Jeśli cewnik się odłączy, a żyła wrotna jest zbyt uszkodzona, aby można było ją ponownie zakanulować, należy zakanulować nadwątrobową część IVC i pozwolić buforowi wypływać przez żyłę wrotną. Należy upewnić się, że podwątrobowa część IVC pozostaje zaklamerowana. - Trawić wątrobę przez 12 min. Obserwować pojawianie się przeźroczystych plam/sieci w miarę jak wątroba traci swoją gładką, brązową teksturę. W miarę trawienia wątroba będzie stawać się większa i bardziej miękka. Gdy wątroba uzyska papkowatą konsystencję, należy zatrzymać perfuzję. W razie potrzeby czas trawienia można wydłużyć.
UWAGA: Jeśli torebka Glissona została przerwana, bufor z kolagenazą w zlewie może stać się mętny z powodu wydostania się komórek wątroby.
5. Izolacja hepatocytów
- Ostrożnie usuń kaniulę, odcinając żyłę wrotną. Ostrożnie zdejmij klips. Przenieś wątrobę do szalki 150 mm zawierającej 60 mL zimnego DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium).
- Delikatnie opukaj wątrobę grzbietem zakrzywionej pęsety, aby przerwać i oddzielić torebkę Glissona. Następnie delikatnie kołysz wątrobą na boki w DMEM, aby uwolnić komórki wątroby. Powtarzaj tę czynność, aż komórki wątroby zostaną całkowicie zdysocjowane do DMEM.
UWAGA: Czasami cała wątroba lub niektóre jej płaty zostaną strawione tylko częściowo. Unikając zdrapywania wątroby, co doprowadziłoby do wymuszenia usunięcia i uszkodzenia niedysocjowanych hepatocytów, można uzyskać wyższą i bardziej powtarzalną żywotność komórek. - Delikatnie kołysz szalką 150 mm, aż komórki wątroby zostaną dobrze rozprowadzone w DMEM. Aby usunąć fragmenty tkanki i aglomeraty komórkowe, przelej zawiesinę komórkową przez nylonowy filtr siatkowy o rozmiarze oczek 100 μm umieszczony nad nową szalką 150 mm. Przepłucz starą szalkę 30 mL DMEM i przenieś zawiesinę na filtr siatkowy. Delikatnie opukaj filtr siatkowy, aby umożliwić przejście uwięzionych pojedynczych komórek wątroby.
- Usuń filtr siatkowy i delikatnie kołysz nową szalką 150 mm, aż komórki wątroby zostaną dobrze rozprowadzone. Podziel zawiesinę równo do 4 probówek o pojemności 50 mL. Przepłucz szalkę 30 mL DMEM i podziel zawiesinę równo do tych samych probówek. Upewnij się, że każda probówka zawiera taką samą objętość zawiesiny komórkowej.
- Wirowarkuj 4 probówki z zawiesiną komórkową o pojemności 50 mL przy 50 x g przez 2 min w 4 °C. Ostrożnie odessij nadsącz, nie naruszając luźnego osadu. Usuń nadsącz. Dodaj 20 mL DMEM do każdej probówki i delikatnie kołysz probówkami, aby resuspendować osad komórkowy. Połącz zawiesinę komórkową z czterech probówek do dwóch.
- Wirowarkuj 2 probówki o pojemności 50 mL przy 20 x g przez 2 min w 4 °C. Odessij i usuń nadsącz. Dodaj 20 mL DMEM do każdej probówki i delikatnie kołysz probówkami, aby resuspendować osad komórkowy. Połącz zawiesinę komórkową z dwóch probówek do jednej. Przechowuj komórki w lodzie do czasu użycia.
- Przygotuj roztwór błękitu trypanu, mieszając 400 μL 1x PBS z 50 μL błękitu trypanu. Dodaj 50 μL zawiesiny hepatocytów do roztworu błękitu trypanu. Policz liczbę żywych i martwych hepatocytów za pomocą hemocytometru pod mikroskopem świetlnym.
6. Hodowla hepatocytów
- Wszystkie etapy hodowli komórkowej należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Do szalki 35 mm dodać 1 mL roztworu powlekającego z kolagenu i inkubować przez 4 h. Szalki przepłukać trzykrotnie 1x PBS.
- Zawiesinę hepatocytów rozcieńczyć w pożywce do hodowli hepatocytów do stężenia 0,8 miliona komórek/mL. Do szalki 35 mm dodać 1 mL rozcieńczonej zawiesiny hepatocytów.
UWAGA: Hepatocyty są wrażliwe na naprężenia ścinające podczas pipetowania. Zaleca się stosowanie końcówek do pipet o szerokim otworze. - Delikatnie kołysać szalką, aby równomiernie rozmieścić hepatocyty. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 3-4 h, aby umożliwić adhezję hepatocytów.
- W przypadku hodowli typu sandwich:
- Usunąć pożywkę do hodowli hepatocytów. Przepłukać raz 1 mL pożywki do hodowli hepatocytów, aby usunąć nieprzytwierdzone komórki. Dodać 1 mL roztworu nakładki kolagenowej. Roztwór nakładki kolagenowej nanosić po ściankach szalki, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza do roztworu.
- Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc w celu żelowania kolagenu.
- Dodać 1 mL świeżej pożywki do hodowli hepatocytów. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2.
- W przypadku hodowli monowarstwowej:
- Po kroku 6.3 usunąć pożywkę do hodowli hepatocytów. Przepłukać raz 1 mL pożywki do hodowli hepatocytów, aby usunąć nieprzytwierdzone komórki.
- Dodać 1 mL świeżej pożywki do hodowli hepatocytów. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2.
- Ocenić czystość i funkcjonalność hepatocytów, wykonując barwienie immunocytochemiczne w kierunku markerów specyficznych dla hepatocytów oraz testy funkcjonalne zgodnie z wcześniejszym opisem10,11.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Chirurg może ocenić, czy perfuzja wątroby przebiega prawidłowo, obserwując wyniki po określonych etapach. Pierwszy efekt można zaobserwować po kaniulacji, przecięciu podwątrobnego odcinka żyły głównej dolnej (IVC) i przywróceniu szybkości przepływu perfuzji. Wątroba powinna całkowicie zmienić kolor z ciemnoczerwonego na brązowy, zachowując jednocześnie swoją objętość. Jeśli wątroba wydaje się lekko zapadnięta i ma czerwonawy odcień lub czerwone plamy, oznacza to, że szybkość przepływu perfuzji została ustawiona błędnie (...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Jest kilka punktów, które są szczególnie ważne do przestrzegania w przypadku dwuetapowej procedury perfuzji kolagenazy w ogóle. Po pierwsze, należy zachować szczególną ostrożność podczas resekcji wątroby. Upewnij się, że przewód pokarmowy nie jest uszkodzony, ponieważ wyciek zawartości spowoduje zanieczyszczenie bakteryjne. Ponadto należy unikać uszkodzenia kapsułki Glissona, która pokrywa powierzchnię wątroby podczas zabiegu na zwierzętach. Jeśli rozdarcie jest wystarczająco duże, może to pozwolić na przedwczesne uwolni...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Zhou Yan i Hanry Yu deklarują konkurencyjne interesy, ponieważ posiadają udziały w firmie Vasinfuse, która produkuje i sprzedaje Zintegrowany System Perfuzji. Hanry Yu posiada udziały w Histoindex, Invitrocue, Osteopore, Pishon Biomedical, Ants Innovate i Synally Futuristech, które nie mają konkurencyjnych interesów w stosunku do przedstawionych tutaj informacji.
Podziękowania
Ta praca jest częściowo wspierana przez MOE ARC (MOE2017-T2-1-149); Dotacja NUHS Innovation Seed Grant 2017 (NUHSRO/2017/051/InnovSeed/02); Instytut Mechanobiologii w Singapurze (R-714-106-004-135); oraz Instytut Bioinżynierii i Nanotechnologii, Rada ds. Badań Biomedycznych, Agencja ds. Nauki, Technologii i Badań (A*STAR) (numery projektów IAF-PP H18/01/a0/014, IAF-PP H18/01/a0/K14 i MedCaP-LOA-18-02) finansowanie dla Hanry Yu. Ng Chan Way jest pracownikiem naukowym Narodowego Uniwersytetu Singapuru. Chcielibyśmy podziękować Zakładowi Mikroskopii Konfokalnej i Zarządowi Cytometrii Przepływowej Narodowego Uniwersytetu Singapuru za pomoc i porady w analizie czystości hepatocytów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Materiał/Sprzęt | |||
| 1 mL strzykawka | Igła Nipro | ||
| 27G | Nipro | ||
| pleciony jedwabny niewchłanialny, niesterylny szew chirurgiczny | Look | SP117 | |
| Kleszczyki ze stali nierdzewnej Bochem 18/10, ostra końcówka zawiera wygiętą okrągłą końcówkę | Bochem | 10333511 | |
| Jednorazowy zestaw perfuzyjny | Vasinfuse | BPF-112 | |
| Pływający okrągły stojak na probówki do mikrowirówek 1,5 ml | Sigma-Aldrich | R3133 | |
| Niemieckie standardowe kleszczyki do tkanek, ząbkowane / 1 i razy; 2 zęby, pipeta aspiracyjna 14,5 cm | Walentech | ||
| Greiner Cellstar | Merck | GN710183 | |
| Hemocytometr | |||
| Zintegrowany system perfuzyjny | Vasinfuse | IPS-001 | |
| Nożyczki do tęczówki zakrzywione, nierdzewne, 11 cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | CVD | |
| Light z soczewką | 10XArkusz siatki Olympus | ||
| 100µ M Nylon | Spectra-Teknic(s) Pte Ltd | 06630-75 | |
| Nożyczki operacyjne, BL/BL, 13cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | STR – Nożyczki operacyjne BL/BL | |
| , SH/BL, 13cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | STR – SH / BL | |
| Klips hemostatyczny o odwrotnej sile | Shanghai Jin Zhong Pte Ltd | XEC230 | |
| Kąpiel wodna | Grant | ||
| Odczynniki/Chemikalia | |||
| 10X Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS) | Sigma-Aldrich | ||
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Sigma-Aldrich | A9056 | |
| CaCl2· 2H2O | Merck | 137101 | |
| Kolagenaza typu IV | Gibco | 17104019 | |
| Deksametazon | TCI | D1961 | |
| DMEM | Gibco | 31600-034 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Invitrogen | 11344-041 | |
| Insulina | Sigma-Aldrich | 1-9278 | |
| KCl | VWR | VWRC26764.298 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Kwas linolowy | Sigma-Aldrich | L9530 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NaOH | Merck | 106462 | |
| Penicylina-Streptomycyna | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Kolagen bydlęcy typu I | Zaawansowany BioMatrix | 5005-100ml | |
| William' s E Media | Sigma-Aldrich | W1878 |
Bibliografia
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. H., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917(2012).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993(2018).
- Green, C. J., et al. The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus. Cell and Tissue Banking. 18 (4), 597-604 (2017).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3138(2011).
- Wen, J. W., Olsen, A. L., Perepelyuk, M., Wells, R. G. Isolation of rat portal fibroblasts by in situ liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3669(2012).
- Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60501(2019).
- Shi, W., et al. Isolation and purification of immune cells from the liver. International Immunopharmacology. 85 (95), 106632(2020).
- Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive L-azidohomoalanine labeling method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323(2018).
- Xia, L., et al. Tethered spheroids as an in vitro hepatocyte model for drug safety screening. Biomaterials. 33 (7), 2165-2176 (2012).
- Kegel, V., et al. Protocol for isolation of primary human hepatocytes and corresponding major populations of non-parenchymal liver cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53069(2016).
- Zhu, L., et al. A vertical-flow bioreactor array compacts hepatocytes for enhanced polarity and functions. Lab on a Chip. 16 (20), 3898-3908 (2016).
- Du, Y., et al. Synthetic sandwich culture of 3D hepatocyte monolayer. Biomaterials. 29 (3), 290-301 (2008).
- Tong, W. H., et al. Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture. Biomaterials. 80, 106-120 (2016).
- Xia, L., et al. Laminar-flow immediate-overlay hepatocyte sandwich perfusion system for drug hepatotoxicity testing. Biomaterials. 30 (30), 5927-5936 (2009).
- Gupta, K., et al. Bile canaliculi contract autonomously by releasing calcium into hepatocytes via mechanosensitive calcium channel. Biomaterials. 259, 120283(2020).
- Horner, R., et al. Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes. Scientific Reports. 9 (1), 6542(2019).
- Osypiw, J. C., et al. Subpopulations of rat hepatocytes separated by Percoll density-gradient centrifugation show characteristics consistent with different acinar locations. The Biochemical Journal. 304, Pt 2 617-624 (1994).
- Beal, E. W., et al. A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541(2018).
- Hillebrandt, K., et al. Procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), e53029(2015).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
