Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pomiar wychwytu glutaminianu za pomocą znakowanego radioaktywnie L-[3H]-glutaminianu w ostrych poprzecznych wycinkach uzyskanych z hipokampa wyciętego przez gryzonie

846 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62292

⸱

2 października 2021

 ,  ,  , 
1Graduate Program in Biochemistry, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2Department of Biochemistry, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 3Department of Biological Sciences, Universidade Federal de Ouro Preto, 4Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje niezawodny i prosty sposób na uzyskanie ex vivo ostrych przekrojów poprzecznych hipokampa od myszy i szczurów za pomocą rozdrabniacza tkanek. Wycinki uzyskane z wyciętych hipokampów można przesłać do funkcjonalnej analizy wychwytu glutaminianu w celu zbadania homeostazy układu glutaminergicznego.

Streszczenie

Usuwanie glutaminianu z przestrzeni pozakomórkowej przez transportery zależne od Na+ o wysokim powinowactwie jest niezbędne do zapewnienia prawidłowego działania wewnętrznych mechanizmów połączeń w mózgu i utrzymania homeostazy. Hipokamp jest unikalną strukturą mózgu, która zarządza wyższymi funkcjami poznawczymi i jest przedmiotem kilku badań dotyczących chorób neurologicznych. Badanie mechanizmów fizjologicznych i patologicznych w modelach gryzoni może przynieść korzyści dzięki preparatom z ostrego plastra hipokampa (AHS). AHS ma tę zaletę, że dostarcza wiarygodnych informacji na temat funkcji komórek, ponieważ zachowana jest cytoarchitektura i obwody synaptyczne. Chociaż preparaty AHS są powszechnie stosowane w laboratoriach neurochemicznych, w literaturze można znaleźć pewne różnice metodologiczne. Biorąc pod uwagę, że charakterystyczne protokoły przygotowania plastrów mogą zmieniać analizowane regiony hipokampa, obecny protokół proponuje standardową technikę uzyskiwania poprzecznego AHS z wyciętego hipokampa. Ten prosty do wykonania protokół może być stosowany w modelach eksperymentalnych myszy i szczurów i pozwala na kilka podejść ex vivo badających dynamikę neurochemiczną (w hipokampie grzbietowym, pośrednim i brzusznym) na różnych tłach (np. manipulacje transgeniczne) lub po manipulacjach in vivo (np. leczenie farmakologiczne lub odpowiednie modele gryzoni do badania zaburzeń klinicznych). Po wypreparowaniu hipokampa z mózgu gryzonia uzyskano poprzeczne warstwy wzdłuż osi przegrodowo-skroniowej (o grubości 300 μm). Te AHS zawierają odrębne części hipokampa i zostały poddane indywidualnemu badaniu neurochemicznemu (na przykład: transportery neuroprzekaźników przy użyciu odpowiednich substratów). Ponieważ hipokamp charakteryzuje się dużą gęstością synaps pobudzających, a glutaminian jest najważniejszym neuroprzekaźnikiem w mózgu, układ glutaminergiczny jest interesującym celem dla zjawisk obserwowanych in vivo. W związku z tym obecny protokół zawiera szczegółowe kroki w celu zbadania wychwytu glutaminianu w AHS ex vivo przy użyciu L-[3H]-glutaminianu. Wykorzystanie tego protokołu do zbadania funkcji hipokampa może pomóc w lepszym zrozumieniu wpływu metabolizmu glutaminianu na mechanizmy neuroprotekcji lub neurotoksyczności.

Wprowadzenie

Hipokamp, struktura mózgu ukryta głęboko w przyśrodkowym płacie skroniowym każdej półkuli, gdzie znajdują się wysokie funkcje poznawcze, jest jednym z najlepiej zbadanych podmiotów ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Funkcja hipokampa jest silnie związana z pamięcią deklaratywną i przestrzenną. Struktura ta odgrywa również rolę w zachowaniu emocjonalnym i regulacji funkcji podwzgórza1,2,3,4. Odkąd zostało to potwierdzone, w tym regionie zachodzą ważne mechanizmy tworzenia i przechowywania pamięci, a dziedzina zaczęła dogłębnie badać region hipokampa. W związku z tym wykorzystanie modeli zwierzęcych, które przypominają ludzkie zaburzenia mózgowe związane z funkcjami hipokampa, takie jak choroba Alzheimera, padaczka, poważna depresja i stres, nadal rośnie.

U gryzoni hipokamp jest strukturą o zakrzywionym kształcie, zaczynającą się od blisko przegrody przyśrodkowej w kierunku brzusznej kory skroniowej. Wzdłuż swojej osi podłużnej hipokamp można podzielić na trzy różne regiony, z których każdy jest związany z określonym obwodem1. Górna część stanowi hipokamp grzbietowy/przegrodowy, dolna część stanowi hipokamp brzuszny/skroniowy, a obszar między nimi jest uważany za hipokamp pośredni. Istnieje obszerna literatura obejmująca różnice w projekcjach komórkowych dla każdej części, a także raporty dotyczące konkretnych aspektów poznawczych przetwarzanych przez each5,6. Jeśli chodzi o jego wewnętrzną organizację, regiony hipokampa można oddzielić obszarami funkcjonalnymi. Obszar Cornu ammonis (CA) jest podzielony na CA1, CA2 i CA3 i rozciąga się przez górną część hipokampa, powyżej zakrętu zębatego (DG) i subiculum, które są najbardziej wewnętrznymi częściami hipokampa (Ryc. 1). Synapsy zlokalizowane w tych regionach podlegają ciągłemu przegrupowaniu, wykazując procesy neurogenne i plastyczne przez całe życie3. Kilka badań wykazało już, że różne eksperymentalne manipulacje w hipokampie skutkują niepełnosprawnością poznawczą7. Jeśli chodzi o ocenę zmian biochemicznych i molekularnych, techniki wykorzystujące ostre wycinki mózgu są doskonałym narzędziem do poszerzania wiedzy na temat różnych aspektów hipokampa.

Ze względu na jego precyzję i powtarzalność, wiele badań, które badały aspekty zjawisk związanych z neurotransmisją (aktywność enzymów, wychwyt lub uwalnianie), wykorzystywało poprzeczne AHS z wyciętego hipokampa uzyskane przez rozdrabniacz tkanek8,9,10,11,12. Ta technika krojenia, po której następuje ocena absorpcji, jest odpowiednia dla wyrafinowanych eksperymentów neurochemicznych, które wymagają zachowania aktywności transportera z tkanki hipokampa. W tym celu preferowane jest użycie rozdrabniacza do tkanek, ponieważ jest on szybszy niż wibratomizm i dostarcza AHS w odpowiednim czasie do użytku eksperymentalnego z odpowiednią dokładnością.

Neurotransmisja pobudzająca w mózgu jest realizowana przez glutaminian, najobficiej występujący neuroprzekaźnik, w tym w hipokampie, który jest w większym stopniu zależny od sygnalizacji glutaminianu13,14. Ta obfitość neuroprzekaźników jest ściśle kontrolowana w środowisku zewnątrzkomórkowym. Wewnątrz pęcherzyków wewnątrzkomórkowych może jednak osiągnąć nawet 100 mM15. Po uwolnieniu w szczelinie synaptycznej glutaminian nie jest metabolizowany i musi zostać usunięty, aby uniknąć ekscytotoksyczności, zwykle wywoływanej w odpowiedzi na przeciążenie glutaminianem14,16. Jedynym mechanizmem oddzielającym toksyczność od normalnej sygnalizacji jest transport zależny od sodu poprzez aktywność białek znajdujących się w błonach plazmatycznych głównie komórek glejowych14,17,18,19. Te transportery [GLAST (EAAT1) i GLT-1(EAAT2)] ściśle regulują zewnątrzkomórkowy poziom glutaminianu i mogą być modulowane przez szeroki zakres czynników, takich jak transkrypcja DNA, splicing i degradacja mRNA, synteza i celowanie białek, aktywność transportu aminokwasów i aktywność kanałów jonowych20,21,22,23. W związku z tym ich aktywność można mierzyć poprzez transport substratu znakowanego radioaktywnie, takiego jak glutaminian.

Użycie radioznakowanych substratów stanowi preferowaną metodę ilościowego określania aktywności transportera, ponieważ pozwalają one na śledzenie dynamicznych mechanizmów, takich jak transport przez błony komórkowe. Oprócz wysokiej czułości i specyficzności, do zalet eksperymentów z radioznacznikami należy ich prostota i niewielki koszt w porównaniu z konkurencyjnymi technologiami, takimi jak spektrometria mas24. Ponadto, dzięki zastosowaniu tylko niewielkich ilości znacznika, fizjologiczne poziomy substratów nie ulegają zmianie, zapewniając w ten sposób bardziej reprezentatywny obraz rzeczywistego scenariusza aktywności metabolicznej.

Dostępność eksperymentalnych podejść ex vivo jest kluczowa dla wsparcia podstawowych badań nad identyfikacją nowych celów molekularnych i działań związanych z odkrywaniem leków. Tak więc, biorąc pod uwagę znaczenie wychwytu glutaminianu dla homeostazy układu glutaminergicznego i wysoką dominację synaps glutaminergicznego w hipokampie, protokół ten pokazuje, jak ocenić aktywność wychwytu glutaminianu w szybki i łatwy do odtworzenia sposób przy użyciu poprzecznego AHS z wyciętego hipokampa. Test ten wykorzystuje znakowany radioaktywnie L-[3H]-glutaminian, który pozwala na porównania ilościowe i przejrzystą wizualizację wyników, i może być modyfikowany do stosowania z określonymi lub niestandardowymi substratami, w szerokim zakresie warunków reakcji25.

Ostre wycinki mózgu mają wiele zalet i były używane do wspomagania zmiany funkcji w ramach manipulacji farmakologicznych i genetycznych26,27,28. Ich zastosowanie przynosi korzyści z następujących korzyści: (i) zachowania funkcjonalności neurochemicznej i interakcji międzykomórkowych; (ii) możliwość przeprowadzenia licznych manipulacji farmakologicznych i genetycznych w celu zbadania szlaków leżących u podstaw funkcji neuronalnych i glejowych; (iii) precyzyjna kontrola środowiska zewnątrzkomórkowego; oraz (iv) dobry dostęp eksperymentalny do różnych obszarów hipokampa (takich jak CA1, CA3 lub DG), które są trzymane w tym samym wycinku w zależności od metody krojenia. Biorąc pod uwagę, że charakterystyczne protokoły przygotowania plastrów mogą zmienić odsłonięte obszary hipokampa, protokół ten proponuje standardową technikę uzyskiwania poprzecznego AHS z wyciętego hipokampa. Ten prosty do wykonania protokół może być stosowany w modelach gryzoni i może pozwolić na kilka podejść ex vivo do badania dynamiki neurochemicznej w różnych tłach lub po manipulacjach in vivo29,30 (Rysunek 2).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury zostały wykonane zgodnie z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i zatwierdzone przez lokalną Komisję Etyki (zatwierdzenie projektu # 33732/CEUA-UFRGS). Dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować dyskomfort i liczbę zwierząt wykorzystywanych w eksperymentach.

1. Przygotowanie Zrównoważonego Roztworu Soli Hanka (HBSS)

  1. Do zlewki o pojemności 1 l dodaj około 0,5 l sterylnej lub podwójnie destylowanej wody i zacznij energicznie mieszać na mieszadle magnetycznym. Dodać następujące składniki HBSS (w mM): 137 NaCl, 0,63 Na2HPO4, 4,17 NaHCO3, 5,36 KCl, 0,44 KH2PO4, 0,41MgSO4, 0,49 MgCl2, 5,55 D-Glucose (patrz tabela 1).
  2. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaOH lub HCl przed dodaniem 1,26 mM CaCl2, aby uniknąć wytrącania się. Dodawaj tę sól bardzo powoli i pod wpływem mieszania. Doprowadzić do objętości 1 l sterylną lub podwójnie destylowaną wodą. Bufor ten zostanie wykorzystany do przemycia tkanki i utrzymania AHS w stanie zdolnym do życia podczas eksperymentu. Dostarczy jonów nieorganicznych przy jednoczesnym utrzymaniu fizjologicznego pH i ciśnienia osmotycznego.
    UWAGA: Dodawanie kationów dwuwartościowych odbywa się po miareczkowaniu pH, aby uniknąć wytrącania się.
  3. Oddziel dwie różne frakcje HBSS: jedna będzie przechowywana w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C i wykorzystana podczas paradygmatu absorpcji, podczas gdy druga będzie utrzymywana w lodowatym stanie (4 °C) i wykorzystana do płukania przed i po eksperymencie.
    UWAGA: Możliwe jest przygotowanie roztworów podstawowych każdej soli i przechowywanie ich w stanie zamrożonym do czasu użycia, przechowywanie w zamrażarce (-20 °C) i użycie w ciągu kilku tygodni.

2. Przygotowanie HBSS bez sodu

  1. Przed zmieszaniem składników do bezsodowego HBSS należy wcześniej przygotować dwa inne roztwory: Glukamina-HCl (137 mM) i Glukamina-HEPES (4,17 mM). Wymieszać równomolowe stężenia zasady NMDG i HCl, aby otrzymać roztwór glukaminy-HCl. Wykonaj tę samą procedurę z 2,0 M wolnym kwasem HEPES, aby otrzymać roztwór NMDG-HEPES (patrz Tabela 2).
  2. Do zlewki o pojemności 0,5 l dodaj około 0,2 l sterylnej lub podwójnie destylowanej wody i zacznij energicznie mieszać w mieszadle magnetycznym. Dodać następujące składniki buforowe (w mM): 137 Glukamina-HCl, 4,17 Glukamina-HEPES, 5,36 KCl, 0,44 KH2PO4, 1,26MgSO4, 0,41 MgCl2 i 5,55 D-glukoza (patrz Tabela 2).
  3. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą KOH lub HCl i kontynuuj mieszanie. Dodawać 1,26 mM CaCl2 bardzo powoli i pod wpływem mieszania. Doprowadzić roztwór do objętości 0,3 l sterylną lub podwójnie destylowaną wodą.
    UWAGA: Ten bufor będzie używany do pomiaru wychwytu glutaminianu niezależnego od sodu, co pozwoli na pomiar pasywnego/niespecyficznego wychwytu glutaminianu. Po eksperymencie parametr ten jest odejmowany od całkowitego wychwytu glutaminianu w celu określenia wychwytu zależnego od sodu.
  4. Po przygotowaniu bufor ten można umieścić w zamrażarce (-20 °C) i wykorzystać w kolejnych eksperymentach. To samo dotyczy rozwiązań NMDG.
  5. Podczas eksperymentu zawsze utrzymuj bezsodowy HBSS w lodowatej temperaturze.

3. Porządkowanie materiału do sekcji hipokampa od szczurów

  1. Zorganizuj obszar sekcji obok zlewu przed rozpoczęciem eksperymentu. Umieść specjalną gilotynę dla szczurów (dla myszy będzie można użyć ostrych nożyczek) w zlewie, aby utrzymać ławkę w czystości.
  2. Narzędzia chirurgiczne i inne materiały do usuwania mózgu i rozwarstwiania hipokampa należy ułożyć w kolejności użycia i jak najbliżej miejsca, w którym są potrzebne (patrz Tabela materiałów). Umieść szalkę Petriego w wiaderku z lodem. Trzymaj również w pobliżu plastikową torbę do wyrzucenia tuszy.
  3. Przygotować oba roztwory HBSS w zalecanym stężeniu do użycia. Bezsodowy HBSS można zamrozić i rozmrozić przed eksperymentem.
    1. Oddzielić HBSS zawierający sód na dwie odrębne porcje, zgodnie z wcześniejszymi zaleceniami: jedną podgrzaną w temperaturze 37 °C, a drugą w temperaturze 4 °C, która zostanie użyta do rozbioru materiału. Rozmrozić HBSS bez sodu i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. Aby wywołać znieczulenie, użyj 3% izofluranu31. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy sprawdzić, czy nie występuje odruch rogówkowy i stymulacja nocyceptywna tylnej łapy.
    UWAGA: Należy uważać, aby wybrać odpowiedni lek znieczulający, ponieważ nie powinien on kolidować z żadnymi parametrami, które będą badane. W przypadku tego protokołu zaleca się stosowanie wziewnego środka znieczulającego (np. izofluranu)32.

4. Eutanazja szczura

  1. Eutanazja gryzonia przy użyciu metod zatwierdzonych przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC), a także przez Przewodnik National Institutes of Health dotyczący opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych (Publikacje NIH nr 8023, poprawione w 1978 r.).
  2. Za pomocą gilotyny odetnij głowę szczura bezpośrednio przed pierwszym kręgiem szyjnym.
  3. Połóż głowę na czystym ręczniku papierowym zwilżonym zimnym roztworem soli fizjologicznej. Całkowicie usuń skórę głowy za pomocą nożyczek chirurgicznych w rozmiarze S, a także mięsień skórny, dążąc do pełnego odsłonięcia szwów na górnej powierzchni czaszki. Rozpocznij tę procedurę ostrożnie, zaczynając w pobliżu kości potylicznej i biegnąc do tyłu do kości nosowej.
    UWAGA: W przypadku, gdy modelem eksperymentalnym są myszy, użyj ostrych nożyczek, aby zdjąć głowę. Pamiętaj, aby ciąć tuż za czaszką, aby wykluczyć nadmiar tkanki.

5. Usunięcie mózgu szczura

  1. Usuń mózg tak szybko, jak to możliwe. Za pomocą odpowiednich szczypiec do kości wykonaj pojedyncze nacięcie między oboma otworami ocznymi łączącymi oba otwory w czaszce szczura. Następnie umieść jedną końcówkę nożyczek chirurgicznych w rozmiarze S w otworze wielkim i wykonaj pojedyncze nacięcie boczne w czaszce. Powtórz dla drugiej strony.
  2. Odetnij płytki czaszki od płytki potylicznej, następnie wzdłuż szwu środkowego płytek ciemieniowych, a na końcu do płytki czołowej w kierunku nosa. Upewnij się, że głowa gryzonia jest mocno trzymana, a nacisk jest kierowany z dala od mózgu, aby zapobiec uszkodzeniu tkanki pod spodem.
    UWAGA: Niezwykle ważne jest, aby nacisk był kierowany z dala od mózgu, aby zapobiec uszkodzeniu tkanki pod spodem. U młodych szczurów i myszy możliwe jest przecięcie czaszki małymi nożyczkami chirurgicznymi.
  3. Delikatnie usuń płytkę potyliczną i ciemieniową z obu półkul za pomocą szpatułki lub kleszczy. Dokładnie sprawdź, czy nie ma opony twardej, która może być przyczepiona do kości czaszki i rozciągnięta na powierzchni mózgu.
  4. Natychmiast usuń mózg cienką dwustronną szpatułką i delikatnie umieść cały mózg na lodowatej szalce Petriego pokrytej bibułą filtracyjną. Za pomocą plastikowej pipety Pasteura zwilż ją lodowatym roztworem soli fizjologicznej. Natychmiast zacznij preparować hipokampy z obu półkul mózgowych, jak wyjaśniono poniżej.
  5. Ostrożnie wytnij móżdżek z całego mózgu za pomocą ostrza skalpela #11. Aby całkowicie oddzielić półkule mózgowe, należy przeciągnąć ostrze skalpela przez szczelinę wewnątrzpółkulową. Za pomocą plastikowej pipety Pasteura często zwilżaj ją lodowatym buforem HBSS, aby tkanka była mokra i konserwowana.
  6. Weź każdą półkulę osobno, wytnij pień mózgu i śródmózgowie z leżącej nad nią kory za pomocą nożyczek Iris. Ostrożnie, nożyczkami chirurgicznymi przetnij pień mózgu/śródmózgowie/wzgórze, natomiast cienką szczoteczką dociśnij i pociągnij te struktury mózgu. Poniżej będzie można obserwować hipokamp (powierzchnię przyśrodkową) i komorę boczną. Kora z hipokampem powinna być teraz wolna od pnia mózgu.

6. Sekcja hipokampów od szczurów

  1. Aby wyciąć hipokamp, umieść jedną półkulę mózgu w płaszczyźnie koronalnej z korą ciemieniową skierowaną w dół. W tym momencie można zaobserwować białe włókna fimbrii, które tworzą płytką hiperbolę na dnie hipokampa.
  2. Bardzo ostrożnie, ręką niedominującą, zakotwicz tkankę mózgową cienką pęsetą. Dominującą ręką umieść drugą pęsetę pod ogonowym końcem hipokampa.
  3. Zakotwiczając przyśrodkowe drogi istoty białej, umieść pęsetę całkowicie pod hipokampem, aby delikatnie oddzielić go od reszty mózgu. Wywieraj nacisk, przesuwając drugą końcówkę lekko do przodu i na boki. Jeśli zostanie to zrobione prawidłowo, hipokamp powinien wylądować na bibule filtracyjnej.
  4. Aby zakończyć rozwarstwienie hipokampa, usuń zapasową tkankę za pomocą tej samej pęsety (zwykle pozostałą korę, naczynia krwionośne i istotę białą). Powtórz tę samą metodologię dla drugiej półkuli.
  5. Po usunięciu obu hipokampów przenieś je na szalkę Petriego z HBSS umieszczonym na wiadrze z lodem i przenieś na obszar stołu do krojenia powyżej ostrza w rozdrabniaczu tkanek. Upewnij się, że prawidłowo zidentyfikowałeś obszary grzbietowe i brzuszne, jeśli badanie wymaga ich osobnej analizy.
    UWAGA: Ważne jest, aby zawsze rozróżniać brzuszną i grzbietową część hipokampa podczas sekcji. W ten sposób przedni koniec będzie skierowany do góry33. Ta część hipokampa jest nieco cieńsza niż tylny koniec.

7. Przygotowanie plastrów

UWAGA: Podczas układania materiału chirurgicznego na stole (sesja 2), przygotuj rozdrabniacz do tkanek, aby uzyskać poprzeczny wycinek z wyciętego hipokampa.

  1. Ustaw parametry w rozdrabniaczu tkanek przed jego użyciem. Rozdrabniacz może ciąć plastry od 100 do 400 μm; Ustaw go na 300 μm. Dodatkowo zaleca się zakres 60-80 ruchów na minutę, ponieważ utrzymuje integralność tkanki podczas procedury krojenia.
  2. Po wszystkich procedurach wykonanych w sesji 2, po wycięciu hipokampów z mózgu i umieszczeniu ich na bibule filtracyjnej zwilżonej zimnym roztworem soli fizjologicznej na gładkim podłożu polipropylenowym, wyrównaj każdy hipokamp na bibule filtracyjnej przed poddaniem ich procedurze siekania.
  3. Umieść hipokamp na raz na okrągłym stole do cięcia ze stali nierdzewnej z rozdrabniacza tkanek, prostopadle do ostrzy tnących, aby uzyskać poprzeczne plastry hipokampa wzdłuż osi przegrodowo-skroniowej. Przed rozpoczęciem procesu siekania lekko nawilż ostrze alkoholem izopropylowym. Ta procedura zapobiega przywieraniu tkanki do ostrza, umożliwiając bardziej gładkie i precyzyjne krojenie.
  4. Po włączeniu sprzętu ostrze w ramieniu siekającym będzie podnoszone i opuszczane, krojąc tkankę na wybraną grubość. Jest to szybki proces i zwykle po minucie tkanka zostanie odpowiednio pokrojona. Możliwe jest siekanie więcej niż jednego hipokampa w tym samym czasie, jeśli są one odpowiednio oddzielone na stole do krojenia.
  5. Aby oddzielić plastry, należy ostrożnie pobrać każdą pokrojoną próbkę z rozdrabniacza tkanek za pomocą dwustronnej szpatułki i zanurzyć ją na szalce Petriego z lodowatym roztworem soli fizjologicznej. Za pomocą dwóch cienkich szczotek delikatnie uszczypnij hipokamp i oddziel plastry. Zachowaj ostrożność, aby zachować integralność plasterka w tym procesie.
    1. Przeprowadź ten eksperyment w trzech próbkach, a następnie wybierz 6 plasterków z każdej próbki: 3 plastry dla całkowitego wychwytu glutaminianu i 3 dla wychwytu niespecyficznego.
  6. Za pomocą szczoteczki delikatnie przenieś każdą plasterkę z płytki Petriego na 24-dołkową płytkę zawierającą: (i) 1 ml HBSS; oraz (ii) 1 ml HBSS bez sodu. Zidentyfikuj studzienkę/płytkę z odpowiednimi grupami doświadczalnymi i przeprowadź analizę co najmniej w trzech egzemplarzach.
    UWAGA: Ze względu na ograniczony czasowo problem, jeśli eksperyment jest przeprowadzany w trzech egzemplarzach, ogranicza liczbę zwierząt/grup do zaledwie 6 na raz (jeden hipokamp na zwierzę w ciągu 5 minut). Oznacza to, że L-[3H]-glutaminian będzie podawany co 15 sekund, aż wszystkie plastry zostaną inkubowane. Aby zatrzymać reakcję, należy zachować ten sam odstęp czasu, aby zapewnić, że wszystkie próbki są poddane 5-minutowemu okresowi inkubacji.

8. Test wychwytu glutaminianu

  1. Podczas stabilizacji plastrów w odpowiednim buforze (HBSS lub HBSS bez sodu) należy przygotować roztwór zawierający promieniowanie promieniotwórcze, rozcieńczając L-[3H]-glutaminian w sterylnej wodzie do końcowego stężenia 4,5 μCi/ml w końcowej objętości, która pozwala na 20 μL na plaster plus pewien nadmiar, co zapobiegnie brakowi radioaktywnego wkładu na końcu partii, ponieważ na początku konieczne będzie ilościowe określenie, ile rozpadów na minutę (DPM) zaoferowano każdemu wycinkowi.
    UWAGA: Dla każdej płytki 24-dołkowej zaleca się przygotowanie 500 μL 4,5 μCi/mL L-[3H]-glutaminianu ze względu na całkowity czas inkubacji potrzebny do wychwytu L-[3H]-glutaminianu (5 min) i czas pipetowania każdej podwielokrotności 20 μL (0,33 μCi w każdym dołku), jak wyjaśniono poniżej. Podstawowe stężenie L-[3H]-glutaminianu wynosi zwykle 1,0 mCi/ml, dlatego przygotuj rozcieńczenie 1:200 do nałożenia na plastry.
  2. Po 15 minutach wstępnej inkubacji w HBSS należy całkowicie usunąć bufor za pomocą pipety Pasteura i zastąpić go, dodając do plastrów 280 μl jednego z poniższych: (i) zwykłego HBSS (37 °C) dla całkowitego wchłonięcia; lub (ii) HBSS bez sodu (4 °C) dla niespecyficznego wychwytu. Ważne jest, aby pamiętać, że całkowity pobór musi być przeprowadzony na płycie grzewczej w temperaturze 37 °C, podczas gdy pobór niespecyficzny odbywa się na lodzie.
  3. Przygotuj jeden timer i ustaw początek eksperymentu, dodając 20 μl wkładu do pierwszego dołka zawierającego plasterek. Odczekaj 15 - 20 s (w zależności od liczby plasterków na płytce) i dodaj radioaktywny wkład do następnej studzienki i tak dalej, aż do końca studzienek zawierających plasterki. Rozprowadzić 20 μl materiału wejściowego we wszystkich studzienkach, zawsze biorąc pod uwagę całkowity czas inkubacji (5 min).
  4. Po napełnieniu każdej z studzienek zawierających plastry na płytce, poczekaj, aż pierwszy plasterek zakończy 5-minutową inkubację z L-[3H]-glutaminianem. Następnie należy natychmiast przenieść pożywkę inkubacyjną do odpowiedniej kolby na odpady radioaktywne.
  5. Natychmiast po usunięciu szybko dodaj 300 μl lodowatego HBSS i delikatnie go usuń. Powtórz tę procedurę jeszcze dwa razy w każdym dołku, wykonując trzy prania na każdy plasterek. Pamiętaj, aby użyć bezsodowego HBSS do mycia plastrów przeznaczonych do pomiaru niespecyficznego wychwytu. Po umyciu wszystkich plastrów na płytce, dodać 300 μl 0,5 M NaOH do każdej studzienki i przechowywać płytkę zabezpieczoną parafilmem w temperaturze 4 °C przez noc.

9. Liczenie radioaktywnego L-[3H]-glutaminianu

  1. Następnego dnia oznacz tyle probówek, ile plasterków w eksperymencie i zbierz zawartość studzienki do każdej probówki. Upewnij się, że plastry są całkowicie rozpuszczone w roztworze do lizy. W razie potrzeby homogenizować próbkę za pomocą igły o rozmiarze 26 połączonym ze strzykawką o pojemności 1 ml.
  2. Dodać 1,2 ml cieczy scyntylacyjnej do końcowej objętości około 1,5 ml i homogenizować wszystkie próbki w wirze przed odczytaniem ich w liczniku scyntylacyjnym przez 60 s każda.
    UWAGA: Upewnij się, że parametry wykrywania są ustawione na tryt, a wynik zostanie dostarczony w DPM.

10. Obliczenia

  1. Przelicz wyniki podane przez licznik scyntylacyjny na radioaktywność emitowaną przez odczynnik uwięziony w wycinku i reprezentuje ilość pobranego glutaminianu. Wartość uzyskaną dla wychwytu nieswoistego należy odjąć od wyniku uzyskanego za pomocą zwykłego HBSS. Jeden μCi odpowiada 2,22×106 DPM.
  2. Znając ilość μCi i pierwotne stężenie [3H]L-glutaminianu (informacje zwykle podane w kolbie odczynnika lub karcie katalogowej), oblicz L-[3H]-glutaminian wychwycony przez każdą warstwę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wychwyt glutaminianu jest jednym z najważniejszych mechanizmów kontrolujących neurotransmisję w mózgu. Hipokamp w szczególności stanowi krytyczne miejsce w sygnalizacji glutaminianowej, będąc istotnym ośrodkiem łączącym pamięć, poznawanie i emocje w mózgu. Zgodnie z protokołem, w celu uzyskania reprezentatywnych wyników wykorzystano dorosłe samce szczurów linii Wistar. Zwierzęta znieczulono izofluranem 3% do utraty przytomności. Po wycięciu mózgu usunięto hipokampy i umieszczono je prostopadle do ostrza na stole do kroje...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Prezentowany protokół pokazuje łatwą do wykonania ocenę wychwytu glutaminianu za pomocą plastrów hipokampa. Wyniki pokazują, że AHS regularnie pobiera około 60 fmol znakowanego radioaktywnie L-[3H]-glutaminianu, że grubość warstwy (ilość białka) nie wpłynęła na wychwyt L-[3H]-glutaminianu (dane nie pokazane) oraz że grzbietowa, pośrednia i brzuszna część hipokampa wykazywała podobne wyniki, gdy uzyskano ją od naiwnych dorosłych samców szczurów Wistar (Figura 3A). Wykaza...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy otrzymują wsparcie finansowe od Brazylijskiego Narodowego Instytutu Nauki i Technologii w zakresie ekscytotoksyczności i neuroprotekcji [465671/2014-4], CNPq [438500/2018-0] i [152189/2020-3], FAPERGS/CAPES/DOCFIX [18/2551-0000504-5], CAPES [88881.141186/ 2017-01], CNPq [460172/2014-0], PRONEX, FAPERGS/CNPq [16/ 2551-0000475-7], FAPERGS/MS/CNPq/SESRS-PPSUS [30786.434.24734.23112017]

UFOP - MODALIDADE: "EDITAL PROPP 19/2020 AUXÍLIO À PUBLICAÇÃO DE ARTIGOS CIENTÍFICOS - 2020", PROCESSO N.: 23109.000929/2020-88

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
#11 ostrze skalpelaSwann-Morton525
100 mm szklana szalka PetriegoWspólni dostawcy
Filtr Whatman o średnicy 110 mm FiltrSigma AldrichWHA1001110
średnicy 42,5 mm Filtr WhatmanSigma AldrichWHA1001042
24-dołkowa płytka do hodowli komórkowychFalcon353047
BeckerWspólni dostawcy
Ostrza do rozdrabniacza tkanekWilkinson3241
Bone rongeurErwin Guth9,00,005
CaCl2Sigma AldrichC4901
D-[2,3-3H]-asparaginowyPerkinElmerNET581001MC11,3 Ci/mmol
(37 MBq)
D-GlukozaSigma AldrichG8270
N-metylo-D-glukaminaSigma AldrichM2004
HEPESSigma AldrichH3375
Hidex 300 SLHidex Oy.Super niski poziom # 425-020
Nożyczki do tęczówkiErwin Guth8,00,040
IsofluraneCristalia (Sã o Paulo, Brazylia)4,10,5251 ml/ml
KClSigma AldrichP3911
KH2PO4Sigma AldrichP0662
L-[3,4-3H]-Kwas glutaminowyPerkinElmerNET490005MC49,7 Ci/mmol
(185 MBq)
MgCl2Sigma AldrichM8266
MgSO4Sigma AldrichM7506
Na2HPO4Sigma AldrichS9763
NaClSigma AldrichS9888
NaHCO3Sigma AldrichS5761
Plastikowa pipeta PasteuraTypowi dostawcy
Płyn scyntylacyjnyPerkinElmer1200.437 do 1 x 5 LitrOptiphase HiSafe 3
Małe nożyczki chirurgiczneErwin Guth8,00,040
Mała pęsetaErwin Guth6,00,131
Zapasowe tarcze do cięcia do rozdrabniacza Wspólnidostawcy
Nożyczki standardoweErwin Guth8,00,010
Cienkie szczotki ( rozmiar 0 lub 2)Zwykli dostawcy
Cienka dwustronna szpatułkaErwin Guth470.260E
Rozdrabniacz do tkanekTed Pella, Inc.Numer katalogowy: 10180

Bibliografia

  1. Knierim, J. J. The hippocampus. Current Biology. 25 (23), 1116-1121 (2015).
  2. Stella, F., Cerasti, E., Si, B., Jezek, K., Treves, A. Self-organization of multiple spatial and context memories in the hippocampus. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 36 (7), 1609-1625 (2012).
  3. Toyoda, H., et al. Interplay of amygdala and cingulate plasticity in emotional fear. Neural Plasticity. 2011, 813749(2011).
  4. Koehl, M., Abrous, D. N. A new chapter in the field of memory: adult hippocampal neurogenesis. European Journal of Neuroscience. 33 (6), 1101-1114 (2011).
  5. Bannerman, D. M., et al. Regional dissociations within the hippocampus--memory and anxiety. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 28 (3), 273-283 (2004).
  6. Moser, E., Moser, M. B., Andersen, P. Spatial learning impairment parallels the magnitude of dorsal hippocampal lesions, but is hardly present following ventral lesions. Journal of Neuroscience. 13 (9), 3916-3925 (1993).
  7. Spiers, H. J., Bendor, D. Enhance, delete, incept: manipulating hippocampus-dependent memories. Brain Research Bulletin. 105, 2-7 (2014).
  8. Gubert, P., et al. Low concentrations of methamidophos do not alter AChE activity but modulate neurotransmitters uptake in hippocampus and striatum in vitro. Life Sciences. 88 (1-2), 89-95 (2011).
  9. Andersen, J. V., et al. Extensive astrocyte metabolism of gamma-aminobutyric acid (GABA) sustains glutamine synthesis in the mammalian cerebral cortex. Glia. 68 (12), 2601-2612 (2020).
  10. Nonose, Y., et al. Guanosine enhances glutamate uptake and oxidation, preventing oxidative stress in mouse hippocampal slices submitted to high glutamate levels. Brain Research. 1748, 147080(2020).
  11. Rambo, L. M., et al. Creatine increases hippocampal Na(+),K(+)-ATPase activity via NMDA-calcineurin pathway. Brain Research Bulletin. 88 (6), 553-559 (2012).
  12. Papp, L., Vizi, E. S., Sperlagh, B. Lack of ATP-evoked GABA and glutamate release in the hippocampus of P2X7 receptor-/- mice. Neuroreport. 15 (15), 2387-2391 (2004).
  13. Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31 (3), 571-591 (1989).
  14. Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Progress in Neurobiology. 65 (1), 1(2001).
  15. Featherstone, D. E. Intercellular glutamate signaling in the nervous system and beyond. ACS Chem Neurosci. 1 (1), 4-12 (2010).
  16. Dong, X. X., Wang, Y., Qin, Z. H. Molecular mechanisms of excitotoxicity and their relevance to pathogenesis of neurodegenerative diseases. Acta Pharmaceutica Sinica B. 30 (4), 379-387 (2009).
  17. Grewer, C., Rauen, T. Electrogenic glutamate transporters in the CNS: molecular mechanism, pre-steady-state kinetics, and their impact on synaptic signaling. Journal of Membrane Biology. 203 (1), 1-20 (2005).
  18. Tzingounis, A. V., Wadiche, J. I. Glutamate transporters: confining runaway excitation by shaping synaptic transmission. Nature Reviews Neuroscience. 8 (12), 935-947 (2007).
  19. Vandenberg, R. J., Ryan, R. M. Mechanisms of glutamate transport. Physiological Reviews. 93 (4), 1621-1657 (2013).
  20. Peterson, A. R., Binder, D. K. Post-translational Regulation of GLT-1 in Neurological Diseases and Its Potential as an Effective Therapeutic Target. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 164(2019).
  21. Martinez-Lozada, Z., Guillem, A. M., Robinson, M. B. Transcriptional Regulation of Glutamate Transporters: From Extracellular Signals to Transcription Factors. Advances in Pharmacology. 76, 103-145 (2016).
  22. Carbone, M., Duty, S., Rattray, M. Riluzole elevates GLT-1 activity and levels in striatal astrocytes. Neurochemistry International. 60 (1), 31-38 (2012).
  23. Jimenez, E., et al. Differential regulation of the glutamate transporters GLT-1 and GLAST by GSK3beta. Neurochemistry International. 79, 33-43 (2014).
  24. Wang, C. H., et al. Radiotracer Methodology in the Biological, Environmental and Physical Sciences. , Prentice-hall. (1975).
  25. Karra, A. S., Stippec, S., Cobb, M. H. Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP. Journal of Visualized Experiments. (123), e55504(2017).
  26. Buskila, Y., et al. Extending the viability of acute brain slices. Scientific Reports. 4, 5309(2014).
  27. Cho, S., et al. Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Neurochemistry International. 45 (1), 117-127 (2004).
  28. Pringle, A. K., Sundstrom, L. E., Wilde, G. J., Williams, L. R., Iannotti, F. Brain-derived neurotrophic factor, but not neurotrophin-3, prevents ischaemia-induced neuronal cell death in organotypic rat hippocampal slice cultures. Neuroscience Letters. 211 (3), 203-206 (1996).
  29. Paniz, L. G., et al. Neuroprotective effects of guanosine administration on behavioral, brain activity, neurochemical and redox parameters in a rat model of chronic hepatic encephalopathy. Metabolic Brain Disease. 29 (3), 645-654 (2014).
  30. Hansel, G., et al. The potential therapeutic effect of guanosine after cortical focal ischemia in rats. PLoS One. 9 (2), 90693(2014).
  31. Cittolin-Santos, G. F., et al. Neurochemical and Brain Oscillation Abnormalities in an Experimental Model of Acute Liver Failure. Neuroscience. 401, 117-129 (2019).
  32. Westphalen, R. I., Hemmings, H. C. Effects of isoflurane and propofol on glutamate and GABA transporters in isolated cortical nerve terminals. Anesthesiology. 98 (2), 364-372 (2003).
  33. Lee, A. R., Kim, J. H., Cho, E., Kim, M., Park, M. Dorsal and Ventral Hippocampus Differentiate in Functional Pathways and Differentially Associate with Neurological Disease-Related Genes during Postnatal Development. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 331(2017).
  34. Thomazi, A. P., et al. Ontogenetic profile of glutamate uptake in brain structures slices from rats: sensitivity to guanosine. Mechanisms of Ageing and Development. 125 (7), 475-481 (2004).
  35. Nonose, Y., et al. Cortical Bilateral Adaptations in Rats Submitted to Focal Cerebral Ischemia: Emphasis on Glial Metabolism. Molecular Neurobiology. 55 (3), 2025-2041 (2018).
  36. Arriza, J. L., et al. Functional comparisons of three glutamate transporter subtypes cloned from human motor cortex. Journal of Neuroscience. 14 (9), 5559-5569 (1994).
  37. Aggarwal, S., Mortensen, O. V. In Vitro Assays for the Functional Characterization of the Dopamine Transporter (DAT). Current Protocols in Pharmacology. 79, 12(2017).
  38. MacGregor, D. G., Chesler, M., Rice, M. E. HEPES prevents edema in rat brain slices. Neuroscience Letters. 303 (3), 141-144 (2001).
  39. Moreira, J. D., et al. Dietary omega-3 fatty acids prevent neonatal seizure-induced early alterations in the hippocampal glutamatergic system and memory deficits in adulthood. Nutritional Neuroscience. , 1-12 (2020).
  40. Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
  41. Zuo, Z. Isoflurane enhances glutamate uptake via glutamate transporters in rat glial cells. Neuroreport. 12 (5), 1077-1080 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

oznaczony promieniotwórczo glutaminianskrawki hipokampahipokamp gryzonitransportery neuroprzekaźnikówanaliza ex vivotransportery glutaminianuobwody synaptycznedynamika neurochemiczna

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.